1

Microbiología

De:

Wagner Junior Delgado Arteaga

Docente:

DR. Dolores Vázquez

Curso:

3er nivel “A”

Índice Temas

Pág.

Tinción de Gram

Colorantes que se utilizan en la Tinción de Gram

Técnica de la coloración Gram

Para qué sirven el método de Gram en la Tinción

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

Ejemplo de las bacterias con la tinción de Gram

Glosario

Bibliografía

2

3

3

4

6

7

11

12

9

Tinción de GramLa tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Colorantes que se utilizan en la Tinción de Gram

Violeta de genciana.- es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. El violeta de genciana destruye células, y es usado en desinfectante de intensidad moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la mayoría de los animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para desinfección de la piel de estos animales.Yodo.- actúa como un mordente, es decir ayuda a la fijación del colorante previo que has aplicadoAlcohol cetona.- actúa en forma contraria, ayudando a arrastrar el colorante excedente que no haya fijado a las paredes celularesSafranina.- es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología.

Otros colorantes

3

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg)

Colorantes Básicos:

I. TioninaII. cristal violetaIII. violeta de gencianaIV. rojo neutroV. fucsina básicaVI. hematoxilina.

Colorantes Ácidos:

I. Acido pícricoII. Fucsina acida,III. Eosina.

Neutros:

I. Eosinato de azul de metileno.

II. Eosinato de azur de metileno.

Indiferentes:

I. Sudan III II. Rojo escarlata

Técnica de la coloración GramFijar un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

4

Tinción

Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.

Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.

Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias.

Decoloración (paso crítico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul.

Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

5

Tinción de contraste

Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.

Para qué sirven el método de Tinción de Gram

La tinción de Gram es una prueba esencial y obligatoria a realizar en el laboratorio de microbiología. Es una etapa preliminar que se utiliza para diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. El método tradicional de tinción Gram es un proceso largo y complejo que requiere de experiencia técnica y de numerosas etapas manuales, lo que tiene como consecuencia una menor fiabilidad y reproducibilidad. Es el método de identificación de bacterias mediante una tinción específica, desarrollado por el médico danés Hans Christian Joachim Gram, es un procedimiento utilizado universalmente. En un primer momento las bacterias se tiñen con violeta de genciana (derivado metilado anilínico) y después se tratan con la solución de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potásico y 300 partes de agua); por último se lavan con alcohol etílico, y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo. A veces se añade una contratinción con fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles.Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que producen forúnculos; Gram negativas representativas

6

son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram

negativoLos fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al

7

poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

8

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teñidas con la tinción de Gram.

Ejemplo de las bacterias con la tinción de Gram

9

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra de líquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infección.

Una tinción Gram en la que observamos un mezclado de

Staphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo

Gram negative)

Glosario: Lugol.- este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antiséptico, para la desinfección de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en análisis médicos y de laboratorio.

Fucsina.- la fucsina ácida es un colorante magenta utilizado en histología, en las tinciones de mallory, van gieson y tricrómica de masson.Y dependiendo del tejido a teñir, da estos resultados:

* colágeno: azul oscuro.* musculatura: anaranjado* cromatina rojo, amarillo opaco.

Hematoxilina.- es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa haematoxylum campechianum l., conocida también con el nombre de palo de campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hemateína.

Eosina.- es un colorante ácido, por lo cual se denomina basófilo (ya que tiene afinidad por las sustancias alcalinas), en forma de polvo rojo cristalino, de uso ampliamente extendido en el ámbito industrial, desde la industria textil hasta el estudio biológico e histológico. Como curiosidad, también se utiliza en la coloración de la gasolina

Mordiente.- el mordiente es una sustancia empleada en tintorería que sirve para fijar los colores en los productos textiles. La función del mordiente es favorecer la fijación del colorante en las fibras. Este término es usado principalmente en la industria textil

Fosfolípidos.- los fosfolípidos son un tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo fosfato.

Bibliografía.-10

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gramhttp://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20060909112406AAhjBR6http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20060909112406AAhjBR6http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080926063302AAzfQ7Zhttp://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20111014141321AAVOqNOhttp://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml

http://books.google.com.ec/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA69&lpg=PA69&dq=tincion+de+gram+que+colorantes+emplea&source=bl&ots=z82quK92qD&sig=S_q9mlo-m09dMN4KtQi9Z2WMes0&hl=es&sa=X&ei=EoWJUeinKIX50gG_woHABg&ved=0CGAQ6AEwBQ#v=onepage&q=tincion%20de%20gram%20que%20colorantes%20emplea&f=falsehttp://mediens.blogspot.com/2011/10/como-realizar-una-tincion-de-gram.html

11