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T. Legler 20.03.07
Theorie der molekulargenetischen
RH-Bestimmung
Molekulargenetische RH-Bestimmung in der Schwangerschaft20. März 2007 in Kiel
Tobias J. LeglerAbteilung Transfusionsmedizin, Universitätsmedizin Göttingen
Zertifiziert nach DIN ISO 9001:2000
T. Legler 20.03.07
1. Molekulargenetik von RH, weak D, Partial D
2. RHD-Zygotie
3. Klinische Bedeutung der molekulargenetischen Blutgruppenbestimmung und Indikationsstellung
4. Keine Besprechung von Bandenmustern
5. Fetale RHD-Bestimmung aus mütterlichem Blut
T. Legler 20.03.07
Erythrozytäre Blutgruppensysteme
= Oligosaccharide = Peptidketten
ABOABO
Duffy
Kell
MN
Ss
Rh Kidd
T. Legler 20.03.07
Meilensteine in der Molekulargenetik1990 Avent ND et al.: cDNA cloning of Rh CcEe
1992 Le Van Kim C, et al.: cDNA cloning of RhD
1993 Lo YM, et al. Prenatal determination of fetal RhD status byanalysis of peripheral blood of rhesus negative mothers (cells).
1994 Chérif-Zahar B et al.: Organization of the gene (RHCE)
1995 Rouillac C, et al.: Transcript analysis of D categoryphenotypes predicts hybrid Rh D-CE-D proteins
1996 Poulter M et al.: Reliable C/c typing method
1997 Gassner C et al.: RHD/CE typing by polymerase chainreaction using sequence-specific primers
T. Legler 20.03.07
1998 Faas BH et al. and Lo YM et al.: Detection of fetal RHD-specific sequences in maternal plasma.
1999 Wagner FF et al.: Molecular basis of weak D phenotypes
2000 Okuda H et al. Complete sequence RHD and RHCE
2000 Singleton BK et al.: Pseudogene RHDψ
2000 Wagner FF and Flegel WA: RHD gene deletion occurredin the Rhesus box.
2001 Wagner FF et al.: RHD positive haplotypes in D negative Europeans
2002 Shao CP et al.: Molecular basis of DEL and D-negative in Chinese
T. Legler 20.03.07
Rh-Blutgruppensystem
– RhD Protein, • wenn vorhanden, Individuum Rh-
positiv (D+), ca. 83% unserer Bevölkerung
• wenn nicht vorhanden, Individuum Rh-negativ (dd), ca. 17% unserer Bevölkerung
– RhCcEe Protein,• exprimiert die Antigene C oder c sowie
E oder e
T. Legler 20.03.07
Evolution der RH GenfamilieWagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box
Blood 95:3662-8 (2000)
Chromosom 1p34-p36RHCESMP1
vor 5-12 Mio Jahren
RHCESMP1RHD
T. Legler 20.03.07
Rh-System (CcD.ee bzw. CDe/cde)
Chromosom 1RHCERHD
D Ce CDe
cdeChromosom 1
d
RHCE
ce
T. Legler 20.03.07
T. Legler 20.03.07
Schwache D-Phänotypen
D-Varianten
weak D (früher Du) Partial-D
D-Kategorie DFRDBTDHar
.....
DEL
„Partial DEL“
„weakDEL“
T. Legler 20.03.07
82,7
0,44 0,016
17,3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Häu
figke
it (%
)
D+ weak D D VI D- incl. DEL
Häufigkeit schwacher D-PhänotypenWagner et al. Infusionsther Transfusionsmed 1995;22:285
T. Legler 20.03.07
Weak D (Typ 1-53): Intrazelluläre AS
Avent und Reid: Blood 2000;95:375-387Legler TJ, Maas JH et al., Transfusion 1998;38:434-40Wagner FF, et al. Blood 1999;93:385-393, Wagner FF, et al. Blood 2000;95:2699-708
T. Legler 20.03.07
Punktmutationen bei Partial-D Phänotypen: Extrazelluläre AS
Avent and Reid: The Rh blood group system: a review. Blood 2000;95:375-387
Körmöczi GF, Legler TJ, et al. Molecular and serological Characterization of DWI,a novel "high grade" partial D. Transfusion 2004;44:575-580.
T. Legler 20.03.07
Genumlagerungenim RH System
Avent and Reid: The Rh blood group system: a review. Blood2000;95:375-387
Legler TJ, et al. DVa-category phenotype and genotype in Japanesefamilies. Vox Sang 2000;78:194-197.
T. Legler 20.03.07
D-negativer Phänotyp
D-negativ
RHD-Deletion RHD positivnicht exprimiert
RHD-RHCE-RHDHybridallele
Stopp-CodonFrame-ShiftSplice-SiteMissense
DEL
„Partial DEL“
„weakDEL“
T. Legler 20.03.07
RHD Allele bei D-negativen Individuen
Europäer1 1:1.536
Schwarze in Afrika2 82%
Chinesen3 24-40% (+DEL)6,4% (-DEL)
1 Wagner FF, et al.: BMC Genetics 2001;2:102Singleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8.3Shao Vox Sang 2002;83:156-161.
T. Legler 20.03.07
RHD ψSingleton BK et al.: Blood. 2000; 95: 12-8.
T. Legler 20.03.07
Ccdes
Faas et al. Transfusion 1997; 37:38-44
D-negativ, VS positiv (schwaches C, schwaches e)
RHD-Gen codiert C, Hybrid Exon 3 (RHD-CE(4-7)-RHD)
RHCE Gen codiert ce
Rh-Formel serologisch: dd (C)c ee
Molekulargenetisch: C-Reaktion von RHCE negativc-Reaktion von RHCE positivCdes-Reaktion positiv
T. Legler 20.03.07
DEL
RHD (IVS3+1G>A)
Wagner FF, Frohmajer A, Flegel WA: RHD positive haplotypes in D negative Europeans. BMC Genetics 2001;2:10
Shao CP, Maas JH, Su YQ, Köhler M, Legler TJ. Molecular background of Rh D-positive, D-negative, Del and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang 2002;83:156-161.
Wagner T, Körmöczi GF, Buchta C, Vadon M, Lanzer G, Mayr WR, Legler TJ. Anti-D immunization by DEL red blood cells. Transfusion 2005;45:520-526.
Körmöczi GF, Gassner C, Shao CP, Uchikawa M, Legler TJ. A comprehensive analysis of DEL types: Partial Del individuals are prone to anti-D alloimmunization. Transfusion 2005;45:1561-1567
RHD (K409K)(M295I)RHD
T. Legler 20.03.07
Häufige D negative RHD-Allele
RHD ψ
RHD-CE(3-7)-RHD
RHD (K409K)
RHD-CE(2-9)-D
T. Legler 20.03.07
Rhesus boxWagner FF, Flegel WA: RHD gene deletion occourred in the Rhesus box
Blood 95:3662-8 (2000)
RHCESMP1
hybrid Rhesus-box
upstream Rhesus-box downstream Rhesus-box
RHCESMP1RHD
T. Legler 20.03.07
Homologie und Nachweis der Hybrid Rhesus box
hybrid Rhesus box
downstream Rhesus box
upstream Rhesus box
identity region 1463 bp
TTTT
TTTT rnb31
rnb31
rez7
rez7
rez7
Pst
PCR-RFLP,Wagner und FlegelBlood 2000;95:3662-3668
hyb2-U
hyb2-U
hyb2-L
hyb2-L
PCR-SSP, Chiu et alClin. Chem. 2001;47:667-672
PCR-SSP + IPC, Perco et al.Transfusion 2003;43:335-359
u1-s
u1-s
T. Legler 20.03.07
Anwendungen der molekulargenetischen Rh-Bestimmung in der Schwangerschaft
Abklärung serologisch schwacher Reaktionen bei Schwangeren (und Neugeborenen)
Bestimmung der D-Zygotie bei Partnern von Anti-D immunisierten Frauen
D-Status des Feten bei Anti-D immunisierten Schwangeren
T. Legler 20.03.07
Molekulargenetik zur Entscheidung über Rh-Prophylaxe
Schwangere D-negativ: kann Anti-D bilden
D-positiv: bildet kein Anti-D
Fetus/Neugeborenes
D-negativ: ist nicht immunogen
D-positiv: ist immunogen
Rhesus-Immunisierungsregister: http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/RIR/Die Rhesus site http://www.uni-ulm.de/~wflegel/RH/W. Flegel and F.F. Wagner
Serologisch schwacheoder unklare Reaktionen
Zygotiebestimmung
Pränataldiagnostikbei MHN
T. Legler 20.03.07
Molekulargenetik zur Entscheidung über Rh-Prophylaxe
Serologisch schwacheoder unklare Reaktionen
Zygotiebestimmung
Pränataldiagnostikbei MHN
Schwangere mit serologisch schwachem D solltenbei weak D Typ 1-3 keine Rh-Prophylaxe erhalten, beianderen D-Varianten ist die Rh-Prophylaxe sinnvoll.
Bei Neugeborenen sollten serologische Methodenverwendet werden, die auch sehr schwache D-Variantenerfassen.
Ein molekulargenetisches RHD-Screening beiNeugeborenen müsste einfach und schnell sein, um rechtzeitig eine Aussage über die Rh-Prophylaxezu ermöglichen
T. Legler 20.03.07
Sequenzierung von RHDLegler TJ et al.: RHD sequencing: a new tool for decision making on
transfusion therapy and provision of Rh prophylaxis
Ds1 Ds2 Ds3 Ds4 Ds5 Ds6 Ds7 Ds8 Ds9 Ds10
M D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D- D+ D-M
100
300200
500
1000bp
bp
T. Legler 20.03.07
Bestimmung der RHD Zygotie bei Partnern von Anti-D Immunisierten
Serologisch schwacheoder unklare Reaktionen
Zygotiebestimmung
Pränataldiagnostikbei MHN
Bei Paaren mit Kinderwunsch und Anti-DImmunisierung kann heute genauer bestimmt werden,ob ein D-positiver Mann hemi- (Dd) oder homozygoter(DD) Träger von RHD ist.
Beim hemizygoten Träger kann im Verlauf derSchwangerschaft der D-Status des Kindesbestimmt werden. Dieses ist zu 50% D-positivund zu 50% D-negativ.
Beim homozygoten Träger können Unter-suchungen zur Bestimmung des kindlichenD-Status vermieden werden.
T. Legler 20.03.07
Vorgehen bei Zygotiebestimmung
Test für hybrid-Rhesus Box
D-positiver Partner
1 D-negatives Allel
1 D-positives Allel
+ -
Test für nicht exprimiertes
RHD
1 D-negatives Allel
1 D-positives Allel
+
2 D-positive Allele
-
Perco P, et al. Transfusion 2003;43:335-339
RH-TypeRHD ψCdes
DEL
T. Legler 20.03.07
Molekulare Diagnostik bei Schwangeren mit Anti-D
Serologisch schwacheoder unklare Reaktionen
Zygotiebestimmung
Pränataldiagnostikbei MHN
Beim hemizygoten Partner sollte ab der 11. SSWder fetale D-status aus mütterlichem Blut untersuchtwerden.
Nur bei RHD negativem Ergebnis für fetales RhDaus mütterlichem Blut und sonographischen Zeicheneiner Anämie sollte über Amniozentese der fetale RHD-Status untersucht werden.
Bei RHD positivem Ergebnis für fetales RhDaus mütterlichem Blut besteht bei invasivenEingriffen grundsätzlich eine hohe Gefahr derBoosterung des Immun-Anti-D.
T. Legler 20.03.07
ZusammenfassungBei Schwangeren mit unklarem D-Status sollte weak D Typ 1-3
berücksichtigt werden, um eine falsch positive D-Bestimmung und damit eine fehlerhafte Unterlassung der Rh-Prophylaxe zu vermeiden.
Die Beratung von Partnern mit Allo-Anti-D erfolgt nach Bestimmung der D-Zygotie des Mannes durch Bestimmung der Hybrid Rhesus Box.
Die fetale D-Bestimmung bei MHN sollte aus mütterlichem Blut erfolgen
D-Varianten mit Allo-anti-D Bildung sollten molekulargenetisch untersucht und ggfls. sequenziert werden.
Bei D-negativen Patientinnen mit Allo-Anti-D und Vortransfusionen sollte eine Look-back Untersuchung zeigen, ob unter den Blutspender evtl. DEL Spender die Immunisierung hervorgerufen haben.
T. Legler 20.03.07
The SSpecial Non-Invasive AAdvances in
FFetal and Neonatal EEvaluation Network
Network of excellence sponsored under the EU’s Framework programme 6 ‘Life Sciences, Genomics and Biotechnology for Health’
www.safenoe.org
Chair of steering committee Neil Avent ([email protected]) Scientific Director Sinuhe Hahn ([email protected])
T. Legler 20.03.07
50 Partner in 19 Nationen
6. EU-Rahmenprogramm
T. Legler 20.03.07
Bis 1% Risiko einer Fehlgeburt
Kaum möglich vor der 11. SSW
Die derzeitige Pränataldiagnostik ist of invasiv
CVS
CORDOZENTESE
AMNIOZENTESE
ChromosomenanomalieMonogene ErkrankungenHämoglobinopathien
T. Legler 20.03.07
SAFE SAFE network: network: ZielZiel
Einführung eines kosteneffizienten, nicht-invasiven Pränatalscreenings
und Neugeborenenscreenings durch Schaffung von lang anhaltenden
Partnerschaften innerhalb und außerhalb der Europäischen
Gemeinschaft
März 2004 – Februar 2009
50 Partner aus 19 Staaten
12 Millionen EUR
T. Legler 20.03.07
Vorteil:• Komplettes fetales Genom
Probleme:• Sehr wenige! 12-20/ml mütterl. Blut
(Mergenthaler et al., JHC 2005, 53 (3): 319-322)
• Bis jetzt keine perfekten Marker• Persistenz über längere Zeit
(Bianchi et al., Med. Science, 1996; 93 (2), 705-708)
Intakte fetale Zellen im mütterlichen Blut
T. Legler 20.03.07
Quellen fetaler Marker immütterlichen Blut
Schwierig zu isolieren, möglicherweise viele Jahre persistent
FetaleFetale ZellenZellen imim mmüütterlichentterlichen BlutBlutErythroblastenThrophoblastenLeukozyten
ZellfreieZellfreie fetalefetale DNADNA imim mmüütterlichentterlichen KreislaufKreislauf
Ab der 5. SSW nachweisbarMetabolisierung innerhalb von 30 Minuten nach Entbindung3 – 6% der gesamten zirkulierenden freien DNA im Plasma
T. Legler 20.03.07
• Apoptose fetaler Zellen?• Plazenta! Keine starre Barriere
Trophoblasten(Guibert et al.,Hum.Repr.,2003;18 (8), 1733-36)
Ursprung fetaler DNA im Plasma
T. Legler 20.03.07
Abbau fetaler DNA nach Entbindung Rasche Clearance (Lo et al. Am J Hum Gen,1999; 64:218-24 ) :
T1/2 = 16 minutes (range 4-30)
T. Legler 20.03.07
SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisse
Bestimmung des fetalen RHD status ausmütterlichem Blut– Wird in mehreren Staaten Europas bei alloimmunisierten
Schwangeren angewendet. In Deutschland: UniversitätGöttingen, Abt. Transfusionsmedizin und DRK Oldenburg
– SAFE unterstützt Studien zur routinemäßigen Bestimmung des fetalen RhD Status aus mütterlichem Blut vor der antenatalenRh-Prophylaxe (indikationsbezogene Rh-Prophylaxe)
– Bestimmung von C, c, E, e, Kell, Duffy, HPA aus fetaler DNA in mütterlichem Blut.
– Etablierung von Kontrollmaterialien (Standards) und Standardisierung von Bestimmungsmethoden durchinternationale Ringversuche
T. Legler 20.03.07
Schwangerschaft ohne Rh-Prophylaxe
Schwangerschaft mit postnataler Rh-Prophylaxe
Schwangerschaft mit prä- und postnataler Rh-Prophylaxe
13.2% pro D+ Schwangersch.
1.8% pro D+ Schwangersch.
0.14% pro D+ Schwangersch.
Bowman J: Transfusion 2003;43:1661-1666
Rate der Anti-D Alloimmunisierung
T. Legler 20.03.07
Neuere Daten• Die antinatale Rh-Prophylaxe halbiert das Risiko einer Rh-Immunisierung und
eines schweren M. haemolyticus neonatorum (Koelewijn et al. DGTI 2006, 3 Jahre Studie, 600.000 Schwangerschaften in den Niederlanden:Neue Anti-D Immunisierungen im 1. Trimester von Schwangeren mit mind. einem D+ Kind)
Nurpostnatal
Ante + postnatal
Allo-Anti-D 58 (0,69%) 39 (0,31%)KeineImmunisierung 8687 12537
T. Legler 20.03.07
Anti-D Immunglobulin
• Blutprodukt• Freiwillige, hyperimmunisierte
Plasmaspender• Weltweiter Mangel• Kosten
T. Legler 20.03.07
Studien in GöttingenLegler TJ, Lynen, R, Maas JH, Pindur G, Kulenkampff D, Suren A, Osmers R, Köhler M. Prediction of fetal Rh D and Rh CcEephenotype from maternal plasma with real-time polymerase chain reaction. Transfusion Science 2002;27:217-223.
1. Studie: Vergleich der Genotypisierungsergebnisse aus Amnionpunktat und peripherem Blut 7.-21. SSW.
2. Studie: Vergleich der RHD Genotypisierungsergebnisse aus Blut von Rh-negativen Schwangeren in der 22.-34. SSW mit anamnestischen Angaben (Mutterpaß etc.) der Probandinnen nach Geburt (163 Einsender).
T. Legler 20.03.07
Kosten-Nutzen Analyse: Niederlande• Szenarien:
(34.000 D-negative Frauen, pränatale Rh-Prophylaxe 1000 IU (= 48 EUR) in der 30. SSW
– Alle D-negativen Frauen erhalten eine generelle pränatale Rh-Prophylaxeund eine postnatale Rh-Prophylaxe nach D-Bestimmung ausNabelschnurblut
• 6.6 Mio Euro
– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhaltenentsprechend dem Ergebnis eine Rh-Prophylaxe. Die postnatale Rh-Prophlaxe erfolgt nach D-Bestimmung aus dem Nabelschnurblut.
• 3.9 Mio Euro
– Alle D-negativen Frauen werden mit PCR gescreent und erhaltenentsprechend dem Ergebnis eine prä- und postnatale Rh-Prophylaxe
• 3.5 Mio Euro
C. Ellen van der Schoot, 7. März 2007, SAFE Workshop in Göttingen
T. Legler 20.03.07
Fazit: Die pränatale Anti-D Prophylaxe ist oft nicht indiziert!
15-18 % aller Schwangerschaften betrifft D-negative Frauen
In 40% der Schwangerschaften bei D-negativen Frauen ist eine Anti-D Prophylaxe nicht indiziert, da der Fet D-negativ ist.
Im Falle eines D-positiven Feten würde nach Geburt eine sofortige Rh-Prophylaxe möglich werden, die Blutgruppenbestimmung aus Nabelschnurblut müßte nicht abgewartet werden.
Somit wäre die Rh-Prophylaxe effizienter und möglicherweise könnten hierdurch weitere Kosten durch eine verlängerte Liegedauer der Patientinnen vermieden werden.
T. Legler 20.03.07
SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisseBestimmung des fetalen Geschlechts aus
mütterlichem Blut• Indikation bei geschlechtschromosomal vererbten
Erkrankungen und bei Frauen mit angeboreneradrenaler Hyperplasie. Durch die Y-Chromosom-Testung konnten die invasiven Eingriffe um 50% reduziert werden.
• Standardisierung innerhalb Europas
• Labore in Tschechien, England, Frankreich, Israel, Italien, Niederlanden, Schottland, Spanien.
T. Legler 20.03.07
SAFESAFE -- ErgebnisseErgebnisse
Monogene Erkrankungen• Etablierung einer Biobank für Familien mit Chromosomenanomalien
und monogenen Erbkrankheiten für den Fall, dass neueTechnologien sich im Labor durchsetzen.
• Umfangreiche Untersuchungen bei Thalassaemie– Eine wachsende Zahl von Primer/Sonden für die häufigsten
Mutationen bei ß-Thalassämie wurden etabliert.
• Eine Diagnostik der Achrondroplasie aus mütterlichem Blut wurdeentwickelt.
T. Legler 20.03.07
SAFESAFE –– AusblickAusblick
In-house verfügbar• Screening für fetales RhD zur Einführung der indikationsbezogenen Rh-
Prophylaxe• Bestimmung des fetalen Geschlechts• Pränataldiagnostik für Paternale genetische Marker
Neue Forschungsansätze für andere Erkrankungen• Besseres Screening für Down Syndrom oder andere Aneuploidien durch
Proteomics oder Epigenetics• Bessere Diagnositik zur Vorhersage von Schwangerschaftskomplikationen
(Präeklamsie, IUGR, Frühgeburtlichkeit)• Diagnostik für X-chromosomal vererbte und rezessive Erkrankungen
T. Legler 20.03.07
DanksagungenDanksagungenMolekulargenetikJens-Holger MaasNadja BustamiVolker WiemannChao-Peng ShaoSerjey LukinElisabeth BinderPaul PercoGünther KörmöcziThomas WagnerHitoshi Ohto etc. etc.
Consensus EmpfehlungenFranz F. WagnerWilly A. FlegelChristoph GassnerHartmut Kroll
Mütterliches BlutSina MüllerSibylle DammeMichael KöhlerWolfgang EngelIris BartelsGünther EmonsEndokrinologikumKai Gutensohn163 Gynäkologen
Kit-EntwicklungMartina PragerNicolas Sachsenberg
SAFE PartnerC Ellen van der SchootGeoff DanielsKirstin Finning
T. Legler 20.03.07