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Jocelyn CERALINE
EA 4438/UdS/Faculté de Médecine/EA4438Equipe Signalisation et cancer de la prostate
Service d’Hématologie et d’Oncologie – HUS
Mécanismes de l’apoptose
The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Les notions de mort cellulaire
La nécrose est une mort cellulaire accidentelle faisant suite à une agression très violente.
Elle induit une lyse cellulaire provoquant une réaction inflammatoire.
Événements non génétiquement programmés
Gonflement des organellesCaryolyseLibérations des enzymes lysosomales
Rupture des membranes et désintégration de la cellule
Réaction inflammatoire
1 2
1.
2.
Les notions de mort cellulaire
Événements génétiquement programmés
1. La sénescence
Arrêt irréversible de la prolifération cellulaire due à l’érosion des télomères.
Locus INK4a/ARF/INK4b 35 kb sur le chromosome 9p21
Epissage alternatif conduisant à l’expression de trois gènes suppresseurs de tumeurs : p15INK4b, p16INK4a et ARF
p16INK4a et ARF partagent les mêmes exons 2 et 3, mais sont traduits dans un cadre de lecture différent
Deux protéines distinctes (ce ne sont pas des isoformes) avec des fonctions distinctes.
Levée de l’inhibition de deux gènes suppresseurs de tumeurs pRB et p53.
Kim and Sharpless, Cell 127, Oct. 2006; p265
Les notions de mort cellulaire
Événements génétiquement programmés
2. L’autophagie
L’autophagie correspond à une vacuolisation de tout ou d’une partie des constituants du cytoplasme.
Sarkar et al. Nat. Chem. Biol. 3: 331-338 (2007
Les vacuoles sont ensuite présentées aux lysosomes pour une dégradation complète.
L’autophagie est considérée comme une adaptation de la cellule à son environnement.
C’est aussi un moyen utilisé par la cellule pour éliminer des constituants cytoplasmiques endommagés ou surnuméraires.
Elle dépend de la voie de signalisation de mTor (target of rapamycine).
Excessive, elle induit une mort cellulaire autophagique.
Les notions de mort cellulaire
Événements génétiquement programmés
3. L’apoptose ou mort cellulaire programmée
Description de nouvelles caractéristiques morphologiques de cellules mourantes.
Modifications distinctes de celles observées lors de la nécrose.
Résultat d'un programme endogène sous-jacent de mort cellulaire appelé apoptoseou mort cellulaire programmée, suicide cellulaire.
Le nom apoptose fait référence à la chute programmée des feuilles à l'automne : apo pour éloignement et - ptose pour chute.
Première description par Kerr, Wyllie et Currie en 1972 (Br. J. Cancer 26, 1972, 239-257)
Apoptose
Processus par lequel des cellules déclenchent leur auto-destruction enréponse à un signal.
C'est une mort cellulaire physiologiquegénétiquement programmée, nécessaire à lasurvie des organismes pluricellulaires.
Rôle important au cours de l’embryogenèse.
L’apoptose est en équilibre constant avec la prolifération cellulaire, et contribue ainsi à l’homéostasie tissulaire.
L’apoptose est une cible des mécanismes moléculaires conduisant au cancer et à la résistance thérapeutique.
Apoptose
Observation microscopique de l’apoptose
Condensation périnucléaire de la chromatineDiminution du volume cellulaire
Fragmentation de la cellule
Phagocytose des cellules fragmentées par les macrophages
Les membranes plasmiques ne sont pas détruites
Il n’y a pas d'inflammation
La cellule émet des signauxentrainant sa phagocytose
par les macrophages.
Phénotype apoptotique
Modifications biochimiques de la membrane cytoplasmique
La membrane cellulaire garde sa cohésion tout au long du processus d’apoptose mais elle bourgeonne transitoirement.
Sa composition biochimique change : Il y a externalisation de la phosphatidylsérine.
Il s’agit d’un phospholipide anionique initialement situé sur le feuillet interne de la membrane cytoplasmique.
Cette externalisation implique l’inhibition de l’aminophospholipide translocase.
La sphingomyéline se déplace en sens opposé et devient accessible aux sphingomyélinases qui la dégradent.
Mise en évidence de l’externalisation de la phosphatidylsérine
Phénotype apoptotique
Des modifications morphologiques et une fragmentation de l’ADN
Bourgeonnement de la membrane cytoplasmique et présence de corps apoptotiques
Marquage avec un fluorochrome, le DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) qui se fixe spécifiquement àl'ADN.
Fragmentation de l'ADN causée par les endonucléases induites durant le processus apoptotique.
Coupure internucléosomale de l'ADN conduisant à la libération de fragments oligonucléosomaux typiques de l'apoptose de 180-200 paires de bases.
Visualisation de ces fragments sur un gel d'agarose sous forme de bandes multiples formant une "échelle d'ADN"(DNA ladder).
Phénotype apoptotique
Phénotype apoptotique
Mécanismes moléculaires des changements nucléaires
La fragmentation de la chromatine (≈50 Kpb) est attribuée à la
migration nucléaire d’une flavoprotéine mitochondriale, Aif (apoptosis inducing factor).
La fragmentation de l’ADN (180-200 pb) est attribuée à la migration nucléaire de l’endonucléase G, initialement mitochondriale, et à la nucléase Cad (caspase activated Dnase).
D’autres endonucléases comme par exemple, la L-DNase II issue de la maturation de la protéine Lei (leucocyte elastase inhibitor) y contribuent également.
Clivage de protéines cibles intracellulaires assurée par des caspases.
Phagocytose des corps apoptotiques
Phénotype apoptotique
Phagocytose des corps apoptotiques
La phagocytose est assurée par des cellules « spécialisées » (macrophages) ou « amatrices » (hépatocytes, cellules dendritiques).
Les molécules de phosphatidylsérine externalisées et autres modifications de la membrane plasmique sont des signaux « mange-moi » adressés par la cellule apoptotique à la cellule phagocytaire.
La phagocytose comporte une étape de reconnaissance puis une étape d’ingestion.
http://www.biooncology.com/bioonc/research/apoptosis/index.m
Les voies de signalisation de l’apoptose
Voies intrinsèques de l’apoptose
Les caspases (cysteinyl aspartate-cleaving proteases)
Ce sont des protéases à cystéine.
Un résidu cystéine inclus dans une séquence peptidique de type QACXG (X= R, Q ou G) est présent au niveau de leur site catalytique.
Leurs sites de clivage au niveau des protéines cibles sont L/VEXD ou DXXD(X = n’importe quel acide aminé).
Les caspases clivent leur cible du côté carboxy-terminal de l’acide aspartique.
ApplicationsSubstratAc-DEVD-AFC [N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin)]
InhibiteurAc-DEVD-CHO [N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (aldéhyde) ].
Voies intrinsèques de l’apoptose
Les caspases
Les caspases sont synthétisées sous forme de zymogènes ou procaspases inactives.
Les procaspases seront ensuite clivées au niveau de résidus aspartate pour générer la caspase active.
On distingue les caspases initiatrices et les caspases effectricesde l’apoptose.
Les caspases
Caspase effectrices
Caspase initiatrices
C. elegans :
Mammifères :
Prodomaine
- DED (death-effector domain),
- CARD (caspase activation and recruitment
domain) ⇒ bouquet de 6 hélices α : module
d’interaction protéique.
Domaine d’activation auto-catalytique
Spécificité : L/VEXD.
Prodomaine court
Exécution de l’apoptose en clivant des
substrats spécifiques
Spécificité : DXXD (X, n’importe quel acide aminé).
Les protéines de la famille de gènes Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)
Au nombre de 25 à l’heure actuelle
Voies intrinsèques de l’apoptose
Les protéines de la famille de gènes Bcl-2 (B-cell lymphoma 2)
La surexpression de BCL-2 est un évènement courant au cours de la cancérogenèse.
Exemple : le réarrangement chromosomique t(14;18)(q32;q21) dans les lymphomes folliculaires humain
⇒ expression de BCL-2 sous le contrôle d’un promoteur fort du gène des chaînes lourdes des immunoglobulines.
Voies intrinsèques de l’apoptose
Les domaines BH1, BH2 et BH3 des anti-apoptotiques (Bcl-2) forment une structure globulaire permettant une interaction avec le domaine BH3 des pro-apoptotiques.
=> Inhibition des anti-apoptotiques
Equilibre ou déséquilibre en faveur ou en défaveur de l’apoptose
La mitochondrie est au cœur de la machinerie apoptotique
La mitochondrie séquestre dans son espace intermembranaire, une série de molécules solubles, les Simp (soluble intermembrane proteins).
Quand les Simps quittent cet espace ⇒ induction de l’apoptose.
C’est le cas du cytochrome c, une hémoprotéine assurant le transport des électrons entre les complexes III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale.
Au début du processus apoptotique, cette hémoprotéine quitte l’espace intermembranaire à travers des canaux spécialisés et passe dans le cytosol.
Voies intrinsèques de l’apoptose
La mitochondrie est au cœur de la machinerie apoptotique
Voies intrinsèques de l’apoptose
La sortie du cytochrome c de l’espace intermembranaire mitochondriale est contrôlée par les membres de la famille Bcl2.
Bcl2, anti-apoptotique, inhibe la sortie du cytochrome c.
Bax, Bad, Bak, et Bid, pro-apoptotiques, au contraire activent la sortie du cytochrome c.
Une fois dans le cytoplasme, le cytochrome c va ensuite interagir avec des partenaires pour activer la caspase-9
La caspase-9 activée entraine une activation en cascade des autres caspases dans le cytosol (caspases -3 et -7 sont les premières).
La protéine adaptatrice Apaf-1 connecte le cytochrome c à la cascade des caspases
Apaf-1 (apoptosis protease-activating factor-1) = protéine cytosolique de 130 kDa.
Domaine CARD en N-terminal, un domaine d’hydrolyse de l’ATP et des motifs WD40 répétés C-terminaux.
Cytochrome c cytosolique ↔ motifs WD40 exposés après hydrolyse de l’ATP.
⇒ Oligomérisation d’Apaf-1 et interaction avec la procaspase-9 via les motifs CARD.
=> Complexe Apaf-1/Procaspase9/Cytochrome c ou apoptosome.=> Activation de la caspase-9 initiatrice, puis de la caspase-3 effectrice.
Voies intrinsèques de l’apoptose
La voie intrinsèque de signalisation de l’apoptose
The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Clivage limité de protéines cytoplasmiques ou nucléaires impliquées dans :
- la régulation du cycle cellulaire
- la formation du cytosquelette
- la signalisation intracellulaire
- la réparation de l’ADN [Poly(ADP-ribose)polymérase ou Parp],
- l’apoptose.
Le clivage protéique conduit soit à une activation fonctionnelle, soit àune inactivation (Parp) de la protéine cible.
Rôle des caspases effectrices
http://www.biooncology.com/bioonc/research/apoptosis/index.m
La voie extrinsèque de signalisation de l’apoptose
Voies extrinsèques de l’apoptose
Les récepteurs à domaine de mort
Ces récepteurs membranaires appartiennent à la superfamille du TnfR (tumor necrosis factor receptor) : TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand), Fas, DR (Death Receptor) 3, 4, 5.
Ils possèdent dans leur partie intracytoplasmique C-terminale, une région conservée appelée domaine de mort DD (Death Domain, comme DED et CARD).
Ligand + Récepteur ⇒ Trimérisation ⇒recrutement de protéines cytosoliques FADD (fas associated death domain) ⇒ Complexe DISC(death inducing signaling complex) ⇒ activation des caspases 8 et 10.
Voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose
Trois classes de molécules contrôlent les activités des caspases
- BCL-2 qui bloque uniquement la voie mitochondriale en empêchant la sortie du cytochrome c des mitochondries.
Structure de la protéine Bcl-2 en complexe avec un ligand de type acyl-sulfonamide. Source PDB 2021
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose
Les protéines IAP pour Inhibitors of Apoptosis.
Domaines d’interaction avec les protéines à motif IBM (IAP-
binding motif)
E3 Ubiquitine ligase
Structure des IAPs Famille des IAPs
IBM : Tétrapeptide avec alanine en N-ter retrouvédans caspase initiatrice (caspase 9) et effectrice (caspase 7)
Ce sont des protéines d’environ 80 acides aminés
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose
Seule la protéine XIAP bloque in vivo les deux voies de signalisation de l’apoptose. Elle inhibe l’activation de la caspase-3 par la caspase-9 et empêche la libération de la caspase-3 de l’apoptosome.
La protéine Survivin inhibe l’apoptose sans interaction directe avec les caspases.
Le modèle proposé est une coopération avec XIAP.
Dario C. ALTIERI, Biochem. J. (2010) 430, 199–205
Lien avec le cancer
Surexpression de la survivin dans la plupart des tumeurs
Rôle important dans la survie des cellules cancéreuses
Facteur de risque de progression tumorale et d’échappement thérapeutique.
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l’apoptose
La protéine mitochondriale Smac/DIABLO
Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)
Inhibiteur des activités des IAPs.)
Voies de signalisation de l’apoptose induite par p53
Impact du génotype p53 sur la réponse des thymocytes à une
irradiation
Ce qu’il faut retenir
L’apoptose est une mort cellulaire génétiquement programmée
Processus d’élimination de cellules en voie de transformation
Voie intrinsèque faisant intervenir médiateurs anti-et proapoptotiques
Voie extrinsèque impliquant des récepteurs membranaires de mort
Importance de la mitochondrie
Différentes approches de mise en évidence de l’apoptose
Ne reflète pas toujours les effets cytotoxiques des agents anticancéreux
Applications en thérapie anticancéreuse des récepteurs de mort.
