Upload
others
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
„Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007- 2013”
Investeşte în oameni!
Universitatea de Vest “Vasile Goldiş” din Arad
Conducător de doctorat,
Prof. univ. dr.
Doctorand,
AUREL ARDELEAN
BLAGA (ORODAN) MARIA
- Arad-
2013
TEZĂ DE DOCTORAT
STUDIUL EFECTELOR RADIAŢIILOR DE TIP UV-
B ASUPRA EVOLUŢIEI UNOR PROCESE
MORFOLOGICE ŞI BIOCHIMICE, LA HIBRIZI DE
ZEA MAYS L., - IMPLICAŢII SOCIO-
ECONOMICE
2
CUPRINS
PREFAŢĂ
CAPITOLUL 1. CONSIDERAŢII GENERALE
1.1. IMPORTANŢA LUMINII ÎN CREŞTEREA ŞI DEZVOLTAREA
PLANTELOR
1.1.1. Reacţiile plantelor în funcţie de calitatea luminii
1.2. UNDELE ŞI RADIAŢIILE ELECTROMAGNETICE, SPECTRUL
ELECTROMAGNETIC
1.2.1. Mărimi fizice care descriu fenomenul de propagare a undelor
electromagnetice (lungimea de undă, perioada, frecvenţa)
1.2.2. Clasificarea undelor şi a radiaţiilor electromagnetice. Spectrul
electromagnetic
1.2.3. Energia radiaţiilor electromagnetice şi interacţiunea lor cu material
1.2.4. Interacţiunea radiaţiilor neionizante cu materia
1.2.4.1. Transferul energiei undelor electromagnetice către molecule.
1.2.4.2. Transferul energiei undelor electromagnetice către electronii periferici ai
atomilor şi moleculelor, Ee.
1.2.4.3. Transferul energiei undelor electromagnetice către molecule, având drept
rezultat creşterea reactivităţii chimice a acestora ori producerea unor
reacţii fotochimice.
1.3. INFLUENŢA EXERCITATĂ DE CĂTRE RADIAŢIILE ULTRAVIOLETE
(UV), DE DIFERITE LUNGIMI DE UNDĂ, ASUPRA PLANTELOR
1.3.1. Efectul mutagen al radiaţiilor UV
1.3.2. Impactul şi efectele induse de ozon asupra plantelor
1.3.3. Efecte şi modificări fiziologice şi celulare produse plantelor de acţiunea
radiaţiilor UV
1.3.4. Radiaţiile UV-B şi mecanismele de protecţie a plantelor împotriva acestora
1.4. CĂILE DE MORFOGENEZĂ LA PLANTE, RESPECTIV GENERAREA DE
CALUS (CALUSOGENEZA) ŞI ORGANOGENEZA (EMBRIOGENEZA,
CAULOGENEZA, RIZOGENEZA, FILOGENEZA) LA VITROCULTURILE
VEGETALE
1.4.1. Culturile in vitro: definiţie, caracterizare
1.4.2. Calusogeneza şi cultura de calus
1.4.3. Rizogeneza in vitro
1.4.4. Caulogeneza in vitro
3
1.4.5. Scurt istoric al cercetărilor efectuate asupra gramineelor iradiate cu
radiații ultraviolete (UV)
1.4.6. Biotehnologia vegetală, ecobioeconomia și siguranţa alimentelor, efectul
radiațiilor - implicaţiile socio-economice
CAPITOLUL 2. CERCETĂRI PROPRII
2.1. INTRODUCERE
2.2. SCOPUL CERCETĂRILOR EFECTUATE ÎN CADRUL TEZEI DE
DOCTORAT
2.2.1. Obiectivele cercetărilor efectuate în cadrul tezei de doctorat
2.3. MATERIALE ŞI METODELE DE LUCRU UTILIZATE ÎN PREZENTA TEZĂ
DE DOCTORAT
2.3.1. Materialul vegetal utilizat în experimente – explante şi cariopse de Zea mays
L., hibrizii Helga şi ZP471
2.3.1.1. Încadrarea taxonomică a speciei Zea mays L. (porumb)
2.3.1.2. Descrierea botanică a porumbului (Zea mays L.)
2.3.1.3. Structura anatomică a cariopselor de porumb (figura 6D)
2.3.1.4. Compoziţia chimică a cariopselor de porumb
2.3.1.5. Cerinţele plantelor de porumb faţă de factorii de vegetaţie
2.3.1.6. Importanţa furajeră a porumbului
2.3.1.7. Hibrizii de porumb
2.3.1.8. Zonele pedoclimatice de cultivare a hibrizilor de porumb
2.3.1.9. Particularităţi ale proceselor fiziologice în plantele de porumb (Zea mays L.)
2.3.2. Metodele şi tehnicile de lucru utilizate de către noi în efectuarea experimentelor
de vitrocultură de porumb (Zea mays L.), hibrizii Helga şi ZP471
2.3.2.1. Spaţiile de lucru utilizate pentru efectuarea experimentelor şi aparatura
utilizată
2.3.2.2. Etapele de prelucrare a materialului vegetal în vederea examinării la
microscopul electronic
2.3.2.2.1. Analiza materialului vegetal la microscopul electronic cu baleiaj
2.3.2.2.2. Evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor UV-B
2.3.2.2.3.1. Activitatea catalazei (CAT)
2.3.2.2.3.2. Activitatea guaiacol peroxidaza (POD)
2.3.2.2.3.3. Activitatea ascorbat peroxidaza (APX)
2.3.2.2.3.4. Activitatea glutation reductazei (GR)
4
2.3.2.2.3.5. Activitatea glutation-S-transferazei (GST)
2.3.2.2.3.6. Activitatea enzimatică a superoxid-dismutazei (SOD)
2.3.2.3. Vitroculturile vegetale – tehnici utilizate
2.3.2.3.1. Compoziţia mediului de cultură utilizat pentru efectuarea experimentelor
2.3.2.3.2. Particularităţi de metodică
2.3.2.3.2.1. Germinarea în condiții aseptice a cariopselor de porumb (Zea mays L.)
hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige - Skoog (1962), şi
Linsmaier-Skoog (1965), agarizat, lipsit de regulatori de creștere
2.3.2.3.2.1.1. Obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpaţi din cariopse de
porumb (Zea mays L.) hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige
- Skoog (1962), şi Linsmaier-Skoog (1965), agarizat suplimentat cu regulatori
de creștere
2.3.2.3.2.1.2. Obţinerea de calus din embrioni scalpaţi din cariopse de porumb
(Zea mays L.) hibrizii Helga şi ZP471, pe mediul de cultură Murashige -
Skoog (1962), şi Linsmaier-Skoog (1965), agarizat suplimentat cu regulatori
de creștere
2.3.2.3.2.2. Aclimatizarea vitoplantulelor în condiţii de laborator, transferate în
ghivece, continuarea iradierii după o schemă prestabilită şi realizarea
analizelor biochimice
2.3.2.3.2.3. Prelucrarea matematică a datelor experimentale
2.4. REZULTATE ŞI DISCUŢII
2.4.1. Iniţierea de vitroculturi de Zea mays, hibrizii Helga şi ZP471 din cariopse
germinate in vitro
2.4.1.1. Obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpați din cariopse
germinate in vitro
2.4.2. Evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor UV-B
2.4.2.1. Efectul tratamentului cu radiaţii de tip UV-B, cu lungimi de undă 280
nm-310 nm, asupra activităţii enzimelor antioxidante, pe parcursul dezvoltării
vitroplantulelor, aclimatizate, şi sub protecţie SMM
2.4.2.2. Efectul tratamentului cu radiaţii UV-B de lungimi de undă 280 nm -310
nm asupra activităţii enzimelor antioxidante în condiţii de temperatură
scăzută
CONCLUZII
BIBLIOGRAFIE
5
PREFAŢĂ
Omul, ca oricare organism viu, nu se află în afara legilor care guvernează viaţa pe
Terra, din contră, el s-a format şi s-a dezvoltat în interacţiune directă cu mediul natural şi cu
societatea din care acesta făcea parte.
Este important ca omul, în activitatea sa economică, să se limiteze strict la nevoile
sale, de asemenea să cunoască care sunt factorii care influenţează echilibrul ecologic şi
modul în care poate fi întreţinută stabilitatea vegetală. Monitorizarea modificărilor nu ne
poate furniza date suficiente referitoare la acomodarea plantelor la aceste schimbări. Doar
experimentele organizate în laboratoare pot elucida o serie de aspecte fiziologice și genetice
dar și măsurile care se impun a fi luate din punct de vedere bioecologic.
Biotehnologia, prin apariţia ei, a produs o adevărată revoluţie în întreg procesul de
proliferare a speciilor vegetale, prin mijloace moderne de lucru, într-un timp scurt putându-se
obţine un număr nelimitat de exemplare, în raport cu posibilităţile de înmulţire a acestora
prin intermediul tehnicilor tradiţionale de propagare a plantelor de interes economic.
În prezenta teză de doctorat am abordat subiectul „Studiul efectelor radiaţiilor de
tip UV-B, asupra evoluţiei unor procese morfologice şi biochimice, la hibrizi de Zea
mays L., - implicaţii socio-economice” deoarece schimbările indirecte cauzate de radiaţiile
ultraviolete - UV-B - cum ar fi impactul produs de ele asupra morfologiei plantelor, a
modului în care nutrienţii sunt distribuiţi în interiorul acestora, în diferite faze de dezvoltare
ale lor, ori a metabolismului acestora (primar sau/şi secundar) pot fi la fel de importante, sau
chiar mai importante, decât efectele negative directe ale radiaţiilor, în special a celor de tip
UV-B. Astfel de modificări pot avea implicaţii importante în menţinerea echilibrului
sistemului ecologic vegetal şi animal, dar şi în pepetuarea unor specii sau genotipuri pe
Terra, ceea ce influenţează, inerent, calitatea vieţii social-economice.
În această lucrare am dorit să evidenţiem particularităţile care guvernează creşterea şi
dezvoltarea plantelor de porumb (Zea mays L.) ce se află sub incidenţa radiaţiilor de tip UV-
B, de diferite lungimi de undă, utilizând ca modele experimentale doi hibrizi cultivaţi
actualmente pe zone agricole extinse, şi anume: Helga şi ZP.
Experienţa în domeniul cercetărilor ştiinţifice, căştigată pe parcursul realizării acestei
teze de doctorat, a stat la baza elaborării mai multor lucrări publicate, sau care se află sub
tipar ce sunt enumerate la sfârşitul lucrării. Informaţiile obţinute de către noi în cursul
cercetărilor întreprinse contribuie la completarea cunoştinţelor despre modificările şi
6
mutaţiile apărute la nivelul plantelor studiat, eficientizând sau îmbunătăţind şansele de
supravieţuire a plantelor tinere de Zea mays L., la radiaţii UV-B şi temperaturi letale.
Capitolul 1 din prezenta teză de doctorat, cuprinde partea de Considerații generale în
care sunt detaliate aspecte referitoare la importanţa luminii în creşterea şi dezvoltarea
plantelor, influenţa exercitată de către radiaţiile ultraviolete (UV), de diferite lungimi de undă,
asupra plantelor, scurt istoric al cercetărilor efectuate asupra gramineelor iradiate cu radiații
ultraviolete (UV), biotehnologia vegetală, ecobioeconomia și siguranţa alimentelor, efectul
radiațiilor - implicaţiile socio-economice.
Capitolul 2 este structurat pe următoarele părți componente : Scopul cercetărilor
efectuate, în care sunt prezentate obiectivele al prezentei lucrări de doctorat, respectiv,
obţinerea vitroplantulelor din embrioni scalpaţi de la cariopse de porumb (Zea mays L.)
hibrizii Helga şi ZP471, in vitro, pe medii artificiale, cu o balanţă hormonală variată,
iradierea vitroplantulelor obţinute, cu radiaţii de tip UV-B şi biometrizarea parametrilor de
creştere in vitro, în regim de iradiere comparativ cu biometrizarea parametrilor
vitroplantulelor neiradiate, aclimatizarea vitroplantulelor obţinute din cariopse, dar şi
evaluarea activităţii enzimelor antioxidante sub acţiunea radiaţiilor de tip UV-B: activitatea
catalazei (CAT), activitatea guaiacol peroxidazei (POD), activitatea ascorbat peroxidazei
(APX), activitatea glutation reductazei (GR), activitatea glutation-S-transferazei (GST),
activitatea superoxid-dismutazei (SOD).
7
2.1. INTRODUCERE
Radiaţiile ultraviolete (UV) sunt un factor de stres important pentru plante, care
poate duce la alterarea sistemului genetic şi a structurii membranelor celulare, precum şi a o
serie de procese metabolice. Dintre acestea, UV-B-ul exercită un efect mult mai distructiv
asupra plantelor, datorită faptului că macromoleculele de ADN (acid dezoxiribonucleic) sau
de proteine au o absorbţie puternică a razelor solare la lungimi de undă 280-320 nm.
Din cauza scăderii nivelului de ozon atmosferic influenţa negativă exercitată de către
razele UV-B a devenit tot mai pronunţată. Această situaţie a impus reconsiderarea eforturilor
ştiinţifice pentru o mai bună înţelegere a efectului radiaţiei UV asupra plantelor şi a altor
organisme.
Sistemele biologice sunt, în general, vulnerabile la radiaţii cu lungimi de undă
cuprinse între 280 nm-320 nm. Creşterea expunerii la UV-B este îngrijoratoare pentru toate
organismele, dar în special pentru plante, mai ales din cauza cerinţelor acestora pentru
lumină şi a inabilităţii lor de a se deplasa.
O serie de studii au arătat faptul că, plantele răspund cu variabilitate ridicată la
acţiunea UV-B-ului (Musil şi colab. , 2002; Cona şi colab., 2006).
Pentru o mai bună înţelegere a semnificaţiei modificărilor induse de creşterea
nivelului de radiaţii UV-B este necesară concentrarea eforturilor ştiinţifice în direcţia
cercetării aspectelor principale referitoare la creşterea plantelor, precum şi la nivelul unor
parametri biochimici sub acţiunea iluminării plantulelor cu radiaţii UV-B, reacţii care s-ar
putea să fie regăsite şi la plantele aflate în câmp.
Având în vedere aspectele menţionate în literatura de specialitate, datele
experimentale efectuate la doi hibrizi de porumb, repectiv Helga şi ZP471 aduc dovezi noi
în ceea ce priveşte modificările morfologice şi biochimice ce au loc la nivel celular, în
condiţii de expunere îndelungată a acestora la UV-B.
2.2. SCOPUL CERCETĂRILOR EFECTUATE ÎN CADRUL TEZEI DE
DOCTORAT
În cadrul experimentelor efectuate în prezenta teză de doctorat ne-am propus să
urmărim reacţia plantulelor a doi hibrizi de porumb (Zea mays L.), Helga şi ZP 471, în urma
iradierii acestora cu raze ultraviolete, tip UV-B, cu lungimea de undă de 287 nm, exemplare
care au fost, sau nu, expuse unor astfel de tratamente, respectiv care au fost menţinute ca
loturi de referinţă (martor sau control), sau ce au fost etalate – de repetate ori - la asemenea
8
iradieri; materialul vegetal vitrocultivat şi iradiat, in vitro fiind amplasat pe mediu de cultură
complex, după 30 zile plantulele au fost transferate ex vitro şi ele au suferit sau nu, reiradieri
repetate (vezi tabelul 3 schema de organizare a experimentelor cu UV-B).
După iradiere, în funcţie de tratamentul aplicat, la nivelul materialului vegetal
vitrocultivat, sau a plantulelor aclimatizate la regimul de viaţă ex vitro, iradiate sau nu, s-au
efectuat fie măsurători biometrice privind creşterea organelor plantulelor, sau a plantulei
întregi, ori s-au făcut determinări privind activitatea unor enzime, cum sunt catalaza,
glutation reducataza, ascorbat peroxidaza, guiacal peroxidaza, glutation-S- transferaza şi
superoxid dismutaza, dar şi în ceea ce priveşte conţinutul frunzuliţelor lor în pigmenţi
asimilatori, în funcţie de iradierea, sau nu, a plantulelor cu radiaţii UV-B.
În paralel, au fost dublate unele variante experimentale supuse iradierii cu UV-B, în
condiţiile în care la nivelul solului cu care au fost umplute ghivecele în care au fost
amplasate exvitroplantulele provenite din vitrocultură, s-a procedat la înnobilarea solului (de
tip Campo Sana) cu sulfat metionină sau S- metilmetionină, compus abreviat cu iniţialele:
SMM, o substanţă considerată ca fiind o vitamină, vitamina U, un osmoprotector şi reparator
celular, în condiţiile iradierii plantelor cu raze UV-B. În toate condiţiile experimentale s-au
organizat şi loturi martor (control), ce nu au fost supuse tratamentelor cu radiaţii UV.
În faza de început a experimentului, au fost efectuate unele cercetări referitoare la
analizarea consecinţelor asupra creşterii organelor plantulelor celor doi hibrizi de porumb,
iradiaţi cu raze UV-A, care după cum s-a văzut în capitolul „Consideraţii generale” a
prezentei teze de doctorat – sunt mai nocive decât radiaţiile UV-B, cu care ocazie am
procedat la examinarea ultrastructurii embrionilor iradiaţi, sau nu, cu UV- A (320-400 nm),
la microscopul electronic cu baleaj.
2.2.1. Obiectivele cercetărilor efectuate în cadrul tezei de doctorat
Pentru identificarea şi caracterizarea modificărilor ce au loc sub acţiunea radiaţiilor
UV-B, şi pornind de la ceea ce ne-am propus, de la obiectivele stabilite şi scopul cercetărilor,
toate acestea ne-au permis să investigăm, în mod punctual, următoarele aspecte:
1. cum inflenţează radiaţiile UV-B procesele de regenerare şi de creştere in vitro, a
plantulelor, dar şi in vivo, respectiv aclimatizarea la viaţa în mediul septic, plantate fiind în
sol, în ghivece, şi menţinute în camera de creştere;
2. care sunt modificările biochimice şi rolul sistemului enzimatic şi non-enzimatic de apărare
a celulelor plantulelor în condiţii de iradiere a lor cu lumină UV-B in vitro fiind, sau ex
9
vitro, de diferite lungimi de undă, dar şi privind potenţialul rol al S-metilmetioninei în
protecţia enzimatică a acestora;
3. corelarea rolului pe care îl au regulatorii de creştere din mediul de cultură şi nutrienţii de
care dispun plantulele regenerate din fitoinoculi sub influenţa radiaţiilor UV.
2.3. MATERIALE ŞI METODELE DE LUCRU UTILIZATE ÎN PREZENTA TEZĂ
DE DOCTORAT
2.3.1. Materialul vegetal utilizat în experimente – explante din cariopse de Zea
mays L., hibrizii Helga şi ZP471
Selectarea corectă a materialului biologic, în vederea iniţierii de vitroculturi vegetale,
reprezintă un factor decisiv, din punctul de vedere al calităţilor naturale pe care le deţin
celulele viitorilor fitoinoculi, în marcarea unei reactivităţi pozitive a acestora la regimul de
vitrocultură şi la tratamentele aplicate, întrucât procedurile de asepsizare pot afecta profund
vitalitatea şi capacitatea regenerativă a celulelor sau a ţesuturilor cultivate in vitro.
Experimentele de iradiere cu UV, a vitroplantulelor obţinute din embrioni scalpaţi,
din cariopse de porumb, hibrizii Helga şi ZP471, au fost efectuate in vitro şi ex vitro(Tab. 3),
– parte din ele - la Arad, iar o altă parte în laboratorul de Fiziologia plantelor al Institutului
de Biologie Celulară din Szeged.
Lămpile, sursă de radiaţii ultraviolete, sub formă de tuburi, de tip Philips TL 40W/12
UV Narrowband, au deţinut o putere de 100W, şi au emis radiaţii cu lungimi de undă până
la cca. 315 nm, intensitate luminoasă fiind de 7 W/m2.
Radiaţii de tip UV-B Narrow Band (după http://www.homephototherapy.com/nbc-
narrowband.htm).
După 5 zile de la inocularea cariopselor şi creşterea embrionilor in vitro în regim
fotoperiodic de 8h întuneric/24h şi intensitate luminoasă de 1700 lucşi, emisă de tuburi
10
fluorescente albe, şi la o temperatură de 21ºC ± 2ºC, fază în care s-au demarat procesele de
creştere, respectiv: imbibiţie, trecerea de la activitatea fiziologică latentă, la un metabolism
intens activ, s-a procedat la scalparea embrionilor din cariopse vezi (Fig 11 poziţia 5),
embrioni pe care i-am transferat pe aceleaşi tipuri de medii de cultură (Murashige-Skoog sau
Linsmaier-Skoog) suplimentate, sau nu, cu regulatorii de creştere amintiţi anterior,
respectând aceleaşi concentraţii, în funcţie de scopul urmărit.
În urma acestui experiment s-au obţinut vitroplantule pe ambele categorii de medii de
cultură. În schimb calusulul a fost generat pe mediul de cultură Murashige-Skoog (1962)
suplimentat cu 3mg/l de 2,4-D.
După iniţierea de vitroculturi de porumb din cei doi hibrizi, din embrioni scalpaţi de
la cei doi hibrizi din cariopse aflate în a 5-a zi de germinaţie (figura 11, poziţia 5) s-au
constituit 2 categorii de loturi experimentale: prima categorie, conţinând variante martor, ce
provenea din cariopse neiradiate, crescute pe medii lipsite de regulatori de creştere şi o a
doua categorie conţinând explante embrionare ce proveneau de la cariopse iradiate in vitro
fiind, regimul de iradiere coresponzând la: 280 nm – 310 nm.
Explantele de tip embrionar, au fost biometrizate la 7 zile, la 14 zile şi la a- 30 a zi de
la inocularea lor in vitro, urmărindu-se oranogeneza şi creșterea la nivelul acestora.
11
TABELUL 3. REGIMUL DE APLICARE A TRATAMENTELOR LA
PLANTULELE DE PORUMB (ZEA MAYS) CU RADIAŢII UV –B -
SCHEMA EXPERIMENTALĂ IN VITRO EX VITRO
Iradierea materialului vegetal
vitrocultivat cu radiaţii de tip UV-B
Momentul
biometrizării
lungimii
tulpinițelor,
frunzulițelor, şi
a rădăcinițelor
Regim de iradiere a
tratamentelor la plantulele
crescute în mediul septic, în
ghivece
Mmentul
analizei
activităţii
enzimatice
Variante de
tratament
Regimul de
aplicare a
tratamentelor Variante de
tratament
Regimul de
aplicare a
tratamentelor
În 1-a săptămână -
s-au aplicat 3
tratamente cu UV-
B, de diferite
lungimi de undă:
280 nm, 285 nm,
287 nm, 290 nm,
310 nm
Luni-15
minute
a -7 – a zi de la
iniţierea
tratamentelor
cu UV-B, şi a-
3-a zi de la
aplicarea
ultimei iradieri
-număr
tratamente
aplicate
insumate: 3
În 1-a
săptămână s-
au aplicat 4
tratamente cu
UV-B, de
diferite
lungimi de
undă: 280 nm,
285 nm, 287
nm, 290 nm,
310 nm
Luni-15
minute
1 – a
analiză s-a
făcut după
4 zile de
iradiere, şi
2 zile
pauză,
deci, în a
7-a zi,
după
iniţierea
iradierii
Marţi -pauză Marţi -15
minute
Miercuri-15
minute
Miercuri-15
minute
Joi- pauză Joi-15
minute
Vineri-15
minute
Vineri-pauză
Sâmbătă-
duminică
pauză
Sâmbătă -
pauză
Duminică -
pauză
În a-2-a săptămână
- s-au aplicat 3
tratamente cu UV-
B, de diferite
lungimi de undă:
280 nm, 285 nm,
287 nm, 290 nm,
310 nm
Luni-15
minute
a-14 – a zi de
la iniţierea
tratamentelor
cu UV-B;
-număr
tratamente
aplicate
insumate: 6
În a-2-a
săptămână - s-
au aplicat 4
tratamente cu
UV-B, de
diferite
lungimi de
undă: 280 nm,
285 nm, 287
nm, 290 nm,
310 nm
Luni– 15
minute
2- a
analiză, s-a
făcut după
8 zile de
iradiere, şi
3 zile
pauză deci,
în a 14-a
zi, după
iniţierea
iradierii
după15
zile
Marţi -pauză Marţi -15
minute
Miercuri-15
minute
Miercuri -
15minute
Joi- pauză Joi -15
minute
Vineri-15
minute
Vineri - pauză
Sâmbătă-
duminică
pauză
Sâmbătă -
pauză
Duminică-
pauză
În a- 3-a
săptămână - s-au
aplicat 3
tratamente cu UV-
B, de diferite
lungimi de undă:
280 nm, 285 nm,
287 nm, 290 nm,
310 nm
Luni-15
minute
a-30 -a zi de la
iniţierea
tratamentelor
cu UV-B;
-număr
tratamente
aplicate
insumate: 9
În a- 3-a
săptămână - s-
au aplicat 3
tratamente cu
UV-B, de
diferite
lungimi de
undă: 280 nm,
285 nm, 287
nm, 290 nm,
310 nm
Luni - 15
minute
3- a
analiză, s-a
făcut după
11 zile de
iradiere, şi
4 zile
pauză
după
iniţierea
iradierii
după 30
zile
12
2.3.1.1. Încadrarea taxonomică a speciei Zea mays L. (porumb)
Din punct de vedere sistematic, porumbul poate fi încadrat astfel:
Supraîncrengătura : TRACHEOPHYTA (CORMOPHYTA)
Încrengătura: SPERMATOPHYTA
Subîncrengătura: ANGYOSPERMOPHYTINA
Clasa: LILIOPSIDA (MONOCOTYLEDONEAE)
Ordinul: POALES
Familia: POACEAE
Genul: ZEA
Specia: ZEA MAYS L.
2.4. REZULTATE ŞI DISCUŢII
Într-o primă parte a experimentului am monitorizat parametrii de creştere, respectiv
înălţimea vitroplantulelor, a lungimii frunzuliţei celei mai mari, a rădăciniţei embrionare
celei mai mari, în condiţii de iradiere cu radiaţii de tip UV-B, de lungimi de undă cuprinse
între 280-310 nm, dar şi pentru vitroplantulele considerate de noi martor, adică nesupuse
iradierii. De asemenea, au fost biometrizaţi aceeaşi parametrii funcţie de mediul de cultură
utilizat, respectiv Murashige-Skoog (1962) şi sau Linsmaier-Skoog, coroborat cu iradierea
cu radiaţii de tip UV-B.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
7 ZILE 14 ZILE 30 ZILE
control Helga
Helga
control ZP471
ZP471
Înă
lţim
ea
med
ie v
itro
pla
ntu
lei
(cm
)-
va
ria
nta
3,
pe m
ed
iul
de c
ult
ură
LS
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7 ZILE 14 ZILE 30 ZILE
control Helga
Helga
control ZP471
ZP471
**
***
Înă
lţim
ea m
edie
vit
rop
lan
tule
i (c
m)-
va
ria
nta
3,
pe
med
iul
MS
Rezultatele evaluărilor biometrice a înălţimii vitroplantulelor obţinute din cariopsele de
porumb hibrizii Helga, şi ZP471, în cea de a - 7 zi, 14 a - zi şi 30 - zecea zi de la
amplasarea embrionilor pe medii aseptice de bază Murashige - Skoog (1962) şi /sau
Linsmaier-Skoog (1965), nesupuse iradierii.
13
Astfel, în urma biometrizărilor efectuate la 7, 14 şi 30 de zile de la inocularea
embrionilor scalpaţi, pe medii de cultură, de tip MS şi/sau, LS, putem afirma că în fiecare
variantă V1, V2, V3, şi / sau V01, V02, V03, vitroplantulele au crescut în înălţime, cea mai
proeminentă creştere fiind înregistrată pe varianta V3, respectiv V03, la 30 zile, unde valoarea
a atins un spor de 370% faţă de martor, pe ambele medii de cultură. Însă ceea ce diferenţiază
comportamentul celor doi hibrizi, în condiţii egale de experiment, este numărul de
vitroplantule generat, care este mai mare la hibridul Helga.
Comparativ, înălţimea vitroplantulei, în cazul în care acesteia i s-a aplicat tratamentul
cu radiaţii de tip UV-B, de lungimi de undă de 280-310 nm, se evidenţiază de asemenea o
creştere, dar mai ales în cazul lungimii de undă de 287 nm, şi mai ales în cazul utilizării
mediului de cultură MS, completat cu regulatori de creştere, reflectată în talia tulpinţei celei
mai mari de 4,1cm, comparativ cu mediul de cultură LS, unde talia tulpiniţei ajunge la 4 cm,
nesemnificativ mai mică, aproximativ cu 0,1cm.
0
1
2
3
4
5
6
280nm 285nm 287nm 295nm 310nm
CONTROL HELGA HELGA ZP471 CONTROL ZP471
Lu
ng
ime
a m
ed
ie a
tu
lpin
ițe
lor
(cm
),
vit
rop
lan
tule
lor
de
po
rum
b h
ibri
zii
Helg
a
şi Z
P4
71 p
e m
ed
iul
de
cu
ltu
ră M
B-M
S,V
3
– 3
0 z
ile
0
1
2
3
4
5
6
280nm 285nm 287nm 295nm 310nm
CONTROL HELGA HELGA ZP471 CONTROL ZP471
Lu
ng
imea m
ed
ie a
tu
lpin
ițe
lor
(cm
),
vit
rop
lan
tule
lor
de
po
rum
b h
ibri
zii
He
lga
şi Z
P4
71
pe
me
diu
l d
e c
ult
ură
LS
-
V 3
- 3
0 z
ile
Rezultatele evaluărilor biometrice a înălţimii tulpinițelor vitroplantulelor obţinute din din
cariopsele de porumb hibrizii Helga, şi ZP471, în cea de a -30 zi, de la amplasarea
embrionilor pe medii aseptice de bază Murashige - Skoog (1962); şi /sau Linsmaier-Skoog
(1965), supusă iradierii cu radiaţii de tip UV-B.
Există o diferenţă în comportamentul ambilor hibrizi pentru celelalte lungimi de
undă: la 285 nm, lungimea frunzuliţelor atât pentru Helga cât şi pentru ZP471, este identică
de 2,9 cm, dar se remarcă o inhibiţie în ceea ce priveşte creşterea frunzuliţelor la 310 nm, în
valoare de 2,60 cm, 92,86% pentru Helga, şi 2,5 cm, 82,29%, pentru hibridul ZP471. Reiese
influenţa şi efectul iradierii cu radiaţii de tip UV-B, funcţie de lungimi de undă fapt relatat în
diferenţa taliei frunzuliţelor.
14
2,5
2,55
2,6
2,65
2,7
2,75
2,8
2,85
2,9
2,95
3
280nm 285nm 287nm 295nm 310nm
CONTROL HELGA HELGA CONTROL ZP471 ZP471
Cre
şte
rea l
un
gim
ii f
run
zu
liţe
lor
pen
tru
hib
rid
ul H
elg
a și Z
P471 la -
30 z
ile (
cm
)
vari
an
ta V
3, p
e m
ed
iul M
S
2,5
2,55
2,6
2,65
2,7
2,75
2,8
2,85
2,9
2,95
280nm 285nm 287nm 295nm 310nm
CONTROL HELGA HELGA CONTROL ZP471 ZP471
Cre
şte
rea l
un
gim
ii f
run
zu
liţe
lor
pen
tru
hib
rid
ul H
elg
a și Z
P471 la -
30 z
ile (
cm
)
vari
an
ta V
3, p
e m
ed
iul L
S
Rezultatele evaluărilor biometrice privind creşterea frunzuliţelor vitroplantulelor de porumb
hibrizii Helga şi ZP471 în cea de a - 30 - zecea zi pe mediul de cultură de bază Murashige -
Skoog (1962) și Lindsmaier-Skoog (1965 sub efectul iradierii cu radiaţii de tip UV-B, cu
lungimi de undă cuprinse între 280 nm -310 nm.
Comparativ, se poate remarca superioritatea mediului de cultură MB-MS, faţă de
mediul de cultură LS, atât în ceea ce priveşte talia frunzuliţelor dar şi a numărului de plantule
generate în varianta V3, unde numărul de plantule generate este de 5 pentru hibridul Helga pe
mediul de cultură MS, faţă de V03 pe mediul de cultură LS, în condiţii egale de tratament.
În cea de a doua parte a lucrării au fost examinate efectele produse de anumite
tratamente administrate vitroculturilor obţinute din embrionii scalpaţi de la cariopsele celor
doi hibrizi de porumb, cu radiaţii UV-B, de diferite lungimi de undă, asupra plantulelor
transferate fiind ex vitro şi aclimatizate la regimul de viaţă în mediul septic, precum şi
urmărirea modificării unor parametrii biochimici, la nivelul acestora, respectiv a determinării
activităţii catalazei, a superoxiddismutazei, a peroxidazei, a ascorbat peroxidzei, a glutation
S transferazei.
S-a urmărit modificărea unor parametrii biochimici, la nivelul frunzelor plantulelor
de porumb în vârstă de 18-21 zile de la iniţierea aclimatizării, la stresul indus de radiaţiile de
tip UV-B, de diferite lungimi de undă, (cu preponderenţă la 287 nm, cu atât mai mult cu cât,
această undă are efecte asupra plantulelor de porumb), precum, şi rolul protector special dat
de S-metilmetionina (SMM), în condiţiile de stres, provocate de radiaţiile UV-B, (care oferă
plantelor studiate de noi capacitatea de a elabora răspusuri adaptative inductibile în condiţii
de stres oxidativ).
15
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7
Control
Helga
ZP471
Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a enzimei ascorbat-
peroxidaza (APX), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471,
aclimatizate, sub efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat
cu acţiunea protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după
iradiere.
Analiza comparativă a activităţii enzimatice a APX-ului, în frunzele celor doi
hibrizi cu potenţial diferit de rezistenţă la stres ne-a aratat că în condiţii optime şi naturale de
creştere şi dezvoltare pentru hibridul sensibil, nivelul acţiunii enzimelor, este mult mai
redus, faţă de planta control. Are loc o creştere în cea de a patra zi, la hibridul tolerant
Helga, comparativ cu hibridul ZP471. (Tabelul 31, Fig. 68).
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7
Control
Helga
ZP471
Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a enzimei catalaza
(CAT), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471, aclimatizate, sub
efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat cu acţiunea
protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.
Activitatea enzimei CAT prezintă o tendinţă de scădere uşoară, cu aproximativ
0,97%, doar în condiţiile de iradiere cu radiaţii de tip UV-B, la lungime de undă de 287 nm,
16
faţă de control, iar în condiţii de tratament cu sulfat-metilmetionină, activitatea acestei
enzime creşte, ajungând la valori semnificative în ziua a-4-a de tratament, cu un spor de
15,95 %, pentru hibridul Helga, şi 13,95 % pentru hibridul ZP471.
Din datele experimentale reiese gradul de toleranţă a hibridului Helga, faţă de
hibridul ZP471 (Tabelul 32, Fig. 69). Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B
creşterea activităţii CAT a fost semnificativă la plantele tratate, şi considerată normală în
condiţiile în care activitatea enzimei POD, prezintă o uşoară scădere pe parcursul zilelor
analizate (Tabelul 30, 32, Fig. 67, 69).
În urma iradierii UV-B cu lungime de undă 287 nm, GR, s-a activat în aceeaşi măsură
atât la plantele control, însă în urma tratamentului SMM activitatea ei a crescut în continuare
şi în ziua a şaptea, şi astfel depăşind în mod semnificativ rezultatele obţinute la plantele
control.
Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B creşterea activităţii GR
comparativ între control şi lot tratat pentru plantele de porumb a fost semnificativă în ziua a-
4-a, în cazul ambilor hibrizi, dar cu valori procentuale diferite (Tabelul 34, Fig. 71).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
Ziua 1 Ziua 4 Ziua 7
Control
Helga
ZP471
Variaţia activităţii enzimatice, (absorbanței), (A[U/mg]unități/proteină), a glutation reductaza (GR),
pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi ZP471,, aclimatizate, sub efectul
iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287 nm, coroborat cu acţiunea protectivă a S-
sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a - 4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.
În urma iradierii UV-B cu lungime de undă 287 nm, GR, s-a activat în aceeaşi măsură
atât la plantele control, însă în urma tratamentului SMM activitatea ei a crescut în continuare
şi în ziua a şaptea, şi astfel depăşind în mod semnificativ rezultatele obţinute la plantele
control.
Sub efectul tratamentului cu lungime de undă UV-B creşterea activităţii GR
comparativ între control şi lot tratat pentru plantele de porumb a fost semnificativă în ziua a-
4-a, în cazul ambilor hibrizi, dar cu valori procentuale diferite (Tabelul 34, Fig. 71).
17
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
1 zi 4 zile 7 zile
Control
Helga
ZP471
P <0,016
Monitorizarea activităţii enzimatice, (absorbanței), A[U/mg]unități/proteină), a enzimei
guaiacol peroxidaza (POD), pe parcursul dezvoltării plantulelor de porumb hibrizii Helga şi
ZP471, aclimatizate, sub efectul iradierii cu radiații de tip UV-B de lungime de undă de 287
nm, coroborat cu acţiunea protectivă a S- sulfatmetil – metioninei SMM, în prima zi, în a -
4 - a zi şi a - 7 - a zi după iradiere.
Pe baza rezultatelor obţinute şi analizate, putem concluziona, că, toate enzimele
antioxidante şi non-oxidante, studiate s-au activat la lungimea de undă 287 nm, deşi fiecare
într-o măsură şi un ritm diferit. Activitatea GR, GST şi CAT a atins maximul din a patra zi
de tratament, cu diferenţe în ceea ce privesc valorile atinse functie de hibridul studiat.
Astfel, activitatea GR şi a POD într-o măsură mai importantă, a crescut de 2 ori, în a
patra zi, în comparaţie GST-ul unde creşterea a fost de 1,5 ori comparativ cu controlul.
Iradierea UV-B a scăzut semnificativ activitatea enzimei guaiacol peroxidazei (POD)
la ambele genotipuri.
În cazul CAT din ziua a 4-a de tratament s-a observat o tendinţa de scădere a
acumulării acesteia în frunze, în timp ce GR şi GST au rămas active până în ultima zi de
tratament. Activitatea APX a crescut într-o mare măsură, şi datorită activării sub acţiunea
lungimii de undă în a 4-a zi a atins punctul maxim, acumularea acesteia, fiind extrem de
importantă în eliminarea radicalilor liberi.
18
CONCLUZII
1. S-a evidenţiat faptul că, procesele de organogeneză la porumb, se diferenţiază în funcţie
de mediile de cultură şi combinaţia regulatorilor de creştere, utilizaţi. Acest fapt este
reflectat în diferenţa taliei vitroplantulelor dezvoltate din cariopse germinate, dintre hibrizii
Helga şi ZP471.
2. Creşterea vitroplantulelor la cei doi hibrizi în condițiile de experimentare impuse este
diferită în cazul celor doi hibrizi, cu diferențieri semnificative la lungimea de undă de
287nm, reflectată în diferenţa taliei frunzuliţei celei mai mari.
3. Comportamentul vitroplantulele obținute din embrioni scalpaţi din cariopse germinate, în
cazul celor doi hibrizi de porumb, Helga şi ZP471, permite să recomandăm utilizarea în
experimentele de regenerare in vitro, coroborat cu iradierea cu radiaţii de tip UV-B, de
lungimi de undă apropiate de lungimea de undă considerată letală, -310nm, a hibridului
Helga, datorită toleranței crescute faţă de UVB.
4. Compararea mediilor de cultură MS şi LS, completaţi cu acelaşi nivel al regulatorilor de
creştere, respectiv BAP şi ANA, în combinaţii sau utilizaţi separat, sub aspectul formării
neoplantulelor, evidenţiază superioritatea mediului MS, în ceea ce privește generarea de
vitroplantule.
5. Balanţa hormonală asociată cu iradierea la 287 nm este capabilă să inducă regenerarea de
plante cu sistem radicular, reflectat în lungimea medie a celei mai mari rădăciniţe.
7. În cazul hibrizilor de porumb, radiaţia UV-B de 287 nm, stimulează sinteza enzimelor
antioxidante, în valori procentuale diferite, dar de maniera protejării plantelor de efectul
negativ al stresului oxidativ.
8. Din rezultatele obţinute, se poate remarca activitatea intensă a enzimelor antioxidante
studiate, dar şi faptul că SMM-ul are efecte împotriva consecinţelor negative ale formelor de
oxigen reactiv, ale stresului oxidativ, prin sistemul antioxidant, la temperatura de 5°C şi
iradierea UV-B considerată pentru porumb deja letală, deşi în proporţii diferite, dar le creşte
activitatea enzimatică.
9. În frunzele tinere (faza frunzei a 3-a) si mature (a 2 a) nivelul înalt al activităţii enzimelor
antioxidante protejează plantele de distrugerea oxidativă. Efectul stresului oxidativ provocat
în urma iradierii cu ultraviolete de tip UV-B, poate fi redus la minim prin creşterea
activităţii enzimelor antioxidante, cu preponderenţă în plantele tinere (faza frunzei a 3-a),
faţă de plantele mature care pot răspunde similar numai la un stres moderat.
Recomandăm utilizarea în cultură a hibridului Helga, în zonele cu exces de UVB
datorită toleranței ridicate manifestate la iradirea de lungă durată.
19
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Atri, D., Melott, A. L., Thomas, B. C., 2010. Lookup tables to compute high energy
cosmic ray induced atmospheric ionization and changes in atmospheric chemistry.
Journal Cosmology Astrology Physics 05, pp. 8-10.
2. Baier M., Kandlbinder A., Golldack D., Dietz K.J., 2005. Oxidative stress and ozone
perception, signaling and response. Plant.Cell. Environment. 28, p. 1012-1020.
3. Ballaré C.L, Caldwell M.M, Flint S.D, Robinson S.A, Bornman J.F., 2011. Effects of
solar ultraviolet radiation on terrestrial ecosystems. Patterns, mechanisms, and
interactions with climate change. Photochem.and Photobiol. Sciences 10, pp. 226–241.
4. Cachiţă, C.D., 1987. Metode „in vitro” la plantele de cultură. Baze teoretice şi practice.
Editura Ceres. Bucureşti, pp. 134-147.
5. Cachiţă, C.D., Deliu, C., Rákosy-Tican, L., Ardelean, A., 2004. Tratat de biotehnologie
vegetală. Vol. 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca.
6. Evans N.H., McAinsh M.R., Hetherington A.M., Knight M.R., 2005. ROS perception in
Arabidopsis thaliana: the ozone –induced calcium response. Plant J., 41, pp. 615-626.
7. Houghton, J.T., Ding Y., Griggs, D.J., Dai, X., Maskell, K., Johnson, C.A., 2001.
Climate change 2001. Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. New
York: Cambridge University Press.
8. Ko, S., Eliot, A.C., Kirsch, J.F., 2004. S-methylmethionine is both a substrate and an
inactivator of 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase. Arch. Biochem. Biophys.,
421, pp. 85-90.
9. Kocsy, G., von Ballmoos, P., Riiegsegger, A., Szalai, G., Galiba, G., Brunold, C., 2001.
Increasing the glutathione content in a chilling-sensitive maize genotype using safeners
increased protection against chilling-induced injury. Plant Physiol. 127, pp. 1147-1156.
10. Peykarestan, B., Seify, M., Fadaei, M., S., Abdoli, M., 2012. Ultraviolet irradiation
effects on seed germination and growth, protein content, peroxidase and protease
activity in purslane and thyme. International Journal of Agriculture: Research and
Review. Vol., 2 (1), pp. 12-19.
20
B
Titlul programului: „Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013”
Titlul proiectului: „Burse doctorale de pregătire ecoeconomică şi bioeconomică complexă pentru siguranţa şi securitatea alimentelor şi furajelor din ecosisteme antropice”
Editorul Materialului: Doctorand BLAGA (ORODAN) MARIA Data publicării: 2013