7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 1/11

3. Descrierea etapelor de extractie a componentelor cu posibile activitati biologiceIn analizele fitochimice identitatea botanica a plantelor studiate trebuie autentificata de o

autoritate avizata. Autenticitatea materialului vegetal de studiat este esentiala pentru orice raportarede noi substante existente in acestea. Din aceste motive, in practica fitochimica, plantele seidentifica dupa o specie etalon aflata intr-un ierbariu [1].

Extractia odul de extractie depinde de textura si continutul de apa al materialului de extras si de tipulde substanta ce urmeaza a fi izolata. In general, este de dorit ca tesutul vegetal sa fie distrus,pentru a preveni oxidarea enzimatica, sau o posibila hidroliza. !lterior, materialul vegetal poate fimacerat intr-un blender si filtrat, dar aceasta este necesar doar daca se are in vedere o extractiecompleta. "rocedura chimica clasica de extractie in vederea obtinerii constituentilor organici dintesut uscat de planta #seminte uscate, radacina, frunze$, este sa se extraga continuu materialul prafintr-un aparat %oxhlet cu un domeniu de solventi, incepand de la eter, eter de petrol si cloroform,pentru separarea lipidelor si terpenoidelor, si apoi utilizand alcool si acetat de etil, pentru compusimai polari. Aceasta metoda este utila cand se lucreaza la scala de ordinul gramelor. &xtractulobtinut este clarificat prin filtrare la vid si concentrat la rotaevaporator.

'and se izoleaza componente solubile in apa din tesut foliar, lipidele trebuie indepartate detimpuriu, inainte ca proba sa fie concentrata la rotaevaporator, prin extractie succesiva cu eter depetrol. De fapt, cand un extract etanolic este concentrat la rotaevaporator, aproape toata clorofila silipidele sunt depozitate la partea inferioara a balonului de sticla, si concentratul apos poate fi preluatatunci cand este aproape lipsit de impuritati lipidice. &xtractul astfel concentrat poate detine cristale,astfel incat ele trebuie colectate prin filtrare si omogenitatea lor trebuie testata prin cromatografie inanumiti solventi [1].

1

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 2/11

(igura 1. "rocedeul general de extractie din tesut de material vegetal proaspat si fractionarea indiferite clase de compusi in functie de polaritatea acestora [1].

Daca este prezenta doar o singura substanta, cristalele pot fi purificate prin recristalizare siapoi materialul poate fi supus altor analize. In cele mai multe cazuri, este prezent amestecul desubstante in cristale si va fi necesar sa fie redizolvate intr-un solvent potrivit si constituentii separatprin cromatografie. 'a precautie impotriva pierderii materialului astfel obtinut, extractele concentratetrebuie stocate in frigider, carora li se adauga putin toluen pentru a preveni cresterea fungilor [1].

Material vegetal proaspat

Reziduu Filtrat

Reziduu Filtrat CHCl3

extract

Strat apos

acid

Omogenizare – 5 min. in MeOHH!O

Filtrare

"xtractie cu "tO#cFiltrare

"vaporare Fi$re

"xtract neutru

%grasimi& ceruri& etc.'

(scare

"vaporare

"xtracte de polaritate moderata

%terpenoide& )enoli& etc.'

Stratapos

 $azic

"xtractCHCl3MeOH

(scare"vaporare "vaporare

extractuluicu MeOH

"xtractul de $aza

%alcaloizi in special'"xtractul in MeOH

este extract polar 

*azi)icare la

 pH1+ cu

 ,H-OH

"xtract cuCHCl3MeOH

%31' si CHCl3

"vaporare 11+ vo

#cidi)iere"xtractie cu CHC

!

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 3/11

'and se investigheaza profilul fitochimic complet este de preferat ca extractul crud sa fiefractionat in scopul separarii compusilor din clase principale de substante, inainte de analizacromatografica [1].

4. Protocol culturi celulare

Selectarea celulelor stem mezenchimale in cultura Aspiratul medular sternal efectuat prin punctie sternala este prelucrat in vederea obtinericelulelor stem mezenchimale. )oate procedurile ce urmeaza a fi effectuate se relalizeaza in hotasterile cu flux laminar.

 Aspiratul medular se transfera intr-un tub de centrifuga, iar peste acesta se mai adauga "*%#"hosphate+s *uffer %aline$ in cantitate egala cu aspiratul medular astfel incat sa fie in concentratede 11 #"*% trebuie incalzit in prealabil in baia de apa, la /'$.

%e omogenizeaza, apoi se centrifugheaza la 10 rpm, timp 1 minute, la temperaturacamerei. %e arunca supernatantul, se lasa cca 1 ml, se omogenizeaza. %e determina numarul decellule astfel se iau 1 2l si se resuspenda in 3 2l solutie 4azarus.

%e lasa cca 5 minute pentru a liza sa fie completa, apoi se iau 1 2l si se introduce inhemacitometru. %e numara celulele si se vor insamanta in fuctie de numarul obtinut cu o concentratie de 0x1 6

celule7cm5. ediul de cultura folosit pentru insamantare este &8, suplimentat cu 19 ('%, 19"enicilina si %treptomicina, 1 ng (:(7ml mediu de cultura."lacile de cultura se trec in incubator, la /', 09 ';5.

ediul de cultura se schimba la -6 zile prin inlocuirea celui vechi cu unul proaspat incalzit inprealabil.

Repicarea culturilor celulareIn momentul in care culturile celulare ating o confluenta de aproximativ 3-19 acestea

trebuiesc repicate. Aceasta procedura presupune urmatorii pasi

%e arunca mediul de cultura din placa de cultura. %e pune "*% in placa de cultura si spala usor pentru a inlatura urmele de ('%, inhibitor pentrutripsina. %e arunca "*%-ul. In placa de cultura se pune tripsina incalzita in prealabil la /' si se pipeteaza repetat timp de 5minute. )ripsina cu celule se transfera intr-un tub de centrifuga cu mediu de cultura #&8, 59 ('%,19 "enicilina si %treptomicina$ tinut pe gheata. %e centrifugheaza timp de 1 minute, la 10 rpm, la 6/'. %e arunca spernatantul, se vortexeaza pellet-ul. %e adauga "*% si se mai centrifugheaza o data in aceleasi conditii, la 10 rpm, 1 minute, la6/'. %e arunca supernatantul, se vortexeaza pellet-ul. %e determina numarul de celule, prin numarare cu a<utorul hemacitometrului si in functie denumarul de celule obtinut se insamanteaza in placi la o concentratie de 0x1 celule7cm5. "lacile de cultura se pun in incubator la /', 09 ';5.

Crioconservarea culturilor celularePreparea mediului de crioconservare:

3

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 4/11

"reparea mediului de crioconservare se face pe gheata. %e recomanda ca ('%-ul sa fierece in momentul in care se adauga D%; #reactie exoterma$.

%e urmaresc aceleasi etape ca si in cazul repicarii celulelor pana la determinarea numaruluide celule. %uspensia celulara se distribuie in criotuburi in raport de 11 suspensie celulara mediude crioconservare.

 Aceste etape se desfasoara pe gheata.'riotuburile se iau si se aseaza in stativul sistemului programabil de crioconservare, sefixeaza parametrii ciclului si se ruleaza programul.

Dupa terminarea ciclului criotuburile se transfera in stocatorul cu azot lichid.

btinerea culturilor celulare tumorale primare din tumori maligne de di!erite tipuri- aterialul biologic recoltat se pune intr-o placa "etri si cu a<utorul unui bisturiu se taie in bucatimici.- *ucatile se transfera intr-un tub si se adauga tipuri diferite de .enzime.- %e lasa sa actioneze circa de minute la /', in urma digestiei enzimatice obtinandu-se osuspensie celulara.

- %e centrifugheaza la 10 rpm, 0 minute, la temperatura camerei.- %e arunca supernatantul, se vortexeaza pellet-ul.- %e mai spala inca o data cu "*% pentru inlaturarea urmelor de enzime la 10 rpm, 0 minute, latemperatura camerei.- %e arunca supernatantul, se vortexeaza pellet-ul.- %uspensia celulara obtinuta se repartizeaza in placi de cultura cu mediu #="I 1>6, 19 ('%,19 "enicilina si %treptomicina, 4-:lutamina$- "lacile de cultura se pun in incubator la /', 09 ';5.- 4a -6 zile se schimba mediul de cultura vechi cu unul proaspat incalzit in prealabil.

Repicarea culturilor celulare aderente si in suspensieCulturile celulare aderenteIn momentul in care culturile celulare ating o confluenta de aproximativ 3-19 acestea

trebuiesc repicate. Aceasta procedura presupune urmatorii pasi se arunca mediul de cultura din placi de cultura. se pune "*% in placa de cultura si spala usor pentru a inlatura urmele de ('%, inhibitor pentrutripsina. se arunca "*%-ul. in placa de cultura se pune tripsina incalzita in prealabil la /' si se pipeteaza repetat timp de 5minute. tripsina cu celule se transfera intr-un tub de centrifuga cu mediu de cultura tinut pe gheata. se centrifugheaza timp de 1 minute, la 10 rpm, la 6/'. se arunca spernatantul, se vortexeaza pellet-ul. se pune "*% si se mai centrifugheaza o data in aceleasi conditii la 10 rpm, 1 minute, la 6/'. se arunca supernatantul, se vortexeaza pellet-ul. se determina numarul de celule si se in functie de numarul de celule obtinut se repartizeaza inplaci la o anumita concentratie celulara. placile de cultura se pun in incubator la /', 09 ';5.

Culturile celulare in suspensie se transfera mediul de cultura impreuna cu celulele intr-un tub de centrifuga.

-

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 5/11

se centrifugheaza la 10 rpm, 1 minute, la temperatura camerei. se arunca supernatantul, pelletul se vortexeaza. se determina numarul de celule si in functie de numarul de celule obtinut se repartizeaza inplacile de cultura la concentratia dorita.

". #etode de studiu a proli!erarii celulare si de viabilitate in populatiile celulare.%-a dezvoltat un numar de metode in vederea studierii viabilitatii si proliferarii celulare. 'elemai convenabile metode sunt cele care utilizeaza formatul de microplaci cu 3> de godeuri. Aceastaminiaturizare permite analiza simultana si rapida a mai multor probe. (ormatul de microplaci reducede asemenea cantitatea de mediu de cultura si de celule care trebuie puse in godeu, de asemeneasi costul consumabilelor. etode colorimetrice permit probelor sa fie analizate direct in microplaci cuun cititor de placi &4I%A. etodele pe microplaci s-au dezvoltat in baza diferitilor parametri asociativiabilitatii si proliferarii celulare. 'ei mai importanti parametri utilizati au activitate metabolica sisinteza de AD?. Distrugerea celulara este inevitabila ca rezultat al pierderii abilitatii celulei de amentine si asigura energie pentru activitatea metabolica a functiei si cresterii celulei. etodele deactivitate metabolica sunt bazate pe activitatea mitocondriala. 'elulele sunt incubate cu un substrat

colorat #)), @)), %)-1$ [5].

#etode de masurare a activitatii metabolice.!nul din parametrii utilizati pentru metoda colorimetrica este activitatea metabolica a

celulelor viabile. De exemplu, metode cu microplaci utilizeaza sarea de tetrazoliu )) utilizata largpentru cuantificarea proliferarii si citotoxicitatii celulare. Datorita faptului ca sarile de tetrazoliu suntreduse la un produs colorat, precum formazan, doar prin activitatea metabolica a celulelor active,aceste teste detecteaza exclusiv celule viabile. De exemplu, in testele )), )) este redus decatre celulele viabile la un produs colorat, sarea de formazan insolubila in apa. Dupa solubilizare,formazanul format usor si rapid, poate fi cuantificat prin citire la un cititor de placi precum &4I%A la0 nm [].

5

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 6/11

(igura 5 %tructura moleculara a )), @)), %)-1 si produsii lor corespunzatori de reactie.

Din moment ce celulele care prolifereaza sunt mai active decat cele care nu prolifereaza,

metodele sunt potrivite nu numai pentru determinarea viabilitatii celulare si citotoxicitateafactomediata, dar de asemenea pentru determinarea activarii si proliferarii celulare. )otusi,rezultatele obtinute in urma testului cu )) poate varia in functie de conditii de cultura neideale,precum pB si concentratia de D-glucoza, datorita starii metabolice celulare #concentratia celulara denucleotide piridinice$ [].

/

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 7/11

(igura . asurarea activitatii metabolice utilizand saruri )), @)) si %)-1 de tetrazoliu [].

=eactivul )) este gata de utilizare si stabil la 6 grade ' la intuneric pana la 1C luni. )rebuieavut gri<a ca sa se evite contaminarea ))-ului cu mediu de cultura in timpul pipetarii.

%e recomanda ca pentru realizarea testului )) sa se aiba in dotare urmatoareleechipamente cititor de placi cu filtre avand urmatoarele lungimi de unda >0 nm, respectiv 0 nm,microscop inversat, pipeta multicanal, incubator cu grade ' si 09 ';5, hota cu flux laminar,placute cu godeuri, tuburi sterile, pipete sterile, varfuri sterile pentru pipete [].

$. Protocolul #%% se pun in placute cu godeuri de la 1 la 1, de celule per godeu se incubeaza cu compusul de testat, extract, etc., de la > h pana la 56 h se adauga 1 u4 de reactiv )) in fiecare godeu se incubeaza de la 5 h pana la 6 h pana devine vizibil precipitatul astfel format de culoare

purpurie se adauga 1 u4 reactiv detergent din Eit-ul de )) se lasa 5 h la temperatura camerei se inregistreaza absorbanta la 0 nm.In vederea efectuarii testului )) se selecteaza un numar optim de celule si fiecare

substanta de testat se realizeaza in triplicat. )estele includ godeuri blanE sau etalon, continand doar mediul de cultura godeuri cu celule control, netratate godeuri cu celule tratate cu substantele de interes.Daca se utilizeaza mai mult de 1 u4 de mediu per godeu, se creste proportional cantitatea

de reactiv )) de exemplu, daca se utilizeaza 50 u4 de mediu se utilizeaza 50 u4 de reactiv ))[].

0

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 8/11

&nterpretarea datelor Falorile absorbantei ce sunt mai mici fata de ale celulelor control indica o reducere a ratei de

proliferare. Invers, o absorbanta ridicata indica o crestere a proliferarii celulare. ai rar, o cresterein proliferarea celulara poate fi indusa de moartea celulara evident o moarte celulara poate ficauzata de schimbari morfologice [].

'. #etoda Cell%iter()lue de viabilitate celulara este o metoda omogena si fluorimetrica deestimare a viabilitatii celulelor prezente in placi cu godeuri. !tilizeaza indicatorul de culoareresazurin pentru a masura capacitatea metabolica a celulelor G un indicator de viabilitaet celulara.'elulele viabile au abilitatea de a reduce resazurinul la resorufin, un produs fluorescent #fig.$.'elulele neviabile isi pierd rapid capacitatea metabolica, nu reduc indicatorul, si deci nu genereazaun semnal fluorescent [6].

=eactivul 'ell)iter-*lue este o solutie tampon care contine resazurin purificat. Ingredienteles-au optimizat pentru utilizarea in teste de viabilitate celulara. "roprietatile spectrale ale reactivului'ell)iter-*lue se schimba in timpul procesului de reducere ale resazurinului in resorufin #fig.6$.=esazurinul are o culoare albastra inchis si prezinta o fluorescenta intrinseca pana ce este redus la

resorufin, care este un produs colorat roz si inalt fluorescent #03 extinctia70C6 emisia$. Absorbantamaxima ale resazurinului este >0 nm si aceea a resorufinului este 0 nm. "ot fi utilizate fiefluorescenta, fie absorbanta pentru inregistrarea rezultatelor totusi este de preferat o metodafluorescenta pentru ca este mai sensibila si implica cateva date de calcul [6].

(igura 6. )ransformarea resazurinului in resorufin de catre celulele activ metabolice rezultate inurma generarii de produs fluorescent. (luorescenta produsa este proportionala cu numarul decelule viabile [6].

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 9/11

(igura 0. "roprietatile spectrale ale resazurinului si resorufinului in ="I H 19 (*% [6]."anel A. %pectrul de absorbtie pentru resazurin si resorufin."anel *. %pectrul de fluorescenta excitatie-emisie pentru resorufin.

!n flux de lucru sumarizeaza protocolul etodei 'ell)iter-*lue aratat in fig.0. "roceduraimplica adaugarea unui singur reactiv #reactivul 'ell)iter-*lue$ direct peste celule in mediulsuplimentat cu ser. Dupa pasul de incubare, datele se inregistreaza utilizand un fluorimetru sauspectrofotometru. %palarea celulelor, indepartarea mediului si pasii multipli de pipetare nu suntceruti, facand ca metoda sa fie mai usoara, adaptata si automatizata pentru analiza viabilitatii sicitotoxicitatii celulelor [6].

In conditii experimentale, semnalul fluorescent dat de reactivul 'ell)iter-*lue este

proportional cu numarul de celule viabile. Domeniul linear si limita <oasa de detectie suntdependente de tipul de celula si de abilitatea de a reduce resazurinul #fig.0$ [6].

2

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 10/11

(igura >. Protocolul Cell%iter()lue de testare a viabilitatii celulare."laci cu 3> de godeuri compatibile cu un fluorimetru sunt pregatite cu celule si

compusi de testat. =eactivul 'ell)iter-*lue este adaugat direct in godeuri, placile sunt

incubate la 37°C pentru a permite celulelor sa transformeresazurinul la resofurin, si se masoara uorescenta [6].

Domeniul linear de raspuns este dependent de raportul dintre reactivul 'ell)iter-*lue inmediul de cultura si timpul de incubare.

'antitatea de reactiv 'ell)iter-*lue de utilizat este de 5 u4 de reactiv adaugat in fiecaregodeu ce contine 1 u4 mediu intr-un format de placi de 3> de godeuri. %e citeste fluorescenta laun fluorimetru la un filtru 0> nm &x703 nm &m. =aportul de reactiv 'ell)iter-*lue volum decultura celulara trebuie a<ustat pentru o performanta optima depinde de tipul de celula, timpul deincubare si domeniul linear dorit [6].

*bsorbanta si +luorescenta=eactivul 'ell)iter-*lue are proprietati atat de fluorescenta, cat si de absorbanta, fiind

interschimbabile prin reducerea celulara a resazurinului la resofurin.In figura 0 se prezinta absorbti si spectrul de emisie de fluorescenta a resazurinului si

resorufinului in mediul de cultura suplimentat cu ser. Absorbtia maxima a resazurinului este de >0nm si cea pentru resorufin este de 0 nm. Daca masuratorile absorbantelor se inregistreaza serecomanda ca citirile sa se faca la 0 nm si utilizand ca lungime de unda de referinta > nm.Falorile se compara cu godeurile blanE #etalon$ continand reactivul 'ell)iter-*lue fara celule.

=esazurinul este de culoare albastra in reactivul 'ell)iter-*lue si produsul sau de reactieeste resorufinul care are o culoare roz, acesti compusi fiind sensibili la lumina [6].

,. Concluzii#etoda Cell%iter()lue este o metoda excelenta de testare a viabilitatii celulare sau a

citotoxicitatii, de asemenea si metoda #%%. Datele obtinute releva o corelare extraordinara detestare a toxicitatii celulare, pentru ambele tipuri de teste celulele neviabile isi pierd capacitatea dea reduce colorantul si de a nu genera vreun semnal.

1+

7/21/2019 Teste in Vitro

http://slidepdf.com/reader/full/teste-in-vitro 11/11

-. )ibliogra!ie.

[1] .*.Barborne, "hJtochemical ethods, A :uide to odern )echniKues of "lant AnalJsis, %econd&dition, 13C6, 'hapman and Ball )hird Avenue, ?eL MorE ?M 11, I%*? 615 5000 5[5] (errari, ., et al. . Immunol. ethods 11 1>0-15, 133.

[] :erlier, D., and ?. )homasset. . Immunol. ethods 36 0->, 13C>.[6] ;N*rien, ohn ilson, Ian ;rton, )errJ "ognan, (ranOois  #5$ Investigation of the Alamar*lue #resazurin$ fluorescent dJe for the assessment of mammalian cell cJtotoxicitJ. Eur. J. Biochem.

$', 0651.>.[0] FoJtiE-Barbin %4, *rightman A;, aisner *, 4amar 'B, *adJlaE %(., #133C$ Application andevaluation of the Alamar *lue assaJ for cell groLth and survival of fibroblasts. In Vitro Cell. Dev.

Biol. Animal 34, 53.6>.

11