Thèse doctorat 2 - univ-ouargla.dz DOCTORAT/BENCHEIKH...Remerciements En premier lieu, je remercie mon DIEU, notre Créateur pour m’avoir donné la force pour accomplir cette thèse

الديمقراطية الشعبيةالجمهورية الجزائرية REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

وزارة التعليم العالي والبحث العلمي

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE

ورقلة-مرباحجامعة قاصدي

UNIVERSITE KASDI MERBAH – OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES APPLIQUEES

DEPARTEMENT DE GENIE DES PROCEDES

THÈSE EN VUE DE L’OBTENTION D’UN DIPLÔME DE DOCTORAT (LMD)

Spécialité : GENIE DES PROCEDES ET ENVIRONNEMENT

Intitulé

Présentée et Soutenue publiquement Par :

BENCHEIKH Salah Eddine

Le : 06 /07 / 2017

Devant le jury composé de :

- Mr. Ammar MESSAITFA Professeur U.K.M. Ouargla Président - Mr. Noureddine Gherraf Professeur U. Oum Elbougui Examinateur - Mr. Mohamed redha OUAHRANI Professeur U. Elouad Examinateur - Mr. Segni Ladjel Professeur U.K.M. Ouargla Rapporteur

Etude de l’activité des huiles essentielles de la

plante Teucrium polium ssp Aurasianum Labiatae

.

Dédicace

A ma chère famille du petit au grand

A mes enseignants et professeurs du primaire à l’université

A toutes mes amies

Je dédie ce modeste travail

Salah Eddine

Remerciements

En premier lieu, je remercie mon DIEU, notre Créateur pour m’avoir donné la force pour

accomplir cette thèse

J'ai eu la chance d'effectuer ce travail de thèse dans le Laboratoire de recherche de génie des

procédés (LGP) de l'Université KASDI Merbah OUARGLA, sous la direction de professeur

Segni LADJEL, C’est l’homme de sciences que j’adresse mes remerciements Vous avez initié

et dirigé ce présent travail avec la rigueur scientifique, l’enthousiasme et la persévérance qui

sont les vôtres Soyez assurée que j’ai bénéficié de vous l’éducation qui doit animer un chercheur

Ce que vous nous avez toujours fait savoir. Aux tribulations diverses qui auraient pu

compromettre la réalisation de ce travail, Vous avez toujours trouvé les solutions qui

s’imposaient. Aussi grande que puisse être ma gratitude, soyez assurée qu’elle ne sera jamais à

la hauteur de tous les efforts que vous avez déployés. Puisse Dieu me permettre de vous imiter.

Monsieur le Professeur Pr. Mokhtar HAMDI et Mr. Abdeljalil ABID, de INSAT (Tunisie)

: je tenais à vous remercier chaleureusement pour votre soutien scientifique pour faire les

analyses et l’identification des huiles essentielles

Une grande part de ma reconnaissance s'adresse à Pr. CHAHMA Abd Elmadjid pour

son aide matériel qui m’a permis de mener à bien la partie antibactérienne de ce travail

Sans oublier, mes camarades doctorants de l’équipe du laboratoire génie des procédés

Mes sincères remerciements vont également à mes amis Mohamed Bilal GOUDJIL, Mahdi

BELGUIDOUM, Abdeljalil ABID, Amel RAMDANI, Hibatallah MEZZAR Souad

ZIGHMI, Soumia BECHAR, Zineb MAHCENE et Siham MEFLAH

مــــلــــخـــــــــص

اسةدرب مهتمون ونحن العالجية، بخصائصها المعروفة الجزائرية الطبية النباتات تثمين من جزء هو العمل هذا

السكان قبل من المستخدمة الفعالة الموادب غناهاب المعروف Teucrium polium aurasianum الخياطة نبات

العالجات مختلف في المحليين

مردود على الظل في التجفيف وتأثير العطرية، الزيوت الستخراج ،أوال ناحيتين من العمل هذا ويكرس

ادالمض النشاط ذلك في بما البيولوجية األنشطة دراسة هدفب وذلك الكيميائي التركيب وتحديد ستخراجالا

Teucrium الطبي النبات من المستخرجة األساسية زيوتلل لألكسدة المضاد والنشاط للفطريات مضاد للجراثيم،

polium aurasianum ، األنشطة هذه على الضوء لتسليط وثانيا.

الناتج راجستخالامردود . بالبخار التقطير تقنية بواسطة نباتلل هوائيال الجزء من األساسية الزيوت ستخراجا تم

.٪0.585 هو

منها كانت المكونات؛نوع من 35 تحديد وتم GC / MS بواسطة للزيوت األساسية الكيميائي التركيب تحليل تم

، β-Pinèneمن مركب α-pinène ، (8.59٪)من مركب limonène، (25.42٪)من مركب (34.72٪)

.ةمركبات غالبة في الزيوت األساسي α-elemolومن مركب (4.21٪)

لتثبيط حساسية األكثر هي staphylococcus aureus بكتيريا أنواع من ثمانية ضد تم للبكتيريا المضاد النشاط

.ملم 21 قطرها بمساحة

diphenyl-1-picrylhydrazyl-2,2 تجربة باستخدام تقييمها تم العطري الزيت لألكسدة المضادة النشاط

(DPPH) وréduction de fer (FRAP) كاآلتي النتائج: IC50 58.6336 ±0، 7207 و مل/ ميكروغرام

EC50 :48.1936 ± 0.5628 مل/ ميكروغرام

Alternaria arborescens, fusarium salani, Fusarium على للفطريات المضادة دراسة

moniliforme, Fusarium oxysporum, et Stemphylium solani ، ضعيفة نتائج ت الى وجودوأفاد.

ضد الفعالية ; االكسدة ضد الفعالية ; الجراثيم ضد الفعالية ; األساسية المفتاحية: الزيوتالكلمات

; Teucrium polium aurasianum ; GC/MS الفطريات

Abstract

This work is part of the valuation of the Algerian medicinal plants known for their therapeutic

properties; we are interested in the study of the plant Teucrium polium Labiatae known for its

richness in active material used by the local population in various therapies

This work is dedicated on the one hand, to the extraction of essential oils, the influence of

drying in the shade on the extraction yield and the identification of the chemical composition

of which the objective is to study biological activities including antimicrobial activity,

antifungal activity and the antioxidant activity of essential oils from medicinal plant Teucrium

polium Labiatae, and secondly to highlight these activities.

We performed the extraction of essential oils from the aerial part of the plant by the technique

of steam distillation. The resulting extraction yield is 0.585%. The essential chemical

composition of the oil was analyzed by GC / MS and 35 components were identified; limonene

(34.72%), the α-pinene (25.42%), the β-pinene (8.59%), the α-elemol (4.21%) were the

majority components

The antibacterial activity was measured against eight bacteria Staphylococcus aureus is the

most sensitive to inhibition of 21 mm diameter. The antioxidant activity of the essential oil was

evaluated using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) test and power reduction iron

antioxidant (FRAP) results give : IC50 of 58.6336 ± 0, 7207 mcg / ml and EC50 48.1936 ±

0.5628

The antifungal study on stem Alternaria arborescens, fusarium salani, Fusarium moniliforme,

Fusarium oxysporum, et Stemphylium solani, also reported a weak results.

Keywords: Essential oils; Teucrium Polium Labiatae; GC / MS; antibacterial activity;

antifungal activity; Antioxidant Activity.

Résumé

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation des plantes médicinales algériennes réputées

pour leurs vertus thérapeutiques, nous sommes intéressés à l’étude de la plante Teucrium polium

Labiatae connue par sa richesse en matière active utilisée par la population locale dans

différents thérapies

Le présent travail est consacré d’une part, à L’extraction des huiles essentielles, l’influence du

séchage à l’ombre sur le rendement d’extraction et l’identification de la composition chimique

dont l’objectif visé est d’étudier les activités biologiques dont l’activité antimicrobienne,

l’activité antifongique et l’activité antioxydante des huiles essentielles de la plante médicinale

Teucrium polium Labiatae, et de l’autre part de mettre en évidence ces activités.

Nous avons procédé l’extraction des huiles essentielles de la partie aérienne de la plante par la

technique d’hydrodistillation. Le rendement d’extraction obtenu est de 0,585 %. La

composition chimique de l'huile essentielle a été analysé par GC / MS et 35 composants ont été

identifiés ; le limonène (34,72 %), l’α-pinène (25,42 %), le β-Pinène (8,59 %), le α-Elemol

(4,21 %) sont les composants majoritaire

L’activité antibactérienne, a été dosée contre huit bactéries le staphylococcus aureus est le plus

sensible de 21 mm de diamètre d’inhibition. L'activité antioxydante de l'huile essentielle a été

évaluée en utilisant 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) essai et le pouvoir antioxydant de

réduction de fer (FRAP) les résultats donnent : IC50 de 58,6336±0,7207 µg/ml et EC50

48.1936±0.5628

L’étude antifongique sur les souches Alternaria arborescens, fusarium salani, Fusarium

moniliforme, Fusarium oxysporum, et Stemphylium solani, a signalée des faibles résultats.

Mots clés : Huiles essentielles ; Teucrium Polium Labiatae; GC/MS ; Activité antibactérienne ;

Activité antifongique ; Activité antioxydante.,

Liste des Tableaux

Tableau 1 Place dans la classification systématique botanique 27

Tableau 2 Propriétés organoleptiques de l'HE de Teucrium polium aurasianum. 48

Tableau 3 Analyses physico-chimique de HE de Teucrium polium aurasianum. 48

Tableau 4 Composition chimique de HE de Teucrium polium ssp aurasianum 51

Tableau 5 Activité antioxydante par la méthode de DPPH 54

Tableau 6 Activité antioxydante par la méthode de FRAP 56

Tableau 7 Activité antibactérienne des huiles essentielles de Teucrium polium

aurasianum

56

Liste des figures

Figure 1 Provenance des huiles essentielles en fonction des différentes parties de

plantes.

07

Figure 2 Structure chimique de quelques monoterpènes extraits des H.E. 08

Figure 3 Structure chimique de quelques sesquiterpènes extraits des H.E. 09

Figure 4 Structure chimique de quelques composés aromatiques extraits des

H.E.

09

Figure 5 Montage d'extraction par Hydrodistillation. 14

Figure 6 Montage d'extraction par entraînement à la vapeur d'eau. 14

Figure 7 Montage d'extraction par hydrodiffusion 15

Figure 8 Montage d'extraction par L'expression à froid 16

Figure 9 Montage d'extraction par micro- ondes 18

Figure 10 Organigramme d’identification des huiles essentielles par CPG et

CPG-SM

21

Figure 11 Sites d’action des huiles essentielles sur la cellule bactérienne 23

Figure 12 Teucrieum polium ssp aurasianum 29

Figure 13 Plan général de la partie expérimentale 34

Figure 14 La plante étudiée Teucrieum polium ssp aurasianum 35

Figure 15 Protocole expérimental de l’essai d’activité antifongique de chaque

huile essentielle de Teucrium polium aurasianum

44

Figure 16 Variation du rendement des huiles essentielles et la perte de poids de la

plante Teucrium polium aurasianum au cours du temps de séchage.

46

Figure 17 Chromatogramme en GC/SM de HE de Teucrium polium ssp

aurasianum

50

Figure 18 Distribution des composants majoritaire de HE de Teucrium polium

ssp aurasianum

52

Figure 19 les composants majoritaires de L’HE de Teucrium polium ssp

aurasianum

52

Figure 20 Activité antiradicalaire des huiles essentielles Teucrium polium

aurasianum et l’acide ascorbique

54

Figure 21 Réduction du fer par huile essentielle de Teucrium polium aurasianum

et l’acide ascorbique

55

Figure 22 Exemples des mécanismes de résistance aux antibiotiques 58

Figure 23 Effet d’huile essentielle de Teucrium polium ssp. aurasianum Labiatae

sur les souches fongiques.

59

Figure 24 Cinétique de croissance mycélienne en fonction de temps et de la

concentration des huiles essentielles de Teucrium polium ssp.

aurasianum Labiatae

60

Figure 25 Taux d’inhibition des souches en fonction de la concentration 60

Figure 26 Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de l'augmentation de

la concentration d’huile essentielle de Teucrium polium ssp.

aurasianum Labiatae

61

Liste des abréviations

AFNOR Association française de normalisation

EC50 Concentration efficace qui réduite le Fer dans une absorbance de 0,5

Cm Centimètre

CMI Concentration minimale inhibitrice

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil

DMSO Dimethyl sulfoxide

FRAP Ferrique reducing antioxydant power

GC/MS Chromatographie en phase gazeuse couplée au spectromètre de masse

°C Degrés Celsius

G Gramme

HE Huile essentielle

Ia Indice d’acide

IC50 Concentration inhibitrice à 50%

IR Indice de rétention

MHA Mueller–Hinton

Min Minute

Ml Millilitre

Mm Millimètre

PDA Potato dextrose agar

pH Potentiel d’Hydrogène

Tr Temps de rétention

UFC Unité Formant Colonie

µ Micro

Sommaire

Introduction 01

Partie I Synthèse bibliographique

Chapitre I : Les huiles essentielles

I - Huiles essentielles Généralités 4

I.1- Définition et historique 4

I.1.1- Définition 4

I.1.2- Historique 4

I.2- Localisation des huiles essentielles 6

I.3- Rôle des huiles essentielles 7

I.4- Composition des huiles essentielles 8

I.4.1- Les terpénoïdes 8

I.4.2- Les composés aromatiques 9

I.4.3- Les composés d'origines diverses 10

I.4.4- Les chémotypes 10

I.5- Biosynthèse des huiles essentielles 11

I.5.1- Voie des Terpenoïdes 11

I.5.2- Voie des Phenylpropanoïdes 11

I.6- Facteurs de variabilité 11

I.6.1 Origine botanique 12

I.6.2 L’organe producteur 12

I.6. 3 Origine géographique 12

I.7- Obtention des huiles essentielles 12

I.7.1- Principales méthodes d'extraction 12

I.7.1.1- L'entraînement à la vapeur d'eau 13

I.7.1.2- L'hydrodistillation 13

I.7.1.3- La distillation à vapeur saturée (La méthode de Parnas-Wagner) 14

I.7.1.4- L'hydrodiffusion 15

I.7.1.5- L'expression à froid 15

I.7.2.6- Extraction par solvants 16

I.7.2.7- Extraction par les corps gras 17

I.7.2.8- Extraction par micro- ondes 17

I.8- Méthodes d'analyse et contrôle de la qualité 18

I.8.1- Analyses des caractéristiques physico-chimiques 18

I.8.2- Analyse de la composition chimique 19

I.8.2.1- Principe de fonctionnement de la chromatographie en phase gazeuse (CPG). 19

I.8.2.2- Chromatographie en phase gazeuse/Spectrométrie de masse (CPG/SM) 20

I.9- Utilisation des huiles essentielles 21

I.9.1- La voie orale 21

I.9.2- La voie respiratoire 21

I.9.3- La voie cutanée 22

I.10- Action biologique, effets thérapeutiques 22

I.10.1- Activité antimicrobienne des huiles essentielles 22

I.10.2- Activité antifongique 24

I.10.3- Activité antioxydante 24

I.11- Toxicité des huiles essentielles 25

I.11.1- Toxicité par voie orale : 26

I.11.2- Toxicité dermique 26

I.11.3- Cytotoxicité 26

I.11.4- Neurotoxicité : 26

Chapitre II : Etude botanique sur la plante Teucrium polium aurasianum

II.1- Données botaniques et pharmacologiques de l’espèce étudiée 27

II.1.1- Place dans la classification systématique botanique 27

II.1.2- Les Lamiales 27

II.1.3- La famille des Lamiacées 28

II.1.4 - Caractères généraux des Lamiacée 28

II.1.5- Description botanique 29

II.1.6- Synonymes 30

II.1.7- Répartition géographique 30

II.1.8-Propriétés d’utilisations traditionnelles et médicales 30

II.2- Travaux antérieurs 31

II.2.1- Composition chimique 31

II.2.2- Les activités biologique 31

II.2.2.1-Anti-nociceptive, antispasmodique 31

II.2.2.2-Antidiabétique 32

II.2.2.3-Antifongique 32

II.2.2.4-Antipyrétique, Antimicrobien 32

II.2.2.5-Cytotoxique 32

Deuxième partie : Partie expérimentale

Chapitre III : Matériels et méthodes

III.1- Cadre d’étude 33

III.2- Matériel végétal 35

III.3- Extraction des huiles essentielles 35

III.4- Caractérisation des huiles essentielles 36

III.4.1- Analyses physico-chimiques 36

III.4.1.1- Le rendement 36

III.4.1.2- Indice de réfraction 36

III.4.1.3- Indice d'acide 37

III.4.1.4- Variation de la Densité 38

III.4.1.5- Potentiel d’hydrogène (pH) 38

III.4.2- Analyses par chromatographie en phase gazeuse couplé à spectromètre de

masse GC/MS

38

III.5- Activités biologique 39

III.5.1- Activité antibactérienne 39

III.5.1.1- Souches bactériennes 39

III.5.1.2- Tests d’activités antimicrobiennes 39

III.5.1.3- Principe de l'antibiogramme : 39

III.5.1.4- Préparation des boîtes de gélose (J-24H) 39

III.5.1.5- Détermination de CMI 40

III.5.2- Activité antioxydante 41

III.5.2.1- Méthode de DPPH 41

III.5.2.2- Méthode de la réduction du fer FRAP (Ferric reducing antioxidant power) 42

III.5.3- Activité antifongique 42

III.5.3.1- Souches fongiques testées 42

III.5.3.2- Méthode de contact direct 42

III.5.3.3- Paramètres étudiés dans l’activité antifongique 44

Chapitre IV : Résultats et discussions

IV.1- Rendement d’extraction 46

IV.2- Effet du séchage sur le rendement des huiles essentielles 46

IV.3- Analyses physico-chimique et organoleptiques 48

IV.3.1- Caractéristiques organoleptiques 48

IV.3.2- Caractéristiques physico-chimiques 48

IV.4- Détermination de la composition chimique de HE 49

IV.5- Activités biologiques 53

IV.5.1- Activité antioxydante 53

IV.5.1.1- Mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH* 53

IV.5.1.2- Méthode de la réduction du fer FRAP 55

IV.5.2- Activité antibactérienne 56

IV.5.3- Activité antifongique 59

IV.5.3.1- Les croissances mycéliennes 59

IV.5.3.2- La cinétique de croissance mycélienne 60

IV.5.3.3-Taux d'inhibitions (TI) 60

IV.5.3.3- Vitesse de la croissance mycélienne 61

Conclusion 63

Références bibliographiques 65

Annexes 72

Publications 85

Introduction

----------------------------------------------------------------------Introduction

1

Introduction

La plupart des grands médecins du passé sont des phytothérapeutes[1]. C’est pour ça l'Homme

est toujours soigné par les plantes, de manière empirique, guidé par la tradition ou les coutumes.

L’utilisation thérapeutique des plantes (phytothérapie) est très ancienne mais elle connaît

actuellement un regain d’intérêt auprès du public. Il est possible d’utiliser les plantes entières

ou les extraits qu’elles fournissent.

Selon l’organisation mondiale de la santé (O.M.S); la médecine traditionnelle se définit comme

l’ensemble de toutes les connaissances pratiques explicables ou non pour diagnostiquer ou

éliminer un déséquilibre physique, mental en s’appuyant exclusivement sur l’expérience vécue

et l’observation, transmises de génération en génération (oralement ou par écrit)[2].Selon

(OMS), 60 % de la médecine traditionnelle en Afrique utilise plus de 4000 plantes médicinales,

et près de 6377 espèces de ces plantes.

La flore Algérienne est caractérisée par sa diversité florale, plus de 3000 espèces appartenant

à plusieurs familles botaniques, distribué comme suit : méditerranéenne, saharienne et une

flore subtropicale. Ces espèces sont pour la plupart spontanées avec un nombre non

négligeables (15%) d'espèces endémiques[3]. L'investigation de ces espèces représente un

potentiel inestimable pour la découverte de nouvelles substances.

Chacune de ces plantes peut contenir des centaines voire des milliers de métabolites

secondaires, ou de principes actifs qui peuvent produire différentes actions physiologiques sur

le corps humain[4].

La popularité dont jouissent depuis longtemps les huiles essentielles et les plantes aromatiques

en général reste liée à leurs propriétés médicinales en l'occurrence les propriétés anti-

inflammatoires, antiseptiques, antivirales, antifongiques, bactéricides, antitoxiques,

insecticides et insectifuges, tonifiantes, stimulantes, calmantes, etc.[5, 6].

Les mots nature ou naturellement ne sont pas forcément signifier la sécurité. Les huiles

essentielles sont des substances très actives et par ailleurs elles peuvent être toxiques. Leur

toxicité est liée à la présence de certains sites fonctionnels oxygénés[7]

----------------------------------------------------------------------Introduction

2

Selon Hostettmann[8], connaître une plante ayant des vertus médicinales suppose pouvoir

décrire sa morphologie et son anatomie, connaître son origine et son mode d'action, apprécier

l'incidence de ceux-ci sur sa qualité, analyser sa composition chimique et les facteurs qui

peuvent la faire varier, aussi bien que leur activité pharmacologique, savoir apprécier la qualité

par des éléments objectifs et mettre en œuvre des méthodes pour la contrôler,

La maîtrise de tous ces paramètres ne peut se faire qu'avec un concours de plusieurs disciplines,

chacune apportant une contribution suivant sa spécialité.

Cette étude s’intègre dans le contexte global de la mise en valeur de la biodiversité des plantes

aromatiques et médicinales Algérienne en général, et de l’espèce du genre Teucrium Polium

ssp aurasianum en particulier, pour leurs propriétés médicinales, alimentaires et conservatrices.

Le travail qui nous a été confié consiste à approfondir la connaissance de cette espèce et à la

valoriser.

Pour cela, nous avons attachez une étude chimique consiste à des analyses (physico-chimiques,

composition chimique) et étude biologique représenté dans les différentes activités

(antimicrobiennes, antifongiques et antioxydantes)

Le travail présent est composé de deux parties :

Dans la première partie, nous avons abordés, l'état des connaissances bibliographiques incluant

une généralité sur les huiles essentielles et une présentation botanique de la famille de Lamiacée

et de l’espèce Teucrium polium aurasianum et leur usages

- La première partie passe en revue les généralités sur les huiles essentielles et la description

botanique d’espèce étudiée,

La deuxième partie s'articule au matériel et méthodes utilisées, tel que :

L’extraction de l’huile essentielle d’espèce végétale étudiée Teucrium polium ssp

aurasianum

L’analyses physico-chimiques et détermination de la composition chimique des huiles

essentielles par GC/MS

Les activités biologiques telles que les tests antibactériennes, les tests antifongiques et

détermination de leur CMI et tests antioxydantes qui font par deux méthodes

----------------------------------------------------------------------Introduction

3

Et en fin résultats et discussions et interprétations scientifiques de ces résultats et une

conclusion générale.

Partie I

Synthèse

bibliographique

Chapitre I :

Les huiles essentielles

Chapitre I----------------------------------------------------------Les huiles essentielles

4

I - Huiles essentielles : Généralités

I.1- Définition et historique

I.1.1- Définition

Il y a plusieurs définitions disponibles d'une huile essentielle convergent sur le fait que les huiles

essentielles, Une huile essentielle est définie comme un produit obtenu à partir d’une matière

première d’origine végétale, après séparation de la phase aqueuse par des procédés physiques.

La pharmacopée européenne[9] défini les huiles essentielles comme : « Produit odorant,

généralement de composition complexe, obtenu à partir d’une matière première végétale

botaniquement définie, soit par entraînement par la vapeur d’eau, soit par distillation sèche, ou

par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L’huile essentielle est le plus souvent

séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n’entraînant pas de changement

significatif de sa composition »

Selon l’AFNOR (l’Association Française de Normalisation ), [10]ce sont des produits

généralement odorants, obtenus soit par entraînement à la vapeur d’eau, de végétaux ou de

parties de végétaux, soit par expression du péricarpe frais de certaines citrus. Cette définition

excluant les essences obtenues par d’autres procédés d’extraction.

Les huiles essentielles sont des mélanges de nombreux composés qui sont des molécules peu

complexes comme les terpènes, les phénols, les méthyle-éthers, les oxydes, les esters, et les

cétones…[11]

Elles ont des applications importantes en médecine soit par leur qualité odorante soit pour

soulager la douleur ou pour leur efficacité physiologique [12]

I.1.2- Historique

L'utilisation des huiles essentielles sont des fins diverses depuis des millénaires, les plantes

aromatiques ont toujours été tenues en haute estime par les thérapeutes du monde entier.

L’histoire des (P.A.M.) plantes aromatiques et médicinales est lie à l’évolution des

civilisations. L’histoire des peuples montre que ces plantes ont toujours une importance en

médecine, dans la composition des parfums et dans les préparations culinaires.

Les premières preuves de fabrication et d’utilisation des huiles essentielles H.E datent de l’an

3000 avant J.C [13]

Il semble donc que les huiles essentielles accompagnés la civilisation humaine depuis ses

premières genèses.


5

Les grands berceaux géographiques de la civilisation aromatique sont l'Inde, la Chine et le

bassin méditerranéen. Ces berceaux ont donné à l'humanité des connaissances dans le domaine

des huiles essentielles dont la validité est toujours d'actualité.

dans l'ouvrage " Aromathérapie ", de GATTEFOSSE En 1931, a décrit ses expériences et ses

découvertes, il fut le premier à démontrer les relations entre la structure et l’activité des

molécules aromatiques et à établir les grandes propriétés des arômes naturels comme étant

antitoxiques, antiseptiques, tonifiantes, stimulantes, calmantes, etc [14].

A cette époque Il a prédit que les huiles essentielles réserve un rôle important dans cette thérapie

à l'avenir ; c'est bien ce que l'on constate aujourd'hui.

Selon NTEZURUBANZA [15], l'histoire de l'aromathérapie, qui est celle des huiles

essentielles, peut se résumer en quatre époques suivantes :

- L'époque au cours de laquelle étaient utilisées des plantes aromatiques telles quelles ou sous

forme d'infusion ou de décoctions.

- Celle dans laquelle les plantes aromatiques étaient brûlées ou mises à infuser ou à macérer

dans une huile végétale. A cette époque, intervient la notion d'activité liée à la substance

odorante

- La troisième correspond à la recherche de l'extraction de cette substance odorante. Il apparaît

le concept " Huile essentielle " qui aboutit à la création et au développement de la distillation.

- En fin, la dernière qui est la période moderne dans laquelle les connaissances des composants

des huiles essentielles intervient et explique les effets physiques, chimiques, biochimiques, et

physiologiques.

Au cours des dernières années, l'Amérique du Nord a montré un grand intérêt à l'utilisation des

plantes médicinales pour plusieurs raisons :

- Elles sont moins coûteuses par rapport aux médicaments de synthèse.

- La médecine moderne n'arrive pas à trouver des remèdes à tous les maux. Voilà ce qui rend

le public se sent déçu et recourir aux plantes médicinales.

- Enfin, les preuves scientifiques de la valeur médicinale des plantes constituent d'ailleurs un

argument de taille pour leur usage en médecine.


6

En 1990, le livre "Aromathérapie exactement " de FRACHOMME et PENOËL[16] évoque

le terme de "la médecine aromatique" qui contenant les chémotypes et les indications

thérapeutiques reposant sur les bases scientifiques.

Ainsi, l'industrie des plantes médicinales est devenue, en peu de temps, le secteur de l'industrie

pharmaceutique connaissant la plus forte croissance annuelle, soit 15 à 20%[17]

I.2- Localisation des huiles essentielles

Les huiles essentielles se rencontrent dans tout le règne végétal. Cependant elles sont

particulièrement abondantes chez certaines familles [18]: Conifères, Rutacées, Ombellifères,

Myrtacées, Lamiacées, Poacées. Tous les organes peuvent en renfermer, surtout les sommités

fleuries (lavande, menthe...), mais on en trouve dans les racines ou rhizomes (vétiver,

gingembre), dans les écorces (cannelles), le bois (camphrier), les fruits (poivres), les graines

(Muscade).


7

Figure 1: Provenance des huiles essentielles en fonction des différentes parties de

plantes.

I.3- Rôle des huiles essentielles

Les plantes les utilisent pour se protéger contre les virus et tous pensent qu’il s’agit d’hormones

végétales. D’autres considèrent que les huiles sont des messagers entre sorte de parasites et de

microbes[19] ; des travaux ont montré que les monoterpènes et les sesquiterpènes peuvent jouer

des rôles importants dans la relation des plantes avec leur environnement. Par exemple, le 1,8-

cinéole et le camphre inhibent la germination des organes infectés ou la croissance des agents

pathogènes issus de ces organes[20, 21]


8

I.4- Composition des huiles essentielles

L'étude de la composition chimique des huiles essentielles montre qu'il s'agit de mélanges

complexes et variables de constituants est due exclusivement à deux groupes caractérisés par

des origines biogénétiques sont : les terpénoïdes et les composés aromatiques dérivés du

phenylpropane[22].

I.4.1- Les terpénoïdes

Le terme terpène rappelle la toute première extraction de ce type de composé dans l'essence de

térébenthine. Les terpénoïdes Dans les huiles essentielles, sont celles qui ont la masse

moléculaire n'est pas élevée c'est à dire, ceux dont les molécules les plus volatils. Ils portent

dans la plupart des cas la formule générale (C5H8)n. Suivant les valeurs de n, on a les

hémiterpènes (n =1), les monoterpènes (n=2), les sesquiterpènes (n=3), les triterpènes(n=6), les

tétraterpènes (n=8) et les polyterpènes. Les constituants des huiles essentielles sont très

variés .On y trouve en plus de terpènes, des hydrocarbures, des esters, des lactones, des

aldéhydes, des alcools, des acides, des cétones, des phénols, des oxydes et autres[22].

Figure 02 : Structure chimique de quelques monoterpènes extraits des H.E.


9

Figure 03 : Structure chimique de quelques sesquiterpènes extraits des H.E.

I.4.2- Les composés aromatiques

Contrairement aux dérivés terpéniques, les composés aromatiques sont moins de présence dans

les huiles essentielles. Mais il est considéré comme un ensemble important car ils sont

généralement responsables des caractères organoleptiques des huiles essentielles. Très souvent,

il s'agit d'allyle et de propénylphénol. Nous pouvons citer comme exemple l'eugénol qu’est

responsable de l'odeur du clou du girofle[22].

Figure 04 : Structure chimique de quelques composés aromatiques extraits des H.E.


10

I.4.3- Les composés d'origines diverses

Compte tenu de leur mode d'extraction, les huiles essentielles peuvent renfermer divers

composés aliphatiques, généralement de faible masse moléculaire, entraînables lors de l'hydro

distillation. Ces produits peuvent être azotés, soufrés, des carotènes ou des acides gras [22].

Alcools : Menthol, géraniol, linalol,...

Aldéhydes : Géranial, citronellal,...

Cétones : Camphre, pipéritone

Phénols: Thymol, carvacrol ...

Esters : Acétate de géranyle,...

Acides : Acide géranique,...

Oxydes : 1,8-cinéole,...

Phénylpropanoïdes ; Eugénol.

Terpènes : Limonène, para-cymène,...

Autres : Ethers, composés soufrés, composés azotés, sesquiterpène,...

I.4.4- Les chémotypes

La connaissance des chémotypes d'une huile essentielle et leur comportement est nécessaire car

elle permet de concevoir l'activité pharmacologique, de prévoir aussi la pharmacocinétique et

la biodisponibilité.

La composition chimique de l'huile essentielle pour une même espèce botanique n'est pas

immuable. Les huiles essentielles sont élaborées par les plantes aromatiques au sein des cellules

sécrétrices. Leur élaboration est dépend entièrement du rayonnement solaire Son absence

affecte le rendement des produits aromatiques et leur nature. En sa présence, et tout

particulièrement en fonction de la présence de tel ou tel rayonnement, les types de composants

pourront varier considérablement au sein d'une même espèce. Par exemple, le basilic cultivé en

pleine lumière à Madagascar a un taux de chavicol de 57% alors que la même plante cultivée à

l'abri de la lumière en contient 74%[16]. Cette variabilité peut être influencée également par la


11

composition du sol et la position géographique; le Lippia mutiflora récoltée au Togo a révélé

les chémotypes à citral, à thymol (acétate de thymyle), à para-cymène, à 1 -8 cinéole[23].

I.5- Biosynthèse des huiles essentielles

La biosynthèse des huiles essentielles se fait suivant deux principales voies[18] :

I.5.1- Voie des Terpenoïdes

Le matériau de base est l'IPP (isopentylpyrophosohate), molécule à cinq atomes de carbones

ayant une structure semi- alvéolaire. Il est dérivé de l'Acétyl CoA (carrefour important), lui-

même issu du PEP (phosphoenolpyrivate) provenant directement du fructose. La construction

des squelettes hydrocarbonés a lieu de la même manière par la juxtaposition "tête à queue"

d'unités isopréniques, unités pentacarbonés ramifiées assemblées enzymatiquement. Ainsi on

trouve des squelettes hydrocarbonés à dix carbones (monoterpènes), puis à quinze carbones

(sesquiterpènes) et plus rarement, à vingt carbones (diterpènes). Le processus peut se poursuivre

mais dans d'autres buts que la synthèse des essences.

I.5.2- Voie des Phenylpropanoïdes

La synthèse des huiles essentielles par la voie des phenylpropanoïdes commence par un

métabolite du fructose, le PEP (phosphoenolpyrivate). Elle aboutit à un très grand nombre de

substances aromatiques, via une série d'acides, dont l'acide shikimique (d'où son nom, voie

shikimique) et l'acide cinnamique. Les métabolites terminaux, importants en thérapeutique, sont

les acides aromatiques suivants: acides salicylique, cinnamique et benzoïque et leurs esters dont

la salicylate de methyle, les cinnamates, les benzoates, certains phénols (eugénol) ainsi que les

coumarines,... Quelques grandes familles chimiques de molécules non volatiles, comme les

tannoïdes et les flavonoïdes, se trouvent incluse dans cette voie[24]

I.6- Facteurs de variabilité

Des travaux de recherche ont preuvé que la composition chimique des huiles essentielles est

très fluctuante. En effet, elle dépend de deux grands axes; ordre naturel (génétique, localisation,

maturité, sol, climat, etc…) ou technologiques (mode de culture ou d’extraction d’huile

essentielle de la plante), dont nous citons les plus importants:


12

I.6.1 Origine botanique

La composition d’une H.E varie en fonction de l’espèce productrice. En effet, l’extraction de

l’H.E d’un même organe de deux plantes différentes ne donne pas la même composition

chimique[25, 26] ,par exemple deux espèces de sauge : la sauge officinale (Salvia officinalis)

et la sauge sclarée (Salvia sclarea), Et cela peut être vendu à la fois sous le nom de l'huile de

sauge. La première, riche en cétones neurotoxiques, peut provoquer des crises d’épilepsie, alors

que la seconde possède des esters aromatiques anti-épileptisants[27].

I.6.2 L’organe producteur

La composition et le rendement d’une huile essentielle varient selon la partie de la plante à

partir de laquelle est extraite[28].

I.6. 3 Origine géographique

Cela permet de connaître l’environnement dans lequel grandit la plante et de caractériser ainsi

l’huile essentielle obtenue. Il y a des différences de composition chimique selon le pays

d’origine.

La composition chimique des huiles essentielles d’une même plante grandissant dans des lieux

différents avec changement de situation géographique (altitude et latitude), avec variation de la

nature du sol peut être différente [29]. Par exemple, le thym vulgaire à géraniol ne produit cette

molécule de géraniol qu’en hiver alors que l’acétate de géranyl la remplacera en été[30].

I.7- Obtention des huiles essentielles

Plusieurs méthodes existent pour extraire les huiles essentielles. Elles sont basées

principalement sur l'entraînement à la vapeur, l'expression, la solubilité et la volatilité. Le choix

de la méthode la mieux adaptée se fait en fonction de plusieurs paramètres tel que la nature de

la matière végétale à traiter, des caractéristiques physico-chimiques de l'essence à extraire, et

l'usage de l'extrait et l'arôme du départ au cours de l'extraction[31].

I.7.1- Principales méthodes d'extraction

Il existe plusieurs méthodes de distillation dont voici les principales :


13

I.7.1.1- L'entraînement à la vapeur d'eau

La plupart des composés volatils contenus dans les végétaux sont entraînables par la vapeur

d'eau; parce que leur point d'ébullition est relativement bas et a partir de leur caractère

hydrophobe ; Nous pouvons utiliser Les méthodes d'extraction par l'entraînement à la vapeur

d'eau. Sous l'action de la vapeur d'eau introduite ou formée dans l'extracteur, l'essence se libère

du tissu végétal et entraînée par la vapeur d'eau. Le mélange de vapeurs est condensé sur une

surface froide et l'huile essentielle se sépare par décantation[32].

En fonction de sa densité, elle peut être recueillie à deux niveaux:

- Au niveau supérieur du distillat, si elle est plus légère que l'eau.

- Au niveau inférieur, si elle est plus dense que l'eau.

Les principales variantes de l'extraction par l'entraînement à la vapeur d'eau sont

l'hydrodistillation, la distillation à vapeur saturée et l'hydrodiffusion.

I.7.1.2- L'hydrodistillation

Le principe de l'hydrodistillation (La méthode de Moritz) est celui de la distillation des

mélanges binaires non miscibles. Elle consiste à immerger la biomasse végétale dans un

alambic rempli d'eau, que l'on porte ensuite à l'ébullition. La vapeur détruit la structure des

cellules végétales, libère les molécules contenues et entraîne les plus volatiles en les séparant

du substrat cellulosique. La vapeur, chargée de l’essence de la matière première distillée, se

condense dans le serpentin de l’alambic avant d'être récupérée dans un essencier (vase de

décantation pour les huiles essentielles). Les parties insolubles dans l’eau de condensation

sont décantées pour donner l’huile essentielle surnageant. La partie contenant les composés

hydrosolubles est appelée eau de distillation (ou hydrolat).


14

Figure 05 : Montage d'extraction par Hydrodistillation.

I.7.1.3- La distillation à vapeur saturée (La méthode de Parnas-Wagner)

La distillation à vapeur saturée est la méthode la plus utilisée à l'heure actuelle dans l'industrie

pour l'obtention des huiles essentielles à partir de plantes aromatiques ou médicinales. Dans

cette méthode, la matière végétale n'est pas en contact avec l'eau. La vapeur d'eau est injectée

au travers de la masse végétale disposée sur des plaques perforées. En général, elle est pratiquée

à la pression atmosphérique ou à son voisinage et à 100°C, température d'ébullition d'eau.

Les principes volatils sont entrainés par les vapeurs d’eau puis refroidis et enfin séparés de la

phase par décantation[33, 34].

Figure 6: Montage d'extraction par entraînement à la vapeur d'eau.


15

I.7.1.4- L'hydrodiffusion

Elle a été développée par la firme Suisse Schmidt [35] qui consiste à pulser de la vapeur d’eau

à très faible pression (0,02-0,15 bar) à travers la masse végétale, du haut vers le bas. la méthode

permet d'extraire des produits avec de composition sensiblement identique à celle des produits

obtenus par les méthodes classiques. Le procédé permet aussi un gain de temps et d’énergie,

et évite un grand nombre d'artéfacts liés à une température excessive. En fait, ce procédé

correspond à la percolation en phase vapeur.

Figure 7: Montage d'extraction par hydrodiffusion

I.7.1.5- L'expression à froid

L'extraction par expression est souvent utilisée pour extraire les huiles essentielles des agrumes

comme le citron, l'orange, la mandarine, etc. Son principe consiste à rompre mécaniquement

les poches à essences. L'huile essentielle est séparée par décantation ou centrifugation. D'autres

machines rompent les poches par dépression et recueillent directement l'huile essentielle, ce qui

évite les dégradations liées à l'action de l'eau.


16

Figure 8: Montage d'extraction par L'expression à froid

I.7.1.6- Extraction par solvants

Cette méthode est utilisée pour les organes végétaux présentant une faible concentration en

essence ou pour les essences que l’on ne peut extraire par distillation. Les essences étant de

nature huileuse, ils sont solubles dans les solvants organiques. Un épuisement des plantes est

effectué à l’aide d’un solvant volatil dont l’évaporation laisse un résidu cireux, très coloré et

très aromatique appelé «concrète»[36, 37]. On utilise comme solvant organique volatil

l’hexane, qui est le plus utilisé actuellement; le benzène très utilisé dans le passé mais interdit

pour des raisons de toxicité ; le propane ; le toluène, etc... [38, 39]. L’extraction passe par

plusieurs étapes, on lave la matière avec le solvant deux à trois fois. Il semble que la presque

totalité des produits odorants passe en solution dès la première extraction. Mais, il est nécessaire

de pratiquer des dilutions successives avec de nouvelles charges de solvant (lavages) car la

matière traitée retient une forte proportion de la solution. La matière épuisée retient une

proportion importante de solvant. Il faut donc concentrer la solution en évaporant le solvant qui

est recyclé pour d'autres lavages. La récupération du solvant atteint couramment

94 à 96 % de la quantité retenue[40]. De ce fait une proportion résiduelle de solvants reste dans

les concrètes d’où un risque de toxicité non négligeable[41]. Pour cette raison, cette technique

est limitée à l’industrie des parfums.


17

I.7.1.7- Extraction par les corps gras

La méthode d'extraction par les corps gras est utilisée en fleurage dans le traitement des parties

fragiles de plantes telles que les fleurs, qui sont très sensibles à l'action de la température. Elle

met à profit la liposolubilité des composants odorants des végétaux dans les corps gras. Le

principe consiste à mettre les fleurs en contact d'un corps gras pour le saturer en essence

végétale. Le produit obtenu est une pommade florale qui est ensuite épuisée par un solvant

qu'on élimine sous pression réduite. Dans cette technique, on peut distinguer l'enfleurage où la

saturation se fait par diffusion à la température ambiante des arômes vers le corps gras et la

digestion qui se pratique à chaud, par immersion des organes végétaux dans le corps gras[42].

I.7.1.8- Extraction par micro- ondes

Le procédé d'extraction par micro-ondes appelée Vacuum Microwave Hydrodistillation

(VMHD) Consiste à extraire l'huile essentielle à l'aide d'un rayonnement micro-ondes d'énergie

constante et d'une séquence de mise sous vide. Seule l'eau de constitution de la matière végétale

traitée entre dans le processus d'extraction des essences. Sous l'effet conjugué du chauffage

sélectif des micro-ondes et de la pression réduite de façon séquentielle dans l'enceinte de

l'extraction, l'eau de constitution de la matière végétale fraîche entre brutalement en ébullition.

Le contenu des cellules est donc plus aisément transféré vers l'extérieur du tissu biologique, et

l'essence est alors mise en oeuvre par la condensation, le refroidissement des vapeurs et puis la

décantation des condensats. Cette technique présente les avantages suivants: rapidité, économie

du temps d'énergie et d'eau, extrait dépourvu de solvant résiduel[42, 43].


18

Figure 9: Montage d'extraction par micro- ondes

I.8- Méthodes d'analyse et contrôle de la qualité

En raison de l'importance industrielle des huiles essentielles, leur qualité s'impose depuis le

producteur, en passant par l'industriel jusqu'au consommateur. Cette exigence se traduit

nécessairement par l'établissement de normes de qualité, élaborées pour des considérations de

santé et de sécurité dans différents domaines d'applications des huiles essentielles.

Normalement, les normes de qualité sont établies par les instances gouvernementales et servent

de référence. Dans le cas des huiles essentielles, ces normes ont été définies par l'Association

Française de Normalisation (AFNOR) et " Essential Oils Association" (EOA). Ainsi l'analyse

des huiles essentielles porte sur les caractéristiques physico-chimiques et la composition

chimique (AFNOR, 1999).

I.8.1- Analyses des caractéristiques physico-chimiques

Ces analyses concernent essentiellement les paramètres suivants :

- La densité,

- L'indice de réfraction,

- L'indice d'acide et l'indice d'ester.


19

A ces paramètres, on peut aussi ajouter les caractéristiques organoleptiques telles que l'aspect,

la couleur et l'odeur.

Nous pouvons confirmer que les huiles essentielles sont généralement liquides à la température

ambiante d'odeurs aromatiques rarement colorées quand elles sont fraîches. Leur densité est

plus souvent inférieure à celle de l'eau. Elles ont un indice de réfraction élevé et, le plus souvent,

sont doués d'un pouvoir rotatoire. Elles sont volatiles et entraînables par la vapeur d'eau, elles

lui communiquent leur odeur. Elles sont solubles dans l'alcool, l'éther, les huiles fixes et la

plupart de solvants organiques[44].

I.8.2- Analyse de la composition chimique

La connaissance de la composition chimique des huiles essentielles est très importante parce

qu'elles considérées comme une matière première destinée à divers secteurs d’activités tels que

la parfumerie, la cosmétique, l’industrie pharmaceutique et de l’agroalimentaire.

Plusieurs techniques et méthodes nous permet d'analyser quantitativement et qualitativement

les huiles essentielles. Parmi ces méthodes nous parlons sur les méthodes micro analytiques qui

permettent l’identification et le dosage des produits même à l’état de traces. Ces méthodes

consistent en l’utilisation des techniques de séparation et d’analyse des structures chimiques.

On peut utiliser les méthodes suivantes : CG, GC/MS, HPLC, RMN, IR, etc. ces méthodes

concernent l'identification qualitative et quantitative des différents constituants d'une huile

essentielle.

Parmi les méthodes d'analyse chromatographiques la méthode la plus utilisée dans le domaine

des huiles essentielles est La chromatographie en phase gazeuse. C'est une méthode de

séparation des composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans subir une

décomposition dont voici le principe ci-après :

I.8.2.1- Principe de fonctionnement de la chromatographie en phase gazeuse (CPG).

La CPG est basée sur le principe de la chromatographie de partage[45]. La phase stationnaire

étant un liquide non volatil réparti ou greffé sur un support inerte. La phase mobile est

constituée de gaz inerte (H2, N2, He). La solution est injectée au moyen d'une seringue soit

manuellement, soit avec un injecteur automatique qui permet d'obtenir une meilleure

reproductibilité. La température de La chambre d'injection est réglée telle que la vaporisation

de l’échantillon se fasse dans un temps le plus court possible. Type de colonne utilisée et de la

polarité de la phase stationnaire qui contrôlent La séparation des composés.


20

Après avoir choisi le type de colonne appropriée et un programme de température adéquat, la

détection des composés élués est obtenue par un détecteur FID (flamme ionisation détector -

détecteur à ionisation de flamme). Dans le cas des huiles essentielles, le FID est le détecteur le

plus cité dans la littérature. Pour d’autres applications particulières, recherche de pesticides par

exemple, les détecteurs de type ECD (détecteur à capture d’électron) ou TSD (détecteur termo-

ionique spécifique) sont les plus adaptés. Ces détecteurs sont très rarement utilisés pour

l'analyse des huiles essentielles en raison de leur grande sensibilité envers les atomes de chlore,

d’azote ou de phosphore, atomes qui sont peu fréquemment rencontrés dans celles-ci.

I.8.2.2- Chromatographie en phase gazeuse/Spectrométrie de masse (GC/SM)

La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse est une méthode

d'analyse qui combine la séparation et l'identification (les performances de la chromatographie

en phase gazeuse et de la spectrométrie de masse) afin d'identifier et/ou de quantifier

précisément de nombreuses substances. La méthode est basée sur la séparation des constituants

à l’aide de la CPG et leur identification par la spectrométrie de masse.

Les spectres de masse obtenus sont ensuite comparés avec ceux des produits de référence

contenus dans les bibliothèques informatisées disponibles, commerciales (NIST/EPA/NIH

Mass Spectral Library[46], Wiley Registry of Mass Spectral Data[47], contenant plusieurs

milliers de spectres, Konig-Joulain, intitulée « Terpenoids and Related Constituents of Essential

Oils » contenant plus de 1200 composés) ou identifies au laboratoire. Il y a une bibliothèque

nommée « Arômes » elle contient près de 500 spectres de composés essentiellement

terpéniques. Il y a plusieurs spectres de masse expérimentaux peuvent aussi être comparés à des

spectres contenus dans des bibliothèques non informatisées (Figure 10)[48, 49]. Ces spectres

sont de constituants de l’huile essentielle inconnus dans les bibliothèques de comparaison et

qu’ils ne sont pas décrits dans la littérature. Il est alors nécessaire de les purifier par distillation

fractionnée ou par des techniques chromatographiques préparatoires telles la Chromatographie

sur Couche Mince (CCM), la Chromatographie liquide sur Colonne ouverte (CC), la

Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP) ou encore la Chromatographie en Phase

Gazeuse Préparatoire (CGP).

Pour se rendre à l’identification structurale on utilise les techniques spectroscopiques suivantes

: Résonance Magnétique Nucléaire du proton (RMN-1H) et du carbone-13 (RMN-13C), SM,

IRTF,… [50].


21

Figure 10 : Organigramme d’identification des huiles essentielles par GC et GC-SM.

I.9- Utilisation des huiles essentielles

Il existe plusieurs voies d’utilisations des H.Es nous pouvons les avales, les respires ou les

utilisés en application directes sur la peau :

I.9.1- La voie orale

Elle doit être utilisée uniquement sur conseils du médecin d’aromathérapie. Il faut jamais

prendre une huile pure dans la bouche peut se produire des brûlures. Aussi, nous conseillons de

ne jamais prendre plus de trois gouttes[51, 52]

I.9.2- La voie respiratoire

Les H.Es sont, très vite, absorbées par toutes les petites cellules ciliaires qui tapissent notre

arbre respiratoire depuis les fosses nasales jusqu’au bout de nos alvéoles pulmonaires.

GC/MS


22

I.9.3- La voie cutanée

C’est la voie idéale car sans danger et très efficace. Généralement, les huiles sont utilisées à des

concentrations très diluées. Il peut être utilisé de plusieurs façons soit massage ou simplement

en application selon la zone et l’affection à traiter. D’autres formes sont aussi possibles :

pommades, bain, etc.[53].

Dans tous les cas, les H.E pénètrent dans notre corps pour atteindre la circulation sanguine afin

pour être transporté jusqu’au site malade[54].

I.10- Action biologique, effets thérapeutiques

Les huiles essentielles sont utilisées pour leurs différentes propriétés et effets thérapeutiques

divers[55]

Depuis des millénaires, L'emploi d'huiles essentielles destiné au guérison et la prévention des

maladies.

Les être Humains ont pu constater l’efficacité de ces petites gouttes, de manière empirique dans

un premier temps et scientifique plus tard. A mesure que les études, les expériences et les

témoignages s’accumulaient, des principes communs se sont dessinés[56, 57].

Plusieurs études ont prouvé que l’activité biologique d’une huile essentielle liée avec sa

composition chimique, les groupes fonctionnels des composés majoritaires[58], et les effets

synergiques entre les composants. Ainsi la nature des structures chimiques qui la constituent,

mais aussi leurs proportions jouent un rôle déterminant[59].

I.10.1- Activité antimicrobienne des huiles essentielles

Les propriétés thérapeutiques des huiles essentielles se résument ou : antispasmodiques,

rafraîchissant, diurétique, antiseptique….

Cependant, dans ce travail, nous allons nous limiter à leurs propriétés antimicrobiennes,

antifongiques et antioxydant qui constitueront l’essentiel de notre étude de recherche.

Les propriétés antimicrobiennes des huiles essentielles sont bien connues et bien documentées.

En effet, de nombreux travaux de recherche ont mis en évidence leur puissante activité

antiseptique agissant aussi bien sur les bactéries, les champignons pathogènes que les virus[60,

61], Et ainsi leur donner diverses indications thérapeutiques..

L’activité antibactérienne des huiles essentielles a été la plus étudiée. On distingue deux sortes

d’effets des huiles essentielles sur ces microorganismes :


23

- Effet bactéricide (bactéricidie) : exerçant une activité mortelle

- Effet bactériostatique (bactériostase) : entraînant une inhibition de la croissance.

Ces actions des huiles essentielles sur la cellule bactérienne demeure encore insuffisamment

élucidée[62]. Plusieurs mécanismes seraient mis en jeu[63]:

- Précipitation des protéines et des acides nucléiques[64].

- Inhibition de la synthèse des macromolécules (ADN, ARN, protéines et peptido-

glycanes)[65].

- Inhibition de la perméabilité membranaire sélective[66] et détérioration membranaire.

- Inhibition de la glycolyse et déplétion potassique[67].

- Modification de la morphologie de la cellule bactérienne[68].

- Absorption et formation d’un film autour de la cellule bactérienne avec inhibition des

processus de respiration, d’absorption et d’excrétion[64].

Figure 11: Sites d’action des huiles essentielles sur la cellule bactérienne (Burt, 2004).


24

I.10.2- Activité antifongique

Les infections fongiques sont d'une actualité criante aujourd'hui. En effet, leur extension est

largement favorisée par l'utilisation abusive et parfois trop légère des antibiotiques.

Ici les groupes moléculaires cités en priorité pour leurs actions antibactériennes Elles sont

également active sur les champignons. Néanmoins, la durée de ce type de traitement pendant

une période plus longue que pour le traitement antibactérien.

Par exemple, les huiles essentielles de Cannelle, de Palmarosa, de Clou de girofle et de Niaouli

sont des antifongiques.

Le pouvoir antifongique est attribué aussi à la présence de certains groupements fonctionnels

chimiques dans la composition des HEs. Plusieurs travaux montrent que le pouvoir inhibiteur

était essentiellement dû à la réactivité de la fonction aldéhyde avec le groupement thiol des

acides aminés impliqués dans la division cellulaire[69].

D’autres auteurs ont démontré que la formation d’un complexe entre le donneur d’électrons et

l’aldéhyde Aboutir à un changement de l’état ionique de la membrane traduisant par un

déséquilibre d’échange avec le milieu extérieur. Ce déséquilibre entraîne la destruction

cellulaire[13]

Cependant, les phénols (eugénol, chavicol 4-allyl-2-6- diméthoxyphénol) sont plus

antifongiques que les aldéhydes testés [70].

I.10.3- Activité antioxydante

Les antioxydants sont des substances capables de protéger l’organisme contre les effets

de stress oxydatif[71].

Il existe trois types d’antioxydants : les antioxydants enzymatiques, les enzymes de réparation,

et les antioxydants non enzymatiques. Les substances naturelles dont les huiles essentielles sont

classées entant qu’antioxydants non enzymatiques.

L’activité antioxydante peut être primaire ou préventive (indirecte), cette dernière est capable

de retarder l’oxydation par des mécanismes indirects tels que la réduction

d’oxygène[72].

Par contre les antioxydants à action directe sont capables de donner des électrons à l’oxygène

radicalaire afin qu’ils puissent le piéger, empêchant ainsi la destruction des structures

biologiques. Ils peuvent agir comme agents réducteurs capables de passer leurs électrons aux

ROS et les éliminer[73].

Quelques travaux ont rapporté que certaines huiles essentielles sont plus efficaces que les

antioxydants synthétiques[74].


25

Les effets antioxydants d'huiles essentielles et d'extraits des plantes en raison principale de la

présence des groupes d'hydroxyle dans leur structure chimique[75]

On conclusion la composition chimique des huiles essentielles est directement responsable sur

les activités biologiques

Nous pouvons citer les composants suivants comme des molécules antibactériennes les plus

puissantes: le Carvacrol, le Thymol et l'Eugénol, le Géraniol, le Linalol, Térpineol menthol, etc.

Cette activité antivirale se retrouve surtout dans les huiles essentielles contenant des cétones,

des monoterpenols ou certains aldéhydes.

Les effets calmants et antispasmodiques; les aldéhydes (citral de la verveine,...), les

esters (salicylate de méthyle,...).

Les effets antiparasitaires; surtout les phénols.

Les effets anti-inflammatoires; selon le type de douleurs, on peut utiliser les esters, des

alcools (menthol) ou des aldéhydes (cuminal).

Les huiles essentielles sont de même utilisées pour traiter des aphtes, gingivites et maux de

gorge en faisant les gargarismes et les bains de bouche. Le massage aux huiles essentielles

constitue un traitement curatif puissant, stimulant et relaxant. Les huiles essentielles sont

incorporées dans les crèmes, les lotions, gels et shampooings. Les huiles essentielles possèdent

également des propriétés insecticides et insectifuges : c'est le cas de l'huile essentielle de

Cymbopogon schoenanthus, un biopesticide efficace contre collasobruchus maculatus F.,

prédateur de niébé[76].

L'huile essentielle de Bétula lenta (betula aleghaniensis), composée de 98,5% de salicylate de

méthyle naturel est très recherchée par son excellente activité antirhumatismale[30].

I.11- Toxicité des huiles essentielles Bien que les huiles essentielles sont des substances naturelles, mais cela ne signifie pas qu'il

est sans danger pour la santé humaine. Il est ainsi important de connaître le produit, le choisir

selon des critères qualificatifs rigoureux, de respecter avec précision les doses et de choisir le

mode d’administration adéquat, et pour éviter la survenue d’effets indésirables, et les

interactions avec d’autres médicaments.

Ainsi, les huiles essentielles peuvent s’avérer allergisants, photosensibilisants, cytotoxiques,

irritants, néphrotoxiques, hépatotoxiques, neurotoxiques…

On distingue les toxicités suivantes :


26

I.11.1- Toxicité par voie orale :

La majorité des huiles essentielles couramment utilisées présentent une toxicité par voie orale

faible avec des doses létales à 50% (DL50) supérieures à 5 g/kg. Cependant, la Sarriette et

l’Origan présentent une toxicité élevée autour des 1.4 g/kg (données observées chez l’animal),

tandis que les plus toxiques sont les huiles essentielles de Boldo (0,13 g/kg), de

Chénopode (0,25 g/kg), de Thuya (0,83 g/kg), ainsi que l’essence de moutarde (0,34 g/kg)[41].

L’eugénol, l’un des constituants du Thym, peut s’avérer hépatotoxique et même entraîner une

insuffisance rénale chez l’enfant à doses élevées (10 ml)[77].

I.11.2- Toxicité dermique :

L’usage des huiles essentielles en parfumerie ou en cosmétique, Elle nous oblige à utiliser en

application locale sur la peau, peut générer des irritations, allergies voire photosensibilisation.

C’est le cas de l’huile essentielle de Thym, d’Origan, de la Sarriette qui sont connues pour leur

pouvoir irritant et agressif, les essences d’agrumes (pamplemousse, citron…) qui sont

photosensibilisantes par des réactions épidermiques après exposition au soleil[78].

I.11.3- Cytotoxicité :

Quelques huiles essentielles peuvent être cytotoxiques sur les cellules animales et humaines.

En effet, il a été démontré que les huiles essentielles d’Origan, de différentes variétés,

présentent une forte cytotoxicité sur des cellules humaines cancéreuses[79, 80].

Egalement, il a été démontré que les huiles essentielles de Thym et de Lavande, selon la phase

dans laquelle elles sont mises en contact (phase liquide ou gazeuse), sont cytotoxiques sur des

cellules animales (hamster)[81].

I.11.4- Neurotoxicité :

Certaines huiles essentielles peuvent être convulsivantes et abortives suite à une utilisation

prolongée. C’est le cas des huiles essentielles à thuyones (Thuya, Absinthe, Sauge officinale)

qui sont neurotoxiques[16, 78].

Chapitre II :

Etude botanique de

la plante Teucrium

polium ssp

aurasianum

Chapitre II---------------------------------------------------------------Etude botanique

27

II.1- Données botaniques et pharmacologiques de l’espèce étudiée

Ce travail a porté sur la plante Tucrium polium ssp aurasianum labiatae de la famille lamiacée

La plante est de la famille lamiacée

II.1.1- Place dans la classification systématique botanique

Tableau 1 : Place dans la classification systématique botanique

Classification APG III (2009) selon NCBI

Règne Plantae

Embranchement Spermatophyta

Sous embranchement Angiospermes

Classe Astéridées

Sous classe Lamiidées

Ordre Lamiales

Famille Lamiaceae

Genre Teucrium

Espèce Polium

Sous espèce aurasianum

II.1.2- Les Lamiales

La place des Lamiales dans la classification systématique botanique APG II (Angiosperm

Phylogeny Group) est la suivante [82-84] :

Embranchement des Spermaphytes (plantes à graines), encore appelés Phanérogames

Sous-embranchement des Angiospermes (graines protégées) ou plantes à fleurs

Clade des Eudicotylédones (Eudicots) ou dicotylédones vraies : plantes à grains de

pollen tri-apertirés ou d'un type dérivé, toujours dicotylédonées, toujours sans cellule à essence

dans les tissus parenchymateux.

Clade des Eudicotylédones centrales (Core Eudicots) : plantes ne combinant pas à la

fois la production d’alcaloïdes et une placentation marginale (contrairement aux

Eudicotylédones basales), à fleurs ayant des caractères apomorphiques (évolués) : périanthe

souvent hétérochlamydé (c’est-à-dire composé d’une corolle et d’un calice différenciés),

soudure des pièces, disposition verticillée, pentamérie, parfois apétalie.

https://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A8gne_(biologie)

https://fr.wikipedia.org/wiki/Plantae

https://fr.wikipedia.org/wiki/Ast%C3%A9rid%C3%A9es

https://fr.wikipedia.org/wiki/Lamiid%C3%A9es

https://fr.wikipedia.org/wiki/Ordre_(biologie)

https://fr.wikipedia.org/wiki/Lamiales

https://fr.wikipedia.org/wiki/Famille_(biologie)

https://fr.wikipedia.org/wiki/Lamiaceae

https://fr.wikipedia.org/wiki/Genre_(biologie)

https://fr.wikipedia.org/wiki/Teucrium


28

Les étamines ne sont jamais laminées, le filet des anthères est généralement bien différencié.

La placentation est rarement marginale, souvent axile ou pariétale, moins souvent basale ou

apicale. Elles sont très souvent productrices de tanins, de bétalaïnes, d'huiles sinapiques ou de

composés iridoïdiques.

Classe des Asteropsida ou grade des Asterideae : plantes à ovules ordinairement

tenuinucellés et à fleurs gamopétales, moins fréquemment dialypétales ; étamines généralement

isomères des lobes de la corolle ou moins nombreuses, verticille d’étamines le plus externe

toujours alterne des pétales ; ovaire supère ou infère, ovules fréquemment unitéguminés, parfois

bitéguminés, ovules crassinucellés et bitéguminés extrêmement rares, placentation axile ou

pariétale ; semences albuminées ou fréquemment exalbuminés ; composés iridoïdiques ou

d’autres sortes de répulsifs fréquents, tanins rares, bétalaïnes et huiles sinapiques absentes.

Groupe des Euastéridées I, caractérisé par une sympétalie tardive et des fleurs assez

régulières à préfloraison tordue ou valvaire éventuellement tétracycliques.

Super-ordre des Lamianeae, qui regroupe Gentianales, Lamiales, Solanales et des

familles telles que les Borraginacées.

II.1.3- La famille des Lamiacées

La famille des lamiacées connue également sous le nom des labiées, comporte environ 258

genres pour 6900 espèces plus ou moins cosmopolites; mais dont la plupart se concentrent

dans le bassin méditerranéen tel que le thym, la lavande et le romarin[85].

Elle est divisée en deux principales sous-familles: les Stachyoideae et les Ocimoideae.

Les lamiacées sont des herbacées ayant la consistance et la couleur de l’herbe, parfois

sous-arbrisseaux ou ligneuses[85]. Une grande partie de ces plantes sont aromatiques riches

en l’huile essentielle d’où leur intérêt économique et médicinal. Entre autres, un grand

nombre de genres de la famille des Lamiaceae sont des sources de terpènoides, flavonoïdes et

iridiodes glycosylés.

II.1.4 - Caractères généraux des Lamiacée[86, 87]

- les tiges sont quadragulaires, au moins dans leur jeune âge, et sont à rameaux opposés,

- les feuilles opposées sont simples, parfois amplexicaules, toujours sans stipule et à limbe

penninerve,

- les inflorescences formées par de faux verticilles axillaires ou glomérules proviennent de la

réunion de 2 cymes bipares,


29

- Les fleurs hermaphrodites ou unisexuées sont accompagnées de bractéoles et ont évolué vers

l’adaptation à la pollinisation par les insectes (entomophilie),

- Le calice est gamosépale persistant à 5 sépales soudés,

- la corolle est gamopétale et zygomorphe. Elle comprend un tube plus ou moins long, droit

ou incurvé, souvent poilu. Le limbe est bilabié, partagé en 5 lobes (2 pour la lèvre

supérieure, 3 pour la lèvre inférieure)

- Les étamines sont au nombre de 4 : 2 grandes et 2 petites (sauf pour le genre Mentha qui en

compte 5),

- Le gynécée est formé de 2 carpelles formant un ovaire biloculaire reposant sur un disque

glanduleux et possédant 2 ovules par loge. Chaque loge se subdivise par une fausse cloison en

2 logettes uniovulées. Les ovules sont anatropes ascendants à raphé interne,

- Le fruit est un tétrakène formé de 4 nucules secs enveloppés par le calice.

II.1.5- Description botanique

C'est une plante vivace recouverte de poils ligneux qui lui donne une couleur grise bleutée.

L'aspect de la plante est très variable en général on la rencontre en touffe dense[88] . C'est une

plante herbacée, ramifiée dès la base, et à feuilles linéaires, vert – grisâtres fortement révolutées

sur les marges. Le calice est vert-grisâtre, la corolle est blanche. Les inflorescences en têtes

compactes, les capituliformes sont situées au sommet des tiges[3]. Teucrium polium est une

plante à fleur (sauvage) qui se trouve abondamment dans le sud-ouest de l'Asie, en Europe, et

en nord-africain[89].

Figure 12 : Teucrieum Polium ssp Aurasianum


30

II.1.6- Synonymes[90] :

Nom en Italie : Camedrio polio, Canitola, Polio.

Nom en espagnol : Poleo montano, Timo mascle, Tomillo terrero, Zamarilla.

Nom en français : Polio des montagnes, Germandrée tomenteuse.

Nom commun : El-Djaada. El-khayata

II.1.7- Répartition géographique

Pareillement, Teucrium est originaire du Sud-Ouest d’Asie, d’Europe et d’Afrique du Nord

(abandonnément trouvée dans le secteur Irano-Turanien principalement méditerranéen et

occidental). Elle pousse dans les pelouses arides, les rocailles de basse altitude, collines et les

déserts arides[91].

II.1.8-Propriétés d’utilisations traditionnelles et médicales

Des espèces de T. polium ont été employées en tant qu'herbes médicinales pendant plus de 2000

années comme diurétique, inotropique et chronotropique[92], tonique, antipyrétique,

cholagogue et anorexiques[93]. Le feuillage de T. polium légèrement poivré, était couramment

utilisé pour relever les salades ou parfumerles fromages de chèvres.Une infusion des feuilles

et des fleurs était ainsi consommée comme boisson régénératrice[94]. En médecine

traditionnelle, Teucrium est employée comme analgésique, antispasmodique et

hypolipidémique. Cette plante peut avoir quelques intérêts d’ordre cliniques: cas de désordres

stomacaux[95, 96] et gastro-intestinaux tels que la colite. Ces résultats le soutiennent également

pour son emploi folklorique pour soulager ces douleurs[91].

L’utilisation de l’extrait éthanolique de T. polium sur des milieux de culture de Saccharomyces,

in vitro, a mené à diminuer letaux des acides gras et bloquent la peroxydation au niveau des

érythrocytes, ainsi il à montrer des effets antibactériens et antifongiques[97]. Cette plante est

largement distribuée comme agent hypoglycémiant.

Sa décoction dispose un effet hypoglycémiant chez les rats normoglycémiques par rapport aux

modèles hyperglycémiques induits par le streptozotocine[98]. Cependant, des épreuves de

sûreté sont exigées pour confirmer son action hypoglycémiante.


31

II.2- Travaux antérieurs

II.2.1- Composition chimique

Plusieurs travaux ont été réalisés sur le genre Teucrium et quelques-uns sur l'espèce Teucrium

polium. L'étude menée par[99], montre que les huiles essentielles de la partie aérienne des deux

variétés de Teucrium polium (album et pilosum) sont caractérisées par une richesse en

sesquiterpènes, de 78.61% à 92.07% respectivement pour les deux variétés. D'autre part,[100]

, rapportent que l'huile essentielle de Teucrium polium poussant à l'état spontané en Jordanie, a

donné un faible rendement et contient une forte teneur en 8-cedron-13-oi. D'autres composés

sont également présent en quantités appréciables : le J3-caryophyllène, le D- germacrène et le

sabinène. L'huile essentielle de Teucrium polium spp aurasiacum, récoltée en Algérie a révélé

un rendement important, et a donné une composition chimique caractérisée par la présence de

l'α-cadinol, le 3,13-hydroxy-a- muurolène, l'α-pinène et le J3-pinène essentiellement[101].

Deux diterpénoïdes ont été isolés de la partie aérienne du Teucrium polium, qui sont deux néo-

clérodanes de formule C20H26O7 [102].

II.2.2- Les activités biologiques

Plusieurs recherches ont démontré certains effets pharmacologiques attachés à l’utilisation de

Teucrium, parmi lesquelles on invoque l’action antibactérienne, antiinflammatoire, anti-

ulcerogène, anti-nociceptive, antispasmodique, antidiabétique, diurétique, hypolipidémique,

antifongique, antagoniste du calcium et cytotoxique[91, 103-105]. Récemment, quelques

rapports dans la littérature dévoilent des effets antioxydants des extraits

bruts de T. polium[106] . Par conséquent, d'autres investigations sont nécessaires maintenant

pour élucider le mécanisme de l'action pharmacologique et identifier les composants bioactifs

responsables de telles actions afin d'expliquer leur efficacité thérapeutique.

II.2.2.1-Anti-nociceptive, antispasmodique :

L’extrait aqueux des parties aériennes de T. polium a montré des effets antispasmodiques et

anti-nociceptifs. D’autres études affirment des propriétés antiviscérales de son extrait

éthanolique contre la douleur comparables à ceux de l’hyoscine et de l'indométhacine ; et

suggère son emploi en thérapies antispasmodiques chez l’homme. La présence des flavonoïdes

et des stérols pourrait être responsable de l'activité anti-inflammatoire de cette plante[91, 96].


32

II.2.2.2-Antidiabétique :

L'extrait aqueux de T. polium a montré un effet hypoglycémiant chez les rats.

La propriété insulinotropique de cet extrait a été encore évaluée, in vitro, en utilisant des îlots

pancréatiques de rat[105]. Les données ont indiqué l’extrait brut aqueux est capable de réduire

le taux du glucose sérique principalement en augmentant la sécrétion d'insuline par le pancréas

par comparaison aux îlots témoins. Cependant, les composés responsables de l'activité

hypoglycémique ne sont pas encore élucidés[97, 107].

II.2.2.3-Antifongique :

L’extrait de T. polium a été employé dans le traitement des abcès fongiques[105].

II.2.2.4-Antipyrétique, Antimicrobien :

L’extrait éthanolique deT. polium présente un effet antipyrétique contre la levure et le pyrexia

de carragénine. Le mécanisme du l’hyperthermie de carragénine a été liée à un dégagement des

prostaglandines au site de l'injection par l'irritant en inhibant la synthèse de prostaglandines au

niveau périphérique[108]. Cette hypothèse est renforcée par le fait que cet extrait peut empêcher

la formation d'œdème. Cependant, l’extrait de T. polium a montré une remarquable activité

antibactérienne contre les bactéries Gram positive et Gram négative. D'autre part, il présente

des degrés élevés de résistance à nombreux agents antimicrobiens[103, 109].

II.2.2.5-Cytotoxique :

Les résultats montrent que l’extrait éthanolique de T. polium dispose un potentiel antitumoral

très efficace par l’inhibition, in vivo, de la génération de colonies de quelques lignées

cellulaires en milieu d’agarose et la suppression leurs croissance[110]. Toutefois, l’extrait

aqueux de T. polium augmente la cytotoxicité négociée contre N-méthyl-N-nitro-N-

nitrosoguanidine sur des cultures de cellules primaires des hépatocytes des rats et réduit

significativement les index mitotiques et les cellules nécrotiques[111].

Deuxième partie

Partie expérimentale

Chapitre III

Matériels et

Méthodes

Chapitre III--------------------------------------------------------Matériels et méthodes

33

III.1- Cadre d’étude

Ce travail a été effectué au sein du laboratoire de recherche génie des procédés du département

de génie des procédés, à la faculté des sciences appliqués de l’Université Ouargla. Ce dernier

qui s'occupe de l'extraction et de la caractérisation des huiles essentielles, ainsi que d'autres

extraits totaux des plantes médicinales. Ce travail se repose sur le protocole expérimental

suivant

- L’extraction de l’huile essentielle d’espèce végétale étudiée

- Analyses effectuées sur l’extrait :

- Analyses physico-chimiques

- Séparations chromatographiques et caractérisation de l’huile essentielle par

chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectromètre de masse

- Tests antibactériennes :

- Etude de l’activité antibactérienne vis-à-vis de quelques souches bactriennes

- Détermination de la concentration minimale inhibitrice CMI

- Tests antioxydants :

- Etude de pouvoir antioxydant de l’huile essentielle par deux méthodes

- DPPH (1,1-diphényl-di-picrylhydrazyl)

- FRAP (ferrique reducing antioxydant power).

- Tests antifongiques :

- Etude de l’activité antifongique

- Détermination de la CMI


34

Figure 13 : Plan général de la partie expérimentale

Activités antifongique

Extraction des huiles essentielles

Analyses Activités biologiques Effet du séchage

Identification de la

composition chimique par

GC/MS

Analyses physico-chimiques

Rendement

Indice de réfraction

Indice d’acide

pH

Densité

Activité

antibactérienne

Activités antioxydant

CMI

Diffusion sur milieu gélosé

FRAP

DPPH

CMI

Contact directe

Teucrium polium ssp aurasianum


35

III.2- Matériel végétal

La plante est récoltée au niveau de la région des Aurès dans la wilaya de Batna au mois de Mai

2013 à une altitude de 1547 m (35°10'0" N; 6°10'0" E). Spécimen bons sont déposés dans

l'herbier de l'Institut National d'Agronomie (INA), El-Harrach, Algérie, sous la référence AC-

AS3. La partie récoltée est constituée de feuilles, tiges et fleures (partie aérienne).

Figure 14 : La plante étudiée Teucrium polium ssp aurasianum

III.3- Extraction des huiles essentielles

L’extraction de l’huile essentielle est effectuée par hydrodistillation au moyen d’un dispositif

d’extraction type Clevenger. L’opération consiste à introduire 100 g de masse végétale séchée

dans un grand ballon de 2 litres, on y ajoute une quantité d’eau distillée correspondant à 2/3

du volume du ballon. L’opération d’extraction est réalisée en trois heures à partir du début

d’ébullition. Enfin l’huile obtenue est conservée dans des flacons fumé et bien scellés à une

température de 5°C, et pour éliminer les gouttes d’eaux on ajoute, une spatule de sulfate de

magnésium anhydre: le sulfate anhydre capte les traces d’eau qui pourraient encore rester

dans la phase organique (les huiles essentielles).


36

III.4- Caractérisation des huiles essentielles :

III.4.1- Analyse physico-chimique :

III.4.1.1- Le rendement

Le rendement est le rapport de la quantité d'huile recueillie après distillation sur la quantité de

la biomasse, exprimée en pourcentage. Les quantités d'huile essentielle proviennent du cumul

suivre l'effet de séchage sur le rendement d'extraction.

R : Rendement en HE en (%)

Mhe : Masse de l’huile essentielle

Mvg : Masse végétale sec

100 × Mvg

MheR

III.4.1.2- Indice de réfraction

Les indices de réfraction sont mesurés à l'aide d'un refractomètre[112] (AFNOR, 2000) à la

température ambiante puis ramenés à 20°C par la formule : N20 = Nt+ 0,00045 (T-20°C) où

N20 : indice à 20°C,

Nt : indice à la température ambiante ou de mesure

T : température ambiante ou de mesure

Les produits étalons de qualité pour réfractométrie servant à ajuster le réfractomètre sont les

suivants (les indices de réfraction à 20°C sont donnés dans la parenthèse) :

- Eau distillée (1,333)

- p-cymène (1,4906)


37

- benzoate de benzyle(1,5685)

- Bromo-1 naphtalène(1,6585)

III.4.1.3- Indice d'acide

Définition

Il donne une évaluation sur la quantité d'acides gras libres. Ces acides sont responsables d'une

plus grande facilité au rancissement.

On appelle indice d'acide d'une huile, le nombre de milligramme d'hydroxyde de potassium

alcoolique nécessaire pour neutraliser les acides gras libres contenus dans un (1) gramme (g)

de matière grasse.

Principe

Les matières grasses s'altèrent par vieillissement en donnant naissance par hydrolyse des acides

gras libres. Cette acidité peut être mesurée par alcalimétrie en milieu éthéro-alcoolique, à l'aide

de l'hydroxyde de potassium alcoolique titrée.

Mode Opératoire

Une prise d'essai de 10g d'huile est solubilisée dans un erlenmeyer contenant préalablement un

mélange d'ether diéthylique/éthanol dans les proportions 1/1. Le titrage des acides gras libres

en solution est éffectué avec une solution à 0,1N d'hydroxyde de potassuim (KOH) dans de

l'éthanol 95°, en utilisant la phénolphtaléine comme indicateur coloré et cela sous agitation

jusqu'au virage au rose.

Expression des résultats

Le résultat est exprimé en mg de KOH par g d'huile.

Indice d'acide = [(V*T*56.1) / P]

Avec : V= volume de KOH

T= titre de la solution de KOH


38

P= prise d'essai en g

III.4.1.4- Variation de la Densité

La densité est le rapport de la masse volumique d’un liquide à celle de l’eau.

Cependant, la mesure des densités de ces huiles à été effectué par le moyen d’un densimètre

type DMA 35N

La densité est mesuré à l'aide d'un densimètre[112] (AFNOR, 2000) à la température ambiante

puis ramenés à 20°C par la formule : D20 = Dt+ 0.00068 (T-20°C) où

D20 : densité à 20°C,

Dt : densité à la température ambiante ou de mesure

T : température ambiante ou de mesure

III.4.1.5- Potentiel d’hydrogène (pH) :

Cette mesure est effectuée par un pH-mètre

III.4.2- Analyses par chromatographie en phase gazeuse couplé à spectromètre de masse

GC/MS

L’analyse de l’huile essentielle de Teucrium polium ssp aurasianum Labiatae a été réalisée, au

INRAP (institue nationale de recherche et d’analyse physico-chimique) Tunisie, par

chromatographie en phase gazeuse type HP 6890 couplée à une spectroscopie de masse type

HP 5975B avec ionisation par impact électronique (70 eV), équipée par une colonne capillaire

HP-5MS (5%-phenyl- methylpolysiloxane) (30 m x 0,25 mm, épaisseur du film : 0,25 cm)

programmé de 50° C jusqu’à 300° C, maintenue à 300° C pendant 10 min de 2° C/mn. Le gaz

vecteur était l'hélium avec un débit fixe de 0,8 mL / min.

L’huile essentielle (1 μL) a été injectée automatiquement et Le mode d’injection est Split.

L’appareil est piloté par un système informatique gérant une bibliothèque de spectres de masse


39

III.5- activités biologique :

III.5.1- activité antibactérienne

III.5.1.1- Souches bactériennes

L’activité antimicrobienne de l’huile essentielle de Teucrium polium ssp aurasianum a été

évaluée sur plusieurs souches bactériennes

Ces souches sont : Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Leisteria, Proteus, Pseudomonas

aeruginosa, salmonella, Staphyloccous aureus et Staphyloccous Sp

Elles proviennent du laboratoire de microbiologie de l’hôpital Mohamed BOUDIAF Ouargla

et du laboratoire de microbiologie de l’Université Kasdi Merbah, Ouargla.

III.5.1.2- Tests d’activités antimicrobiennes

Les tests d’activités antimicrobiennes sont réalisés par la technique par contact direct (méthode

de diffusion sur milieu gélosé)[113].

III.5.1.3- Principe de l'antibiogramme :

L'antibiotique présent dans le disque migre dans la gélose qui a été ensemencée par la souche

bactérienne à étudier. Il se forme une zone circulaire autour du disque de gélose imbibée

d'antibiotique dont la concentration décroit quand on s'éloigne du disque. Dans cette zone, la

croissance des bactéries est ou n'est pas inhibée par la concentration d'antibiotique à laquelle

elles sont soumises. Les bactéries qui peuvent se multiplier forment des colonies visibles à l'oeil

nu après quelques heures de développement.

III.5.1.4- Préparation des boîtes de gélose (J-24H)

Préparation zone stérile :

Désinfecter la paillasse à l'eau de javel diluée

Utiliser un bec bunsen ou un bec électrique pour réaliser une zone stérile.

Fusion de la gélose :

Réchauffer le contenu des bouteilles de Mueller Hinton :

Au bain marie. Remuer régulièrement pour homogénéiser


40

Au micro-onde. Remplacer le bouchon métallique par du coton cardé ou de la gaze stérile.

Réchauffer à faible puissance : 7 min puissance 150 W.

Couler la gélose dans les boites : Couler la gélose dans les boites organisées dans la

zone stérile limitée aux 15 cm autour du bec. (20 à 25 mL par boite soit une hauteur de 3 à 4

mm) Laisser refroidir couvercle entre-ouvert pour éliminer la vapeur d'eau.

Une fois solidifiées, les boîtes de gélose peuvent être stockées quelques jours au réfrigérateur

(couvercle vers le bas).

Cette méthode consiste à déposer des disques de papiers filtres imprégnés d’huile essentielle

sur la surface des géloses ensemencées par le germe à tester et de mesurer les diamètres

d’inhibition en millimètre (mm) après incubation de 24 h à 37° C.

Les disques de papiers chromatographiques de 6 mm de diamètre , préalablement stérilisés sont

déposés à la surface de gélose ensemencée après avoir été chargé de 5 µl d’huile essentielle on

utilise des témoins négatifs utilisant uniquement des disques placés sur gélose inoculée sans

huile essentielle

La sensibilité des différentes souches vis-à-vis d’huile essentielle étudiée est classée selon le

diamètre d'inhibition selon les critères suivants[114]:

Non sensible (-) pour Ø<8 mm;

Sensible (+) pour 9-14 mm;

Très sensible (++) pour Ø 15-19 mm et

extrêmement sensible (+++) pour Ø >20 mm.( Ponce et el., 2003)

III.5.1.5- Détermination de CMI

Sur la base des résultats, la concentration minimale inhibitrice correspond à la plus faible

concentration d'huile qui est corrélée à une absence de croissance[115].

Pour déterminer les CMI (concentration minimale inhibitrice), nous avons suivi les mêmes

étapes que pour l'évaluation de l'activité antibactérienne selon la méthode de diffusion sur

milieu gélosé, en variant les concentrations des huiles essentielles.

La suspension bactérienne (108UFC/mL) est ensemencée en surface par écouvillonnage sur

milieu gélosé (Mueller-Hinton) dans une boîte de Pétri. Le contact avec les solutions à tester se


41

fait par l’intermédiaire d’un disque de papier (6 mm de diamètre) sur lequel 10 L de solution

(huile essentielle à différentes dilutions, 1, ½, ¼, 1/8, 1/16 ….

Les boites ont été ensuite retournées et incubées à 37°C pendant 24 heures.

Un disque contenant du DMSO est utilisé comme blanc. Chaque test est réalisé en triplé.

III.5.2- Activité antioxydante

III.5.2.1- Méthode de DPPH :

Pour évaluer l’activité antioxydante de l’huile essentielle nous avons utilisé la méthode du

DPPH (1,1-diphényl-di-picrylhydrazyl) proposée par[116, 117] avec des modifications.

La solution de DPPH est obtenue en dissolvant 4 mg de la poudre dans 100 ml de l’éthanol.

L’huile essentielle a été préparée par dissolution dans l’éthanol absolu. Le test s’effectue en

mélangeant 1 ml de la solution précédente de DPPH avec 1ml de l’huile à tester à différentes

concentrations. Après une période d’incubation de 30 minutes à la température du laboratoire,

l’absorbance est lue à 517 nm

L’antioxydant de référence ou le contrôle positif (Ascorbic acid) a été aussi préparé selon la

même méthode avec des mêmes concentrations pour la comparaison

Selon[116, 117], l’inhibition du radical libre de DPPH en pourcentage (I%) est calculé de la

manière suivante

𝐼 % = (𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 − 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒

𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 ⁄ ) × 100

Avec A blanc est l’absorbance du témoin (contenant tous les réactifs sans le produit à tester) et

A échantillon est l’absorbance du test.

Le graphique de la variation du pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de

l’huile essentielle permet de déterminer le IC 50 correspondant à 50 % d’inhibition et qui

constitue l’activité antioxydant de l’huile essentielle. Cette valeur est comparée à celle trouvée

pour le composé de référence.


42

III.5.2.2- Méthode de la réduction du fer FRAP (Ferric reducing antioxidant power)

L’activité réductrice du fer de nos extraits est déterminée selon la méthode décrite par[118]

(Oyaizu, 1986), basée sur la réduction du Fe3+ présent dans le complexe K3Fe(CN)6 en Fe2+

Un millilitre de l’huile essentielles à différentes concentrations est mélangé avec 2,5ml d’une

solution tampon phosphate 0,2 M (pH 6,6) et 2,5ml d’une solution de ferricyanure de potassium

K3Fe(CN)6 à 1%. L’ensemble est incubé au bain marie à 50°C pendant 20 minutes, ensuite

2,5ml d’acide trichloroacétique à 10% sont ajoutés pour stopper la réaction. Les tubes sont

centrifugés à 3000 rpm pendant 10 minutes

2,5ml du surnageant sont mélangés à 2,5ml d’eau distillée et 0,5ml d’une solution de chlorure

ferrique fraîchement préparé à 0,1%.

La lecture de l’absorbance du milieu réactionnel se fait à 700nm contre un blanc

semblablement préparé, en remplaçant l’huile essentielle par de l’éthanol distillée qui permet

de calibrer l’appareil (UV-VIS spectrophotomètre). Le contrôle positif est représenté par une

solution d’un antioxydant standard ; l’acide ascorbique dont l’absorbance a été mesuré dans les

mêmes conditions que les échantillons. Une augmentation de l’absorbance correspond à une

augmentation du pouvoir réducteur d’huile essentielle testée[119].

III.5.3- Activité antifongique

L’activité antifongique de l’HE étudiée a été testée sur deux souches pures issues de

Laboratoire de Microbiologie de la Faculté des Sciences de la nature,

Université Kasdi Merbah, ouargla. Les souches sont : Alternaria arborescens, fusarium salani,

Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, et Stemphylium solani.

III.5.3.1- Souches fongiques testées

Les souches fongiques choisies dans cette étude sont isolés à partir des feuilles de tomate, de

poivrons et feuilles de blé.

L’identification des espèces a été réalisée par macro- et microscope

Les espèces ont été identifiées par Mr. Bensaci Messaoud, laboratoire de Protection des

Ecosystèmes en Zones Arides et Semi-Arides. Université de Ouargla, Algérie.

III.5.3.2- Méthode de contact direct

La méthode adaptée est la méthode de contact direct qui permet la mise en évidence de l’activité

antifongique (fongistatique ou fongicide) des huiles essentielles.


43

Compte tenu de la non miscibilité des huiles à l’eau et par conséquence au milieu de culture,

une mise en émulsion de ces huiles a été réalisée par le tween 20 afin d’obtenir dans le milieu

une répartition homogène des composés à l’état dispersé[120, 121]. Les milieux de différentes

concentrations de 0,05% - 0,25%- 0,5% et 0,75% en huile essentielles avec le tween 20, sont

incorporées dans le milieu de culture PDA (Potato Dextrose Agar) après autoclavage à 121° C,

1 bar de pendant 30 min. Ces concentrations sont préparées de la façon suivante :

- Milieu 1(Témoin): 100 ml PDA + sans HE .

- Milieu 2: 100 ml PDA + 50µl HE + 0,5ml tween 20. Concentration en % (v/v) = 0,05




Le mélange de chaque un milieu, est coulé à raison de 5,5 ml dans des boites de Pétri de

60mm de diamètre.

A l’aide d’un embout stérile, nous découpons un fragment de culture fongique d’environ 0,8

cm de diamètre à partir d’un tapis mycélien âgée de 7 jour, est déposé au centre de la boite de

pétri.

Nous opérons de la même façon pour chaque champignons et chaque concentration d’huile

essentielle, les boites de pétri sont ensuite fermées hermétiquement par le para film et incubées

à 25°C, pendant 7 jours.

Pour chaque concentration, trois répétitions sont préparées de la même façon, afin de minimiser

l’erreur expérimentale.


44

Figure 15 : Protocole expérimental de l’essai d’activité antifongique de chaque huile

essentielle de Teucrium polium aurasianum

III.5.3.3- Paramètres étudiés dans l’activité antifongique

Evaluation de la croissance mycélienne

On a déterminé l’influence, des huiles essentielles sur la croissance mycélienne. Dans le but

d’estimer l’évolution de la croissance mycélienne qui est effectuée quotidiennement, par la

mesure du diamètre de la colonie mycélienne du champignon. Cette lecture est toujours réalisée

en comparaison avec celles des témoins, qui sont démarrés dans les mêmes conditions et le

même jour du test.

Toute pousse même légère de chaque champignon sera considérée comme action négative c'est-

à-dire que l’huile essentielle en question n’est pas inhibitrice vis-à-vis de la croissance fongique.

Témoin 0 %

Alternaria arborescens

fusarium solani

Milieu de culture

(PDA)

TWEEN 20 + HE %

0,05 0,75 0,5 0,25


45

Taux d’inhibition (TI%)

D’après[122] les taux d’inhibition de la croissance par rapport témoin, sont ensuite calculés

selon la formule suivante :

TI(%) = Taux d’inhibition exprimé en pourcentage.

dC : Diamètre de la zone de croissance du témoin

dE : Diamètre de la zone de croissance de l’essai (huiles essentielles)

Détermination de la vitesse de croissance mycélienne (VC)

Selon (Cahagnier et Molard, 1998)[123] la vitesse de la croissance mycélienne de chaque

concentration est déterminée par la formule :

D = Diamètre de la zone de croissance du chaque jour (mm).

Te = Temps d’incubation (jour).

TI(%)=100 x (dC-dE)/dC

VC = [D1/Te1]+[(D2-D1)/Te2]+ [(D3-D2)/Te3]+… + [(Dn-Dn-1)/Ten]

Chapitre IV

Résultat et discussion

Chapitre IV------------------------------------------------------Résultats et discussion

46

IV.1- Rendement d’extraction :

Les extractions sont réalisées par deux méthodes à savoir l'hydrodistillation qui est fourni des

huiles essentielles de couleur jaunâtre avec une très forte et persistante odeur.

Le rendement en huile essentielle de la partie aérienne de Teucrium polium ssp aurasianum est

0,585 % (w/w) ce rendement est plus faible comparativement à ceux obtenu résultats obtenu

qui est de 1.7 % (w/w) et 0.75 % (w/w) par[101, 124]

Par rapport aux autres espèces de la même famille étudiées, notre rendement est considéré

comme fort comparé à celui obtenu par[125] qu’est de l’ordre de 0.1% (w/w)

On peut déduire que le rendement en huile essentielle d'une même espèce peut varier, et ceci

en fonction de plusieurs paramètres, telle que : l’espèce de la plante le temps de récolte la

méthode d’extraction.

IV.2- Effet du séchage sur le rendement des huiles essentielles

Figure 16 : Variation du rendement des huiles essentielles et la perte de poids de la plante

Teucrium polium ssp aurasianum au cours du temps de séchage.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ren

de

me

nt

d'e

xtra

ctio

n(%

)

pe

rte

de

po

ids

(g)

jours


47

Les rendements d’extraction de l’huile essentielle de Teucrium polium subissent une variation

notable en fonction du temps de séchage de la matière végétale. En effet, à l’état frais, le

rendement est de 0,368 % et passe à 0,585% après 24 heures de séchage est le rendement

maximal. On remarque une baisse de rendement au reste des jours de séchage

Le rendement augmente d'abord jusqu'à atteindre un optimum puis diminue à la comparaison

de l’évolution de la teneur en eau ou la perte de poids pendant le séchage et celui du rendement,

il semble que les deux phénomènes sont totalement indépendants l’un de l’autre.

Le séchage de la plante, avant sa mise en distillation, est un traitement qui a des effets très nets

sur le rendement en huile essentielle. Plusieurs travaux ont été menés sur cette question et ont

confirmé un phénomène général. Le rendement en huile essentielle, exprimé par rapport à la

matière sèche, évolue durant le séchage du matériel végétal avant sa distillation ; ce rendement

commence, dans une première phase, par augmenter très nettement. Il atteint un maximum.

Puis dans une deuxième phase, il baisse régulièrement. La durée de la première phase et le

niveau du rendement optimal dépendent de l’espèce végétale concernée et des conditions de

séchage mises en œuvre (séchage naturel à l’ombre ou au soleil). Cette règle a été confirmée

pour l’eucalyptus[126, 127], pour la verveine[128, 129], pour les lavandes[130] [12], pour la

tanaisie annuelle[131, 132] et pour le romarin[132, 133]. Ces travaux réalisés sur cette question

au niveau de laboratoire des plantes aromatiques, à l’I.A.V. Hassan II, seule une espèce a

échappé à cette règle. Dans ce cas, le rendement des huiles essentielles reste constant pendant

plusieurs semaines[134]. Au Québec, la même observation est faite dans les cas des feuillages

du sapin baumier (Abies balsamea (L.) Mill.), de l’épinette noire (Picea mariana (Mill.) B.S.P)

et du bois de Thujaoccidentalis[135].

Zrira[127] [9] a cherché à comprendre l’origine de ce phénomène. Après avoir vérifié plusieurs

hypothèses, elle a conclu qu’il s’agit d’un phénomène biologique. La plante, après sa récolte

continue à vivre et son activité de biosynthèse des terpènes et dérivés s’accentue. Il paraît s’agir

pour la plante d’un moyen de défense contre le stress hydrique. C’est ce qui expliquerait

l’augmentation des rendements en huiles essentielles pendant les premières phases. Après la

mort définitive de la plante, toute l’activité de biosynthèse s’arrête et les pertes d’huiles

essentielles par évaporation ne sont plus compensées, d’où les baisses des rendements de

distillation.


48

IV. 3- Analyses physico-chimique et organoleptiques :

Les propriétés organoleptiques et physico-chimiques constituent un moyen de vérification et de

contrôle de la qualité de l’HE. Nos essais ont été effectués selon un protocole précis et obéissent

aux normes édictées par l’ISO. Pour l’HE Teucrium polium aurasianum, c’est la norme NF

ISO 4731 :2006 (NF T 75-212) qui est en vigueur.

IV.3.1- Caractéristiques organoleptiques :

A l’issue des distillations, l’HE obtenue est de couleur jaune avec une odeur prononcée

citronnée.

Les paramètres organoleptiques de notre HE sont en accord avec ceux répertoriés dans les

normes AFNOR

Tableau 2 : Propriétés organoleptiques de l'HE de Teucrium polium aurasianum.

Paramètre AFNOR Teucrium polium aurasianum

Aspect Liquide mobile, limpide Liquide

Couleur Jaune ambré à jaune verdâtre Jaune

Odeur Rosée, ± menthée Rosée, légèrement citronnée

IV.3.2- Caractéristiques physico-chimique

Tableau 3 : Analyses physico-chimique de HE de Teucrium polium aurasianum.

Paramètre Teucrium polium aurasianum Norme AFNOR

Densité 𝒅𝟐𝟎𝟐𝟎 0,867 Norme NF T 75 - 111

Indice de réfraction 𝒏𝒅𝒕 1,465 Norme NF T 75– 112

pH 5,49 5 - 6.5

Indice d’acide 3,276 Norme NFT-60 -2000

La densité relative et le potentiel d’hydrogène pH sont dans les normes

Cependant et malgré ces fluctuations, nous remarquons que les paramètres physico-chimiques

de nos HE sont en accord avec ceux mentionnés par les normes.

Pour les constantes chimiques, l'indice d'acide donne une idée sur le taux d'acides libres. Dans

notre étude, cet indice, certes dans les normes, demeure relativement élevé. Cela peut trouver

une explication dans la dégradation de l'HE (hydrolyse des esters) durant sa conservation, ce


49

qui est à terme préjudiciable. Inversement, un indice d’acide inférieur à 2 est une preuve de

bonne conservation de l’essence (faible quantité d'acides libres)[136].

Un indice de réfraction variant essentiellement avec la teneur en monoterpènes et en dérivés

oxygénés. Une forte teneur en monoterpènes donnera un indice élevé. Pour certains

auteurs[136], le faible indice de réfraction de l'HE indique sa faible réfraction de la lumière ce

qui pourrait favoriser son utilisation dans les produits cosmétiques.

La détermination des propriétés physico-chimiques est une étape nécessaire mais demeure non

suffisante pour caractériser l'HE. Il sera donc primordial de déterminer le profil

chromatographique de l'essence aromatique. Cette dernière analyse donne la composition

chimique de substances trouvées dans l’huile essentielle de Teucrium polium aurasianum.

IV.4- Détermination de la composition chimique de HE

Les résultats des analyses par et CG/SM de l’huile essentielle extraite de la plante Teucrium

polium ssp aurasianum sont présentés dans le Tableau 4. Trente-cinq constituants sont

identifiés représentant un total de 99,99 % de cette essence


50

Fig

ure 1

7: C

hro

mato

gram

me en

GC

/SM

de H

E d

e Teu

crium

poliu

m ssp

au

rasia

nu

m


51

Tableau 4 : composition chimique de HE de Teucrium polium ssp aurasianum

pic Compound RI (%)

1 α-thuiene 742 0.48

2 α-Pinene 782 25.42

3 Camphene 822 0.23

4 n-Butylbenzene 846 0.09

5 β-Pinene 953 8.59

6 β-Myrcene 1032 5.19

7 D-Limonene 1240 34.72

8 β-Ocimene 1323 0.30

9 α-Terpinolene 1621 0.21

10 Isopinocarveol 1832 0.18

11 Myrtenal 2188 0.17

12 Carvone 2502 0.35

13 acetate 2763 0.25

14 Copaene 3310 0.17

15 Elemene 3421 0.17

16 Caryophyllene 3976 2.66

17 α-Caryophyllene 3954 0.64

18 β-Farnesene 3849 0.89

19 Germacrene D 3775 1.74

20 α -Selinene 3580 0.50

21 1,5-Heptadiene 4038 0.87

22 Amorphene 4145 0.22

23 ϒ-cadinene 4158 0.53

24 Cubenene 4220 2.36

25 α-Elemol 4383 4.21

26 Spathylenol 4510 0.42

27 caryophyllene oxide 4530 0.45

28 Cubenene 4792 0.28

29 ϒ-Eudesmol 4817 0.81

30 Naphthalene 4877 2.40

31 β-Eudesmol 4917 0.75

32 α -Eudesmol 4935 0.74

33 α-Cadinol 4961 1.28

34 Ledene 5022 1.08

35 Thujol 5079 0.64

totale 99,99

Le tableau de composition chimique de l'huile essentielle de Teucrium polium est caractérisé

par la présence de quatre composés majoritaires, qui représentent à eux seul 56,11 % de la

composition chimique de cette l'huile essentielle.


52

Figure 18: Distribution des composants majoritaire de HE de Teucrium polium ssp

aurasianum

Trente-cinq constituants sont identifiés représentant un total de 99,99 % de cette essence. Cette

huile essentielle présente comme composés majoritaires le D-limonène (34,72 %), l’α-pinène

(25,42 %), le β-Pinène (8,59 %), le α-Elemol (4,21 %)

D-limonène α-pinène β-Pinène

Figure 19 : les composants majoritaires de HE de Teucrium polium ssp aurasianum

α-Pinene;

25,42

D-Limonene;

34,72

β-Pinene;

8,59

α-Elemol;

4,21


53

La composition chimique de notre huile essentielle extraite de la plante Teucrium polium ssp

aurasianum est différente de celle de[101] dont la teneur en α-cadinol est beaucoup plus

importante (46,8 %).

Et différente aussi de[124] qui l’α-pinène est produit majoritaire de (12,52%) et de[137] de

(31.24%) de patchouli alcohol comme produit majoritaire

C'est la première fois que l'huile de T. polium s'est avéré contenir le limonène à de tel

pourcentage élevé, malgré[138] trouve le limonène comme produit majoritaire mais de faible

pourcentage (11.18%) . Cette différence de composition dans de nombreux travaux sur la

même espèce Cette différence de composition est due probablement à diverses conditions

notamment l’environnement, le génotype, l’origine géographique, la période de récolte, le lieu

de séchage, la température et la durée de séchage, les parasites et la méthode

d’extraction[139].

IV.5- Activités biologiques

IV.5.1- Activité antioxydante

Dans le but de déterminer l'activité antioxydante des fractions obtenues pour l’espèce étudiée,

on a utilisé deux méthodes :

La méthode du piégeage du radical libre DPPH (2,2-diphényl- I -picrylhydrazyl).

L'essai est basé sur la réduction du DPPH dissout dans du méthanol ce qui cause une diminution

de l'absorbance mesurée à 517 nm.

Méthode de la réduction du fer FRAP (Ferric reducing antioxidant power)

IV.5.1.1- Mesure du pouvoir de piégeage du radical DPPH*

La capacité de donation des électrons par les huiles essentielles est mise en évidence

par une méthode spectrophotométrique, en suivant la disparition de la couleur violette d’une

solution méthanolique contenant le radical libre DPPH + (1,1-Diphenyl-2

picryhydrazyl)[140].


54

Tableau 5 : Activité antioxydante par la méthode de DPPH

DPPH IC50 (µg/ml)

Teucrium polium aurasianum 58.6336 ± 0.7207

l’acide ascorbique 6.4584 ± 0.4256

Figure 20 : Activité antiradicalaire des huiles essentielles Teucrium polium aurasianum

et l’acide ascorbique

Les résultats semblent que le pourcentage d’inhibition du radical libre augmente avec

l’augmentation de la concentration soit pour l’acide ascorbique ou pour l’huile essentielle de

Teucrium polium aurasianum

On remarque que le pourcentage d’inhibition du radical libre pour l’huile essentielle est

inférieur à celui de l’acide ascorbique pour toutes les concentrations utilisées.

L’IC50 est inversement lié à la capacité antioxydante d'un composé, car il exprime la quantité

d'antioxydant requise pour diminuer la concentration du radical libre de 50 %. Plus la valeur

d’IC50 est basse, plus l'activité antioxydante d'un composé est grande.

L’huile essentielle de Teucrium polium pouvait ramener le radical libre stable 2.2 diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) au diphenyl-picrylhydrazine jaune-coloré avec un IC50 de

58,6336±0,7207 µg/ml montrant une activité antioxydante inférieure à celle de l’acide

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100

Po

uv

oir

an

tira

dic

ala

ire

(%

)

Concentration (µg/ml)

Teucrium polium ssp.

aurasianum Labiatae

Acide ascorbique


55

ascorbique. Il semble d’après ces résultats que l’antioxydant le plus efficace avec un IC50 de

6,4584±0,4256 µg/ml par rapport à l’huile essentielle étudiée.

[141] ont trouvé une valeur d’IC50 de 95 µg/ml en étudiant l’effet antioxydant de l’huile

essentielle de Teucrium polium de (Bejaïa Algérie), ce qui est inférieur au pouvoir antioxydant

de l’huile essentielle de Teucrium polium aurasianum malgré même espèce. D’autre part à

comparer avec autre espèce Teucrium marum (Lamiaceae) de[142] ils trouvent une valeur

d’IC50 de 13.13 µg/ml ce qui est supérieur par rapport à notre étude

D'une manière générale, notre espèce possède une activité antioxydante très faible en

comparaison avec celle de l'acide ascorbique qui est un antioxydant puissant.

IV.5.1.2- Méthode de la réduction du fer FRAP

Figure 21 : Réduction du fer par huile essentielle de Teucrium polium aurasianum et

l’acide ascorbique

Ces résultats montrent que le pouvoir réducteur dépendant à la concentration de l’huile

essentielle.

D’après la figure 17, on constate que l’huile essentielle possède une bonne action vis-à-vis de

Fe3+ présent dans la solution testée.

La figure 17 montre que les concentrations de l’huile essentielle de 10 jusqu’à 70 µg/ml où l’on

enregistre une augmentation de l’absorbance de 0,196 à 0,613. Par contre mêmes

concentrations de l’acide ascorbique augmentent l’absorbance de 0,069 à 0,539 qui présente un

pouvoir de réduction nettement supérieure à celui de l’acide ascorbique.

Le tableau 6 montre les valeurs de EC50


56

Tableau 6 : Activité antioxydante par la méthode de FRAP

FRAP EC50 (µg/ml)

Teucrium polium aurasianum 48.1936±0.5628

l’acide ascorbique 66.3561±0.3471

L’activité antioxydante de l’huile essentielle serait probablement liée aux composants

majoritaires une étude de[143] a signalé les deux composées on l'occurrence le limonène et le

β-Pinène ont présenté des propriétés importante

Limonène est un monoterpène présent dans les agrumes utilisé comme agents aromatisants

d'aliments. Il est prouvé que les monoterpènes possèdent une activité antioxydante[144].

IV.5.2- Activité antibactérienne

Tableau 7 : Activité antibactérienne des huiles essentielles de Teucrium polium

aurasianum

Microrganism Inhibition zone (mm) MIC (mg/ml)

E.coli 0 /

Leisteria 0 /

salmonella 14,76±0,25 0,66

Proleus 11,23±0,25 /

staphylococcus aureus 21,46±0,55 0,33

staphylococcus SP 20,6±0,53 0,33

Pseudomonas aeruginosa 9,73±0,25 /

Klebsiellapneumonia 14,9±0,17 0,5

Le tableau 7 indique Les résultats qui montrent clairement l’effet significatif du Teucrium

polium aurasianum sur certaines souches étudiées, On peut le voir dans le tableau 7,

staphylococcus aureus et staphylococcus SP sont les micro-organismes les plus sensibles avec

la zone d'inhibition le plus élevé (21,46 mm) et (20,6 mm) respectivement et plus faible

valeur MIC (0,33 pl / ml). D'autre part, on remarque à partir du tableau 7 que E.coli et

Leisteria étaient résistants à cette huile essentielle.

Selon la bibliographie disponible, il n’existe pas de travaux déjà réalisés sur l’activité

antimicrobienne de l’huile essentielle de Teucrium Polium aurasianum, pour cela, les

résultats de cette étude sont comparés à ceux obtenus pour d autre espèce de Teucrium

polium


57

Les résultats obtenus par[138] montrent une activité sur E.coli et une résistance de la

Pseudomonas par contre nos résultats présentent pas une activité sur E.coli et active sur

Pseudomonas de diamètre d’inhibition de 10 mm

Selon Derwich et al[145] l’activité antimicrobienne des monoterpènes est expliquée par la

présence des groupes d'hydroxyles phénoliques capables de former des liaisons hydrogènes

avec les emplacements actifs des enzymes de la cellule ciblée.

Pour une même plante aromatique on a une composition différente en huiles essentielles,

suivant les parties utilisées, la période de cueillette, la localisation géographique et même

suivant le protocole d'extraction[146]. Cela s’explique par la notion de chemotype qui présente

de grandes variabilités, quantitatives et qualitatives ce qui confirme les divergences des résultats

rapportés pour une plante donnée[147].

Trois grands mécanismes permettent aux bactéries de résister face à un antibiotique.

Le premier mécanisme consiste pour la bactérie à modifier la cible de l’antibiotique.

Cette modification peut être soit directement due à une modification de la structure de la

cible soit due à une modification de la voie de synthèse de cette cible pour lui conférer une

nouvelle structure tridimensionnelle. Ce mécanisme va jouer sur différents composants

cellulaires. Prenons l’exemple des macrolides qui agissent en se fixant aux ribosomes des

bactéries. Pour contourner cet effet, une mutation génétique permet de synthétiser un

nouveau ribosome qui ne sera pas reconnu par l’antibiotique.

Ce mécanisme est globalement utilisé contre la majorité des antibiotiques notamment chez les

bactéries Gram négatives qui, en modifiant les cibles des antibiotiques, développent un haut

degré de résistance.

Les antibiotiques d’une même famille ayant généralement la même cible, ce mécanisme

confère aux bactéries une résistance croisée pour toutes les molécules de la même famille

Cliniquement, cette résistance ne se traduit pas toujours par un échec thérapeutique. En effet,

certaines familles d’antibiotiques conservent une efficacité car leur CMI n’est pas

forcément proportionnellement augmentée[148-150]


58

Le deuxième mécanisme consiste à détruire ou modifier l’antibiotique par une inactivation

enzymatique l’empêchant alors de reconnaître sa cible. Ce mécanisme se rencontre

surtout contre les bêta-lactamines, les macrolides, le chloramphénicol et les aminosides.

Une résistance croisée est également possible mais moindre que pour le premier mécanisme

[148-150]

Enfin, les bactéries peuvent également rendre leurs cibles inaccessibles. Ce

mécanisme consiste soit à diminuer la perméabilité membranaire à la pénétration de

l’antibiotique soit à rejeter l’antibiotique par phénomène actif d’efflux.

La diminution de la perméabilité membranaire est rendue possible grâce à une mutation des

gènes codant les porines membranaires, portes d’entrée des antibiotiques, réduisant leur

diamètre et empêchant leur passage dans le milieu intracellulaire.

Le phénomène d’efflux est un mécanisme actif rejetant directement les antibiotiques à l’aide de

pompes membranaires spécifiques[148-150]. La figure 22 illustre ces différents

mécanismes.

Figure 22 : Exemples des mécanismes de résistance aux antibiotiques (d’après

l’Encyclopedia Britannica 2009)


59

IV.5.3- Activité antifongique

Pour étudier l’activité antifongique, nous allons discuter les résultats de deux espèces de

champignon fusarium solani et Alternalia arborescens car les huiles essentielles sont active

contre fusarium solani et ne sont pas active sur les autres souches donc on prend Alternalia

arborescens comme exemple aléatoire

IV.5.3.1- Les croissances mycéliennes :

L’utilisation des témoins pour faire une comparaison de l’effet des huiles essentielles contre

les champignons.

Figure 23 : Effet d’huile essentielle de Teucrium polium ssp. aurasianum Labiatae sur

les souches fongiques.

Les résultats de la croissance mycélienne montrés dans la figure 23 Nous observons l’effet

des différentes concentrations d’huile sur les souches fongiques

En l'absence des huiles essentielles on remarque un diamètre de croissance de 4,71 cm pour

Alternalia arborescens et 6,5 cm pour fusarium solani après l’augmentation de la

concentration des huiles essentielles on observe une décroissance mycélienne de fusarium

solani et n’est pas totale jusqu’à 3 cm

Par contre on remarque une stabilité de croissance mycélienne de Alternalia arborescens

4,7

1

4,6

0

4,4

6

3,6

5

4

6,5

0

5,0

2

4,4

9

4

3

0 . 0 0 % 0 . 0 5 % 0 . 2 5 % 0 . 5 % 0 . 7 5 %

Alternaria arborescens fusarium solani

Dia

mèt

re d

e cr

ois

san

ce

my

céli

ènn

e (c

m)

Concentration d'HE (%)


60

IV.5.3.2- La cinétique de croissance mycélienne :

Figure 24 : Cinétique de croissance mycélienne en fonction de temps et concentration

des huiles essentielles de Teucrium polium ssp. aurasianum Labiatae

La figure 24 résume les résultats enregistrés sur la croissance mycélienne des souches

fongiques sous l’effet de l’huile essentielle de Teucrium polium aurasianum.

On remarque une croissance mycélienne de toutes les souches fongiques à la différente

concentration et sa commence après 72h de l’incubation, ce qui est marqué par leurs témoins.

IV.5.3.3-Taux d'inhibitions (TI)

Les taux d’inhibition de l’huile essentielle de Teucrium polium aurasianum sont consignés

dans les Figure ci-dessous :

Figure 25 : Taux d’inhibition des souches en fonction de la concentration

0

1

2

3

4

5

48 72 96 120 144 168 192

Dia

mèt

re d

e cr

ois

san

ce

my

céli

ènn

e (c

m)

Temps D'incubation (h)

Alternalia arborescens

0,00%

0,05%

0,25%

0,50%

0,75%

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

0.05% 0.25% 0.5% 0.75%

TI

(%)

Concentration d'HE (%)


fusarium solani

0

1

2

3

4

5

6

7

48 72 96 120 144 168 192

Dia

mèt

re d

e cr

ois

san

ce

my

céli

ènn

e (c

m)

Temps D'incubation (h)

Fusarium solani

0.00

%0.05

%0.25

%0.5%


61

L’analyse des résultats de la figure 25 montre que les huiles essentielles, présentent une activité

inhibitrice différente, le taux d’inhibition a augmenté avec l’augmentation de la concentration

des huiles

Pour Alternalia arborescens, , Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, et Stemphylium

solani. on remarque une très faible inhibition

Pour Fusarium solani on remarque un taux d’inhibition de 52,17% est considérable par rapport

les autres souches

IV.5.3.3- Vitesse de la croissance mycélienne

Les rsultats présentés dans la figure 26 est de la vitesse de la croissance mycélenne en

fonction de différentes concentration des huiles essentielles on remarque une diminution de la

croissance de la vitesse par l’augmantation de la concentration des huiles essentielles cette

diminution claire on fusarium solani

Figure 26 : Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de l'augmentation de la

concentration d’huile essentielle de Teucrium polium ssp. aurasianum Labiatae

Les résultats du test antifongique sur les souches fongique montrent que l’huile essentielle de

Teucrium Polium Aurasianum a exercé un effet inhibiteur généralement très faible vis-à-vis

ces souches

La difficulté de développer une molécule antifongique est liée, d’une part à l’ultrastructure de

la cellule fongique qui présente trois barrières (la paroi cellulaire chitineuse, les ergostérols

membranaires et le noyau eucaryote) et d’autre part aux molécules antifongiques elles-mêmes

qui sont soit fongistatiques, toxiques, ou qui peuvent engendrer des résistances[151, 152].

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0.00% 0.05% 0.25% 0.5% 0.75%

Vit

esse

de

cro

issa

nce

(cm

/h)

Concentration d'HE


fusarium solani


62

Selon BELMEKKI[153] est étudié l’effet inhibiteur d’huile essentielle de Teucrium polium de

Tlemcen sur les souches Fusarium oxysporium, aspergillus flavus, Penicillium spp, Rhizopus

stolonfer les résultats ont montré que l’activité antifongique est très faible sauf contre

Penicillium spp qui présente un taux d’inhibition de 70% mais les autres souche une résistance

très forte cette huiles essentielle et de composition majoritaire suivante D-germacrène

(24.98%), B-germacrène (12.59%), β-pinène (11.32%) et en carvacrol (8.64%)

D’après PATTNAIK et al [154] l’activité antifongique d’une HE est à mettre en évidence avec

sa composition chimique, les groupes fonctionnels des composés majoritaires (alcools, phénols,

composés terpéniques et cétoniques) et les possibles effets synergiques entre les composants.

Ainsi, la nature des structures chimiques qui la constituent, mais aussi leurs proportions jouent

un rôle déterminant. Il est cependant probable que les composants minoritaires agissent de

manière synergique[155, 156].

Donc l'activité antifongique décroît selon le type de fonctions chimiques:

Phénols >Alcools> Aldéhydes> Cétones> Ethers> Hydrocarbures.

Un germe est dit résistant à un agent antimicrobien quand la CMI de celui-ci est supérieure à la

concentration sanguine maximale médicamenteuse à une posologie standard. Cette résistance

peut être naturelle ou acquise. On parle de résistance naturelle lorsque toutes les souches d’une

même espèce sont résistantes à l’antibiotique parce que la cible d’action de celui-ci est absente

ou inaccessible. La résistance est dite acquise quand une certaine proportion (parfois très

élevée) des souches d’une espèce normalement sensible à l’antibiotique devient résistante à son

action. Pour ce dernier type de résistance, 3 stratagèmes principaux sont connus chez les

bactéries, les virus et les champignons : le brouillage, le blindage et le camouflage. On parle de

brouillage quand le germe synthétise des protéines qui peuvent dégrader l’antibiotique et le

rendre inefficace par complexation. Il s’agit de camouflage lorsque le germe peut modifier la

cible de l’antibiotique si bien que celle-ci n’est pas reconnue, ce qui rend la cellule insensible à

cet antibiotique.

Enfin, quand le germe empêche l’accès de l’antibiotique aux cibles intracellulaires soit par

modification de la perméabilité membranaire, soit par mise en place d’un système d’expulsion

de l’antibiotique via une pompe membranaire qui refoule ce dernier, on parle de blindage.

Quatre mécanismes de résistance sont connus:

1. Altération du transport des molécules antifongiques

2. Modification moléculaire de la cible des antifongiques

3. Utilisation de voie métabolique compensatrice

4. Présence de structures multicellulaires complexes (biofilms)

Conclusion

63

L'exploitation du potentiel biologique des espèces végétales revêt un intérêt important, ainsi les

nouvelles démarches consistent à s'intéresser à la recherche des principes actifs dans les

produits naturels d'origines végétales.

Dans le but de la valorisation d’une des plantes de la famille Lamiacées issue de la région de

BATNA, en l’occurrence Teucrium polium aurasianum, nous avons effectué un travail

permettant pour contribuer à la mise en évidence de l’activité biologique des huiles essentielles.

Notre travail a porté sur la partie aérienne d’une espèce de la famille de Lamiaceae, une des

familles les plus importantes dans la flore de l'Algérie.

Une identification botanique détaillée a été effectuée sur la partie aérienne l’espèces végétale

de Teucrium polium aurasianum Cette contribution porte sur l’étude et la mise en évidence des

activités biologique et l’évaluation des potentialités bioactives de l’huile essentielle de la plante

médicinale Teucrium polium ssp aurasianum de la famille Labiatae

Quelque expérience effectués sur la plante étudiée dont :

Extraction des huiles essentielles et identification de sa composition chimique par la technique

de GC/MS

Evaluation de l’activité antioxydante par deux méthodes (DPPH et FRAP)

Test de l’activité antibactérienne de l’extrait sur les souches bactérienne suivantes : Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae, Leisteria, Proteus, Pseudomonas aeruginosa, salmonella,

Staphyloccous aureus et Staphyloccous Sp

Et la détermination de l’activité antifongique sur les souches suivantes : Stemphylium solani,

Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Fusarium oxysporum et Alternalia arborescens.

Le rendement en huile essentielle de la partie aérienne de la plante Teucrium polium ssp

aurasianum est de 0,585 % (w/w). Cette valeur est inférieur aux rendements obtenus chez

d’autres espèces du même genre et supérieur à d’autres espèces

Ce rendement a été obtenu dans le deuxième jour de l’extraction après la récolte, donc pour un

meilleur rendement d'extraction des huiles essentielles ; l'extraction doit être effectuée au bout

d'une journée de séchage

64

Ce résultat permettra aux utilisateurs une meilleure gestion de la biomasse de cette espèce pour

espérer un rendement maximale.

D’aprs les résultats de l’évaluation de l’activité antioxydante (IC50= 58.6336 ± 0.7207 et EC50

48.1936±0.5628) (µg/ml)

On constate que l’huile essentielle possède une bonne activité antioxydante avec des faibles

concentrations

Les tests antimicrobiens effectués dans ce travail montrent que l’effet antibactérien de l’huile

essentielle de la plante Teucrium polium ssp aurasianum sur différentes souches bactériennes,

Gram positif et négatif est significatif sur certain souches bactériennes comme salmonella,

staphylococuis aureus, proleus, pseudomonas ; Et inactive sur deux souches bactériennes E.coli,

Leisteria.

L'étude de l'activité antifongique est réelisée par la technique de contact directe

malheureusement donnes de très faibles résultats

L'ensemble de ces résultats obtenus in vitro ne constitue qu'une première étape dans la

recherche de substance de source naturelle biologiquement active.

Des essais complémentaires seront nécessaires telque:

Un fractionnement des huiles essentielles de Teucrium polium aurasianum et l'étude de l'effet

des composés majoritaires

Détermination des autres activités biologiques de cette plante, à savoir les propriétés anti-

inflammatoires, antivirales……

Evaluation de la toxicité de ces huiles essentielles

A la lumière des résultats obtenus on peut conclure que l’huile essentielle de la plante Teucrium

polium ssp aurasianum présente un pouvoir antioxydant et antimicrobien très puissant sur les

souches pathogène et donne une nouvelle alternative dans la lutte biologique par les huiles

essentielles.

Nous invitons enfin les populations à une utilisation à rationnel des plantes médicinales, car un

usage abusif de ces plantes conduira sans doute à une raréfaction, voire leur totale disparition.

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Annexes

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72

Annexe 01 : Montage d’extraction des huiles essentielles

Extraction des huiles essentielle par Hydrodistillation (moyen de Clevenger)

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73

Annexe 02 : matériels d’analyse physico-chimique

Réfractomètre pH mètre

Densimètre matériels utilisés pour la mesure d’indice d’acide

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74

Annexe 03 : Analyse chromatographique (GC/MS)

Chromatographe Agilent 6890, couplé avec un spectromètre de masse type Agilent

5975B

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75

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76

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77

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78

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79

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80

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81

Composition chimiques de l’huile essentielle de Teucrium polium aurasianum

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82

Annexe 04 : Activité antioxydants

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83

Annexe 05 : Activité Antibactérienne

Coulage des Boites pétri en milieu de culture

Préparation de l’inoculum

Placement des disques Incubation 24H à 37°C

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84

Annexe 06 : Activité antifongique

Identification Microscopiques des souches

Détermination de l’activité antifongique par méthode de contact direct

Publications

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ISSN : 0975-413X

CODEN(USA) : PCHHAX

Journal for Medicinal Chemistry, Pharmaceutical

Chemistry and Computational Chemistry

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Thèse doctorat 2 - univ-ouargla.dz DOCTORAT/BENCHEIKH...Remerciements En premier lieu, je remercie mon DIEU, notre Créateur pour m’avoir donné la force pour accomplir cette thèse