Tesis Normal

Especies vegetales y microorganismos rizosféricos tolerantes a metales pesados de un ecosistema contaminado.

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I. Introducción.

La composición química de la roca madre y los procesos de meteorización condicionan, de forma natural, la concentración de diferentes metales pesados en los suelos. Esto hace que los márgenes de concentración naturales de los metales puedan ser muy amplios y dependan, en gran medida, de la zona de estudio, de forma tal que puede existir una importante variabilidad espacial en la concentración de metales en los suelos (Ross, 1995).Los metales pesados pueden ser transferidos a los cultivos desde el suelo, elemento clave en la regulación de la dinámica de los mismos. Este hecho, muchas veces olvidado, hace que sea importante conocer la concentración y dinámica de metales pesados en ellos para evaluar si son o no adecuados para la agricultura (Martín, 2002). Así, preservando la calidad de estos puede garantizarse la calidad de los cultivos.Una producción sostenible se deriva del balance apropiado de los suelos, cultivos, nutrientes, luz solar, humedad y de los sinergismos entre organismos existentes. El agroecosistema es productivo cuando este balance y las condiciones óptimas prevalecen y cuando las plantas cultivadas son adaptables para tolerar el estrés y las adversidades a las que son sometidas comúnmente (Altieri, 1999).Actualmente, la Agroecología como ciencia necesaria a aplicar para alcanzar dicha producción sostenible, adquiere una gran relevancia para contrarrestar la actual crisis de los alimentos, promovida por los países desarrollados como los EEUU que se empeñan en la elaboración de biocombustibles a partir del empleo de los cereales, lo cual necesitará de una mayor disponibilidad de áreas productivas para la generación de alimentos.No todos los suelos necesarios para una mayor producción se encuentran aptos para su explotación ya que años de intensa actividad industrial, uso de agroquímicos, falta de tratamientos en las aguas residuales, han provocado la degradación y contaminación de los mismos. Los efectos negativos producidos por los metales pesados en las diferentes partes de los agroecosistemas, suelos, cultivos y agua, así como, en los seres humanos, desde hace décadas, despertó el interés de muchos investigadores. La sociedad, así como decisores y gobiernos que han logrado tomar conciencia de este problema medioambiental, desde la década de los 90 han adoptado, a nivel internacional, algunas políticas para garantizar una mayor protección medioambiental y un desarrollo sostenible. Dentro de estas políticas, en la cumbre de Río de Janeiro (1992) los diferentes Estados participantes firmaron una serie de declaraciones relacionadas con la protección de los suelos que son aún aspiraciones a lograr. Como resultado de algunas investigaciones, especies vegetales con características específicas son cultivadas en las áreas afectadas para acelerar su restauración (Mazzeo, 2002). Estas plantas pueden ser usadas para remover, transferir, estabilizar y degradar metales pesados. Las mismas poseen mecanismos estructurales y adaptativos para la acumulación y tolerancia a las altas concentraciones del contaminante en la rizosfera. Mediante una tecnología conocida como Biorremediación, técnica ambientalmente más saludable, potencialmente más barata y que ofrece la posibilidad de la biorrecuperación de los metales pesados, las propiedades biológicas y físicas del suelo pueden ser mantenidas (Becerril et al., 2002).La fitorremediación como técnica incluida en la Biorremediación por tanto, constituye un método competitivo y sencillo de limpiar las cada vez más abundantes áreas contaminadas en todo el mundo. La identificación de plantas que germinan en ambientes muy contaminados presenta, frente a otros sistemas complejos de limpieza, un gran interés en la recuperación de suelos y/o aguas (Cámara, 2002). La actividad de los microorganismos propicia la degradación de compuestos químicos y orgánicos en la rizosfera, estimula la producción de exudados radicales y enzimas y favorece la producción de carbono orgánico en el suelo, todo lo cual posibilita el enriquecimiento de la microbiota. También

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influyen directamente en el proceso de fitorremediación, aumentando la biodisponibilidad de los metales en las rizosferas de las plantas (Schnnor, 1999).

El área objeto de estudio, ubicada frente a la industria de cerámica blanca “Adalberto Vidal” y enclavada en el Municipio San José de las Lajas, Provincia La Habana, ha sido identificada por el CEDAR (2004) como uno de los focos contaminantes del municipio, el cual cuenta con un gran asentamiento industrial y poblacional, detectándose el vertimiento indiscriminado de grandes volúmenes de aguas y lodos residuales por parte de las industrias, población e instituciones científicas que provocan en muchas ocasiones daños irreparables en los ecosistemas (FITOPLANT, 2007).

En dicha área se identificaron un total de 32 especies agrupadas en 22 familias que se desarrollan sin mostrar signos de toxicidad, manteniéndose a lo largo de los cuatro muestreos las especies Glycine habanica L., Acacia farnesiana L. (Willd), Dichantium caricosus L. Pers., Cynodon dactylon L. Pers., Cyperus gigantus L., Panicum maximum Jacq., Rivea corymbosa (L) Hall, Bursera sumaruba y Typha dominguensis (Pers). Kunth., de las familias botánicas Fabaceae, Mimosaceae, Poaceae, Cyperacae, Convolvulaceae, Burseraceae y Typhaceae, respectivamente; lo cual está relacionado con las características perennes de estas especies que son utilizadas como pastos y plantas medicinales (Quevedo, 2006).

Por esta razón proponemos el siguiente problema científico: La empresa de Cerámica Blanca contamina el ecosistema donde son vertidos los desechos de su producción, por lo que se hace necesario investigar la presencia de plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos tolerantes a los niveles de toxicidad existentes, para poder aplicar las técnicas de Biorremediación.

Surgiendo así como Hipótesis: En el área donde son vertidos los desechos de la Empresa Cerámica Blanca de San José de las Lajas, existen plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos específicos tolerantes a los niveles de contaminación que tienen las rizosferas de estas especies. Por tanto, para dar cumplimiento a lo planteado el Objetivo general es: Identificar especies de plantas acumuladoras de metales pesados y microorganismos rizosféricos tolerantes con potencialidades para aplicar la biorremediación en el área estudiada.Objetivos específicos:

Determinar la concentración pseudo-total de los metales pesados en las rizosferas de las especies vegetales seleccionadas, de acuerdo a su abundancia en el área experimental.

Determinar el contenido de metales pesados totales en la parte área y radical de las especies vegetales seleccionadas para identificar las que son acumuladoras de metales pesados con posibilidades a ser utilizadas en un sistema de recuperación de los suelos a través de la fitorremediación.

Aislar poblaciones de bacterias, hongos y actinomicetos de la rizosfera de las especies definidas como acumuladoras con más posibilidades a ser empleadas en sistemas de remediación de suelos.

Seleccionar morfotipos aislados con potencialidades para su empleo en técnicas de recuperación ecológica (Biorremediación).

Novedad Científica: A partir del establecimiento de protocolos de trabajo que constituyen estudios pioneros en nuestro país relacionados con la interacción suelo contaminado-microorganismos tolerantes-plantas acumuladoras, se aportan los primeros resultados que permiten encaminar la aplicación de las técnicas de Biorremediación en ecosistemas urbanos contaminados por la actividad antrópica acumuladora en el tiempo.

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II. Revisión Bibliográfica.

2.1. Contaminación por metales Pesados.

2.1.1. Origen de los metales pesados en los suelos.

Los metales pesados están presentes en suelos y acuíferos como componentes naturales o resultados de la actividad humana, por lo tanto su procedencia puede ser variada, asociándose las fuentes de contaminación a componentes naturales como resultado de la actividad humana (Garbisu et al., 2002a). La procedencia de metales pesados en los suelos puede ser: a) origen natural y b) de origen antropogénico:

De origen natural: Provenientes de erupciones volcánicas y de los metales pesados contenidos en el material original, que al meteorizarse, se concentran en los suelos. Estas concentraciones naturales de metales pueden llegar a ser tóxicas para el crecimiento de las plantas, así por ejemplo, el níquel puede aparecer en concentraciones tóxicas en suelos derivados de rocas ultra básicas.De origen Antropogénico: Las actividades generadas por el hombre proveniente del desarrollo industrial que han ejercido un efecto considerable en la concentración y movilidad de los metales en suelos. Las siguientes actividades como generadoras de contaminación de origen Antropogénico Lenntech (2004) y Nerín (2004):

Productos químicos agrícolas y lodos residuales.

Generación de electricidad y otras actividades industriales.

Residuos domésticos.

El transporte automotriz.

Fabricación de sanitarios y azulejos.

Por lo tanto, el desarrollo de determinadas actividades industriales puede constituir un riesgo moderado de contaminación ambiental. Dicho riesgo no es solo debido a las emisiones atmosféricas sino también a mala gestión de sus residuos o a un deficiente almacenamiento de las materias primas y productos, que pueden ocasionar fugas de componentes que se acumulan en el suelo (Vullo, 2004).Situación por la cual en la actualidad la mayoría de las actividades industriales son consideradas como "actividades potencialmente contaminantes de los suelos” (Nerín, 2004).

2.1.2. Transporte y dispersión de los contaminantes.

A partir de un contaminante en el suelo se pueden desencadenar una serie de procesos de movilización del mismo, cuya acción efectiva dependerá de una parte de la composición y características físicos-químicas de la sustancia y por otra de las características geoquímicas de ese suelo (Peris, 2006).

De forma general, el suelo por sí mismo no es un vector importante de dispersión de contaminantes, pero en combinación con otros factores ambientales se revela como un foco emisor de contaminación de gran importancia. El agua, y en menor medida el aire, son los agentes dispersantes de la contaminación presente en un suelo. También, hay que tener en cuenta el papel depurador de ciertos

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componentes del suelo, como son los coloides, dentro del material sólido inorgánico los materiales húmicos y los microorganismos. La retención de los contaminantes se lleva a cabo por medio de fenómenos de absorción física, interacción química o bien los transforman por medio de reacciones químicas (Kabata-Pendias y Pendias, 2001).

2.1.3. Las arcillas y la industria cerámica como generadora de contaminación.

Las arcillas son constituyentes esenciales de los suelos y sedimentos debido a que son mayoritariamente productos finales de la meteorización de los silicatos que formados a mayores presiones y temperaturas, en el medio exógeno se hidrolizan. Se consideran arcillas todas las fracciones con un tamaño de grano inferior a 2 mm (Domínguez y Schifter, 2005).

Lo que normalmente se entiende por arcilla es, desde un punto de vista geológico, una roca arcillosa que contiene cuarzo y varios filosilicatos del grupo de la arcilla, como ilita, caolinita, clorita, esmectitas. Lo más frecuente es que sea de tipo ilítico o ilítico-caolinítico. También puede contener feldespato, carbonatos (que actúan ambos como fundentes en la cocción de la arcilla) y yeso. En la arcilla refractaria, predomina la caolinita, que es el nombre genérico de un grupo de filosilicatos de la familia de las kanditas. Y en las arcillas especiales, las esmectitas, la sepiolita o la paligorskita, según el tipo de roca arcillosa (Novelo et al., 2003).

Según esto todos los filosilicatos pueden considerarse verdaderas arcillas si se encuentran dentro de dicho rango de tamaños; incluso minerales no pertenecientes al grupo de los filosilicatos (cuarzo, feldespatos, etc.) pueden ser considerados partículas arcillosas cuando están incluidos en un sedimento arcilloso y sus tamaños no superan los 2 mm (Domínguez y Schifter, 2005).

Los filosilicatos presentan una estructura basada en el apilamiento de planos de iones oxígeno e hidroxilos. Los grupos tetraédricos (SiO)4 se unen compartiendo tres de sus cuatro oxígenos con otros vecinos formando capas, de extensión infinita y fórmula (Si2O5)2-, que constituyen la unidad fundamental de los filosilicatos. En ellas, los tetraedros se distribuyen formando hexágonos. El silicio tetraédrico puede estar, en parte, sustituido por Al3+ o Fe3+. Estas capas tetraédricas se unen a otras octaédricas. En ellas algunos cationes Al3+ o Mg2+, pueden estar sustituidos por Fe2+ o Fe3+ y más raramente por Li1+, Cr3+, Mn2+, Mn3+, Ni2+, Ni3+, Cu2+ o Zn2+. El plano de unión entre ambas capas está formado por los átomos de oxígeno de los tetraedros que se encontraban sin compartir con otros tetraedros (oxígenos apicales) y por grupos (OH)- de la capa octaédrica, de forma que, en este plano, quede un grupo (OH)- en el centro de cada hexágono formado por 6 oxígenos apicales (López et al., 2003).

Como roca industrial, la propiedad más importante de la arcilla común, y la que determina muchas veces su posible uso, es la plasticidad una vez amasada con agua. El contenido en Hierro, Titanio y Manganeso determina el color de la arcilla cocida, distinguiéndose dos grandes grupos: arcillas de cocción roja y arcillas de cocción blanca. Otras propiedades importantes son la resistencia mecánica en crudo, la temperatura de sinterización y la contracción de secado y durante la cocción (Cabo et al., 2006).

Las arcillas pueden tener diferentes términos en función de su uso, según Bravo (2004):-Desde el punto de vista mineralógico, engloba a un grupo de minerales arcillosos, filosilicatos en su mayor parte, cuyas propiedades físicoquímicas dependen de su estructura y de su tamaño de grano, muy fino (inferior a 2 mm). -Desde el punto de vista petrológico la arcilla es una roca sedimentaria, en la mayor parte de los casos de origen detrítico, con características bien definidas.

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Para un sedimentólogo, arcilla es un término granulométrico, que abarca los sedimentos con un tamaño de grano inferior a 2 mm. -Para un ceramista una arcilla es un material natural que cuando se mezcla con agua en la cantidad adecuada se convierte en una pasta plástica. -Desde el punto de vista económico las arcillas son un grupo de minerales industriales con diferentes características mineralógicas y genéticas y con distintas propiedades tecnológicas y aplicaciones, todas relacionadas con la actividad ceramista (construcción de cerámicas artísticas, lozas de pisos, azulejos, sanitarios, talcos, cementos y materias primas de fertilizantes, industria química, farmacéutica, entre otros.

En específico la industria de fabricación de productos cerámicos utiliza como materia prima básica todo tipo de arcillas y caolines, así como arcilla cocida, feldespatos, arenas y otros muchos óxidos resistentes a altas temperaturas, por ejemplo, corindón (Al2O3), óxido de circonio (ZrO2) o carburo de silicio (SiC). Debido al origen de cada arcilla, esta contiene diversos elementos trazas asociados, por tanto, su uso continuo genera contaminación (De Zeeuw y Lock, 2000)

Según Sisti (2002) la industria de fabricación de productos cerámicos puede dividirse para su mejor entendimiento: a) por el tipo de planta que genera la contaminación y b) por el vehículo de contaminación.

Según el tipo de planta que genera la contaminación están las Plantas productoras de cerámica sin esmaltado donde los productos contaminantes son básicamente productos de la combustión, polvo de materias primas y productos de la descomposición de estas materias primas. Las plantas de cerámicas esmaltadas, los contaminantes tienen la característica de que además de los contaminantes producto de la combustión y de la descomposición de las arcillas se les debe agregar los elementos químicos en forma de óxidos, sales, gases, etc., comenzando la contaminación desde el inicio del proceso productivo, durante la producción de los pigmentos, esmaltes y las operaciones propias de molienda y aplicación de esos esmaltes y hasta durante su uso.

Por el vehículo de los elementos contaminantes producidos por la industria cerámica están los efluentes gaseosos (gases, vapores líquidos, sólidos subliminales, polvo), líquidos (líquidos disueltos o en suspensión, sales solubles, sólidos en suspensión coloidal) y sólidos (barros o polvos de arcillas o de esmaltes, descarte de productos sin esmaltar, descarte de productos esmaltados).

2.1.4. Efectos de la contaminación.

Una vez que el elemento ha llegado al suelo puede seguir diversas vías en el mismo. Las principales son aquellas que afectan a su difusión a diversos medios por ser las que afectan a la salud humana. El ingreso en las cadenas tróficas puede hacerse mediante la absorción por las plantas o el lavado hacia las aguas freáticas en las que tiene mucho que ver su solubilidad (Vullo et al., 2003).

De forma general, la presencia de contaminantes en el suelo se refleja de forma directa sobre la vegetación induciendo su degradación, la reducción del número de especies presentes en ese suelo, abandono de la actividad agropecuaria, desaparición de la fauna, pérdida del valor agrícola y económico del suelo y más frecuentemente la acumulación de contaminantes en las plantas, sin generar daños notables en estas (Tarrach, 2001).

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2.1.4.1. Impacto de los metales pesados en las comunidades microbianas.

Los metales pesados provocan grandes efectos en procesos importantes de fertilización de suelo pues afectan la estructura y la función de las comunidades microbianas (González, 2000). Funciones claves en estos procesos la mineralización de la materia orgánica y la fijación biológica del nitrógeno pueden ser inhibidos por concentraciones mínimas por debajo del límite permisible (Madigan et al., 1998).

La contaminación con metales pesados puede llevar a una reducción parcial así como total en la población de la masa microbiana, o bien provocar disminuciones efectivas en poblaciones de microorganismos como Rhizobium (Chaudri et al., 1999) o micorrizas, así como alterar la composición en la estructura microbiana de los suelos. Estudios sobre el dominio Archea, realizados en suelos contaminados con metales pesados demuestran una reducción en el porcentaje de especies comparadas con un suelo no contaminado, demostrándose además diferencias cualitativas en la estructura de esas (Enger y Torsvik, 1999; Castrillo, 2004).

Varios estudios han concluido que los metales influyen sobre los microorganismos afectando su crecimiento, morfología y actividades bioquímicas (Reber, 1992). A pesar de estos efectos tóxicos de los metales pesados, los microorganismos han desarrollado mecanismos de resistencia que permiten su supervivencia: entre los que se encuentran la volatilización, precipitación extracelular y exclusión, ligazón en la superficie celular y secuestro intracelular (Shuttleworth y Unz, 1993).

2.1.5. Mecanismos de Interacción Metal-Microorganismo.

Los microorganismos han coexistido con los metales desde un principio, hecho este que se refleja en el ancho espectro de divalentes de metales o de transición encontrados en los centros activos de muchas enzimas. Se han usado las propiedades químicas de los metales en las reacciones bioquímicas más importantes y en el mantenimiento de la estructura de las proteínas. Estos metales son, necesarios, en cantidades mínimas (microelementos) para el metabolismo celular normal y su recepción es llevada a cabo por un mecanismo de homeostasia que garantiza efectivamente una adquisición nunca excesiva del metal. Muchos otros metales parecen no tener ninguna función biológica importante como el Pb (plomo). Al contrario, causan graves daños y perjuicios a la salud, principalmente debido a su avidez por los agrupamientos sulfhídricos de las proteínas que bloquean e inactivan (Gadd, 2000).

Diferentes organismos muestran variadas respuestas a los iones tóxicos de un metal del ello deben ser el resultado de mecanismos intrínsecos o inducidos. Se define la tolerancia como la capacidad que tiene un organismo de vivir junto con la toxicidad de los metales a través de las propiedades intrínsecas del mismo. La resistencia, por otro lado, es la habilidad de vivir con los metales tóxicos a través de mecanismos del detoxificación producida en respuesta directa a la presencia del metal (Labrenz et al., 2000).

Los Eucariontes son más sensibles a la toxicidad de los metales que las bacterias y su mecanismo típico de regulación. La concentración de iones metálicos es intracelular, y se realiza a través de la expresión del metalotioneínas, una familia de quelatos de metal de proteínas. En este caso, las metalotioneínas bacterianas que son funcionalmente homólogas a las eucarióticas las cuales ya fueron demostradas Blindauer et al. 2001, citado por Kamnev (2003). Las bacterias reductoras de sulfatos demuestran un cierto grado de tolerancia a los metales como consecuencia de su metabolismo, son anaerobios que producen sulfatos e inmovilizan iones tóxicos como los sulfitos metálicos (Labrenz et al., 2000).

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2.2. Métodos Biológicos para la Remediación de suelos contaminados por metales pesados.

El término restauración ecológica implica la restauración o rehabilitación de ecosistemas o hábitats que han sido alterados específicamente por el hombre, esta restauración ecológica se vale de diferentes métodos tales como: restauración, rehabilitación, reacondicionamiento, recuperación ecológica y biorremediación (UACh, 2003).

La utilización de métodos biológicos para remediar un ambiente contaminado ofrece una alta especificidad en la remoción del metal de interés con flexibilidad operacional tanto en sistemas in situ como ex situ (Vullo et al., 2003).

La remediación “in situ” de ambientes contaminados por metales pesados, pretende encontrar una solución definitiva que proteja la salud humana y del ecosistema, constituyendo por lo tanto sus objetivos fundamentales (Martín y Ruby, 2004):

Reducir los niveles del metal.

Reducir la Biodisponibilidad de metales a seres humanos y demás receptores ecológicos.

Restablecer la vegetación.

Todos los programas de remediación in situ, siguen una estrategia para la contención del contaminante, estabilización o reducción, Puede que no sea posible una limpieza total del área, más es posible disminuir los riesgos de daños a la salud humana y al ambiente. De forma tal que, la carga contaminante disminuya a niveles aceptables para una manipulación física o química del área en cuestión. Las estrategias de reducción in situ incluyen a la actividad microbiana.

2.2.1. Biodegradación mediada por microorganismos.

En el caso del petróleo, en realidad son los microorganismos asociados a las raíces de las plantas los que se encargan de degradarlo. Los vertidos de petróleo son un blanco perfecto para los fitorremediadores, ya que una vez vertido en el suelo, el petróleo posee escasa movilidad, y forma una delgada capa en la superficie del suelo, donde puede estar en contacto directo con las raíces. Las plantas aceleran la acción de los microbios, proporcionando más oxígeno al suelo y gran cantidad de preciados nutrientes a través de las raíces. Este mecanismo ha servido para descontaminar con éxito diversos vertidos de petróleo crudo, y otros productos petrolíferos, en los Estados Unidos (Wangensteen, 2002).

Los microorganismos pueden reducir la toxicidad de los metales por la incorporación de estos en sus células o por precipitación en la superficie de ellas en unión no específica (Gadd y Griffiths, 1978). Igualmente pueden contribuir a reacciones de metilación de elementos traza como As, Hg, Pb y Tl, incrementando su toxicidad (González, 2000).

Las principales interacciones extracelulares entre bacterias y metales son: la movilización, e inmovilización; la producción de polímeros extracelulares y la liberación de sideróforos. La movilización e inmovilización de metales es motivo de interés por sus aplicaciones industriales, principalmente en la minería. Los microorganismos son sensibles tanto a las deficiencias como a excesivas concentraciones de elementos, aunque son capaces de adaptarse a ellas. Los metales pesados son tóxicos para la microbiota, reduciendo el crecimiento así como la actividad enzimática (Kabata-Pendias y Pendias, 2001).

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Dependiendo del estado de oxidación que se presente un metal y la especie en que esté conformando un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles. Una correspondería a la movilización del metal, es decir el pasaje de un estado insoluble inicial metales asociados a suelos, sulfuros u óxidos metálicos, por ejemplo) correspondiente a una fase sólida, a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviación microbiana. El otro corresponde a la inmovilización del metal, es decir el paso de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida. A su vez, existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilización del metal puede llegar a ocurrir (Vullo, 2004).

Nuevas técnicas de tratamiento han aparecido, teniendo su génesis en la capacidad de diferentes organismos (plantas y microorganismos) para degradar, extraer o inmovilizar los contaminantes orgánicos o inorgánicos del suelo o el agua. Estas técnicas han sido denominadas Biorremediación y como un caso particular al emplear diferentes plantas la Fitorremediación (Becerril et. al., 2002).

2.2.2. Biorremediación.

La biorremediación un proceso que utiliza las habilidades catalíticas de los organismos vivos para transformar contaminantes en productos inocuos, o en su defecto, menos tóxicos, que pueden entonces integrarse a los sitios bioquímicos naturales, tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos, presentando un enorme potencial en la mitigación de la contaminación ambiental (Garbisu et al., 2002b).

Es una tecnología que tiene como objetivo acelerar la biodegradación natural de los compuestos orgánicos mediante la optimización de las condiciones limitantes del proceso. En este proceso influye la composición, concentración y disponibilidad de los contaminantes, o las características físicas y químicas del lugar contaminado. En muchos casos, una o varias de estas condiciones no se encuentran presentes, de forma que la biodegradación se produce a velocidades tan bajas que impiden conseguir rendimientos de depuración satisfactorios (Montrás y Vincent, 2002).

Lo que hace sobresaliente a esta técnica frente a los métodos convencionales de “limpieza” ambiental, es que se basa en medidas y aplicaciones que permiten potenciar la actividad metabólica de ciertos microorganismos nativos capaces de transformar contaminantes orgánicos en compuestos químicamente más sencillos, que la naturaleza puede aprovechar (Vásquez, 2002).

Constituye una técnica muy segura, ya que depende de microbios que existen normalmente en los suelos. Esos microbios son útiles y no representan un peligro para los seres humanos en el sitio o la comunidad. Además, no se emplean sustancias químicas peligrosas. Los nutrientes que se añaden para que las bacterias crezcan son fertilizantes de uso corriente en el césped o el jardín (ITGE, 1995).

En conclusión el uso de técnicas biológicas puede reducir fuertemente los costos de remediación de sitios contaminados (Lodewyckx y Mergeay, 2002). La biorremediación constituye una alternativa biológica, económica y socialmente aceptable por su bajo costo y eficiencia, en el tratamiento de suelos y acuíferos contaminados por metales pesados e hidrocarburos (Vásquez, 2002).

Las estrategias de descontaminación basadas en el empleo de plantas se encuentran entre las técnicas más recientemente usadas para la reducción de contaminantes 'in situ' (Kan et. al., 2000).

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2.2.3 Fitorremediación.

La utilización de plantas para la descontaminación de los suelos se denomina en forma genérica fitorremediación, siendo una técnica que utiliza las plantas acumuladoras e hiperacumuladoras para extraer e inmovilizar los contaminantes del suelo y las aguas (Becerril et al., 2002).

Esta técnica in situ, sin levantamiento de la zona contaminada, permite tratar: suelos afectados, lodos, sedimentos, además de las aguas y también las zonas hortícolas, a través de, supresión, degradación o estabilización del contaminante (Kaemmerer, 2003).

La fitorremediación es una tecnología que deriva de métodos botánicos y biogeoquímicos, y utiliza a diversas especies (plantas y microorganismos) para degradar, extraer, inmovilizar y recuperar los suelos contaminados y cualquier otro tipo de material que contenga contaminantes (Evanko y Dzombak, 1997) citados por Flocco (2004).

La idea de utilizar plantas con alta capacidad de acumular metales, para removerlos selectivamente del suelo cuando se encuentran en exceso, fue propuesta por R. Chaney y otros autores en 1983, pero a partir de 1990 tuvo aceptación (Higueras, 2004).

La fitorremediación como técnica de tratamiento de sitios contaminados es económica y representa otras ventajas como la conservación del suelo superficial, previene la migración y lixiviación de los compuestos tóxicos por el movimiento del agua en el suelo, puesto que la secreción o síntesis de exudados por la rizosfera motivan el crecimiento de diversos microorganismos como hongos y bacterias que desdoblan contaminantes (Castrillo, 2004).

2.2.3.1. Técnicas de Fitorremediación.

Las técnicas clásicas para la descontaminación de metales pesados son muy limitadas y prácticamente inexistentes para su eliminación selectiva (Becerril et al., 2002). La Fitorremediación comprende diferentes modalidades, aplicables bajo distintas circunstancias. Se pueden distinguir seis vías de acción:Fitoextracción (fitoacumulación), Fitoestabilización (fitorestauración), Rizofiltración, Fitovolatilización, Fitodegradación (fitotransformación), Fitoestimulación (rizodegradación).

a) Fitoextracción

La fitoextracción de metales pesados es una de las tecnologías más prometedoras por su relativa efectividad y la gran dimensión ambiental y social de la contaminación. Las plantas hiperacumuladoras tienen la habilidad de tomar y tolerar altos niveles de metal en sus tallos, por lo que ellas constituyen las herramientas potenciales para la fitoextracción (McGrath et al., 1993; Baker et al., 1994; McGrath, 1998; Schwartz y Morel, 1998) citados por Perronet (2003).Según Garbisu et al. (2002b), las características de una planta empleada en la fitoextracción pueden resumirse en:

Tolerancia a niveles elevados de metales pesados.

Acumulación razonablemente elevada de niveles de metales pesados.

Rápido rango de crecimiento.

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Alta producción de biomasa en campo.

Sistema radical profuso.

b) Fitoestabilización

La fitoestabilización es el uso de determinadas especies de plantas para inmovilizar contaminantes en suelos y aguas subterráneas mediante la absorción y acumulación de estos en las raíces, o a través de la precipitación de estos en la rizósfera, y estabilización física de los suelos. Estos procesos reducen la movilidad de los contaminantes y previenen la migración de los mismos hacia las aguas subterráneas y la superficie. Estas técnicas pueden ser usadas para restablecer la vegetación de cobertura en sitios donde la vegetación natural ha sido eliminada por las altas concentraciones de metales pesados (ITRC, 2001).

c) Rizofiltración

La rizofiltración consiste en la adsorción o precipitación de contaminantes en las raíces de las plantas o la absorción de contaminantes circundantes en la zona radical. La rizofiltración puede aplicarse como una técnica de Fitorremediación ex situ, dónde el tratamiento consiste en proporcionar el agua contaminada a ser tratada hacia el área donde las plantas son cultivadas similares a un sistema de hidroponía donde las plantas se siembran sobre un lecho artificial. Una vez que las plantas han desarrollado su sistema de raíces, el agua contaminada se desvía del sitio desechado hacia las plantas. Cuando las raíces de las plantas se saturan con los contaminantes las plantas se cosechan y se reemplazan por un nuevo cultivo (EPA, 2000).

d) Fitovolatilización

La fitovolatilización consiste en la captación y transpiración de un contaminante por la planta, con la subsiguiente liberación del contaminante modificado hacia la atmósfera. Esta tiene lugar en árboles y otras plantas que toman agua y contaminantes orgánicos e inorgánicos. Algunos de estos contaminantes pueden pasar a través de las plantas hacia las hojas y volatilizarse en la atmósfera a concentraciones relativamente bajas, muchos de los componentes orgánicos transpirados por la plantas son posteriormente fitodegradados (ITRC, 1999; EPA, 2000).

e) Fitodegradación

La fitodegradación comúnmente llamada fitotransformación consiste en la separación de los contaminantes que son tomados por la planta durante los procesos metabólicos, o la separación de contaminantes externos mediante efectos sinérgicos, a través de enzimas producidas por las plantas. Los contaminantes son degradados y usados como nutrientes e incorporados a los tejidos vegetales. En algunos casos en forma de metabolitos secundarios o productos finales son reincorporados al ambiente dependiendo del tipo de contaminante y la especie de planta (Suresh y Ravishankar, 2004).

f) Fitoestimulación (Rizodegradación)

La fitoestimulación llamada también rizodegradación, o biodegradación rizosférica, consiste en la captación del contaminante en el suelo gracias a la elevada actividad microbiana de los microorganismos rizosféricos (algas hongos y bacterias) que consumen y degradan o transforman

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sustancias orgánicas. Ciertos organismos pueden degradar sustancias orgánicas como gasolina o solventes que son peligrosos para los humanos y eco-receptores y convierten estos en productos menos peligrosos. Las sustancias naturales liberadas por las raíces de la planta como azúcares, alcohol y ácidos contienen carbón orgánico que actúa como fuente de nutrientes para los microorganismos del suelo, estos nutrientes adicionales estimulan su actividad (EPA, 2000).

La fitorremediación puede ser aplicada en grandes superficies con un costo relativamente bajo con respecto a otras tecnologías de remediación. Se puede limpiar y reducir dramáticamente los niveles de contaminación junto con la preservación de la superficie del suelo. La utilización de las tecnologías de fitorremediación resultan útiles para el reciclado de los metales extraídos. Es una tecnología que se puede aplicar para un amplio rango de metales, radionucleótidos y orgánicos. La necesidad de excavar el suelo puede ser minimizada o eliminada (Perronet, 2003).

2.2.3.2. Plantas Hiperacumuladoras.

El caso más representativo y útil para las técnicas de fitorremediación, lo constituyen las plantas denominadas hiperacumuladoras, capaces de tolerar, tomar y acumular en sus tejidos aéreos, elementos esenciales para los cultivos (Fe, Mn, Zn, Cu, Mg, Mo, Ni) y elementos no esenciales o con funciones biológicas aún por determinar (Cd, Cr, Pb, Ag, Se, Hg) alcanzando elevadísimas concentraciones que resultan tóxicas para la mayoría de las plantas (Garbisu y Alkorta, 2001).

Las plantas que hiperacumulan metales han llamado la atención desde hace tiempo como indicadoras geobotánicas de depósitos de minerales. Actualmente se estudia la posibilidad de extraer metales del suelo y concentrarlos en las partes aéreas de las plantas, lo que proporciona una aplicación práctica de la fitorremediación. Estas plantas representan un modelo para estudiar los mecanismos de acumulación de metales como también su tolerancia y detoxificación (Garbizu et al., 2003).

Se habla de plantas acumuladoras e hiperacumuladoras cuando determinadas especies toleran 10-100 veces más los valores normales de un determinado elemento, o sea (0,1 y 1 ppm respectivamente) en tejidos vegetales en base a materia seca. En condiciones experimentales, se alude a valores de absorción diez veces superiores a los alcanzados por las mismas plantas utilizadas como testigo. La hipertolerancia es esencial para que el fenotipo hiperacumulación aparezca en plantas hiperacumuladoras naturales, lográndose por detoxificación interna y probablemente incluya la compartimentación y acomplejación (McGrath y Zhao, 2003).

Según Berazaín (1999), entre los mecanismos que definen la capacidad de acumular metales pesados se encuentran aquellos que están ligados a cierto nivel taxonómico como es el inter-específico; por ejemplo, las subespecies o variedades de una especie que crezcan sobre rocas serpentinitas se comportan similarmente, es decir todos estos niveles tienen un comportamiento igual, o son acumuladores o no lo son.

Se definen como posibles mecanismos fisiológicos que fundamentan la hiperacumulación, los siguientes (Boominathan y Doran, 2003):Como las vacuolas vegetales son los mayores depósitos de ácidos orgánicos, las asociaciones de éstos con los metales sugieren la existencia de la detoxificación metálica por secuestración vacuolar, enlazamiento con la pared celular y localización en el apoplasto.

Los mayores inconvenientes que presentan las plantas nativas hiperacumuladoras de metales son sus relativamente bajas biomasas, lentas tasas de crecimiento y el desconocimiento que hay de plantas

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hiperacumuladoras de determinados contaminantes metálicos como el arsénico y el plomo (Vásquez, 2002).

Las plantas hiperacumuladoras de metales son un grupo pequeño de especies (hay unos 400 identificadas de momento) capaces de absorber a través de las raíces y transportar a sus partes aéreas concentraciones muy elevadas de metales. Hasta la fecha se han estudiado, de forma detallada, sólo un número muy reducido de estas (Garbisu et al., 2003).

2.3. Biodisponibilidad.

La capacidad de absorción de las plantas con respecto a metales pesados es variable, lo que abre la posibilidad de adaptar la elección de cultivos según el grado y tipo de contaminación. Por lo general, las cantidades mayores de metales pesados se acumulan en las hojas, mientras que los contenidos más bajos se encuentran en las semillas. La absorción de metales pesados en las plantas (especialmente cadmio y plomo) varía según la biodisponibilidad del suelo y otros factores según (Iretskaya y Chien, 1999) citados por De Zeeuw y Lock (2000).

El concepto de biodisponibilidad se encuentra íntimamente relacionado con las condiciones fisicoquímicas del ambiente, que determinan la especiación y por lo tanto la concentración de metal libre y lábil (Magnarelli, 2002).

Esta biodisponibilidad de elementos químicos en el suelo depende tanto de la concentración del elemento como de su movilidad respecto a la actividad de la planta. Esto es a su vez función del pH, la capacidad de cambio de bases, y la presencia de agentes acomplejantes. Las raíces, además de captar las sales disueltas pueden absorber material unido a la superficie de partículas plásticas, en parte debido al efecto de microambientes ácidos generados por la raíces y en parte por fenómenos de cambio de bases.

2.3.1. Bacterias Diazotróficas.

Las bacterias fijadoras asociativas colonizan la rizosfera y/o el interior de las células corticales de las plantas hospederas, penetran la endodermis colonizando los vasos conductores. Estas bacterias pertenecen principalmente al grupo de las Beta-proteobacterias y están incluidas en diferentes géneros. Las plantas hospederas de estas bacterias son generalmente monocotiledónias (Kennedy et al., 2004).

Dentro de estas bacterias, pueden ser citados algunos géneros que pueden establecer relaciones de tipo endófitas con las gramíneas: Azospirillum Gluconacetobacter, Herbaspirillum, y Burkholderia (Baldani, 2004).

La primera especie de Azospirillum fue descrita por Beijerinck en 1925. En 1976 J. Doberreiner y JM Day aislaron esta bacteria y fueron los primeros en relatar que la misma estaba presente en las rizosferas de diversas gramíneas tropicales (Bashan et. al., 2004). Posterior a este redescubrimiento, se impulsaron una serie de estudios en todo Brasil y el mundo, siendo actualmente uno de los temas investigativos más abordados; en la actualidad se han identificado otros géneros y otras especies fijadoras de nitrógeno, en el cultivo del arroz, en la caña de azúcar, en plantas forrajeras, pastos (Eckert et al., 2001).

Resultado obtenidos por diversos investigadores demuestran que la inoculación de diazotróficos es capaz de promover el crecimiento de la planta hospedera por mecanismos actualmente desconocidos, pero se ha estudiado que predominan aumentos en la biomasa foliar y en el desarrollo radical. El

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concepto de PGPR comprende bacterias colonizadoras de las rizosferas, originalmente se llamaron Rizobacterias Promotoras de Crecimiento de Plantas (RPCP). El género Azospirillum ha sido ampliamente estudiado como bacteria PGPR (Klopper, 2003).

2.4. Caracterización de las especies seleccionadas.

1. Especie: Cyperus gigantus L.

Nombre común: Farolito chino, quitasol chino, paraguita.

Familia: Cyperaceae.

Descripción botánica y distribución: Planta herbácea, tallos de 50-150 cm de alto y 5-20 mm de grosor en la base. Brácteas 18-20, iguales en longitud, de 20-50 mm de ancho. Hojas reducidas a vainas; radios (18-20) ramificados de hasta 10 cm de largo. Es una planta oriunda de África o Madagascar, introducida en los trópicos como ornamental en fuentes y jardines (León, 1946).

Hábitat y usos: Se encuentra a orillas de ríos y zonas inundadas, pueden comerla los animales (Roig, 1965).

2. Especie: Cynodon dactylon (L.) Pers.

Nombre común: Grama, hierba fina, bermuda.

Familia: Poaceae.

Descripción botánica y distribución: extensamente rastrera; vainas pelosas en el extremo; espigas 3-5, delgadas, de 2.5-5 cm, espiguillas de 2 mm; lemma más larga que las glumas. Se encuentra en toda Cuba y regiones cálidas y templadas (León, 1946).

Hábitat y usos: Muy común en terrenos abiertos; se usa como césped y como pasto. Su polen puede producir reacciones alérgicas y los rizomas se usan como diuréticos (Roig, 1965).

3. Especie: Xanthosoma cubense (Rich.) Schott.

Nombre común: Malanga cimarrona, malanguilla.Familia: Araceae.

Descripción botánica y distribución: Hierba grande; hojas pedatisectas de 25 cm y 39 cm de ancho, los 5 lóbulos enteros, brevemente acuminados y estrechados en la base, dejando los senos visibles. Peciolo craso de unos 26 cm sin la vaina, esta de 15 cm o más. Pedúnculos basales libres en la vaina. Espádice de unos 10-12 cm, enteramente envuelto en la espata, el limbo de esta de longitud doble del tubo. Es una planta endémica que se distribuye naturalmente en toda Cuba (León, 1946).

Hábitat y usos: Silvestre en terrenos húmedos de todo el país y al pie de sierras calcáreas y entre rocas (Roig, 1965).

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4. Especie: Typha dominguensis (Pers.) Kunth.

Nombre común: Macío, espadaña, vela de sabana, pelusa.Familia: Typhaceae.

Descripción botánica y distribución: Hierba de 1-2 m de alto. Hojas lineares, planas, alargadas y esponjosas. Inflorescencia en una densa espiga de color castaño de 15-40 cm. Distribuida en toda Cuba, Antillas y América del Sur hasta la Patagonia (León, 1946).

Hábitat y usos: Abundante en lugares pantanosos, ríos y cañadas. Con los pelos sedosos de las espigas se pueden confeccionar almohadas (Roig, 1965).

2.5. El enfoque agroecológico en la investigación.

La Agroecología sugiere la aplicación de principios ecológicos en el diseño de agroecosistemas sustentables, así como tomar en consideración no sólo estas dimensiones ecológicas y técnicas, sino también las económicas, sociales y culturales asociadas a la producción agrícola (Hecht 1997, Altieri, 1999 y Naredo 2001; citados por Álvarez, 2005).

En su versión “fuerte” la Agroecología, asume el compromiso ético socio-ambiental a favor de los agricultores campesinos, como actores sociales protagonistas del necesario proceso de transición hacia una agricultura sostenible. La adopción de técnicas basadas en principios ecológicos depende decisivamente de la percepción que los campesinos tienen de los problemas, así como de su saber, sus expectativas, intereses y prioridades, en la medida que se encuentran inscritos en una determinada matriz de acción comunitaria, asociativa o cooperativa, y en el contexto de una determinada política de desarrollo agrario (Sevilla, 2002).

El grado de resistencia y estabilidad de los agroecosistemas no está estrictamente determinado por factores de orígenes bióticos o ambientales, sino que intervienen también factores sociales. Por tanto, los factores sociales (internos y externos) de los agroecosistemas, influyen condicionan y determinan su funcionamiento y desarrollo y de manera potenciada dependerá el desarrollo sostenible (Freyre, 1997), la problemática agroecológica considerando la significación de las Ciencias Sociales nos llevará a reconocer la unidad del sistema productivo en sus múltiples interacciones de disímiles factores.

Si bien se reconoce que la biodiversidad es tal vez el atributo más importante de la sustentabilidad ecológica del agroecosistema, la Ciencia Social en base a la Agroecología, realiza una contribución destacada a la sustentabilidad agrícola convencida de que esta última, está indisolublemente vinculada a procesos económicos, sociales, y culturales, además de los ecológicos (Freyre, 1997).

2.5.1. Los métodos participativos en la investigación científica.

La perspectiva de la investigación participativa (IP) propone que diferentes grupos de personas con diferentes intereses sobre una misma tecnología estén involucradas en su desarrollo y participen piensen y reaccionen en función de ella (Hecht, 1997). Los enfoques de investigación participativa están basados en nociones de aprendizaje interactivo, donde el conocimiento generado por la ciencia formal y de los usuarios locales se va construyendo uno sobre otro, en un proceso de retroalimentación continua. Como resultado, las estrategias utilizadas para "hacer" la investigación participativa evolucionan de manera diferente a las utilizadas para la investigación formal. Los procesos de investigación participativa involucran a usuarios de tecnologías,

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personas que tienen diferentes intereses, perspectivas, acceso a recursos por género, objetivos y necesidades específicas. La IP que enfatiza sobre estas diferencias tiene una mejor oportunidad de lograr los objetivos de incrementar la equidad, influencia y capacidad de innovación (Hagmann et al., 1998 citado por Pinzón, 2006).

Usos de la Investigación Participativa.

• Generar conciencia del estado de un recurso.• Movilizar a las personas hacia la acción comunitaria.• Evaluar las necesidades y desarrollar micro-planes.•Agregar valor a las soluciones locales.• Incorporar las preferencias y perspectivas locales.•Monitorear las iniciativas tomadas.• Evaluar los impactos de las acciones e innovaciones.

La evaluación del impacto de la Investigación Participativa y Análisis de Género (IPAG) requiere de innovación en los procedimientos, de métodos, indicadores y procesos acordes a la tarea. De herramientas que "…ayuden a entender…" procesos que están normalmente escondidos o que tienen lugar en escalas espaciales o temporales que no están accesibles a la experiencia humana". Las herramientas desarrolladas para evaluar las iniciativas de la IPAG en el desarrollo de tecnología deben ser tan claras para los usuarios de las tecnologías e innovadores locales como lo son para los agricultores (Álvarez, 2005).

Los métodos participativos facilitan espacios para la socialización e intercambio de conocimiento así como las experiencias entre los grupos de actores sociales Sin embargo, todavía existe preocupación, debido a que algunos métodos participativos desarrollados y utilizados por los agentes de investigación y desarrollo (I&D) tienden a propiciar sociedades desiguales (Hecht, 1997).

Conforme pasa el tiempo y conforme los agentes obtienen experiencia en los procesos participativos, se deben poner a disposición más métodos e instrumentos efectivos para motivar y facilitar la participación y el aprendizaje interactivo. Estos métodos deben ser efectivos y apropiados para situaciones y culturas específicas y adaptadas en forma diferenciada a las necesidades de los géneros, grupos generacionales, étnicos y a su nivel de ingreso (hombres, mujeres, adultos mayores, jóvenes, agricultores a pequeña y gran escala). Una realidad común a muchos espacios rurales es la interculturalidad, dimensión que tiene que ser incorporada tanto en la perspectiva de trabajo como en los instrumentos a ser usados, es decir, tener siempre presente que la realidad no es homogénea (Hagmann et al., 1998 citado por Pinzón, 2006).

III. Materiales y Métodos.

3.1. Características del área experimental.

El área experimental se encuentra ubicada en Ave 47, circunscripción 25 del consejo popular Jamaica, municipio San José de las Lajas, La Habana. La misma recibe los vertimientos de los residuales de la producción de la Empresa Cerámica Blanca “Adalberto Vidal” caracterizada por la presencia de metales tóxicos debido a que en ella, son vertidos diariamente, desechos de la producción que provocan contaminación (FITOPLANT, 2007).

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Se tomó como referencia la selección del área de estudio establecida por el grupo interdisciplinario de investigación FITOPLANT de la Facultad de Agronomía, de la Universidad Agraria de la Habana (UNAH). Se emplearon métodos participativos para el diagnóstico del área la cual presenta una extensión aproximada de una hectárea (10000m2) con una pendiente de 1-1,5% (Guzmán 2006). El suelo es, Ferralítico lixiviado amarillento típico eútrico profundo arcilloso (Hernández, 1999).

3.2. Análisis de las Rizosferas (suelo).

Durante el muestreo de plantas (epígrafe 3.3) se tomaron muestras de rizosferas (suelo con radio 5 cm alrededor de las rizosferas incluyendo esta) en el área experimental, a dos distancias de la fuente de contaminación (50 y 200 m), utilizando como punto de referencia la carretera central. En cada una de ellas se seleccionaron dos puntos aleatorios para el muestreo (Robert y Henry, 2000) a dos profundidades (0–20 y 20–40 cm).

Las muestras fueron procesadas en el laboratorio de química de la Facultad de Agronomía (UNAH). Se secaron a temperatura ambiente durante siete días y se tamizaron empleando un tamiz de 2 mm.

De las muestras tamizadas de cada punto de muestreo, se tomaron 0,5 g y se maceraron. Posteriormente se procedió a realizar una digestión en ácido clorhídrico, ácido perclórico y ácido nítrico (3:1:1) según procedimientos descritos por Alloway (1995).

La solución mineral obtenida se utilizó para determinar la presencia de metales seudo–totales, mediante espectrometría de absorción atómica, en un equipo SP9, en la Universidad Central de las Villas.

3.2.1 Análisis estadístico del los metales pseudo-totales procedentes de las rizosferas.

En el procesamiento estadístico de 8 (Fe, Pb, Zn, Cu, Ni, Co, Mn, Cr) metales provenientes de las rizosferas de las plantas, se empleó como base de los análisis a Statgraphics Plus 5.1 (2001), en análisis Factorial con diseño 2:2 totalmente aleatorizado donde los factores fueron la profundidad y la distancia, así como su interacción y las variables respuestas los metales. Se analizó además mediante una regresión multifactorial los factores principales para Pb y Zn y se empleó un análisis de correlación entre los metales para verificar relaciones de influencia. En las determinaciones se emplearon tres réplicas y el número de muestras fue 12, y para la comparación de las medias se utilizó la prueba de Tukey al 5% de probabilidad.

3.3. Análisis del material vegetal.

A partir de un inventario de vegetación del área realizado por Quevedo (2006), se seleccionaron para su estudio las cuatro especies predominantes: Cynodon dactylon (L.) Pers., Cyperus gigantus L., Typha domiguensis (Pers.) Kunth. y Xanthosoma cubense (Rich.) Schott.

El muestreo se realizó en octubre de 2007. Se colectaron 4 muestras para cada especie, aproximadamente un kilogramo de raíz, tallo y hoja respectivamente. Las muestras fueron lavadas con abundante agua destilada y se secaron a 60 0C por 96 horas. Se tomaron 0,5 g de cada muestra, se maceraron y se digirieron en ácido clorhídrico, ácido perclórico y ácido nítrico (3:1:1) (Alloway, 1995). El contenido de metales pesados en las plantas se determinó de igual forma que para el análisis de suelo.

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3.3.1. Análisis estadístico de muestras vegetales.

Para el procesamiento estadístico de los resultados en el análisis de las muestras vegetales se empleó como base de estos análisis a Statgraphics Plus 5.1 (2001) en un diseño experimental que estimará los efectos de 2 factores categóricos. El diseño es un análisis factorial estándar y analiza todas las combinaciones de los niveles de los factores. Hay un total de 32 ejecuciones en el diseño totalmente aleatorizado, donde los factores fueron las especies y las partes de las plantas. En las determinaciones se emplearon cuatro réplicas y para la comparación de las medias se utilizó la prueba de Tukey al 5% de probabilidad.

3.4. Aislamiento de microorganismos rizosféricos.

Debido a la predominancia de C. dactylon sobre el resto de las especies vegetales estudiadas y de acuerdo con los resultados obtenidos en la determinación de metales pesados en las hojas así como su importancia económica, esta especie fue seleccionada para realizar el aislamiento de microorganismos rizosféricos.

Al realizar el lavado de las muestras de raíces de esta especie, posterior a la colecta (epígrafe 3.3) se reservó el material residual para analizar la población microbiana de la rizosfera. Las muestras se colocaron en erlenmeyers que contenían 500 mL de agua destilada y se sometieron a agitación en zaranda durante una hora y treinta minutos.

Para el aislamiento de los microorganismos rizosféricos, se utilizó el método de las diluciones cuantitativas y la siembra en placas Petri según Novo (1983) y Atlas y Bartha (2002). Los medios de cultivo empleados fueron: Saboroud Dextrosa (10 g peptona micológica; 40 g dextrosa; 15 g/l agar) Agar Almidón Amoniacal (1g K2HPO4; 0,5 g Mg SO47H2O; 2,0 g (NH4)2SO4; 0,5 g KCl; 0,01 g FeSO4; 15 g/l agar; pH 7,6-7,8) y Agar Nutriente (5,0 g peptona bacteriana; 1,0 g extracto de carne; 2,0 g extracto de levadura; 5,0 g cloruro de sodio; 15 g agar) para el aislamiento de hongos, actinomicetos y bacterias, respectivamente.

Se prepararon diluciones a concentraciones de 10-2,10-4,10-6 y se tomó 0,1 mL de cada una, para la siembra en placas Petri que contenían 20 mL de los medios de cultivo descritos anteriormente. La siembra se realizó por extensión con espátula de Diwralsky. Las placas fueron incubadas a 370C durante 120 hrs., para bacterias y de 1 semana hasta 10 días para hongos a 280C. Se aislaron los diferentes grupos microbianos según las características de la colonia.

Las colonias fueron agrupadas según su morfotipo y grupo microbiano, purificadas y replicadas. Se realizó la descripción morfológica. Para ello se emplearon las técnicas descritas en el Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología (Novo, 1983 y Atlas y Bartha, 2002). Las colonias aisladas fueron conservadas a 4 0C para su posterior uso mediante su liofilización.

3.5 Selección de morfotipos bacterianos más resistentes a niveles de concentración de metales pesados en condiciones controladas.

Los liofilizados bacterianos, fueron trasladados hasta los Laboratorios de Gramíneas de Embrapa Agrobiología, Río de Janeiro, Seropédica, Brasil. Donde se continuó estudios.Todas las colonias bacterianas fueron inoculadas en erlenmeyers de 250 mL que contenían 50 mL de caldo nutriente suplementado con metales pesados. Previamente preparado con una solución de agua destilada y bidesionizada, estéril, y de soluciones separadas de los cationes ZnCl2, PbCl2, en las concentraciones 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, respectivamente. El pH fue ajustado previamente hasta 6,5

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adicionando HCl diluído, para no interferir con las soluciones de los diferentes cationes. Estas soluciones fueron tomadas de soluciones de reserva de cada metal con una concentración de 3 mM.Los erlenmeyers con las bacterias fueron incubados durante 24 hrs a 200 rpm en zaranda a una temperatura de 30 0C. Las colonias que lograron desarrollarse en estas condiciones fueron determinadas por la turbidez, frente a un control el cual solo contenía medio de cultivo líquido sin inóculo. Luego fueron aisladas nuevamente aquellas que se desarrollaron similarmente en los tres tratamientos, y se conservaron en refrigeración en agar nutriente a 4 0C.

3.6 Selección de diazotróficos.

Con el objetivo de seleccionar de los morfotipos resistentes a metales pesados, aquellos que pudieran vincularse a C. dactylon en un sistema planta-microorganismo. Se determinó para primeros ensayos, la búsqueda de bacterias diazotróficas (Baldani et al., 1999 y Baldani, 2008).Las bacterias aisladas fueron inoculadas en recipientes de vidrio que contenían 5ml de los medios semisólidos:-JMV (5g Manitol, 6ml sol. 10% (K2HPO4),18ml sol. 10% (KH2PO4), 2ml sol. 10% (MgSO4.7H2O),1ml sol. 10% (NaCl), 2ml sol. 1% (CaCl2. 2H2O), 2ml Azul de bromotimol sol. 0,5% (0,2N de KOH), 4ml sol. 1,64% FeEDTA, 2ml Sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 100 mg Extrato de levedura), adicionar 1,6 g de agar por litro y ajustar el pH 5,0 a 5,4 (Baldani et al., 2000).-LGI (sacarosa, 5ml sol. 10% K2HPO4, 2ml Sol. 10% KH2PO4, 6ml sol. 10% MgSO4.7H2O, 2ml sol. 1% CaCl2.2H2O, 2ml sol. 10%; Na2Mo4.2H2O, 0,002 mL solução de azul de bromotimol (0,5% 0,2 KOH), 5; solución de FeEDTA (solución 1,64%), 4; solución de vitaminas 1ml; pH 6 (Döbereiner et al., 1995 citado por Baldani, 1996).-LGI-P 100g azúcar cristal, 2ml sol. 10% K2HPO4, 6ml sol. 10% KH2PO4, 2ml sol. 10% MgSO4.7H2O, 2ml sol. 1% CaCl2.2H2O, 1ml sol. 1% FeCl3.6H2O, 2ml sol. 0,1 % Na2MoO4. 2H2O, 5ml Azul de bromotimol sol. 0,5% (0,2 N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, ajustar el pH a 5,5 com ácido acético sol. 10 % (Baldani, 1996).-JNF-b 5 g Ácido Málico, 6 ml sol.10%K2HPO4, 18 ml sol.10% KH2PO4, 2 ml sol.10% MgSO4.7H2O, 1ml sol.10% NaCl, 2ml sol.1% CaCl2.2H2O, 4ml (sol.1 1, 64%) FeEDTA, 2ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 2ml de sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 4,5g KOH, adicionar 2,5 g de Agar y ajustar el pH a 5,8 (Baldani, 1996).-NFB 5 g Ácido málico, 5 ml sol. 10% (K2HPO4), 2 ml sol. 10% (MgSO4.7H2O), 1 ml sol. 10% (NaCl), 2 ml sol. 1% (CaCl2.2H2O), 4 ml sol. 1,64% FeEDTA, 2 ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 2 ml Sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 1 ml Sol. de vitaminas para medios de cultivos, 4,5 g KOH, adicionar 2,5 g de agar y ajustar el pH 6,5 (Baldani,1996).

- medio mínimo como control (Baldani, 1996).1 ml sol.10%K2HPO4, 4 ml sol.10% KH2PO4, 2 ml sol.10% MgSO4.7H2O, 1ml sol.10% NaCl, 0,1 ml (sol.1 1, 64%) FeEDTA, 0,286g NH4NO3, 5ml Azul de bromotimol 0,5% (0,2N de KOH), 1ml de sol. de vitaminas para medios de cultivos, 2ml de sol. de micronutrientes para medios de cultivos, 4,5g KOH, adicionar 2,5 g de Agar y ajustar el pH a 6,7

Los cultivos fueron incubados a una temperatura de 35 0C, durante 7 días, conforme lo descrito por Döbereiner (1980) y Baldani (1996) luego se seleccionaron los recipientes donde se observó el

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desarrollo de una película por debajo de la superficie, la misma, indicadora de características diazotróficas. Los microorganismos fueron aislados nuevamente y sembrados en placas Petri que contenían los mismos medios descritos pero sólidos. Se comprobó el desarrollo de colonias idénticas a los aislamientos iniciales a través de la descripción morfológica y empleando tinción de Gram.

IV. Resultados y Discusión.

4.1- Contenido pseudo-total de metales pesados en las rizosferas de las plantas.

En la Figura 1 se muestran los valores pseudo-totales de los metales determinados en las rizosferas de las plantas muestreadas tanto en profundidad como en distancia.

Figura 1. Niveles pseudo-totales de metales pesados en las rizosferas de las plantas muestreadas. En la figura Datos transformados Log10, a y b Letras desiguales difieren significativamente según Tukey para valores con un 95% de confianza. (NS) sin diferencias significativas. (**) Escala real de valores de concentración (Fe, Pb, Zn) independientes, (Co, Cr, Mn) y (Cu y Ni) comparten las mismas escalas y se corresponden con los valores de (MG), media geométrica de la concentración a 50 y 200 metros de la fuente de contaminación. CV% coeficiente de variación, Sx error estándar de la media, muestra diferencias significativas según las letras en figura, en al menos uno de los factores analizados.

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Como se observa, los niveles de concentración de los metales es muy variable, esto se encuentra relacionado con el origen de cada metal en el lugar analizado, ya sea por las características naturales del suelo o por la influencia antrópica (Kabata-Pendias y Pendias, 2001).Los metales pesados analizados en las rizosferas en el área de estudio presentaron diferentes concentraciones medias y mostraron el siguiente orden Pb>Zn>Fe>Co>Cr>Mn>Ni>Cu. La concentración de Pb (104288.33) se encontró 16 veces mayor que el Zn (9536.68), y este está 3.15 veces más concentrado que el Fe (2156.75). Los niveles de Co, Cr, Mn (128.33, 112.67, 106.34) respectivamente, duplican a los contenidos de Cu y Ni (67.83 y 54.75), estos últimos los de menor concentración; todos los valores medios están expresados en mgKg-1 de MS de suelo.

De los tres elementos mayoritarios (Pb, Fe, Zn) al Pb no se le conoce alguna función específica en el metabolismo, por tanto su presencia en valores muy pequeños por encima de los niveles permisibles provoca un efecto tóxico en el ecosistema (Ross, 1995). Por otra parte el Fe y el Zn son micronutrientes y su toxicidad está dada cuando estos son acumulados por encima de los niveles en que normalmente se acumulan en las plantas (Alloway, 1995).

Teniendo en cuenta los diferentes criterios a nivel mundial (Anexo1) de acuerdo a los niveles de concentración de los elementos traza analizados, los valores medios de Pb y Zn se encontraron muy elevados en ambas distancias estudiadas, pues estos son mayores en varios ordenes según los valores obtenidos por Soares (2004), Souza (2006) y Peris (2006) para suelos agrícolas, residencial, industrial y con influencia de lodos, los cuales pueden ocasionar efectos fitotóxicos a las plantas, además de causar graves daños al ecosistema en general.

Para el caso del Fe, las concentraciones se encontraron en valores normales debido a que es uno de los elementos que presenta mayor concentración en el horizonte A de los suelos Ferralíticos, con valores que pueden variar de 2800 a 3000 mgKg-1 MS de suelo (Hernández et al., 2004).

De manera general, las concentraciones de los elementos Mn, Cu, Cr, y Ni se encontraron en valores normales según los valores permisibles propuestos por la literatura (Anexo1).

Para el Mn, la concentración de 106.34 mgkg-1 MS de suelo puede considerarse como normal teniendo en cuenta que la presencia de éste elemento según un estimado realizado por Kabata-Pendias y Pendias (2001) para una amplia variedad de suelos se encuentra en el rango de 20 a 3000 mg·kg-1.

Los contenidos de Cu, Cr (Figura1) se encontraron en niveles de concentración normales para valores de suelos Agrícolas, residenciales, industrial, y con influencia de lodos, teniendo en cuenta los criterios de niveles aceptables de Soares (2004), Souza (2006) y Peris (2006) (Anexo1). Es de destacar en el caso particular del Ni que estos valores medios se consideran algo elevados para los suelos agrícolas de acuerdo con Soares (2004), mientras que para suelos residenciales, industriales, otros suelos y con influencia de lodos residuales según Souza (2006) y Peris (2006) el mismo valor es considerado como normal.

En el caso del Co (128.33 mgkg-1 MS de suelo), la concentración media de este elemento se determinó fuera del rango aceptable (Anexo1). El mismo es un micronutriente que generalmente se encuentra deficiente en los suelos, según Vázquez et al. (2002) los niveles varían en función del material originario; algunos resultados han indicado que generalmente tiene origen litogénico, y por tanto, pudiera encontrarse como metal acompañante unido con los óxidos de Fe dada su afinidad con el mismo, además, se parece a él en muchas propiedades. De color gris o blanco rojizo, y algunos de sus derivados de color azul (azul cobalto) se usan como colorantes en la fabricación de vidrios, esmaltes y

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pinturas (Adriano, 2001). Pudiera ser que sea usado como parte de los pigmentos empleados en el revestimiento de pisos en la planta No2, lo cual habría que estudiar con mayor profundidad.

Teniendo en cuenta que el área en estudio se encuentra afectada por los residuos de la Empresa Cerámica Alberto Vidal, y de acuerdo a los resultados obtenidos, se hace necesario establecer valores de referencia para los suelos del municipio y la provincia (los mismos no existen actualmente en el país) de manera tal que se pueda conocer el posible origen de cada metal, para delimitar si este proviene de la actividad antrópica o forma parte de la composición minerológica de los suelos.

Como los elementos Pb y Zn fueron detectados como los principales metales contaminantes en esta área, se realizó un análisis más detallado de cada uno en función de la distancia y la profundidad.

Según el análisis estadístico (Figura 2) de factores principales, tanto en distancia como en profundidad, existen diferencias significativas en la variación de la concentración del Pb en el área estudiada. Los mayores valores de concentración altamente significativos (P=0.0000) se encontraron a los 50 metros de la fuente de contaminación, por tanto, a medida que nos alejamos de dicha fuente hasta llegar a los 200 metros de distancia, los niveles de Pb seudo-totales disminuyen.

Smith (1996) y Mahvi et al. (2005) estudiaron la variación en la concentración de diferentes elementos pesados a diferentes distancias de una fuente contaminante, y determinaron que para el Pb estos niveles de concentración disminuían a medida que se alejaban de la fuente. Comportamiento similar a lo observado en este estudio, que tiene explicación debido a la baja movilidad que presenta este elemento en el suelo.

Figura 2. Efectos principales de la distancia y la profundidad sobre la concentración de Pb para valores de concentración con un nivel de confianza de 95% y R2=0.9705

Con respecto a la profundidad los mayores valores significativos (P=0.0187) se encontraron de 20 a 40 cm, valor que corresponde a una distancia de 50 m de la fuente (Figura1). En sentido general, los niveles de concentración de Pb son elevados, siendo mayores de 20 a 40 cm, en ambas distancias analizadas.

Estos resultados no se corresponden con los obtenidos por Alloway (1995) y Becerril et al. (2002) quienes comprobaron que en áreas contaminadas el Pb se encuentra generalmente más concentrado en la superficie, debido a que es un elemento de baja movilidad, sin embargo:

Con relación a la profundidad y a la génesis del suelo estudiado, según Martín (2002) este es un suelo Ferralítico amarillento lixiviado eútrico profundo arcilloso, el cual posee un horizonte AP (profundidad de 0 a 20 cm, su color en seco es 5YR 4/6 rojo amarillento) y otro A (profundidad de 20 a 60 cm, su color

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en seco es 2.5YR 3/6 rojo oscuro), presenta una textura arcillosa, estructura granular y se observan raíces. Por tanto, de acuerdo con este criterio la profundidad de 20-40 cm puede considerarse también como superficial.

Como ya se ha dicho, debido a las características químicas del plomo, este se encuentra concentrado en las capas superficiales (Alloway, 1995; Kabata-Pendias y Pendias, 2001; Peris 2006). Esto es muy favorable porque si las raíces de las plantas alcanzan la profundidad de 20 a 60 cm, sería posible a través de un sistema de fitorremediación la extracción de los metales disponibles que se encuentran a esta profundidad.

También se encontraron diferencias significativas en la interacción entre ambos factores (P=0.0484). Es por ello que debemos tener en cuenta además, fenómenos particulares que influyen en la distribución de los coloides del suelo, como es el fuerte carsismo presente en la zona y el efecto de la pendiente (Figura 5). Los análisis de estos efectos se encuentran al final de este capítulo, el mismo pudiera influir para todos los metales.

Para el caso del Zn, a continuación se muestra en la Figura 3 el análisis de factores principales. Los valores de concentración altamente significativos (P=0.0000) fueron encontrados a los 200 metros de la fuente, por tanto, proporcionalmente las mayores concentraciones se encuentran lejos de la fuente de contaminación, aunque los niveles de Zn se mantienen elevados en ambos lugares.

El Zn a diferencia del Pb, frente a cambios del pH en los suelos presenta una mayor movilidad; sobre éste pueden ejercer influencias positivas la actividad de los microorganismos de las rizosferas, así como los ácidos húmicos, fúlvicos, ácido cítrico, málico, y exudados del metabolismo celular de las plantas. Es sensible a la acción de las aguas, aumentando su lixiviación y es retenido superficialmente por la materia orgánica dada su afinidad para formar quelatos con esta (Ross, 1995).

Figura 3. Efectos principales de la distancia y la profundidad sobre la concentración de Zn para valores de concentración con un nivel de confianza de 95% y R2=0.9793

Según estudios de cálculo de disponibilidad de Zn en función del pH en suelos contaminados, realizados por Alloway (1990) citado por Kabata-Pendias y Pendias (2001), se observó que en pH<8 el cinc se encontraba predominando en forma de Zn2+, y que en esta forma era absorbido por las plantas, sin embargo, los niveles disponibles del metal con incrementos del pH en niveles próximos a la neutralidad disminuían hasta 0.07mgL-1.

Con relación a este criterio, se deberá esperar que la disponibilidad de Zn en el área cercana a las rizosferas se encuentre baja, dependiendo del pH. Según los estudios de Guzmán (2006) el pH se mantiene con valores de 7.3 a 7.7 a lo largo del perfil. Con esto se verían afectados los niveles de remoción del metal en un sistema de fitorremediación. Sin embargo, este sistema se pudiera potenciar

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empleando microorganismos en un sistema suelo-planta-microorganismo, que contribuyan con la disponibilidad del metal en la rizosfera.

Harrison y Chiargawi (1989) comprobaron que el Zn se acumulaba lejos de las fuentes de contaminación al analizar los contenidos de metales en las hojas de las plantas a medida que se alejaban de la fuente contaminante. Igualmente a lo observado en este estudio, el Zn se ha concentrado lejos de la fuente de contaminación, lo cual representa un gran peligro, porque no se sabe hasta donde pudieran llegar los efectos acumulativos del metal en los suelos, y a diferencia del plomo, un mayor número de áreas podrían estar afectadas por la acumulación de Cinc. Por tanto, se hace necesario aumentar los análisis en las áreas más alejadas de la fuente de contaminación aguas abajo.

Los niveles de Pb y Zn presentes en el suelo estudiado representan un grave peligro para el agroecosistema analizado, pues pueden afectar los procesos de mineralización en el suelo, la microbiota características y las plantas (Ross, 1995). Por lo que, toda planta y microorganismo encontrado en esta área, pudiera estar sometido a una situación estresante, y su persistencia según Van Hoewyk et al. (2005) presupone cierta tolerancia a los niveles de concentración del metal.

En el Anexo 3 se presentan los coeficientes de correlación entre las concentraciones de los metales pseudo-totales, obtenidos mediante los Rangos de Sperman.

Estas correlaciones son positivas y negativas y entre todas existen diferencias significativas con coeficientes de correlación entre 0.550 y 0.960, lo cual indica la fuerza de las correlaciones, por tanto, la estrecha relación existente entre los agrupamientos formados según este análisis (Marín et al., 2000). Estas correlaciones pudieran estar relacionadas debido a que los metales tengan un mismo origen litogénico o al aporte antropogénico como resultado del proceso de producción de la empresa. Lo cual pudiera justificar el agrupamiento existente entre Mn con Cu, Ni y Cr contra el alejamiento de Zn, Pb, Fe y Co (Figura 4).

Chen (2000) y Marín et al. (2000) en similares modelos de análisis definieron las relaciones entre cada metal, estableciendo en función de los valores de concentraciones cuáles tenían origen antropogénico.

Figura 4. Representación de las interacciones entre los metales pesudo-totales del análisis de correlación de componentes principales.

En la Figura anterior se muestran las relaciones entre cada metal, Co-Fe (0.5149) puede ser explicado debido a que el Co es siderófilo (Kauffman, 1997). Los siderófilos son aquellos metales que tienen afinidad por Ni-Fe, igualmente se pudo comprobar las relaciones entre Ni-Mn (0.9085), esta relación

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superior a 0.800 es muy fuerte, seguramente debido al comportamiento geoquímico que indica, que el Ni pudiera estar fuertemente absorbido por óxidos de Mn (Madrid et al., 2004), igualmente se correlacionaron positivamente Cr-Mn, Zn-Mn, Ni-Cu para los cuales se sigue el mismo principio.

La relación entre Cu-Zn, fue descrita por Ma et al. (1997) sugiriendo que la misma se producía debido a que ambos presentan radios iónicos similares, pudiendo estar absorbidos por las arcillas y algunos óxidos, en este caso con los de manganeso, según se observa en la figura de este análisis, mientras que el Pb, presentó solo dos correlaciones positivas Pb-Co y Pb-Fe, ambas pudieran explicarse debido a que tengan un mismo origen antrópico contenido en los óxidos que conforman los pigmentos que utiliza la cerámica o bien porque están formando parte de las arcillas y estructuras en los óxidos de Fe (Navas y Machín 2002) o ambas (Peris, 2006).

La relación entre Pb-Zn sin embargo fue negativa, lo que podría estar relacionado con los carbonatos presentes en el suelo, que son elevados (Anexo 4) (Marín et al., 2000) o que en los suelos contaminados donde predominan ambos metales la relación generalmente que se establece entre ellos es la siguiente Pb/Zn (Ross, 1995).

De acuerdo con este análisis de correlaciones se pudo comprobar además que efectivamente son el Zn y el Pb los elementos mayoritariamente de origen antrópico y no se descarta la posibilidad de que otros elementos tengan similar origen, por ejemplo el Co.

Peris (2006) en la región de L’Alcora, Castellón en Valencia, España, en similar estudio de metales pseudo-totales determinó la presencia de elevadas concentraciones de Pb y Zn en parcelas de hortalizas. La contaminación de dicha área con estos metales ya había sido estudiada por Roig et al. (1997) el cual identificó como fuente contaminante de ese municipio a una industria de azulejos, o lo que es lo mismo de cerámica blanca, la cual debido al empleo de pinturas, arcillas básicas y al proceso de fabricación incorpora al suelo a través de los residuos vertidos grandes volúmenes de lodos cargados de estos elementos trazas.

Resultados similares describió Quevedo (2006) al caracterizar el proceso productivo de la Empresa Cerámica Blanca de San José de las Lajas, explicando que en las arcillas que llegan a la fábrica de acuerdo su origen pedogenético, transportan gran cantidad de metales pesados que son concentrados como resultado del mismo proceso productivo.

Una vez que las arcillas se encuentran transformadas en lodos, las mismas son dirigidas a través del sistema de trampas al área de vertimientos (50m de la fuente) y además en esta área las arcillas y sedimentos no llegan solamente con los vertidos líquidos a través del sistema de trampas, sino que cada cierto tiempo estos sedimentos son extraídos de las trampas cercanas encargadas de retener dicho material y son depositados fuera de estas sobre el suelo (labores de limpieza de las trampas), por lo que la superficie pasa a ser sepultada por una capa nueva, pudiendo haber diferencias en la concentración de los metales entre las capas.

Como se observa en la Figura 5, la superficie del suelo a 200 metros de la fuente contaminante recibe deposiciones desde lugares más elevados (50 m) donde hay recubrimientos de la superficie por materiales que puedan traer una concentración mineral diferente cambiante en el tiempo, lo cual depende del lugar de origen de la materia prima.

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Figura 5. Esquema de los procesos erosivos en el área de estudios donde se observa el fuerte carsismo, y los procesos de arrastre superficial del material contaminante desde los 50 metros de la fuente de contaminación hasta los 200 metros, así como la infiltración del agua cargada de elementos contaminantes a través de un ponor alcanzando al manto freático que se encuentra muy próximo de la superficie. Esquema modificado del original, tomado de Febles (2006).

El área se encuentra además, bajo la influencia de una pendiente de aproximadamente 1.5% Guzmán (2006), la cual está ubicada en una posición intermedia dentro del meso relieve teniendo la influencia aluvial de los suelos Pardos Sialíticos ubicados en una posición más alta, esta es una fuente proveedora de carbonatos, razón por la cual se encuentran tan elevados en el área (Anexo 4), los mismos según el análisis de correlaciones entre los metales pudieran estar influyendo en la inmovilización de los elementos Pb y Zn, con lo cual se justificarían las correlaciones negativas entre ambos metales y la relación Pb/Zn.

Esta influencia se hace más significativa según Martín (2001 y 2002) durante los eventos ciclónicos ya que los volúmenes de agua bajan de las áreas superiores arrastrando altos contenidos de coloides y de sales solubles. Se observa además que en esta área se produce un movimiento superficial e intrasuelo de las aguas cargadas de elementos tóxicos, ya que en esta zona se desarrolla un proceso de carsismo muy fuerte donde existen muchas dolinas y ponores que evacuan el agua directamente al manto freático (Martín, 2000), en función de los cambios en el pH del suelo se puede movilizar el Zn y otros elementos de comportamiento similar, mientras que el Pb pudiera ser arrastrado con los coloides del suelo, por lo que se puede acumular lejos de la fuente de contaminación, como fue detectado en este estudio.

Como resultado de la actividad productiva son generados grandes volúmenes de lodos arcillosos y aguas saturadas de elementos pesados, que fueron determinados y analizados estadísticamente en este estudio, todos vertidos en el área analizada. Estos se depositan en las áreas más cercanas a la fuente de contaminación (valores correspondientes a 50 m) y son arrastrados luego por las aguas durante el período lluvioso a favor de la pendiente, contaminando otros suelos (valores correspondientes a 200 metros de la empresa), la contaminación además puede estar pasando al manto freático debido a los procesos erosivos cársicos existentes, como se hizo referencia.

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4.2 Acumulación de metales pesados totales en las cuatro especies de plantas seleccionadas.

Las plantas han desarrollado mecanismos altamente específicos para absorber, traslocar y acumular nutrientes, sin embargo algunos metales y metaloides no esenciales son absorbidos, traslocados y acumulados en ellas debido a que presentan un comportamiento electroquímico similar a los elementos nutritivos requeridos (Lasat, 2000).

En la Tabla 1 se observan los niveles de concentración de metales totales en las cuatro especies. Los mismos según los valores permisibles mostrados en la propia tabla, con excepción de Mn, se encuentran por encima de los valores establecidos como normales para las plantas, y tolerantes para los cultivos agrícolas de hojas, y pudieran considerarse valores excesivos o tóxicos con excepción de Cu en C. dactylon, y de Mn en todas las especies (Kabata-Pendias y Pendias, 2001).

Tabla 1. Concentración total de metales pesados acumulados por las especies vegetales en sus tejidos. (mg Kg-1. de MS)

*1 Modificado de Kabata-Pendias y Pendias (2001). (S) Niveles de concentración suficientes o normales en plantas, (T) Niveles tolerables en cultivos agrícolas (E)

Concentraciones excesivas o tóxicas.

Los metales (Ni, Cu, Co, Mn, Zn) son micronutrientes esenciales para los seres vivos y se encuentran acumulados en las plantas en dependencia de los requerimientos de cada especie en concentraciones muy pequeñas (Ross, 1995). Sin embargo en este estudio se observó una tendencia a acumular estos elementos en concentraciones superiores a los niveles propuestos por Kabata-Pendias y Pendias (2001); inclusive el Pb que no está considerado como nutriente resultó ser el elemento de mayor valor de acumulación en C. dactylon (50939 mg.Kg-1 MS), y también se determinaron acumulados elevados en C. gigantus (15 499 mg.Kg-1) y T. domiguensis (11 016 mg.Kg-1) las cuales mostraron diferencias significativas en la acumulación para este elemento.

Los valores totales de Pb obtenidos en las plantas se corresponden con los resultados de las determinaciones de metales pseudo-totales presente en las rizosferas donde se identificó al mismo metal como el de mayor concentración.Pérez et al. (2002) plantea que algunas plantas pueden volverse tolerantes al Pb frente a elevadas concentraciones del metal en los suelos, especialmente gramíneas de pastizales, lo cual les permite colonizar toda un área contaminada, y germinar sus semillas concluyendo que en algunos casos se ha mostrado hiperacumulación. De acuerdo con este planteamiento se justifican entonces los niveles elevados de acumulación para las plantas analizadas destacándose la gramínea C. dactylon.

Para el caso del Zn, igualmente la especie C. dactylon mostró los mayores niveles de acumulación (1090 mg.Kg-1MS), seguido de T. dominguensis existiendo entre ellas diferencias significativas en los valores acumulados.

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Como el Zn es un microelemento que generalmente existe en bajas concentraciones en los suelos, numerosas plantas muestran especial sensibilidad a las deficiencias de Zn, con el que establecen cierta relación de dependencia, si se tienen en cuenta los niveles acumulados por las cuatro especies, pudiera esto estar asociado a los mecanismos de acumulación y tolerancia observados (Pérez et al., 2002) con gran significación en C. dactylon y T. dominguensis, donde el elemento no se encuentra deficiente ni en las partes de la planta (aérea y raíz) ni en los suelos. Una vez más, se puede comprobar el origen antrópico de este elemento.

Hittiarachchi y Pierzyndki, (2002), plantean que los suelos contaminados con Pb se encuentran comúnmente asociados con Zn, comportamiento similar observado en nuestros resultados, porque son estos dos metales los que se encontraron en concentraciones más elevadas en las rizosferas de estas plantas y en sus hojas y raíces.

A pesar que las mismas acumulan elevadas concentraciones de metales pesados, se observó que no mostraban en el momento de la colecta signos de toxicidad. Resultados similares observó Quevedo (2006) en la misma área durante un estudio de muestreo realizado en cuatro etapas, en igual año, donde estas especies resultaron las más predominantes, por lo que pudieran existir mecanismos bioquímicos fisiológicos que les permiten la supervivencia en estas condiciones, existiendo cierta afinidad por la acumulación de un metal en mayor cuantía sobre otro (Ross, 1995; Kabata-Pendias y Pendias, 2001) acorde con los resultados obtenidos.

Debido a que la contaminación en el área de estudio es principalmente por acumulación de Pb y Zn, la especie que mayores niveles totales acumuló de ambos metales resultó ser C. dactylon, seguido de T. dominguensis la cual además se destacó por presentar los mayores niveles totales de acumulación de Fe, Cu, Co y Mn. Estos datos no son suficientes para señalar que las especies son hiperacumuladoras, pero muestran características acumuladoras y tolerantes a los niveles de metales del suelo.

En la Tabla 2, se muestra el coeficiente de transferencia de cada planta para cada metal analizado. Esta relación (PA/PR) nos indica de manera general hacia donde existe una tendencia de las plantas a movilizar los iones metálicos. En este estudio, los metales tienden a ser traslocados mayoritariamente desde las raíces hacia las partes áreas, dando como resultado un coeficiente mayor que uno. Aunque en menor proporción y de manera particular algún que otro metal en cada especie es acumulado en mayor proporción en las raíces, en este caso el coeficiente es menor que uno, por lo que la planta pudiera establecer alguna barrera para que estos metales no sean movilizados hacia las zonas aéreas.

Tabla 2. Coeficiente de transferencia de cada planta.

Plantas Fe Cu Ni Pb Co Zn Mn

mgKg-1 MS

C. gigantus 5.3 1.7 1.4 0.05 0.6 0.5 1.0

C. dactylon 0.3 3.2 1.3 21.1 1.9 3.1 3.7

T. dominguensis 0.6 1.4 1.0 0.1 2.3 1.2 2.7

X. cubense 0.3 11.0 1.9 0.8 1.6 1.1 1.0

ND. No detectado.

Como muestra la tabla, para el Fe excepto en C. gigantus, la tendencia de las plantas es a acumular este metal en las raíces (coeficientes menores que 1), lo mismo ocurre para Pb, Co, Zn en la misma

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especie, esto pudiera deberse a que existan mecanismos que controlen la traslocación de estos metales hacia las hojas, como ha sido señalado por Becker (2000) el cual plantea que una especie al limitar la entrada en las hojas de algunos metales se comporta como excluidora de estos, por tanto, C. gigantus se comporta como una planta excluidora de Pb, Co, y Zn, lo cual pudiera representar uno de los mecanismos le permitan su adaptabilidad en el área contaminada sin mostrar síntomas de toxicidad.

La especie X. cúbense presentó el mayor coeficiente para Cu, T. dominguensis lo hizo para Co, Cr y Mn, Mientras que C. dactylon se sobresale entre las especies por presentar el índice de traslocación mayor, lo cual indica que la mayor cantidad de metal está siendo movilizado para las hojas.

Para el caso de T. dominguensis, los niveles de Mn y Co acumulados en la planta superan el 0.1 % de su peso seco y los coeficientes de traslocación (PA/PR) son mayores que uno, por tanto según Yang et al. (2005) la misma se comporta como hiperacumuladora de ambos metales. Esto concuerda con los resultados obtenidos

por Quevedo (2006) para Mn en la misma área y por Horne (2000), el cual la refiere como una especie que crece sobre sustratos con elevada carga contaminante que posee características para la fitorremediación de suelos contaminados por Manganeso.

La especie C. dactylon presentó el mayor coeficiente de traslocación para Zn y Pb, este último el único mayor que uno. La misma además de poseer concentraciones de ambos metales que superan el 0.1% de su peso seco, necesita según Brooks et al. (1977) y reafirmado por Yang et al. (2005) presentar concentraciones de Pb (50939 mg.Kg-1) mayores que 10000 ppm y Zn (1696 mg.Kg-1) mayores de 1000 ppm, ambos requisitos indispensables para que una planta se comporte como hiperacumuladora, como ocurre en este caso. Por tanto, la especie C. dactylon en nuestras condiciones se comporta como hiperacumuladora de Pb y Zn.

Resultados similares para Zn fueron obtenidos por Beber (2000) e igualmente Madejón et al. (2001) la cataloga como acumuladora de este metal y la recomienda como remediadora de suelos degradados y contaminados con metales pesados.

Desde el punto de vista ecológico, estos resultados permiten tener una panorámica de las respuestas de estas especies frente a los niveles de contaminación. En términos agronómicos si efectivamente los metales son traslocados desde las raíces hasta las hojas (Tabla 2) otras especies como los cultivos de interés económico de las mismas familias pudieran tener la misma capacidad para remover estos metales del suelo, según cierto carácter interespecífico entre especies de la misma familia tal como señala (Berazaín, 1999) lo que pudiera ser el paso de entrada en la cadena trófica poniendo en riesgo la seguridad alimentaria de los pobladores en las áreas vecinas a la de estudio.

Si tenemos en cuenta que la especie C. dactylon es una planta empleada para la alimentación animal y a esto sumamos el hecho de que el Pb se trasloque a las partes áreas lo hace muy peligroso, debido a su gran toxicidad y la importancia que presenta la misma para la ganadería cubana comúnmente conocida como bermuda y hierba fina, es uno de los pastos presentes en las zonas ganaderas de todo el territorio nacional (Pérez et al., 2002).

T. dominguensis y C. dactylon en las partes áreas mostraron los mayores niveles de concentración de metales Co, Mn y Zn y Pb y Zn respectivamente, por tanto, con estas especies sería posible establecer un sistema de recuperación de suelos (Becerril et al., 2002) a través del empleo de las técnicas de Fitorremediación.

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En este caso se selecciona a C. dactylon para continuar estudios, por ser hiperacumuladora de Pb y Zn lo cual se corresponde con el objetivo planteado en este trabajo.

4.3 Microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon.

Los microorganismos aislados de un ambiente contaminado se pueden caracterizar como tolerantes a los niveles de contaminación cercanos a ellos, al igual que las plantas, el hecho de encontrarse en estos suelos donde hasta ahora se han encontrado los elevados niveles de contaminación por Pb y Zn existentes, pudiera significar que poseen mecanismos adaptativos que les permiten la supervivencia. Según Atlas y Bartha (2002) dentro de la complejidad de los ecosistemas y sus respuestas a los contaminantes, las comunidades microbianas por su diverso metabolismo son capaces de utilizar estos compuestos como fuentes de energía.

Los microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon, pertenecen a los tres grupos microbianos fundamentales del suelo, de los cuales 36 morfotipos corresponden a bacterias, cuatro a hongos y dos a actinomicetos.

Las características bacterianas predominantes fueron: colonias circulares, planas, de bordes enteros y apariencia lisa; de color amarillo, rojo, naranja y blanco, como los dos ejemplos que se muestran en la Figura 6.

Figura 6. Dos cultivos predominantes A-19 (amarilla) y A-4 (roja) de bacterias aisladas de la rizosfera de Cynodon dactylon L. Siembra en estrías por agotamiento para la obtención de colonias puras.

El hecho de encontrar 36 morfotipos bacterianos sobre los 4 de hongos, y 2 de actinomicetos podría deberse a que la población fúngica y de actinomicetos se ve más afectada por la acción tóxica de los metales Pb y Zn, los que se encontraron en concentraciones elevadas, mientras que las bacterias al aparecer se afectan menos. Según Ross (1995) las bacterias se afectan muy poco porque estas desarrollan mecanismos que le permiten la supervivencia.

Suárez y Reyes (2002) han descrito interacciones entre las bacterias y los metales pesados; este planteamiento confirma que al parecer la diversidad de morfotipos microbianos encontrados en la rizosfera de C. dactylon pudiera deberse a mecanismos de interacción y al empleo de estos metales como fuente de energía por alguno de estos microorganismos.

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Estos morfotipos aislados se describen en la Tabla 3 donde se observa que existe un predominio de bacterias con respecto a los de hongos y de actinomicetos. Como normalmente ocurre en los suelos (Gadd, 2000; Atlas y Bartha, 2002).

Tabla. 3 Descripción cultural de todos los morfotipos microbianos aislados de la rizosfera de C. dactylon.

Grupo microbiano

morfotipo Características culturales de la colonia

Bacterias

Bacterias

A1 circular plana lisa entero amarillo

A2 circular plana lisa entero crema

A3 circular convexa lisa entero amarilloA4 circular elevada lisa entero rojoA5 ameboide plana lisa ondulado amarilloA6 circular difusa lisa entero blancoA7 irregular convexa opaco ondulado crema

A8 circularconvexa baja

traslúcida ondulado crema

A9 ameboide plana liso entero cremaA10 ameboide plana muy seco rugoso blancoA11 rizoide plana opaca ondulado blanco

A12 circular plana lisa irregularnaranja fuerte

A13 circular elevada lisa entero naranjaA14 circular convexa lisa entero cremaA15 ameboide difusa lisa ondulado cremaA16 circular plana lisa irregular cremaA17 ameboide cóncava lisa entero cremaA18 circular plana seca entero cremaA19 circular plana lisa irregular amarillaA20 circular cóncava lisa entero fluorescenteA21 circular levantada lisa irregular blancoA22 rizoide plana lisa ondulado blancoA23 circular plana opaca ondulado crema

A24 circular elevadamuy húmeda

irregular fluorescente

A25 circular elevada opaca enteroamarillo-verde

A26 ameboide plana opaca ondulado crema claro

A27 circular cóncava lisa lobuladoamarillo cremoso

A28 circular plana lisa entero naranja-claroA29 rizoide plana lisa ondulado carmelita

A30 ameboide plana lisa enteroamarillo-claro

B01 rizoide plana opaca ondulado crema borde blanco

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B03 circular plana lisa entero fluorescenteB07 rizoide plana lisa ondulado blancoB11 circular cóncava lisa irregular rosadoB12 ameboide plana seca ondulado blancoB13 circular plana traslúcido ondulado crema claro

hongos

H01 micelio blanco, algodonoso, crecimiento circular abundante

H02micelio amarillo, verdoso hacia los bordes y blanco al centro, apariencia arenosa, esporulación temprana.

H03micelio arena, crecimiento radial, con formación de abundantes estrías y pliegues hacia adentro.

H04micelio blanco, crecimiento elevado que va oscureciendo hacia el centro.

actinomicetosT01

Blanco, levantado sobre el medio de cultivo, presenta una coloración amarillenta en el centro y es antagonista de hongos.

T02 Crema, seco, levantado sobre el medio de cultivo.

Los procedimientos desarrollados para la caracterización morfocultural de los microorganismos fueron similares a los descritos por Novo (1983), Athlas y Bartha (2002) y Araujo et al. (2006) quienes demostraron la importancia de este método para agrupar bacterias y otros microorganismos aislados del suelo. Los mismos permitieron conocer la diversidad existente en un ambiente contaminado con metales pesados como el de la rizosfera analizada en el presente estudio. Similares resultados describió Khan (2005) en la rizosfera de plantas que crecen igualmente en suelos contaminados con metales pesados.

4.3.1 Selección de morfotipos bacterianos más resistentes a niveles de concentración extremas en condiciones controladas.

En general, los 36 morfotipos bacterianos se desarrollaron en la concentración de 0,5 mM de PbCl2 y ZnCl2 (Tabla 4 a y b) según estaba previsto, por ser microorganismos aislados de un sitio contaminado con metales pesados que presenta niveles de concentración superiores, por tanto, algún mecanismo les permite la supervivencia, así mismo la asociación con esta especie vegetal pudiera influir también en la supervivencia de estos.

En las concentraciones 1mM y 2mM de PbCl2 se desarrollaron 14 morfotipos (38,88% del total), y para ZnCl2 16 morfotipos (44,44% del total) respectivamente, lo cual evidencia que no todas las bacterias toleran las mismas concentraciones de metales fuera de la rizosfera donde existen otras condiciones de humedad, temperatura, pH e interacciones microbianas entre otras.

Similar análisis planteó Wu et al. (2006) quien estudió la absorción de metales entre los que se encontraban Pb y Zn con diferentes bacterias en soluciones de suelo, con la influencia de la rizosfera y sin ella, encontrando diferencias en la capacidad de absorción de manera general y en la absorción de cada metal entre ambos tratamientos. Siendo mayor esta absorción en la solución preparada a partir del suelo rizosférico, donde también se observó el mayor desarrollo celular.

Tabla 4 a y b. Desarrollo microbiano a diferentes concentraciones de Pb y Zn.

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a)

b)

(+) Desarrollo celular, (-) No se observó desarrollo Finalmente los morfotipos que mostraron mayor crecimiento de células fueron: en PbCl2 (Tabla 4a) A4, A6, A9, A10, A13, A14, A16, A19, A20, A21, A24, A27, B06, B12, y en ZnCl2 (Tabla 4b) A4, A8, A9, A10, A12, A13, A14, A16, A19, A20, A24, A27, A30, B06, B12, B13.

Del total, se seleccionaron solo aquellos morfotipos que coincidieron para ambas soluciones utilizadas, estos fueron: A4, A9, A10, A13, A14, A16, A19, A20, A24, A27, B06, y B12, para un total de 12 morfotipos lo que representa 33,33% del total encontrado. Los mismos mostraron mayor tolerancia a los incrementos de las concentraciones de Pb y Zn.

Según los resultados obtenidos en los experimentos, se pudo comprobar que existen diferencias en cuanto a los mecanismos de tolerancia entre los microorganismos que lograron su desarrollo en las tres concentraciones estudiadas de Pb y Zn.

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Rasmussen y Sorensen (2001) señalan que la mejor forma de evaluar los efectos de los metales sobre la comunidad microbiana pudiera estar en los estudios de tolerancia de la misma al metal en cuestión. Mediante los resultados obtenidos se ha podido comprobar este planteamiento (Tabla 9 a y b), teniendo en cuenta que diversos grupos bacterianos aislados de ambientes contaminados con metales pesados demuestran una variedad de respuestas a los iones metálicos (Gadd, 2000) y capacidad para desarrollarse mejor en presencia de un metal u otro (Crowe et al. 2004).

De acuerdo con los objetivos planteados, un estudio de los mecanismos mediante los cuales los 12 morfotipos seleccionados, interactúan con Pb y Zn u otro metal, pudieran constituir próximos trabajos a desarrollar de manera tal que sea posible emplear un sistema de biorremediación en el área estudiada.

4.3.2 Selección de diazotróficos.

Se seleccionaron los 12 aislamientos de bacterias más tolerantes a las concentraciones de metales pesados evaluadas, de ellos solo 8 se desarrollaron en diferentes medios de cultivo específicos para microorganismos diazotróficos Baldani (2008) (Tabla 5) .

Tabla 5. Relación de morfotipos con características diazotróficas.Morfotipos Medios de cultivo

JMV LGI-P LGI

JNF-b NFb mínimo

A-4 Estreptobacilos grandes Gram (-)

- + - + - -

A-10

Bacilos cortos y gruesos Gram (+)

- + - - - -

B-12

Bacilos Gram (-) + - - + - -

A-14

Bacilos Gram (-) + - - - + -

A-16

Bacilos Gram (-) + + - - - -

A-19

Bacilos Gram (-) + - - - - -

A-24

Bacilos Gram (-) - + - - - -

A-27

Bacilos Gram (-) - + - - - -

A-13

Bacilos Gram (-) - + - - - -

A* - - - - - -

A*(A-9, A-20 y B-06) No crecieron en ninguno de los medios.

De los morfotipos evaluados, mostraron especificad A-10, A-24, A-27 y A-13 para el medio LGI-P y A-19 para JMV, mientras que A-4 creció en LGI-P y JNF-b, A-12 en JMV y JNF-b, A-14 en JMV y NFb, A-16 en JMV y LGI-P. En el medio mínimo no se observó desarrollo de ninguno de estos morfotipos, esto indica la selectividad de cada aislamiento para utilizar diferentes fuentes de carbono y para fijar el nitrógeno ausente en los medios evaluados. Los resultados sugieren que los 8 morfotipos que se desarrollaron en los diferentes medios semisólidos, poseen algún mecanismo para obtener el nitrógeno atmosférico.

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En todos los medios semisólidos donde creció alguno de los ocho morfotipos bacterianos se observó el desarrollo de una película aerotáxica blanca por debajo de la superficie, mientras que en los mismos medios sólidos crecen en la superficie, lo que sugiere que estas bacterias son microaerófilas facultativas. Además, se observó el viraje de la coloración característica del medio a azul cuando este era verde, y a verde cuando este era amarillo, esto indica un cambio de pH en el medio según el indicador contenido.

Según el criterio de Baldani (2004) el medio JNFb es semiselectivo para Herbaspirillum, NFb es semiselectivo para Azozpirillum y JMV es semiselectivo para Burkholderia, sin embargo en estos medios pueden crecer otros diazotróficos igualmente que los específicos y la misma colonia en varios de los medios, como se observó en este estudio.

Una parte pequeña de los organismos procariotas consiguen convertir o reducir el N atmosférico en amonio el cual puede ser incorporado para el crecimiento y manutención de las células (Maria et al., 2002). Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y según el planteamiento anterior, todas las características observadas en el desarrollo de los 8 morfotipos en el estudio realizado se corresponden según lo planteado por Baldani (2004) con organismos diazotróficos.

Con estos resultados no es posible la determinación exacta de los géneros y especies de microorganismos diazotróficos encontrados, aún cuando sólo hayan crecido en uno de los medios específicos.

De acuerdo a lo señalado por Magalhães y Döbereiner (1984); Baldani et al. (1999) y Melloni (2004) las bacterias del género Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raíz de una amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales como maíz, trigo, arroz, sorgo, avena pastos forrajeros como Cynodon dactylon, Poa pratensis, Festuca arundinacea, de diferentes especies de Pennisetum y Panicum (Caballero-Mellado et al. 2004). Teniendo que los aislamientos bacterianos proceden de la rizosfera de C. dactylon y considerando las características fisiológicas y morfológicas observadas es probable que alguno de los 8 morfotipos se correspondan con bacterias del género Azospirillum.

Este estudio, a pesar de no determinar los géneros aislados tiene gran importancia, porque ha permitido conocer la presencia de bacterias tolerantes a metales pesados con características diazotróficas, las cuales pudieran ser empleadas conjuntamente con las gramíneas como el C. dactylon en un sistema de biorrremediación para la recuperación de suelos contaminados con metales pesados con lo cual se cumple el último objetivo planteado para este estudio.

VI. Conclusiones.

1. De los ocho metales determinados en las rizosferas de las plantas estudiadas, se encontraron concentraciones pseudo-totales en intervalos que pueden ser considerados elementos contaminantes en los metales Pb y Zn.

2. En las especies ruderales Cynodon dactylon L. Pers., Cyperus gigantus L., Typha dominguensis (Pers). Kunth., Xanthosoma cubense (Rich.) Schott. se detectaron los ocho metales pesados evaluados, destacándose el Pb y el Zn como los de mayor concentración en hojas y raíces.

3. La especie C. dactylon (Bermuda) se definió como hiperacumuladora de Pb y Zn y T. dominguensis (Macío) como acumuladora de Mn y Co.

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4. De la rizosfera de C. dactylon se aislaron 36 morfotipos de bacterias, 4 de hongos y 2 de actinomicetos, comprobándose que existe diversidad de microorganismos tolerantes que pudieran potenciar en las plantas de esta especie sus capacidades hiperacumuladoras.

5. De los 12 morfotipos más tolerantes a diferentes niveles de concentración de Pb y Zn, ocho presentaron características diazotróficas, lo que pudiera estar relacionado con el posible sistema de interacción suelo contaminado-microorganismos tolerantes-plantas acumuladoras.

VII. Recomendaciones.

1. Continuar estudios con C. dactylon (Bermuda) y T. dominguensis (Macío) para su empleo en técnicas de fitorremediación con vistas a descontaminar el ecosistema estudiado.

2. Continuar los estudios con C. dactylon y los ocho microorganismos diazotróficos en un sistema de biorremediación (suelo-planta-microorganismos) a través de la fitoextracción, potenciado con actividad microbiana.

3. Determinar los géneros y especies de microorganismos diazotróficos encontrados.

4. Dada la significación y alcance de los resultados, propiciar la divulgación de los mismos tanto con los actores sociales relacionados al área de estudio, como con la formación agronómica del pregrado y postgrado.

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IX. Anexos

Anexo1. Criterios mundiales sobre valores aceptables y/o permisibles del contenido pseudo-total en suelos agrícolas.

Elemento Agrícola1 Residencial1 Industrial1 Otros2 CE3 Lodos3

mgKg-1 MS de sueloPb 200 350 1200 0.5-135 100-400 (500)1-(1000)2

Co 40 80 100 1.0-70 50 -Cu 100 500 700 0.3-495 100-125 (100)1-(200)2

Ni 50 700 300 0.7-269 100 (50)1-(200)2

Zn 300 200 1500 1.5-264 250-300 (300)1-(600)2

Cr 300 1000 1000 18.7-269 50-100 200-(500)2

Fuente: 1valores citados por Soares (2004) orientadores para diferentes metales pesados en ambientes distintos a ser empleados como referencia para monitorear niveles de contaminación, según el centro holandés CETESB (2001) propuestos para el estado de São Paulo, el cual posee el 33 % de los suelos de tipo Ferralítico y un clima tropical. Otros2 valores citados por Souza (2006) según diferentes criterios a nivel mundial en función de la variabilidad de los metales según su origen pedogenético. CE3 valores de referencia máximos aceptables en suelos agrícolas, considerados como fitotóxicos en el rango para toda la comunidad Europea (Peris, 2006). Los valores entre paréntesis son concentraciones obligatorias por reglamentación contenidos en Lodos con influencia en los suelos 1tolerable y obligatorio, 2 considerado tóxico.

Anexo 2 Conclusiones de los dos últimos talleres de Biorremediación realizados por el grupo FITOPLANT.

II Taller de Biorremediación III Taller de BiorremediaciónEstos talleres tuvieron como fin contribuir con la educación ambiental de los vecinos del lugar, productores y trabajadores de la Empresa Cerámica. En ellos se detectan problemas que muchas veces no son recogidas en las encuestas. Como salida se proponen soluciones y medidas que son llevadas a la Empresa y al gobierno local. El grupo de investigación da respuesta de las investigaciones que realiza y recoge las inquietudes, estas sirven como punto de partida para nuevos procesos investigativos o para darle continuidad a los que ya están trazados.

Los resultados de este trabajo investigativo, dan respuesta a alguna de las interrogantes planteadas en ambos talleres.

Conclusiones

1) El contenido total de Metales Pesados (plomo, níquel, cromo, cobre, hierro, zinc, manganeso, cobalto) en el suelo y en las especies vegetales, los cuales superan los límites permisibles, permiten caracterizar al área de estudio como contaminada.

2) El estado degradativo del área afecta sustancialmente el paisaje y limita su explotación con fines comunitarios, pues la vegetación presente (plantas medicinales y pastos naturales) afecta directamente la cadena trófica influyendo en su seguridad alimentaria.

3) Para lograr la recuperación de dicha área agrícola se impone el establecimiento de una política encaminada a:a. Favorecer la contención química.

1) Importancia de los resultados mostrados y analizados, así como su impacto comunitario, lo cual ratifica la significación del proyecto ejecutado.

2) Se alerta sobre enfermedades adquiridas por trabajadores de la Empresa Cerámica (2 se pusieron de ejemplo), que refleja el posible efecto del proceso productivo

3) Aunar aún más los esfuerzos (grupo científico-Empresa) para ampliar las soluciones al fenómeno estudiado. Necesidad de que el Consejo de Dirección de la Empresa concientice estos problemas y vaya a la búsqueda de soluciones.

4) Se resalta que un primer problema EVITABLE por parte de las Empresas es NO CONTAMINAR.

5) Necesidad de que la empresa evalúe y caracterice los residuales que se obtienen del proceso

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b. Implementar las técnicas de fitorremediación (fitoextracción) empleando: Verbesina alata L. (Asteraceae) (Botoncillo), Cynodon dactylon L. (Poaceae) (Bermuda), Typha dominguensis (Pers) Kunth (Thyphaceae) (Macío) y Lipidium virginicum L. (Cruciferaceae) (Mastuerzo).

4) Proponer un grupo de medidas para no incrementar los efectos de la contaminación:a. Mantener el suelo y/o sustrato con cobertura

vegetal de tal forma que se extraigan una parte de los metales presentes.

b. No cultivar especies vegetales con fines alimenticios en el área estudiada, contribuyendo a la no afectación de la seguridad alimentaria.

c. No emplear los residuos vegetales como

abonos orgánicos.

d. Revisar en detalle el proceso productivo de la Empresa Cerámica Blanca “Adalberto Vidal” (incluyendo trampas y canales).

5) Priorizar la Educación Ambiental, favoreciendo diferentes vías de capacitación con todos los actores sociales involucrados (Gobierno, pobladores, OACE, empresas).

6) Proponer a la Empresa se revise el proceso de producción de forma tal que se disminuya la carga contaminante, para contribuir con las producciones más limpias.

7) Proponer por parte del gobierno y la UNAH a la dirección de la agricultura del territorio alternativas de producción, comercialización y redistribución de los productos frescos.

productivo, y para ello es posible establecer cooperación con el Centro de Investigaciones del Petróleo.

6) Se impone el análisis por parte de la empresa para lograr ir gradualmente introduciendo soluciones hacia la implementación de TECNOLOGIAS MAS LIMPIAS.

7) Se impone evaluar la calidad de las aguas en el pozo de abasto de las Empresas.

8) Posibilidad de que el grupo FITOPLANT preste el servicio de diagnóstico a otras áreas del municipio (por ejemplo la EMI, que abarca áreas relacionadas con Empresas Pecuarias).

9) Insistir en la participación de otros sectores específicos e indispensables en estos análisis (por ejemplo Centro de Higiene).

10) Lograr una mayor vinculación de los consultorios médicos del Consejo Popular con los resultados surgidos de la implementación del proyecto, para lograr un diagnóstico clínico atemperado a la situación ambiental.

11) Socializar estos resultados mostrados (enfatizando en las medidas) con TODOS los actores sociales (preferiblemente por sectores). Priorizar la capacitación con lenguajes específicos para cada sector.

12) Lograr mayor energía en los decisores sociales con medidas para orientar la política emanada de la Educación Ambiental.

13) Posibilidad de que el grupo FITOPLANT emplee incineradores que existen en el municipio, para procesar los desechos de las muestras evaluadas.

14) Proponer al CITMA que siga priorizando esta temática de investigación, ampliándola en los casos requeridos a otras áreas agrícolas.

Anexo 3. Matriz de los coeficientes de correlación entre los niveles de concentración pseudo-totales de los metales pesados.

Pb Zn Fe Mn Co Cr Ni Cu

Pb

Zn -0.6993

Fe 0.5524 -0.7273

Mn -0.6902 0.6479 0.8169

Co 0.8862 -0.8881 -0.5149 -0.6385

Cr -0.8462 0.7063 -0.7762 0.9366 -0.7636

Ni -0.8112 0.7273 -0.8042 0.9085 -0.7496 0.9510

Cu -0.6643 0.6993 -0.7273 0.8733 -0.6410 0.8531 0.8322

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Índice

I. Introducción...............................................................................................................................1

II. Revisión Bibliográfica..............................................................................................................3

2.1. Contaminación por metales Pesados..................................................................................3

2.1.1. Origen de los metales pesados en los suelos..............................................................3

2.1.2. Transporte y dispersión de los contaminantes.............................................................3

2.1.3. Las arcillas y la industria cerámica como generadora de contaminación....................4

2.1.4. Efectos de la contaminación........................................................................................5

2.1.4.1. Impacto de los metales pesados en las comunidades microbianas..........................6

2.1.5. Mecanismos de Interacción Metal-Microorganismo..................................................6

2.2. Métodos Biológicos para la Remediación de suelos contaminados por metales pesados...................................................................................................................................7

2.2.1. Biodegradación mediada por microorganismos.........................................................7

2.2.2. Biorremediación.........................................................................................................8

2.2.3 Fitorremediación...........................................................................................................9

2.2.3.1. Técnicas de Fitorremediación..................................................................................9

2.2.3.2. Plantas Hiperacumuladoras...................................................................................11

2.3. Biodisponibilidad.........................................................................................................12

2.3.1. Bacterias Diazotróficas..............................................................................................12

2.4. Caracterización de las especies seleccionadas..............................................................13

2.5. El enfoque agroecológico en la investigación..............................................................14

2.5.1. Los métodos participativos en la investigación científica.........................................14

III. Materiales y Métodos............................................................................................................15

3.1. Características del área experimental...........................................................................15

3.2. Análisis de las Rizosferas (suelo).................................................................................16

3.2.1 Análisis estadístico del los metales pseudo-totales procedentes de las rizosferas......16

3.3. Análisis del material vegetal.........................................................................................16

3.3.1. Análisis estadístico de muestras vegetales................................................................17

3.4. Aislamiento de microorganismos rizosféricos..............................................................17

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3.5 Selección de morfotipos bacterianos más resistentes a niveles de concentración de metales pesados en condiciones controladas.......................................................................17

3.6 Selección de diazotróficos.............................................................................................18

IV. Resultados y Discusión.........................................................................................................19

4.1- Contenido pseudo-total de metales pesados en las rizosferas de las plantas................19

4.2 Acumulación de metales pesados totales en las cuatro especies de plantas seleccionadas.......................................................................................................................26

4.3 Microorganismos aislados de la rizosfera de C. dactylon.............................................29

4.3.1 Selección de morfotipos bacterianos más resistentes a niveles de concentración extremas en condiciones controladas...................................................................................31

4.3.2 Selección de diazotróficos..........................................................................................33

VI. Conclusiones.........................................................................................................................34

VII. Recomendaciones.................................................................................................................35

VIII. Bibliografía.........................................................................................................................36

IX. Anexos...................................................................................................................................43

A mis padres y mis abuelos, Dedico.

Agradecimientos

A mis familiares a quienes dedico este trabajo: A mi madre Josefina Elías Armas (fifi) y su esposo Tony e Hijos, a mi padre Juan R. Sánchez Durand y su esposa Barbarita e hijas, a mis abuelos todos, a Carmencito, abey y los ballate por el apoyo de siempre. Gracias por todo el amor y por los años que han dedicado en mi formación.A mi tutora Dra. María Irene Balbín Arias, y Dr. Ramiro Valdés Carmenate por la confianza ayuda e interés mostrado. A Ambar, su amistad y ayuda de tantas veces, A Dariellys (lely), Huelva, Satur, Guridi por la preocupación, los debates, las ideas, por dejarme sentir en su colectivo como el mío propio.A Evelyn, Yoannis, Sandra y Daymara por el equipo que hacemos, sin dudas muchas cosas buenas para el futuro.A la Dra María Teresa Nápoles, Guianneya, Belkis, del INCA por el apoyo y las horas de trabajo en ese laboratorio, donde comenzaron estos ensayos.A los profesores y técnicos del Instituto de Agronomía de la Rural (UFRRJ) que me recibieron y brindaron su apoyo, muy especial al profesor Dr. Nelson Moura Brasil do Amaral Sobrinho, mi orientador en brasil, y al Dr. Ricardo Luis Louro Berbara, por dejarme trabajar en su laboratorio y dejarme acompañar sus investigaciones.A la Dra. Vera Lucía Divan Baldani por recibirme bajo su orientación en los laboratorios de gramíneas de la EMBRAPA Agrobiología, RJ. A la Dra. Fabiana Soares y Flia, por su apoyo y amistad y los ratos de dedicación en la rural.

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A MSc Fabiana Dias y esposo Dr. Ednaldo por recibirme en el alojamiento de la Pos Graduación, ofrecerme su amistad y acompañarme durante toda mi estancia en la rural. Por la ayuda inmensa con el idioma portugués, también gracias.A todos los amigos del alojamiento con quienes compartí durante esos cuatros meses de trabajo en la rural.A Teresinha Pascielo, quien cuidó de mí, y que fue como una madre, por todo ese amor, gracias.A Mônica Malheiros, por su compañía, ayuda y amistad los cuales siempre voy a tener presentes. A mis perros siberianos Zimá, Gron y Tumán por ayudarme a salir del estrés.

A todos, gracias

Resumen

La zona de estudio pertenece a un ecosistema que recibe desde hace más de 50 años los desechos de la Empresa de Cerámica Blanca de San José de las Lajas, el mismo se encuentra afectado por contaminación con metales pesados. El Presente trabajo tiene como objetivo general la identificación de especies vegetales acumuladoras de metales pesados y microorganismos rizosféricos tolerantes con potencialidades para aplicar la biorremediación en dicha área. Para ello, durantes el mes de octubre de 2007, se recogieron muestras vegetales y suelo rizosférico de las especies ruderales: Cynodon dactylon L Pers., Cyperus gigantus L., Typha dominguensis (Pers.) Kunth., Xanthosoma cubense (Rich.) Schott., fue determinada la concentración de ocho metales pesados presentes en cada una de las muestras. Se obtuvo como resultado del análisis en las rizosferas, que los niveles pseudo-totales de Pb y Zn se encuentran en intervalos que pueden ser considerados elementos contaminantes. Mientras que en las muestras vegetales (hojas y raíces), consecutivamente el Pb y Zn resultaron los metales más concentrados. De acuerdo con estos niveles de concentración, C. dactylon (Bermuda grass) se definió como hiperacumuladora de Pb y Zn, y T. dominguensis (macío) como acumuladora de Mn y Co. De la rizosfera de C. dactylon, se aislaron 36 morfotipos de bacterias, 4 de hongos y 2 de actinomicetos, comprobándose que existe diversidad de microorganismos tolerantes a los niveles de concentración de los metales pesados determinados. De 12 morfotipos más tolerantes a diferentes niveles de Pb y Zn, ocho presentaron características diazotróficas, lo cual pudiera potenciar en esta planta su capacidad acumuladora.

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