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5/11/2018 Tinci n de gran - slidepdf.com
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Tinción de gran
OBJETIVO
Conocer la técnica de tinción de Gram., conocer el procedimiento y observar las
bacterias en microscopio clasificándolas en Gram. Positivas y Gram. Negativas.
Utilizar correctamente los materiales en esta técnica de tinción. Practica: 6 tinción de Gram.
MATERIALES
Mesa de trabajoFrotis ya realizado
Soluciones de, cristal violeta, yodo lugol, acetona, safranina.
Microscopio
2 mecheros de bunsen
Aceite de inmersión
Asas bacteriológicas
Agua destilada
Vaso de precipitado de 50 ml
Cajas petri con medio de cultivo
Campo de esterilización
Papel secante
Torundas de algodón
INVESTIGACION DE TINCION DE GRAM: El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto
Gram. positivas como Graham negativas).
El lugol está formado por I2 ( yodo) en equilibrio con KI ( yoduro de potasio) , el cual
está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo
insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya
que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras
que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una
tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término
del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se
verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo,
safranina)
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno
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de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado.
Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo,
que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos
con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante.
Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada
diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el
primer tinte, y toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera
coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción
Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. PASOS PARA LA TECNICA DE TINCION DE GRAM:
prepara el frotis y fijar a calor colocar la preparación con la solución de cristal violeta sumergirla durante(1mn)
lavar con solución yodada (lugol)
cubrir el frotis durante con solución lugol durante (1mn)
escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre mas cristal violeta
lavar con agua corriente
contrastar con la solución safranina
lavar con agua corriente y secar al aire
observar con el microscopio con una gota de aceite de inmersión en objetivo (100x) DESARROLLO:
Los materiales como las asas bacteriológicas no tienen nada que ver con la tinción de
Gram., solo se volvieron a poner ala mesa por que algunos de los alumnos no pudieron
completar la práctica a su tiempo y si había algún error en la tinción se tenía la
oportunidad de volver hacer el frotis e intentar de nuevo la tinción.
Se llevo el portaobjetos al lavamanos, se colocaron recipientes con las soluciones de
(acetona, yugol, cristal violeta, safranina), se tomo el portaobjetos y se sumergió en el
recipiente donde contenía el cristal violeta durante 1mn, después se sumergió en el
yodo lugol durante 1mn, se lavo con la acetona hasta que ya no escurriera mas cristal
violeta, posteriormente se sumergió en la safranian durante 1mn y finalmente se lavocon agua corriente, se seco al aire libre y séle coloco una gota de inmersión para
fijarlo en el microscopio con objetivo 1000x. Desarrollo grafico
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Cristal violeta durante 1mn.
Yodo lugol durante 1mn
Se vacío acetona para limpiar el cristal violeta hasta que ya no escurriera más de este.
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Se vacío safranina durante 1mn
Se lavo con agua corriente para limpiarlo de la safranina y se seco al aire libre.
Séle acho una pequeña gota de aceite de palo (aceite de inmersión) para su vista en el
microscopio.
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Se observo através del microscopio.
Se observaron bacilos, de color rojo y por lo tanto los microorganismos son
gramnegativos.
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