Antonio Mutti

Tutte le sostanze sono tossiche

Aureolo Filippo Teofrasto Bombasto von Hohenheim, noto come Paracelso (1493-1541)

Solo la dose determina se una sostanza è tossica oppure no.

Antonio Mutti

0

100

20

40

60

80

Esposizione/Dose, U.A.

Ris

po

ste,

%La relazione dose-risposta: paradigma fondamentale della tossicologia

Antonio Mutti

Matthieu Joseph Bonaventura Orfila (1787-1853)

Traité Des Poisons ou Toxicologie Generale”, Paris, 1814:

1. Studio degli effetti tossici attraverso l’esame autoptico dei diversi organi e tessuti.

2. Estrapolabilità all’uomo dei dati sperimentali ottenuti nell’animale da esperimento

Principi basilari della Tossicologia

Antonio Mutti

0

100

20

40

60

80

Esposizione/Dose, U.A.

Ris

po

ste,

%Diversi organi e diverse specie presentano diverse curve dose-risposta

Antonio Mutti

Rischio chimico: le dimensioni del problema# prodotti conosciuti a base di sostanze

chimiche: >11.000.000

# sostanze tossiche censite in banche dati (Toxline, ECDIN, ecc.): >100.000

# sostanze chimiche “esistenti” nel 1981 (tossicità poco conosciuta): ~30.000

# sostanze abbastanza conosciute da essere regolamentate: ~ 700

# sostanze conosciute e regolamentate in modo affidabile: ~ 100

Antonio Mutti

Rischio da agenti cancerogeni: alcuni numeri dalla Lista delle valutazioni IARC # sostanze e processi valutati dalla IARC: 900

# sostanze, miscele e processi classificati come cancerogeni umani (Gruppo 1): 95

# sostanze e processi classificati come probabili cancerogeni umani (Gruppo 2a): 66

# sostanze e processi classificati come possibili cancerogeni per l’uomo (Gruppo 2b): 241

# agenti, miscele e processi non classificabili rispetto alla cancerogenicità per l’uomo (Gruppo 3): 497

# sostanze, miscele e circostanze probabilmente non cancerogene per l’uomo (Gruppo 4): 1 (caprolattame)

Aggiornata il 22 luglio 2004

Antonio Mutti

Come affrontare il problema?

Etica

PartecipazioneEmotiva

Prudenza

Cautela

Pragm

atism

o

Razionalità

Impar

zialit

à

Parsim

onia

Saggezza

Antonio Mutti

Diversi approcci alla gestione del rischio chimico

Percezione del rischio

Principio di precauzione

Stima formale del rischio

Evidence Based Prevention

Antonio Mutti

Evidence-based prevention: approccio scientifico o slogan vuoto?

Domanda: Cosa succede in seguito ad interventi preventivi efficaci?

Risposta corretta: NULLA ovvero, se presenti, scompaiono intossicazioni e malattie (Prevention-based Evidence).

Antonio Mutti

Errori statistici nell’analisi dei dati e nella stima del rischio

I tipo: agente innocuo identificato come rischioso

(in genere <0.05);

II tipo: agente rischioso identificato come innocuo (in genere <0.2)

III tipo (non previsto nei testi di statistica): risposta corretta ad una

domanda sbagliata*

*Schwartz S, Carpenter KM. 1999. Am. J. Public Health 89:1175–80

Antonio Mutti

Gestione del rischio: come bilanciare la pressione di interessi contrapposti?

Paralisiattraverso l’analisi

Percezione del rischio

Principio di precauzione

Stima del rischio

Monitoraggio del rischio

EBP (PBE)

Governo della prevenzione

Antonio Mutti

Tempo/Grado di certezza

En

tità

del

l’im

peg

no

Percezione del rischio

Ricerca diconferma

Coinvolgimento parti in causa Interventi

precauzionali

Monitoraggio precauzionale

Stima del rischio

Interventi “evidence-based”

Da P. Grandjean: IMPLICATIONS OF THE PRECAUTIONARY PRINCIPLE FOR PRIMARY

PREVENTION AND RESEARCHAnnu. Rev. Public Health 2004. 25:199–223

Diversi approcci alla gestione del rischio chimico

Ricerca iniziale

Antonio Mutti

Different levels of proof may be needed for different purposes, depending on the severity of the problem.

Da P. Grandjean: IMPLICATIONS OF THE PRECAUTIONARY PRINCIPLE FOR PRIMARY PREVENTION AND RESEARCH Annu. Rev.

Public Health 2004. 25:199–223

Antonio Mutti

Accertamento del rischio e Principio di precauzione

Secondo gli orientamenti oggi prevalenti in sede comunitaria, occorre procedere all’accertamento del rischio (risk assessment) nei luoghi di lavoro, mentre è buona norma applicare il “Principio di Precauzione” (precautionary principle) in tossicologia ambientale.

Antonio Mutti

Rischio

Numero e suscettibilità degli esposti

Livelli diesposizione

Determinanti del rischio

Rischio come Probabilità Possibilità

(IUPAC, WHO)

Da: IUPAC, International Union of Pure & Applied Chemistry: Glossary for

Chemists of Terms used in Toxicology, Pure & Applied Chemistry 1993,

65: 2003-2122)

Tossicitàdella sostanza

Antonio Mutti

STIMA DEL RISCHIO GESTIONE DEL RISCHIO

MODELLO GENERALE (National Academy of Science, USA,

1983)Identificazione degli agenti di rischio(L’agente può essere causa di un danno alla salute?)

Definizione della relazione dose - risposta(Qual è la relazione tra quantità dell’agente e risposta biologica?)

Valutazione dell’esposizione(Quali esposizioni sono dimostrate, preventivabili o prevedibili?)

Caratterizzazione del rischio(Quali sono la probabilità e la gravità del danno per la salute?)

Valutazione delle conseguenze economiche, sociali, politiche e sulla salute pubblica(Valutazione del rischio)

Sviluppo di opzioni

Norme – Valori limite

1 2

Antonio Mutti

● Qual’è l’entità del danno alla salute che consideriamo tollerabile?

● Qual’è la proporzione di individui colpiti che consideriamo accettabile?

● Qual’è il grado di certezza della validità delle prove che consideriamo necessaria prima di intervenire?

Domande preliminari prima di definire priorità e modalità di intervento

Antonio Mutti

Antonio Mutti

Malattia

Effettiirreversibili

Effetti critici

Effetti subcritici

Adattamento

VdR

Esposizione professionale a dosi:

TLV® = Threshold Limit Value

0.5 1.0

Moderate Elevate

Livelli di esposizione rispetto al TLV®

Effetti attesi

Classi di esposizione

Antonio Mutti

0Dose, U.A.

100

20

40

60

80

Ris

post

a, %

Prevalenza spontanea

Effetto 1(Cancro)

Effetto 2

Effetto 3

Relazioni dose – risposta:il problema della soglia

Antonio Mutti

Exposure AssessmentQuantificazione o misura dell’esposizione

Monitoraggio ambientale

BLV

Esposizione

Dose

OEL

Risposta

BEI

Monitoraggiobiologico

Interpretazione

a livello di gruppo

Interpretazione

a livello individuale

Antonio Mutti

Utilità relativa del monitoraggio ambientale o biologico

Acuti o cronici Locali o sistemici Precoci o tardivi Reversibili o irreversibili Con soglia o stocastici

Antonio Mutti

Monitoraggio ambientale

Misura periodica della concentrazione di inquinanti aerodispersi, per confrontare le misure ottenute con

appropriati standard igienici

misura oggettiva e standardizzabile

facilmente interpretabile

può non riflettere la dose assorbita: – altre vie di assorbimento– effetto del carico di lavoro;– variabilità interindividuale nel metabolismo.

tende a semplificare fenomeni complessi – miscele– suscettibilità individuale

Antonio Mutti

Monitoraggio biologico

Misura periodica della concentrazione di un inquinante o di suoi metaboliti in matrici biologiche accessibili, per confrontare le misure ottenute con

appropriati valori di riferimento misura integrata della dose assorbita:

– per vie diverse dalla via respiratoria

– a causa di esposizioni extra-professionali

la misura della dose sistemica – non è utile per prevenire effetti acuti;

– è poco utile per prevenire effetti locali.

Antonio Mutti

Vantaggi e limiti del monitoraggio biologico (MB)

La dose è in rapporto più diretto con gli effetti sulla salute la stima del rischio mediante MB è più accurata rispetto a quella basata sul monitoraggio ambientale;Il dato biologico è potenzialmente meno influenzato da fattori interferenti (maschere, imbrattamento campionatori)

Per una corretta interpretazione dei dati di MB sono necessarie approfondite conoscenze tossicologiche (cinetica, dinamica, relazioni dose-effetto/risposta;Il MB è utile solo per effetti sistemici, anche se si stanno aprendo nuove prospettive relative alle sostanze con effetti tossici polmonari.

Antonio Mutti

Aspetti critici nella scelta degli indicatori

conoscenza del meccanismo d’azioneconoscenza della tossicocineticaconoscenza delle relazioni temporali tra esposizione ed effetto che si intende prevenire

Antonio Mutti

Cinetica e significato degli indicatori di dose

breve

intermedio

lungo

➨assorbimento durante l’esposizione

➨esposizione nei giorni precedenti

➨dose accumulata nei mesi/anni precedenti

t/2 significato

Antonio Mutti

Il monitoraggio biologico può essere finalizzato a:

Definire l’esposizione, per ridurre gli errori di classificazione in epidemiologia;Valutare la dose al bersaglio (organo, cellula o molecola);Valutare le relazioni dose-effetto e dose-risposta.

Antonio Mutti

Validità degli Indicatori Biologici

Validità intrinseca

•Pertinenza,

•Stabilità,

•Sensibilità,

•Specificità,

•Accuratezza,

•Precisione

Validità esterna

• Meccanismo d’azione• Vantaggi rispetto ad

altri metodi• Controllo dei fattori interferenti• Valore diagnostico e

prognostico

Variabilità interindividuale: dettaglio fastidioso o fattore determinante?

Da ridurre :differenze legate al campionamentofattori pre-analitici fattori analitici

Da spiegare:differenze nell’assorbimentodifferenze nella biotrasformazionedifferenze nelle capacità di eliminazione

Antonio Mutti

Exposure AssessmentQuantificazione o misura dell’esposizione

Monitoraggio ambientale

BLV

Esposizione

Dose

OEL

Risposta

BEI

Monitoraggiobiologico

Interpretazione

a livello di gruppo

Interpretazione

a livello individuale

Antonio Mutti

Monitoraggio biologico e limiti biologici

- Il problema della variabilità interindividuale

- Il problema dell’interferenza del carico di lavoro

- Il problema dell’interferenza di altri composti in miscela

- È ipotizzabile un BLVmiscela?

Antonio Mutti

[Biomarker] vs. [Esposizione]Media vs. Limite inferiore dell’IC 95 %

Livello di esposizione

Liv

ello

del

bio

mar

ker

Valore medio

Limite inferiore dell’IC 95 %

BEIY

BEIx

OELX

Antonio Mutti

[Biomarker] vs. [Esposizione]2. Effetto del carico di lavoro*

moderato

Esposizione ad A

bio

mar

ker

di A

leggero

riposoBEIY

BEIA

BEIX

OELX

*Effetti simili sono causati dal consumo dialcol o lipidi, dal sesso, etc.

Carico di lavoro

Antonio Mutti

[Biomarker] vs. [Esposizione] 3. OEL e BEI per miscele

Esposizione ad A

bio

mar

ker

per

A A soltanto

In miscelaBEIx

BEIA

OEL

Antonio Mutti

Limiti di esposizione a miscele

Indice di esposizione a miscele =

n

n

TLV

C

TLV

C

TLV

C

TLV

C ++++ ...3

3

2

2

1

1

> 1 supera il TLVmix

Il concetto è applicabile ai limiti biologici di esposizione?

Antonio Mutti

Esempio di una misceladi 5 composti

X

T

E

BB

D

BenzeneTolueneEtilbenzeneXileneDiclorometano

da: Haddad et al. TAP 167(3):199-209, 2000

Antonio Mutti

Diclorometano 100 ppm + Benzene 50 ppm + Toluene 50 ppm + Etilbenzene 50 ppm + m-Xilene 50 ppm

Diclorometano

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 8

Co

nce

ntr

azio

ne

ven

osa

(m

g/L

)

Benzene

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

0 2 4 6 8

Co

nce

ntr

azio

ne

ven

osa

(m

g/L

)

Toluene

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 2 4 6 8

Tempo (ore)

Co

nce

ntr

azio

ne

ven

osa

(mg

/L)

Etilbenzene

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 2 4 6 8

Tempo (ore)

Co

nce

ntr

azio

ne

ven

osa

(m

g/L

)m-Xilene

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 2 4 6 8

Tempo (ore)

Co

nce

ntr

azio

ne

ven

osa

(m

g/L

)

Puro

Miscela

Da: Haddad et al. TAP 167(3):199-209, 2000

Antonio Mutti

Perché utilizzare indicatori biologici?

Per aumentare la sensibilità nella valutazione dell’esposizione e degli effetti

Per ottenere una misura surrogata di fenomeni non misurabili in quanto

il tessuto è inaccessibile

la misura tecnicamente difficile

la misura è distruttiva

la misura è troppo costosa

Per comprendere un processo che conduce ad effetti che si vogliono prevenire.

Antonio Mutti

Esposizione DoseAlterata

funzione/struttura

Dose albersaglio Malattia

Epidemiologia molecolare, ovvero:modello multifattoriale semplificato

Indicatori di esposizione Indicatori di effetto

Indicatori di suscettibilità

Antonio Mutti

Classificazione degli indicatori biologici:

dosesostanza chimica o metabolita o prodotto di interazione con una molecola bersaglio, misurato in un compartimento accessibile.

effetto alterazione biochimica o funzionale misurabile, che in funzione della sua entità può indicare un potenziale rischio per la salute o una malattia.

suscettibilità condizione congenita o acquisita che predispone

agli effetti indesiderati degli agenti chimici.

Antonio Mutti

Biomarkers diDose, Effetto e Suscettibilità

EsposizioneDose

internaDose albersaglio

Effettobiologicoprecoce

Alteratastrutturafunzione

Malattia

Polimorfismi di Enzimi della

riparazione del DNAPolimorfismi Metabolici

Markers Immunogenetici(es., HLA Ag)

• Sostanze tal quali o metabolitiematici, urinari, ecc.• Addotti alle proteine (es., Hb)

•Addotti al DNA: in situ in GB in urina

• Mutazioni in oncogeni o geni soppressori • Citogenetica

(CA, SCE, MN, FISH)

• Proteinuria • Ormoni, ecc.

• Spettri mutazionali nei tumori• Antigeni tumore-specifici circolanti, ecc.

Antonio Mutti

Sostanze tal quali

I solventi organici possono essere misurati nell’aria

alveolare e nel sangue. L’aria alveolare può essere campionata in modo non invasivo ed analizzata in gascromatografia

Il prelievo dell’aria alveolare non è facilmente standardizzabile:

– l’emivita è molto breve (minuti) ed il tempo di prelievo è quindi critico;

– non è ancora disponibile una tecnica di riferimento (promettente il “BioVoc”).

L’analisi nel sangue ha tutti gli svantaggi dell’aria alveolare senza gli svantaggi

Antonio Mutti

Sostanze tal quali (segue)

I solventi organici possono essere misurati

nelle urine. I solventi tal quali disciolti nelle urine possono

essere analizzati in gascromatografia con tecniche oggi affidabili

Il significato delle concentrazioni urinarie dei solventi tal quali non è chiarissimo

– l’equilibrio aria/sangue e sangue/urine si realizza attraverso barriere a diversa permeabilità e flusso;

– non è chiaro il tempo di equilibrio e, quindi, di integrazione dell’esposizione;

– le concentrazioni sono molto piccole e possono comportare un notevole errore nell’estrapolare l’esposizione che le ha generate.

Antonio Mutti

Addotti al DNA

Prodotti di legame covalente tra composti elettrofili e

gruppi nucleofili C, N, O, P del DNA. integrano:

–l’esposizione a genotossici–le differenze nella biotrasformazione –le differenze nei meccanismi di riparazione

possono non riflettere:–la dose vera (per problemi analitici);–la dose al bersaglio;–controllo proliferazione e apoptosi cellulare.

Antonio Mutti

Biomarkers diDose, Effetto e Suscettibilità

EsposizioneDose

internaDose albersaglio

Effettobiologicoprecoce

Alteratastrutturafunzione

Malattia

Polimorfismi di Enzimi della

riparazione del DNA

Polimorfismi Metabolici

Markers Immunogenetici(es., HLA Ag)

• Sostanze tal quali o metabolitiematici, urinari, ecc.• Addotti alle proteine (es., Hb)

•Addotti al DNA: in situ in GB in urina

• Mutazioni in oncogeni o geni soppressori Cytogenetica

(CA, SCE, MN, FISH)

• Proteinuria • Ormoni, ecc.

• Spettri mutazionali nei tumori• Antigeni tumore-specifici circolanti, ecc.

Antonio Mutti

“…an indicator of an inherited or acquired limitation of an organism’s ability to respond to the challenge of exposure to a specific xenobiotic substance”  

National Research Council 1989 .

Biomarker of susceptibility

Antonio Mutti

Funzioni cellulari Polimorfismi genetici Biotrasformazione

· Fase 1 ADH 1B, ADH 1C, ALDH2, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 , CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 , CYP3A4, SOD2,

· Fase 2 COMT, GSTA1 , GSTA2 , GSTA4, GSTM1, GSTM3 , GSTT1 , GSTT2 , EPHX1 , MTHFR, MPO , N QO1 , NAT - 1 , NAT - 2 , SULT1A1, TPMT, UGT1A1, UGT1A7

Riparazione DNA

· Reversione diretta MGMT

· Excisione di basi APE1, ERCC1, ERCC2, ERCC4, ERCC5, hOGG1, LIG3, MPG, PCNA, POLB,

· Rotture a doppio filamento

XRCC1, XRCC2, XRCC3, XRCC9

Proliferazione, apoptosi CDKN1A, CDKN1B, EGF, EGFR, H- ras, MDM2, p53, VHL

Controllo ormonale AR, CYP17, CYP19, GRPR, SRD5A2, VDR Controllo nervoso DAT, DRD2, DRD4 Controllo immunitario HLA, citochine e loro recettori, chemochine e loro recettori

Alcuni polimorfismi genetici noti

Antonio Mutti

Biotrasformazione delle sostanze esogene

Super Idrofobiche Idrofobiche Idrofile Polari

Accumulo nelTessuto adiposo

Metabolismo (fase I):ossidazione, idrolisi(in genere attivazione)

Metabolismo (fase II)coniugazione (in genere

detossificazione)

Escrezione urinaria o biliare

Antonio Mutti

Biomarkers di suscettibilità

Effetti precoci

Alterata

struttura funzione

Malattia

Polimorfismimetabolici

Markers immuno-genetici (es. HLA)

• Mutazioni di oncogeni o digeni soppressori

Test citogenetici (CA,SCE, MN, FISH)

•

•

Ormoni •

- Spettri mutazionali nei tumori (es. p53)

- Marcatori tumorali circolanti

- Citologia esfoliativa

Esposizioneinterna Dose Dose al

bersaglio

• Agenti chimici o metaboliti

nel sangue,nelle urine,ecc.

• Addotti alle

Proteine, specie all’Hb

• Addotti al DNA : in situ nei GB nelle urine

Biomarkers di esposizione

Polimorfismi diEnzimi di ripara-zione del DNA

Biomarkers di effetto

Antonio Mutti

Problemi aperti nel Monitoraggio Biologico: Validità e Validazione

• INDICATORI DI DOSE:– Dose al bersaglio, dose biologicamente efficace,

dose cumulativa: cumulo di dosi o cumulo di effetti?

• INDICATORI DI EFFETTO:– Predittività rispetto all’outcome: indipendente

dall’esposizione? (es. AC)

• INDICATORI DI SUSCETTIBILITA’– Il problema delle interazioni e ruolo dei markers di

suscettibilità individuale (modificatori di effetto).

Antonio Mutti

Biomarker Soglia Nota

Esposizione coerentemente correlato Considerati background con l’esposizione1 ed interferenti

Effetto coerentemente correlato Considerata l’incidenza con il rischio di malattia2 spontanea

Suscettibilità distingue gruppi a rischio3 A parità di esposizione

Postille del tossicologo:1consente di prevedere l’effetto o la risposta biologica2coerentemente correlato con la dose3svolge un ruolo fisiopatologico: se è un polimorfismo metabolico, incide sulla biotrasformazione del substrato; se è un polimorfismo recettoriale modifica la trasduzione del segnale; se è un oncogene condiziona la conversione neoplastica, ecc.

Criteri di validità per un “biomarker” (dal punto di vista epidemiologico)

Antonio Mutti

I Biomarcatori possono assumere diverso significato in funzione dell’uso e della validazione

EsposizioneDose

assorbita

Dose al

bersaglio

EffettoBiologicoPrecoce

AlterataStrutturaFunzione

Malattia

TossicocineticaTossicodinamica

Patogenesi

S U S C E T T I B I L I T A’

Antonio Mutti

Prospettiva Genetica

Malattia

S U S C E P T I B I L I T A’

Antonio Mutti

Prospettiva Igienistica

Esposizione Malattia

Antonio Mutti

Prospettiva Epidemiologica

Esposizione Malattia

S U I B I

Antonio Mutti

Prospettiva Clinica

AlterataStruttura oFunzione

Malattia

Patogenesi

I L I T A’

Antonio Mutti

Prospettiva Tossicologica

Tossicocinetica

Tossicodinamica

Esposizione DoseDose

alBersaglio

EffettoBiologicoPrecoce

AlterataStruttura oFunzione

S U S C E T T I B I

Antonio Mutti

Valutazione del Rischio:effetti stocastici

Antonio Mutti

Rischio

Tossicitàdella sostanza

Numero e suscettibilità

degli esposti Livelli diesposizione

Determinanti del rischio

Rischio comeProbabilità Possibilità

(IUPAC, WHO)

Da: IUPAC, International Union of Pure & Applied Chemistry: Glossary for

Chemists of Terms used in Toxicology, Pure & Applied Chemistry 1993,

65: 2003-2122)

Antonio Mutti

Solo Geni

Solo Ambiente

Genix

Ambiente

Contributo relativo dell’ambiente

N. d

i cas

iInterazioni Geni-Ambiente nella patologia degenerativa

5 95

Antonio Mutti

Diversi genipossono

interagire con fattori ambientali causando una

sola malattia

Ma…

Ciascun gene può interagire con molti fattori di rischio ed essere associato con molte malattie.

Disease 6Disease 5

Disease 4Disease 3

Disease 2Fattore di rischio 1

Disease 6Disease 5

Disease 4Disease 3

Disease 2Malattia 1

Gene 6Gene 5

Gene 4

Malattia 1

Gene 3Gene 2Gene 1

Environment 3Environment 2Fattore

ambientale 1

Complessità delle interazioni gene-ambiente

Antonio Mutti

A grain in the balance will determine which individual shall live and which shall die…

Charles Darwin, 1859

attivazione inattivazionedanno riparazione

aggressione difesaassorbimento escrezione

Pro-ossidante Anti-ossidante

inibizione induzione

consapevolezza ignoranza

Antonio Mutti

Il problema della sorveglianza sanitaria.

Antonio Mutti

Sorveglianza sanitaria e monitoraggio degli effetti biologici

Sorveglianza sanitaria

Monitoraggio effetti biologici

Individui Chi Gruppi

Idoneità del lavoratore Perché Idoneità del lavoro

Clinica Metodologia Epidemiologica

Specifici Test impiegati Sensibili

Valori di riferimento Confronto con Gruppo di controllo

Dicotomiche Variabili Continue

Diagnosi di malattie o ipersuscettibilità

Conclusione Esclusione di malattie

Antonio Mutti

L’importanza degli aspetti etici dipende dallo scopo dell’attività e dall’uso dei dati

Aspetti etici

Attività

Sorveglianza

Diagnosi

Monitoraggio effetti biologici

Analisi, Stima, Valutazione, Misura,

Determinazione, Quantificazione

Assenti

Molto importanti

Moderati

Modesti

Screening

Antonio Mutti

The most important cause of misuse is misconception