Tesis Maestria_in Silico

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

MMMMecanismo de acción de la DNAecanismo de acción de la DNAecanismo de acción de la DNAecanismo de acción de la DNA----metiltransferasametiltransferasametiltransferasametiltransferasa HgiDIIHgiDIIHgiDIIHgiDII: Un : Un : Un : Un estudio estudio estudio estudio in silicoin silicoin silicoin silico

T E S I S

QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL

GRADO DE:

DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICASDOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICASDOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICASDOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS

PRESENTA

M. en C. JM. en C. JM. en C. JM. en C. Juan Arturo Castelán Vegauan Arturo Castelán Vegauan Arturo Castelán Vegauan Arturo Castelán Vega

Directores de tesis

Dra. Rosa María Ribas Jaimes

Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo

Mayo 2010

ORIGINAL PAPER

Homology modeling and molecular dynamics simulations

of HgiDII methyltransferase in complex with DNA

and S-adenosyl-methionine: Catalytic mechanism

and interactions with DNA

Juan A. Castelán-Vega & Alicia Jiménez-Alberto &

Rosa M. Ribas-Aparicio

Received: 25 September 2009 /Accepted: 23 November 2009# Springer-Verlag 2009

Abstract M.HgiDII is a methyltransferase (MTase) from

Herpetosiphon giganteus that recognizes the sequence

GTCGAC. This enzyme belongs to a group of MTases

that share a high degree of amino acid similarity, albeit

none of them has been thoroughly characterized. To study

the catalytic mechanism of M.HgiDII and its interactions

with DNA, we performed molecular dynamics simulations

with a homology model of M.HgiDII complexed with DNA

and S-adenosyl-methionine. Our results indicate that M.

HgiDII may not rely only on Glu119 to activate the

cytosine ring, which is an early step in the catalysis of

cytosine methylation; apparently, Arg160 and Arg162 may

also participate in the activation by interacting with

cytosine O2. Another residue from the catalytic site,

Val118, also played a relevant role in the catalysis of M.

HgiDII. Val118 interacted with the target cytosine and kept

water molecules from accessing the region of the catalytic

pocket where Cys79 interacts with cytosine, thus preventing

water-mediated disruption of interactions in the catalytic site.

Specific recognition of DNAwas mediated mainly by amino

acids of the target recognition domain, although some amino

acids (loop 80–88) of the catalytic domain may also

contribute to DNA recognition. These interactions involved

direct contacts between M.HgiDII and DNA, as well as

indirect contacts through water bridges. Additionally, analy-

sis of sequence alignments with closely related MTases

helped us to identify a motif in the TRD of M.HgiDII that

may be relevant to specific DNA recognition.

Keywords DNA-methyltransferase . DNA recognition .

Homology modeling .M.HgiDII . Molecular dynamics .

S-adenosyl-methionine

Introduction

DNA-methyltransferases (MTases) catalyze the transfer of

methyl groups from cofactor S-adenosyl-methionine (SAM)

to adenines or cytosines in DNA [1]. Some MTases

methylate exocyclic amino groups to form either N6-

methyl adenine or N4-methyl cytosine, whereas others

methylate the C5 carbon to form C5-methyl cytosine

(C5mC). These modifications have important functions in

the cell, ranging from DNA repair in bacteria, to genetic

regulation and embryonic development in vertebrates [2].

Most of the MTases described thus far are from bacterial

origin and associate with restriction enzymes to form

restriction-modification (RM) systems [3]. These systems

are classified in four types (I–IV) [4], of which type II are

J. A. Castelán-Vega

Center for Biologics Evaluation and Research, US FDA,

CBER/DBPAP [HFM-443],

1401 Rockville Pike,

Rockville, MD 20852, USA

A. Jiménez-Alberto :R. M. Ribas-Aparicio (*)

Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional,

Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Distrito Federal,

CP 11340 Mexico, Mexico

e-mail: [email protected]

Present Address:

J. A. Castelán-Vega

Departamento de Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional,

Prolongación de Carpio y Plan de Ayala s/n, Distrito Federal,

CP 11340 Mexico, Mexico

J Mol Model

DOI 10.1007/s00894-009-0632-9

El presente trabajo fue realizado

la Food and Drug Administra

de Biológicos de la Escuela Na

Nacional, bajo la dirección de la

Zepeda Vallejo. Forma parte d

Politécnico Nacional, México

Juan A. Castelán - Mecanismo de acció

i

realizado en el Center for Biologics Evaluation and

tration, EE.UU., y en el Laboratorio de Producción

scuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto P

cción de la Dra. Rosa María Ribas Jaimes y del Dr. Lui

parte del Proyecto SIP con clave 20091190,

México.

cción de M.HgiDII

nd Research, de

roducción y Control

nstituto Politécnico

el Dr. Luis Gerardo

, del Instituto

Juan A. Castelán - Mecanismo de acción de M.HgiDII

ii

La realización de este trabajo de investigación fue posible gracias al apoyo

de diversas instituciones.

Agradezco al CONACYT y al Programa Institucional de Formación de

Investigadores (PIFI) del IPN, por el apoyo otorgado durante mis estudios

de doctorado. Agradezco al Comité Técnico de Prestaciones a Becarios

(COTEPABE) por el apoyo brindado para realizar una estancia de

investigación en la Food and Drug Administration (FDA) y al

Departamento de Energía de los Estados Unidos, que a través del Oak

Ridge Institute of Science and Investigation (ORISE) proporcionó apoyo

logístico y económico durante la estancia en la FDA.

Agradezco a los National Institutes of Health y a la Food and Drug

Administration (USA) por la capacitación y acceso al sistema Helix y

Biowulf de los National Institutes of Health.


iii

Este trabajo está principalmente dedicado a mi familia:Este trabajo está principalmente dedicado a mi familia:Este trabajo está principalmente dedicado a mi familia:Este trabajo está principalmente dedicado a mi familia:

A mi amor de toda la vida, Alicia Jiménez AlbertoAlicia Jiménez AlbertoAlicia Jiménez AlbertoAlicia Jiménez Alberto.

Ambos sufrimos y gozamos este proceso, por lo que este logro es tuyo también.

Muchas gracias por disfrutar conmigo las bondades de la vida, y por apoyarme y

soportarme en mis momentos difíciles. Te amo como más se puede amar…

A la prueba máxima de mi fe en el futuro, Dulce Natalia Castelán JiménezDulce Natalia Castelán JiménezDulce Natalia Castelán JiménezDulce Natalia Castelán Jiménez.

Tú fuiste la motivación que me permitió finalizar este proyecto. Gracias por

sacarme de vez en cuando de mis pensamientos para integrarme a tu mundo. Te

amo hasta el infinito…


iv

A la Dra. Rosa María Ribas JaimesDra. Rosa María Ribas JaimesDra. Rosa María Ribas JaimesDra. Rosa María Ribas Jaimes

No hay palabras suficientes que expresen el infinito agradecimiento que tengo

hacia usted. Agradezco a la vida por haberla puesto en mi camino, pues gracias a

usted he llegado hasta donde estoy. ¡Gracias por su confianza y dedicación!

A Juan Luis ArciniegaJuan Luis ArciniegaJuan Luis ArciniegaJuan Luis Arciniega

Gracias amigo y mentor por expandir mi visión de la vida y la ciencia. Nunca

antes había aprendido tanto en tan poco tiempo. Gracias por brindarme tu

confianza y apoyarme cuando más lo necesité.

Al Dr. Luis Gerardo Zepeda VallejoDr. Luis Gerardo Zepeda VallejoDr. Luis Gerardo Zepeda VallejoDr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo

Le agradezco infinitamente por el apoyo brindado para concluir con esta fase de

mi vida. Sus valiosos conocimientos y experiencia enriquecieron mucho este

trabajo.

A mis sinodales, Dr. Benjamín NoguedaDr. Benjamín NoguedaDr. Benjamín NoguedaDr. Benjamín Nogueda, Dr. Eleuterio BurgueñoDr. Eleuterio BurgueñoDr. Eleuterio BurgueñoDr. Eleuterio Burgueño, Dra. María Dra. María Dra. María Dra. María

ElenaElenaElenaElena VargasVargasVargasVargas y Dr. José Dr. José Dr. José Dr. José Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe TrujilloTrujilloTrujilloTrujillo. Gracias por el esfuerzo vertido en la

revisión de este trabajo y por sus excelentes consejos.


v

A mi madre, GuillermiGuillermiGuillermiGuillermina Vegana Vegana Vegana Vega....

Gracias por darme la vida y por los enormes sacrificios que hiciste para

proveernos siempre lo mejor. Eres el ejemplo máximo de superación.

A mi padre, Lucio CastelánLucio CastelánLucio CastelánLucio Castelán

Gracias papá por brindarme la vida y darme todo tu cariño. Tu nobleza es el

ejemplo que quiero seguir.

A mis hermanos, ReynaReynaReynaReyna, RosaRosaRosaRosa, DulceDulceDulceDulce y LucioLucioLucioLucio

No pude tener mejor compañía desde la niñez que la de ustedes. Gracias

hermanos por todos los momentos buenos (y uno que otro no tan bueno) que

hemos compartido a lo largo de nuestra vida.


vi

A mis entrañables amigos y compadres, NelsonNelsonNelsonNelson y OlgaOlgaOlgaOlga. NelsonNelsonNelsonNelson, amigo de tantos

años que te considero mi hermano, ¡gracias por brindarme tu amistad!

A Paty CauichPaty CauichPaty CauichPaty Cauich, amiga y compañera. Gracias por el apoyo y el ánimo que me has

brindado siempre.

A mis maestros de siempre, mis amigos: AliciaAliciaAliciaAlicia, LupitaLupitaLupitaLupita, AuroraAuroraAuroraAurora, Víctor Víctor Víctor Víctor y al Dr. Dr. Dr. Dr.

MarioMarioMarioMario. Les agradezco infinitamente por sus enseñanzas y por permitirme formar

parte de la mejor academia de la ENCB. Dr. Mario, gracias por brindarme la

oportunidad de expandir mis horizontes. Su apoyo fue determinante para

terminar este proyecto.

A las nuevas generaciones del lab: VanessaVanessaVanessaVanessa, LauraLauraLauraLaura, FranciscoFranciscoFranciscoFrancisco, ElianElianElianElian, JJJJeeeennnnnnnnyyyy,

GloriaGloriaGloriaGloria, JaneJaneJaneJane, JhoannaJhoannaJhoannaJhoanna, AlejandraAlejandraAlejandraAlejandra, EsmeraldaEsmeraldaEsmeraldaEsmeralda, Juan CarlosJuan CarlosJuan CarlosJuan Carlos. Muchas gracias por

la chispa de alegría e inocencia que imparten al lab. Sigan por la buena senda.

¡Les deseo éxito en todos sus experimentos!


vii

ÍNDICE

I. ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................ ix

II. ÍNDICE DE TABLAS ......................................................................................................................... x

RESUMEN .................................................................................................................................................. 1

ABSTRACT ................................................................................................................................................ 3

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................... 5

1.1. Sistemas R-M .................................................................................................................................... 7

1.1.2. Nomenclatura de los sistemas R-M ..................................................................................... 8

1.1.3. Clasificación de los sistemas R-M ......................................................................................... 9

1.2. Aspectos estructurales de las DNA-MTasas ......................................................................... 9

1.3.1. Catálisis enzimática de la metilación ............................................................................... 14

1.3.2. Reconocimiento del DNA blanco ....................................................................................... 16

1.4. Metiltransferasa M.HgiDII........................................................................................................ 17

2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................... 18

3. OBJETIVOS............................................................................................................................................ 20

3.1. Objetivo General .......................................................................................................................... 21

3.2. Objetivos Particulares ............................................................................................................... 21

4. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................................................. 22

4.1. Equipo de cómputo ..................................................................................................................... 23

4.2. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA ............................................................. 23

4.3. Evaluación de la calidad del modelo .................................................................................... 25

4.4. Definición del sistema para la simulación de dinámica molecular .......................... 25

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................................... 29

5.1. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA ............................................................. 30

5.2. Evaluación de la calidad del modelo .................................................................................... 34

5.3. Descripción general de la estructura ................................................................................... 36

5.4. Interacciones dentro del sitio catalítico ............................................................................. 37

5.5. Interacciones con la secuencia blanco ................................................................................ 42

5.6. Aminoácidos conservados en el TRD de MTasas relacionadas a M.HgiDII ........... 46


viii

6. CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 48

7. GLOSARIO DE TÉRMINOS ............................................................................................................. 50

8. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 53


ix

I. ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Modificaciones llevadas a cabo por las DNA-metiltransferasas. .......................... 7

Figura 2. Estructura de algunas MTasas. ....................................................................................... 11

Figura 3. Orden lineal de los motivos conservados en las MTasas. .................................... 12

Figura 4. Rearreglos en M.HhaI en respuesta a la unión de DNA. ....................................... 13

Figura 5. Sitio catalítico de M.HhaI. ................................................................................................. 15

Figura 6. Mecanismo de transferencia del grupo metilo en M.HhaI. .................................. 16

Figura 7. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII mediante

modelamiento por homología. ............................................................................................................ 24

Figura 8. Interacciones relevantes en la simulación de dinámica molecular. ................. 26

Figura 9. Esquema que representa las condiciones de la simulación. ............................... 27

Figura 10. Espectro conformacional explorado en la simulación de dinámicas

moleculares. ............................................................................................................................................... 30

Figura 11. Validez del modelaje por homología en relación con el porcentaje de

identidad en los alineamientos. .......................................................................................................... 31

Figura 12. Alineamiento múltiple de M.HgiDII con los moldes M.HaeIII y M.HhaI…....32

Figura 13. Monitoreo de RMSD y Rg de M.HgiDII durante la simulación. ........................ 34

Figura 14. Evaluación de la calidad de la estructura de M.HgiDII. ...................................... 35

Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM. .............................................. 37

Figura 16. Interacciones en el sitio catalítico de M.HgiDII. .................................................... 39

Figura 17. Canales de agua en el sitio catalítico de M.HgiDII. ............................................... 40

Figura 18. Mecanismo de acción de M.HgiDII. ............................................................................ 41

Figura 19. Interacciones con la secuencia blanco. ..................................................................... 43

Figura 20. Motivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaI. ........................................................... 44

Figura 21. Alineamiento multiple del TRD de M.HgiDII y MTasas relacionadas. .......... 46


x

II. ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Ejemplificación de la nomenclatura de los sistemas RM. ......................................... 9

Tabla 2. Características de los sistemas de restricción-modificación. ............................... 10

Tabla 3. Etapas de la simulación. ...................................................................................................... 28

Tabla 4. Distancias interatómicas relevantes para la actividad catalítica de M.HgiDII38


1

RESUMEN

M.HgiDII es una metiltransferasa (MTasa) de Herpetosiphon giganteus que reconoce la

secuencia GTCGAC. Esta enzima pertenece a un grupo de MTasas que comparten una

gran similitud a nivel de secuencia de aminoácidos, aunque ninguna de ellas ha sido

caracterizada experimentalmente. El objetivo de este trabajo fue estudiar el

mecanismo de acción de M.HgiDII y sus interacciones con el DNA. La estructura

tridimensional de esta enzima se desconoce, por lo que se realizó un modelamiento

por homología de esta enzima con el DNA blanco y el cofactor S-adenosil metionina;

las interacciones relevantes para la función de M.HgiDII (catálisis enzimática y

reconocimiento específico del DNA) se determinaron mediante el análisis de

simulaciones de dinámica molecular. Los resultados indican que los primeros pasos

en la catálisis de M.HgiDII son diferentes a los de otras MTasas, en las cuales un ácido

glutámico es necesario para activar el anillo de citosina en los primeros pasos de la

metilación. En lugar del ácido glutámico, M.HgiDII emplea las interacciones entre

Arg160, Arg162 y el oxígeno O2 de la citosina en los primeros pasos de la reacción de

metilación. Otro hallazgo importante en este trabajo es que el residuo del sitio

catalítico, Val118, también tiene un papel relevante en la catálisis de M.HgiDII. Val118

interactúa con la citosina blanco y mantiene las moléculas de agua alejadas de la

región del sitio catalítico donde Cys79 interactúa con la citosina, evitando de esta

forma la disrupción de interacciones en el sitio catalítico. Se determinó también que el

reconocimiento específico del DNA por M.HgiDII está mediado principalmente por

aminoácidos del dominio de reconocimiento del DNA (TRD), aunque algunos

aminoácidos (asa 80-88) del dominio catalítico pueden contribuir al reconocimiento

específico del DNA. Estas interacciones involucraron contactos directos entre

M.HgiDII y el DNA, así como contactos indirectos mediados por agua. Adicionalmente,

el análisis de alineamientos de secuencias de MTasas relacionadas permitió identificar

un motivo en TRD de M.HgiDII que podría ser relevante para el reconocimiento

específico del DNA. En conclusión, el análisis in silico permitió conocer las regiones de

M.HgiDII que son relevantes para el reconocimiento del DNA blanco y para el

mecanismo catalítico. Asimismo, este análisis permitió asignar una función a un


2

aminoácido que se sabía era importante para la función catalítica (Val118), pero no se

conocía su participación exacta en el proceso de metilación.


3

ABSTRACT

M.HgiDII is a methyltransferase (MTase) from Herpetosiphon giganteus that

recognizes the sequence GTCGAC. This enzyme belongs to a group of MTases that

share a high degree of amino acid similarity, albeit none of them has been thoroughly

characterized. Homology modeling of M.HgiDII in complex with DNA and cofactor S-

adenosyl methionine was required because there is no available structural

information for this enzyme. Interactions that were relevant for the function of

M.HgiDII (enzymatic catalysis and specific recognition of DNA) were determined by

analysis of molecular dynamics simulations. The aim of this work was to study the

catalytic mechanism of M.HgiDII and its interactions with DNA. To achieve it,

molecular dynamics simulations were performed with a homology model of M.HgiDII

complexed with DNA and S-adenosyl-methionine. Results indicate that the first steps

in the catalytic mechanism of M.HgiDII are different from other MTases, in which a

glutamic acid is required to activate the cytosine ring in the first steps of the

methylation process. Instead of the glutamic acid, M.HgiDII relies on interactions

between Arg160, Arg162 and cytosine’s oxygen O2 at the beginning of the

methylation reaction. Another important finding of this work is that the residue from

the catalytic site, Val118, also played a relevant role in the catalysis of M.HgiDII.

Val118 interacted with the target cytosine and kept water molecules from accessing

the region of the catalytic pocket where Cys79 interacts with cytosine, thus preventing

water-mediated disruption of interactions in the catalytic site. It was found that

specific recognition of DNA was mediated mainly by amino acids of the target

recognition domain, although some amino acids (loop 80-88) of the catalytic domain

may also contribute to DNA recognition. These interactions involved direct contacts

between M.HgiDII and DNA, as well as indirect contacts through water bridges.

Additionally, analysis of sequence alignments with closely related MTases helped us to

identify a motif in the TRD of M.HgiDII that may be relevant to specific DNA

recognition. In conclusion, this in silico analysis allowed the identification of regions in

M.HgiDII that are relevant for the recognition of target DNA and for the catalytic

mechanism of this enzyme. Likewise, this analysis enabled for the assignment of


4

function to one amino acid (Val118), which was known to be important for the

catalytic activity, but whose exact participation in the catalytic mechanism was not

known until now.


5

11111111........ IIIIIIIINNNNNNNNTTTTTTTTRRRRRRRROOOOOOOODDDDDDDDUUUUUUUUCCCCCCCCCCCCCCCCIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN


6

La metilación del DNA tiene efectos muy importantes para la función celular. En

eucariontes, este tipo de modificación forma parte de los mecanismos epigenéticos de

regulación, y resulta de vital importancia durante el desarrollo embrionario de

vertebrados [Bheemanaik et al., 2006]. En bacterias, las funciones mejor conocidas de

la metilación del DNA son la reparación de errores durante la replicación, y la

protección del DNA de la acción de endonucleasas (ENasas) [Tock & Dryden, 2005]. Se

ha descubierto que la metilación del DNA es importante para el inicio del proceso de

replicación en ciertos grupos bacterianos [Collier et al., 2007], y también se ha

demostrado que afecta la expresión genética de las bacterias. Lo que es más

interesante, algunos agentes patógenos como Yersinia spp. y Haemophilus influenzae

ven reducida su virulencia cuando sus MTasas son mutadas [Heusipp et al., 2007];

adicionalmente, varios genes asociados a factores de virulencia se encuentran

regulados por metilación [Heusipp et al., 2007; Fälker et al., 2007].

Los efectores de este tipo de modificaciones son las DNA-metiltransferasas (MTasas),

las cuales catalizan la transferencia de grupos metilo del cofactor S-adenosilmetionina

(SAM) a adeninas o citosinas presentes en el DNA [Kozbial & Mushegian, 2005].

Algunas MTasas metilan grupos amino exocíclicos para formar N6-metiladenina ó N4-

metilcitosina, mientras que otras metilan el carbón C5 de citosinas para formar C5-

metilcitosina (m5C) (Fig. 1). Los grupos metilo se encuentran orientados hacia el

surco principal de la hélice de DNA, en posiciones que no interfieren con el

apareamiento de las bases [Wilson & Murray, 1991]. El SAM sirve siempre como el

donador del grupo metilo, por lo que es cofactor esencial para la metilación. En

bacterias, las MTasas pueden hallarse como entidades independientes (MTasas

huérfanas), o asociadas a endonucleasas formando parte de los sistemas de

Restricción-Modificación (R-M) [Bujnicki, 2001]. En este último caso, las MTasas

tienen la función de proteger al DNA bacteriano de la acción de las endonucleasas,

discriminando así el DNA propio del extraño, el cual será degradado por las

endonucleasas al carecer de la metilación apropiada [Murray, 2002; Blakely & Murray,

2009].


7

La mayoría de las MTasas descritas a la fecha son de origen bacteriano. Dentro de

éstas, las asociadas a sistemas R-M son las más abundantes, con 927 MTasas descritas

a la fecha en la base de datos REBASE (http://rebase.neb.com), la cual es una base de

datos de sistemas R-M [Roberts et al., 2010]. Estos sistemas se clasifican en cuatro

tipos (I-IV) [Tock & Dryden, 2005], de los cuales los tipo II son los más abundantes y

estudiados. Las enzimas de restricción de tipo II son conocidas por su aplicación en

biotecnología y como herramientas en técnicas de DNA recombinante; así mismo, las

MTasas de tipo II se han empleado cada vez más para estudiar el efecto de la

metilación en la expresión genética [Buryanov & Shevchuk, 2005] y para marcaje

específico del DNA [Klimasauskas & Weinhold, 2007].

Figura 1. Modificaciones llevadas a cabo por las DNA-metiltransferasas. m6A, N6-metiladenina; m4C, N4-metilcitosina; m5C, C5-metilcitosina.

1.1. Sistemas R-M

Los sistemas R-M están formados por pares de actividades enzimáticas intracelulares:

una endodesoxirribonucleasa (ENasa) y una MTasa. Estas enzimas interactúan con

secuencias específicas de nucleótidos en el DNA. Tales secuencias comprenden

generalmente de 4 a 8 nucleótidos definidos, que pueden ser continuos o

interrumpidos, únicos o degenerados [Wilson & Murray, 1991]. Las ENasas catalizan

la ruptura de ambas cadenas de DNA, lo cual ocurre una vez por cada secuencia

reconocida no protegida; ésto se realiza por la hidrólisis del enlace fosfodiéster en

ambas cadenas del DNA, resultando terminaciones 3’-hidroxilo y 5’-fosfato [Wilson &

Murray, 1991; Brooks, 1987]; dependiendo de la posición de los sitios de corte en el

DNA de doble cadena éste puede quedar con extremos adhesivos o romos. Las MTasas

N

NH

NH2

O

CH3

N

N

NH

N

NH

CH3

N

NH

NH

O

CH3

m6A m5C m4C


8

catalizan la adición de un grupo metilo a un nucleótido específico de la secuencia de

reconocimiento, protegiéndola así de la digestión por parte de su ENasa acompañante

[Blakely & Murray, 2009].

Estos sistemas funcionan en las células a manera de sistemas inmunes, los cuales

protegen a la célula de la invasión de DNA extraño, principalmente el que proviene de

fagos. Los sistemas R-M también funcionan como reguladores de la adquisición de

material genético mediante la restricción de DNA proveniente de procesos de

conjugación o transformación [Jeltsch, 2003].

1.1.2. Nomenclatura de los sistemas R-M

La gran variedad de sistemas R-M descritos a la fecha y su creciente complejidad ha

hecho que la nomenclatura de estos sistemas cambie con el tiempo. El sistema de

nomenclatura vigente nombra a los sistemas R-M de acuerdo a los siguientes criterios

(Tabla 1) [Roberts et al., 2003; Roberts et al., 2010]:

1. Las primeras tres letras están formadas por el nombre de la especie donde fue

hallado el sistema R-M. La primera letra corresponde al género y va en

mayúsculas; las siguientes dos corresponden a las dos primeras letras de la

especie.

2. Posteriormente se añade la designación de la cepa.

3. Si el sistema R-M es el primero descrito para una cepa en particular, se añade al

final el número romano “I”; si es el segundo se pone “II” y así sucesivamente.

4. Cuando se refiere a las proteínas, se adiciona el prefijo “M.” para MTasas, o “R.”

para ENasas.

5. En el caso de nombrar los genes, todas las letras se ponen en cursivas, y la

designación de MTasa (M) ó ENasa (R) se adiciona como sufijo.

6. Las enzimas putativas se nombran de manera similar a las enzimas

caracterizadas experimentalmente, solo que al final se añade el sufijo “P”; una


9

vez que se demuestra que son genes pertenecientes a sistemas R-M, este sufijo

se elimina.

Tabla 1. Ejemplificación de la nomenclatura de los sistemas RM.

Organismo Sistema Proteínas Genes

ENasa MTasa ENasa MTasa

Escherichia coli R EcoRI R.EcoRI M.EcoRI ecoRIR ecoRIM

Escherichia coli R1 EcoRII R.EcoRII M.EcoRII ecoRIIR ecoRIIM

Listeria monocitogenes A2 LmoAP R.LmoAP M.LmoAP lmoAPR lmoAPM

1. Ejemplo del segundo sistema R-M descrito para E. coli R. 2. Ejemplo de un sistema R-M putativo en L. monocitogenes A.

1.1.3. Clasificación de los sistemas R-M

De acuerdo al requerimiento de cofactores, manera de actuar y formas activas se

pueden reconocer básicamente cuatro tipos de sistemas, cuyas características se

muestran en la Tabla 2. Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias

palindrómicas de 4 a 8 pb; son altamente específicas y cortan al DNA de manera

definida dentro de la secuencia de reconocimiento (4-8 pb). Estas características,

aunadas al escaso requerimiento de cofactores, han hecho que las enzimas de tipo II

sean las que se utilicen para caracterizar al DNA mediante mapeo de restricción, y en

la generación de DNA recombinante [Williams, 2003]. Las MTasas de tipo II se han

empleado para estudiar el efecto de la metilación en la expresión genética [Buryanov

& Shevchuk, 2005], y gracias al desarrollo de análogos de SAM con capacidad de

fluorescencia se han empleado para el marcaje específico del DNA [Klimasauskas &

Weinhold, 2007].

1.2. Aspectos estructurales de las DNA-MTasas

El impacto que la metilación del DNA tiene sobre la expresión genética ha hecho

imprescindible el estudio de los mecanismos de acción de las MTasas para conocer

mejor procesos como el desarrollo del cáncer o para establecer estrategias


10

terapéuticas en el caso de genes de patogenicidad regulados por metilación. Gracias a

este interés, se ha dilucidado el mecanismo catalítico que siguen las MTasas, así como

se ha hecho un progreso notable para entender la forma en que estas enzimas

reconocen al DNA con gran especificidad.

Tabla 2. Características de los sistemas de restricción-modificación.

Tipo Estructura Cofactores1

TRD2 Sitio de

rompimiento

Secuencias de

reconocimiento ENasa MTasa

I Actividad de

ENasa, MTasa y

reconocimiento

en subunidades

diferentes.

ATP, SAM,

Mg2+

SAM (Mg2+,

ATP)

Subunidad S. Al azar; hasta

1 kb alejado

del blanco

Asimétricas con

un espaciador de

longitud variable

(ej. GAGN7GTCA)3

II ENasa y MTasa

en diferentes

enzimas.

Mg2+ SAM Independiente Dentro del

blanco.

Palindrómicas

(ej. GTCGAC)4

III Complejo

formado por una

subunidad de

modificación y

una de

restricción.

ATP,

(SAM),

Mg2+

SAM (Mg2+,

ATP)

Subunidad M Definida, a 25-

27 pb del

extremo 3’ del

blanco.

Asimétricas

(ej. AGACC)5

IV6 Formados por

una o dos

subunidades.

Mg2+, GTP 30 pb de la

secuencia

blanco

Dinucleótidos

modificados

(RmC)7

Basado en [Gingeras, 1991] y [Roberts et al., 2003] 1. Los cofactores en paréntesis no son necesarios pero estimulan la actividad. 2. TRD: Dominio de reconocimiento del DNA blanco 3. Secuencia de reconocimiento para el sistema EcoAI. 4. Secuencia de reconocimiento para el sistema SalI. 5. Secuencia de reconocimiento para el sistema EcoP1I. 6. A diferencia de los sistemas anteriores, el tipo IV corta DNA metilado, hidroximetilado, o glucosil-

hidroximetilado. 7. La secuencia de reconocimiento solo se ha definido para el sistema EcoKMcrBC.


11

En las MTasas, las funciones de catálisis y reconocimiento del DNA están localizadas

en dos dominios diferentes: el dominio catalítico, donde se lleva a cabo la

transferencia del grupo metilo del SAM a la base blanco; y el dominio de

reconocimiento de DNA (TRD, por Target Recognition Domain), el cual determina la

secuencia de reconocimiento. Todas las MTasas caracterizadas estructuralmente

presentan conservación estructural en el dominio catalítico y elevada heterogeneidad

a nivel del TRD (Fig. 2). El dominio catalítico está formado por una hoja de siete

plegamientos β flanqueada por hélices α en ambas caras de la hoja, creando una

estructura tipo sándwich (Fig. 2), la cual contiene los sitios de unión a SAM y de la

base a metilar [Cheng & Roberts, 2001; Roberts, 1994].

Figura 2. Estructura de algunas MTasas. El TRD se muestra en gris. Los plegamientos β están mostrados en verde, mientras que las hélices α en azul. Tomado de [Cheng & Roberts, 2001].

A pesar de que el dominio catalítico de las MTasas se encuentra estructuralmente

conservado, no hay una correspondencia con la similitud a nivel de aminoácidos

[Cheng & Roberts, 2001]. Sin embargo, se han detectados varios motivos conservados

a nivel de secuencia de aminoácidos (9 para MTasas de adenina, y 10 para las de

citosina), lo que facilita su identificación cuando se cuenta con la secuencia

aminoacídica. Estos motivos son responsables del reconocimiento de SAM (motivos I-


12

III, V, X), en la catálisis de la metilación (motivos IV y VI), y en el posicionamiento

adecuado de la base blanco dentro del sitio activo de la enzima (motivos IV, VI, VIII)

[Jeltsch, 2002; Malone et al., 1995]. El orden en el que se presentan estos motivos

varía con el tipo de MTasa (Fig. 3). Las m5C-MTasas contienen los diez motivos en

orden consecutivo; el TRD se encuentra insertado entre los motivos VIII y IX. Las

MTasas que modifican adenina o el grupo amino de la citosina carecen del motivo IX, y

tienen la peculiaridad de presentar los motivos de manera permutada. Esta

permutación ha permitido clasificar a las amino-MTasas en tres clases diferentes: α, β,

y γ [Malone et al., 1995].

De todos estos motivos, las posiciones más conservadas entre las MTasas son una

glicina en el asa posterior al plegamiento β1 (motivo I), un aminoácido cargado

negativamente: Asp/Glu (motivo II) en el extremo carboxilo terminal del plegamiento

β2, y un residuo hidrofóbico, Val/Ile/Leu (motivo IV) dentro del plegamiento β4. Solo

uno de estos motivos (motivo I) es identificable a partir de la secuencia aminoacídica,

aunque cuando se comparan MTasas dentro de la misma familia (5mC, α, β, ó γ) el

grado de similitud aumenta considerablemente [Cheng & Roberts, 2001].

Figura 3. Orden lineal de los motivos conservados en las MTasas. Los bloques representan la secuencia de aminoácidos orientada del extremo amino terminal (N) al carboxilo terminal (C). En azul se muestran el dominio catalítico y en naranja el TRD (dominio de reconocimiento del DNA).

1.3. Mecanismo de acción de las

Gran parte de la información que se tiene acerca del mecanismo d

MTasas proviene de M.HhaI

reconoce la secuencia GCGC y metila la citosina interna en la posición C5

(http://rebase.neb.com/rebase/enz/M.HhaI.html

determinadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y

ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de acción de esta enzima

la han colocado como prototipo de las m5C

El paso inicial del proceso de metilación es el

consolidación del sitio activo

linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco,

dominio catalítico sufre un cambio conformacional

asa del dominio catalítico hacia el

2004; Zhou et al., 2009].

Figura 4. Rearreglo conformacionalM.HhaI se une a DNA específico, un asa del dominio catalítico (rojo) se inserta en el surco menor del DNA (verde). Imagen basada en las estructuras de M.HhaI sin DNA (1HMY) y unida a DNA específico (3HMT).


13

1.3. Mecanismo de acción de las m5C-MTasas

Gran parte de la información que se tiene acerca del mecanismo de acción de las

MTasas proviene de M.HhaI. Esta enzima fue aislada de Hemophilus haemolyticus


http://rebase.neb.com/rebase/enz/M.HhaI.html). La gran cantidad de estructuras

erminadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y

ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de acción de esta enzima

la han colocado como prototipo de las m5C-MTasas.

El paso inicial del proceso de metilación es el reconocimiento del sitio blanco

consolidación del sitio activo. Se ha propuesto que M.HhaI se une al DNA y se mueve

linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco,

dominio catalítico sufre un cambio conformacional ocasionado por la migración de

asa del dominio catalítico hacia el surco menor del DNA (Fig. 4) [Estabrook

conformacional en M.HhaI en respuesta a la unión de DNADNA específico, un asa del dominio catalítico (rojo) se inserta en el surco

menor del DNA (verde). Imagen basada en las estructuras de M.HhaI sin DNA (1HMY) y unida

Mecanismo de acción de M.HgiDII

e acción de las m5C-

Hemophilus haemolyticus;


. La gran cantidad de estructuras

erminadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y

ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de acción de esta enzima y

reconocimiento del sitio blanco y

Se ha propuesto que M.HhaI se une al DNA y se mueve

linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco, el

ocasionado por la migración de un

Estabrook et al.,

en M.HhaI en respuesta a la unión de DNA. Cuando DNA específico, un asa del dominio catalítico (rojo) se inserta en el surco

menor del DNA (verde). Imagen basada en las estructuras de M.HhaI sin DNA (1HMY) y unida


14

Este rearreglo se presenta únicamente cuando M.HhaI ha reconocido su sitio blanco

[Klimasauskas et al., 1994]; adicionalmente, el cambio conformacional contribuye al

ensamblaje correcto del sitio activo y está acoplado con la transferencia de la base

hacia el sitio catalítico [Estabrook & Reich, 2006]. Se ha demostrado que la proteína

participa activamente en la migración de la citosina blanco hacia el sitio activo. Los

contactos que M.HhaI establece con el DNA blanco permiten la disminución de la

barrera de energía libre requerida para el desplazamiento de la base, además de que

estabiliza este estado mediante el secuestro de la citosina dentro del sitio catalítico

con el asa proveniente del sitio catalítico [Huang et al., 2003].

1.3.1. Catálisis enzimática de la metilación

El mecanismo de transferencia del grupo metilo ha sido ampliamente estudiado en

M.HhaI. Los residuos del sitio activo Glu119 y Arg165 se requieren para orientar y

estabilizar la citosina para el ataque nucleofílico mediado por Cys81 (Fig. 5) [Shieh &

Reich, 2007; Shieh et al., 2006]. En el caso de M.HhaI se ha demostrado que Glu119

tiene un papel importante en los primeros pasos de la catálisis. Este residuo protona

la posición N3 (Fig. 5 y 6a), ocasionando un reacomodo electrónico en el anillo de

citosina que resulta en una carga parcial positiva en la posición C6. Esto permite el

ataque en C6 por Cys81 (Fig. 6a), lo que posteriormente desencadena un ataque

nucleofílico de C5 al grupo metilo del SAM (Fig. 6b). El paso final de la reacción incluye

la eliminación de un átomo de hidrógeno de C5. Análisis de simulaciones de dinámicas

moleculares en el sitio catalítico de M.HhaI mostraron que un canal de agua en el sitio

activo provee aniones hidróxido requeridos para deprotonar el complejo Cys81-

citosina (Fig. 6c) y liberar la citosina liberada (Fig. 6d) [Zhang & Bruice, 2006; Lau &

Bruice, 1999].

Figura 5. Sitio catalítico de M.HhaIesqueleto carbonado blanco; los

El papel de Glu119 en la catál

donde se concluyó que

contribuyendo únicamente a crear la con

residuo todavía resultaría esencial para el proc

activamente en la orientación de la citosina blanco

acuerdo a este mecanismo de acción, las interacciones entre la posición O2 y los

residuos Arg163 y Arg165 serían los principales mecanismos

mediante una deslocalización

por parte de Cys81 [Zhang & Bruice

M.HhaI parece seguir la ruta que utiliza la protonación en N3, pue

diferentes inhibidores análogos a citosina han demostrado que Glu119, Arg163, y

Arg165 participan activamente promoviendo y estabilizando la formación del

intermediario protonado [Kumar, 1997]

Arg


15

Figura 5. Sitio catalítico de M.HhaI. La citosina blanco se muestra como cilindros de los aminoácidos de M.HhaI se muestran en verde.

El papel de Glu119 en la catálisis ha sido debatido por estudios computacionales

donde se concluyó que Glu119 tiene un papel secundario en la catálisis,

contribuyendo únicamente a crear la conformación del estado basal; no obstante

residuo todavía resultaría esencial para el proceso catalítico debido a que participa

activamente en la orientación de la citosina blanco [Zhang & Bruice


serían los principales mecanismos que inician la catálisis

deslocalización de electrones hacia O2, lo que permitiría el ataque en C5

Zhang & Bruice, 2006]. Sin embargo, se ha demostrado que

M.HhaI parece seguir la ruta que utiliza la protonación en N3, pues estudios con



[Kumar, 1997].

Glu119

Arg165

N3

O2


La citosina blanco se muestra como cilindros de

ha sido debatido por estudios computacionales

Glu119 tiene un papel secundario en la catálisis,

no obstante, este

eso catalítico debido a que participa

Zhang & Bruice, 2006]. De


que inician la catálisis

permitiría el ataque en C5

se ha demostrado que

s estudios con




16

Figura 6. Mecanismo de transferencia del grupo metilo en M.HhaI. La numeración del anillo se muestra en la estructura de la derecha. (a) Activación del anillo de citosina por protonación en N3 mediada por Glu119 facilita el ataque nucleofílico en C6 por Cys81. (b) Flujo de electrones hacia el anillo de pirimidina activa el C5, el cual ataca al grupo metilo del SAM. (c) Un anión hidróxido del agua deprotona la posición C5, causando el rompimiento del enlace covalente entre Cys81 y la citosina. (d) Los productos finales de la reacción: m5C, y S-adenosil metionina. Basado en [Shieh & Reich, 2007] y [Zhang & Bruice, 2006].

1.3.2. Reconocimiento del DNA blanco

Mientras que el mecanismo de metilación ha sido bien estudiado y se ha visto que es

conservado entre las MTasas, el reconocimiento específico del DNA no ha sido bien

estudiado debido a la elevada divergencia de aminoácidos del TRD, lo que hace que los

estudios comparativos sean difíciles de realizar [Roberts, 1994]. A pesar de esto, se ha

visto que las MTasas que reconocen secuencias similares muestran cierto grado de

conservación a nivel del TRD [Roberts, 1994; Szegedi & Gumport, 2000].

Adicionalmente, se ha mostrado que varias MTasas de citosina contienen un motivo

conservado (motivo TL), el cual está involucrado en la orientación e inmovilización de

la citosina blanco dentro del sitio catalítico [Vilkaitis et al., 2000]. La conservación de

aminoácidos que rodean el motivo TL en MTasas que reconocen secuencias similares

ha originado la posibilidad de usar esta región como predictor de especificidad de

secuencia [Neely & Roberts, 2008].

La forma en que algunas MTasas interactúan con el DNA ha sido establecida mediante

el empleo de agentes modificadores del DNA. De esta forma se ha encontrado que las

MTasas hacen contactos específicos con las bases a través del surco principal del DNA

[Finta & Kiss, 1997] así como con el esqueleto de fosfato en el caso de M.TaqI [Mayer

N

N

NH2

O

DNA S-

Cys81

Glu119

OH

O

SCys81

N

NH

NH2

O

DNA

Glu119

O-

O

Ade

S+

R

CH3

SCys81

N

N C

NH2

O

DNA

CH3

H

Glu119

OH

O

OH-

N1

N32

4

5

6

NH2

O

DNA

CH3

Glu119

OH

O

S-

Cys81

Ade

S

R Ade

S

R

(a) (b) (c) (d)


17

& Barany, 1994]. Mediante mutagénesis dirigida se han encontrado en M.EcoRV dos

residuos (arginina y asparagina) que son importantes para la unión al DNA [Roth et

al., 1998]. El estudio del reconocimiento del DNA en los sistemas RM de tipo I se ha

realizado principalmente mediante análisis por alineamiento de secuencias,

modelamiento molecular y análisis mutacionales. Empleando las dos primeras

estrategias, Sturrock & Dryden (1997) hallaron que en general los sistemas de tipo I

presentan una semejanza estructural en su dominio de unión a DNA, y que ésta es

parecida a la de M.HhaI, por lo que estas enzimas pueden reconocer su sustrato

específico de manera similar. Empleando mutagénesis al azar y dirigida se han

encontrado varios residuos críticos en el reconocimiento del DNA por parte de

MTasas de tipo I [Murray, 2000].

1.4. Metiltransferasa M.HgiDII

M.HgiDII es una m5C-MTasa que reconoce la secuencia GTCGAC, y pertenece al

sistema RM HgiDII de Herpetosiphon giganteus D [Kröger et al., 1984]. Este sistema ha

sido estudiado en el aspecto de regulación genética mediante la generación de

sistemas R-M híbridos empleando a M.HgiDII y SalI, una ENasa con la misma

especificidad pero que normalmente se encuentra asociada a una amino-MTasa

(M.SalI) [Pélaez et al., 1998].

No se han realizado estudios estructurales en esta enzima, y aunque se ha

determinado su especificidad, todavía se desconoce cuál de las dos citosinas es

metilada. Adicionalmente, varias MTasas identificadas en proyectos de secuenciación

de genomas son altamente similares a M.HgiDII a nivel de aminoácidos, por lo que los

descubrimientos hechos en esta enzima podrían ser extrapolados a estas MTasas.


18

22222222........ JJJJJJJJUUUUUUUUSSSSSSSSTTTTTTTTIIIIIIIIFFFFFFFFIIIIIIIICCCCCCCCAAAAAAAACCCCCCCCIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN


19

A pesar de que el mecanismo catalítico de las MTasas ha sido descrito con detalle,

prácticamente toda la información proviene principalmente de una sola enzima,

M.HhaI. Así, el estudio del mecanismo de acción de M.HgiDII, la cual tiene una

secuencia de reconocimiento diferente a M.HhaI, permitirá tener un panorama más

amplio del mecanismo de acción de estas enzimas. Como el mecanismo de acción de

las MTasas se encuentra conservado, los conocimientos generados podrán aplicarse a

otras MTasas, particularmente aquellas con secuencias de reconocimiento parecidas a

las de M.HgiDII y las que guardan una elevada similitud con ésta pero que todavía no

han sido caracterizadas.


20

33333333........ OOOOOOOOBBBBBBBBJJJJJJJJEEEEEEEETTTTTTTTIIIIIIIIVVVVVVVVOOOOOOOOSSSSSSSS


21

3.1. Objetivo General

Proponer el mecanismo catalítico de M.HgiDII así como la forma en que interactúa con

el DNA blanco mediante el análisis de simulaciones de dinámica molecular.

3.2. Objetivos Particulares

• Crear el modelo estructural de M.HgiDII acoplada al cofactor SAM y al DNA

blanco.

• Realizar simulaciones de dinámica molecular sobre el complejo ternario.

• Determinar las interacciones relevantes para el mecanismo de acción de

M.HgiDII.

• Identificar los aminoácidos responsables del reconocimiento específico del

DNA en MTasas que reconocen secuencias idénticas o similares a la de

M.HgiDII.


22

44444444........ MMMMMMMMAAAAAAAATTTTTTTTEEEEEEEERRRRRRRRIIIIIIIIAAAAAAAALLLLLLLL YYYYYYYY MMMMMMMMÉÉÉÉÉÉÉÉTTTTTTTTOOOOOOOODDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS


23

4.1. Equipo de cómputo

El modelamiento por homología y la preparación del sistema fueron realizados en una

computadora personal Toshiba Satellite E105 (Intel® Core Duo™ CPU P8400; 2.26

GHz). Las simulaciones fueron realizadas en el sistema de alto desempeño Biowulf,

instalado en los Institutos Nacionales Salud de los Estados Unidos (NIH, por sus siglas

en Inglés, National Institutes of Health; http://www.biowulf.nih.gov); se trata de un

sistema de cómputo en racimo con 2130 unidades de procesamiento de datos (nodos).

Para las simulaciones se emplearon 32 nodos, equivalentes a 64 procesadores

Opteron de 2.8 GHz, con conectividad Gigabit Ethernet.

4.2. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA

La estrategia que se siguió para el modelaje por homología fue un procedimiento

iterativo basado en el perfil energético de los aminoácidos (Fig. 7). Este método

consiste básicamente en crear variantes estructurales de M.HgiDII mediante la

modificación del alineamiento usado para el modelaje. Las estructuras generadas son

evaluadas y se selecciona aquella que presenta el mejor perfil energético.

Los moldes usados para deducir la estructura de M.HgiDII (clave Entrez: P25265)

fueron las MTasas HaeIII unida a DNA, y HhaI unida a DNA y S-adenosil-l-

homocisteína (PDB: 1DCT y 3MHT, respectivamente). Las secuencias de aminoácidos

fueron alineadas con ClustalX [Larkin et al., 2007]. Para mejorar la calidad del

alineamiento, la estructura secundaria asignada por PSI-PRED [Bryson et al., 2005]

fue usada para añadir restricciones estructurales, eliminando así la introducción de

huecos en hélices α o plegamientos β. El alineamiento fue modificado manualmente

para hacer coincidir los motivos catalíticos y el motivo TL en todas las MTasas.

Figura 7. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII modelamiento por homologíaañadiendo variaciones al alineamiento múltiple hasta obtener un perfil energético en el cual ningún aminoácido tenga una energía

Los modelos fueron generados con Modeller 9.3

restricciones estructurales basadas en la predicción de estructura secundaria

región del TRD (aminoácidos 207

programa. El perfil de energía libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor

ANOLEA [Melo et al., 1997], realizando modificaciones manuales en

hasta que ningún aminoácido en el modelo tuviera un puntaje mayor

unidades E/kT. Las coordenadas

la secuencia de DNA fue modificada con Chimera

GTCGAC (C es la citosina blanco

M.HgiDII. Como M.HgiDII tiene un

DNA fue extendida empleando

DNA fue añadido a la estructura de M.HgiDII usando como guía el


24

. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII modelamiento por homología. La estructura final es obtenida por modelaje iterativo añadiendo variaciones al alineamiento múltiple hasta obtener un perfil energético en el cual ningún aminoácido tenga una energía mayor o igual a 10 E/kT.

os fueron generados con Modeller 9.3 [Eswar et al., 2008

basadas en la predicción de estructura secundaria

región del TRD (aminoácidos 207-352); las asas fueron optimizadas con

energía libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor

, realizando modificaciones manuales en la región del TRD

hasta que ningún aminoácido en el modelo tuviera un puntaje mayor

E/kT. Las coordenadas para el DNA fueron obtenidas de la estructura 1DCT

la secuencia de DNA fue modificada con Chimera [Pettersen et al., 2004],

blanco), para adaptarla a la secuencia de reconocimiento de

Como M.HgiDII tiene un TRD más grande que el de los moldes, l

empleando una estructura de DNA no relacionada (PDB: 1BNA). El

DNA fue añadido a la estructura de M.HgiDII usando como guía el ácido nucleico


. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII mediante La estructura final es obtenida por modelaje iterativo

añadiendo variaciones al alineamiento múltiple hasta obtener un perfil energético en el cual

2008], añadiendo

basadas en la predicción de estructura secundaria para la

352); las asas fueron optimizadas con el mismo

energía libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor

la región del TRD

hasta que ningún aminoácido en el modelo tuviera un puntaje mayor o igual a 10

para el DNA fueron obtenidas de la estructura 1DCT;

, de GGCCAC a

para adaptarla a la secuencia de reconocimiento de

TRD más grande que el de los moldes, la cadena de

una estructura de DNA no relacionada (PDB: 1BNA). El

ácido nucleico


25

presente en las estructuras de M.HhaI y M.HaeIII. Finalmente, el cofactor SAM fue

reconstruido con el módulo AutoPSF de VMD [Humphrey et al., 1996] a partir de un

residuo de adenina alineado con la estructura de SAM presente en 3MHT. Para añadir

los átomos restantes de SAM se requirió de los archivos de topología y parámetros de

las versiones c35b2 y c36a2 de CHARMM [Mackerell et al., 1998; MacKerell &

Banavali, 2000]. El modelo fue refinado con simulaciones de dinámica molecular

(descritas más adelante). La estructura promedio en un nanosegundo de simulación

fue minimizada por el método de gradiente conjugado (1000 pasos) para obtener la

estructura final del complejo ternario (M.HgiDII-SAM-DNA).

4.3. Evaluación de la calidad del modelo

La calidad de los modelos fue evaluada en relación a su energía y geometría

estereoquímica. Se empleó Procheck [Laskowski et al., 1993] para evaluar la

geometría, ProSA-Web [Wiederstein & Sippl, 2007] para evaluar el potencial de

energía, y Verify3D para evaluar la compatibilidad local del modelo en relación a

estructuras de buena calidad depositadas en el PDB [Eisenberg et al., 1997]. ANOLEA

fue utilizada para calcular la energía para cada aminoácido de acuerdo al “ambiente

no local” de cada átomo pesado en la proteína [Melo et al., 1997].

4.4. Definición del sistema para la simulación de dinámica molecular

Las simulaciones de dinámica molecular tratan de predecir el comportamiento de

sistemas biológicos a nivel atómico. Las interacciones atómicas están definidas por

tres potenciales de energía: Potencial de enlace covalente, potencial de enlace débil, y

potencial electrostático (Fig. 8). Además de estos potenciales, la interacción atómica

se ve influida por la velocidad y aceleración de los átomos, las cuales están definidas

por la temperatura y presión asignadas al sistema. Las funciones que definen estas

interacciones se conocen como campos de fuerza. El cálculo de estos potenciales

representa una enorme cantidad de operaciones matemáticas, por lo que se requirió

de sistemas de cómputo de alto rendimiento para realizar las simulaciones. Para darse

una idea de la complejidad de los cálculos, la simulación de 5 nanosegundos en un

sistema conformado por aproximadamente 65000 átomos requirió el trabajo

concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente

archivos generados durante la simulación son de un tamaño considerable, del orden

de gigabytes, por lo que el análisis de los resultados también requirió una inversión

considerable de tiempo computacional.

Figura 8. Interacciones relevpotencial de enlace covalente; http://www.stanford.edu/group/pandegroup/folding/education/molmodel.html

Todas las simulaciones fueron realizadas

en el sistema de alto rendimiento

(http://www.biowulf.nih.gov

[Mackerell et al., 1998; MacKerell & Banavali

simulaciones. El complejo ternario fue

de agua. La geometría de estas moléculas corresponde al

prefiere para la simulación de dinámicas moleculares porque e

interacciones requiere menor capacidad de cómputo. El cubo de agua fue construido

de manera tal que hubiera una distancia mínima

del cubo; además, la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adición de


26


concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente



considerable de tiempo computacional.

relevantes en la simulación de dinámica molecular.potencial de enlace covalente; B. Potenciales de interacción débil. Imagen modificada de: http://www.stanford.edu/group/pandegroup/folding/education/molmodel.html

Todas las simulaciones fueron realizadas con NAMD v2 [Phillips et al., 2005

de alto rendimiento Biowulf, instalado en el NIH

http://www.biowulf.nih.gov). Los campos de fuerza CHARMM22 y CHARMM27

MacKerell & Banavali, 2000] fueron usados para las

l complejo ternario fue introducido en un cubo formado por

. La geometría de estas moléculas corresponde al modelo TIP3P

prefiere para la simulación de dinámicas moleculares porque el cálculo de sus

s requiere menor capacidad de cómputo. El cubo de agua fue construido

una distancia mínima de 12 Å entre el soluto y las paredes

la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adición de



concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente, los



dinámica molecular. A. El Potenciales de interacción débil. Imagen modificada de:

http://www.stanford.edu/group/pandegroup/folding/education/molmodel.html

2005] instalado

instalado en el NIH

). Los campos de fuerza CHARMM22 y CHARMM27

fueron usados para las

formado por moléculas

modelo TIP3P, el cual se

cálculo de sus

s requiere menor capacidad de cómputo. El cubo de agua fue construido

entre el soluto y las paredes

la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adición de


27

iones Na+ y Cl- distribuidos al azar dentro del cubo. Al final el sistema quedó

conformado por 64300 átomos.

Figura 9. Esquema que representa las condiciones de la simulación. Los cuadros representan las condiciones periódicas. rcut fue equivalente a 10 Å. Imagen tomada de: http://www.compsoc.man.ac.uk/~lucky/Democritus/Theory/pbc-mi.html

El sistema fue simulado en condiciones periódicas a una temperatura y presión

constantes de 310 K (370 C) y 1 atm, respectivamente. Las condiciones periódicas

implican tener un número infinito de celdas idénticas a la celda de simulación, y

permiten un flujo libre de moléculas de una celda a otra del sistema, evitando pérdida

de moléculas o efectos de tensión superficial. Se empleó un radio de corte de 10 Å

para las interacciones débiles (Fig. 9); es decir, se calcularon las interacciones de cada

átomo del sistema únicamente con átomos dentro de un radio de 10 Å. Con esta

distancia se disminuyó el requerimiento de poder de cómputo sin afectar el

comportamiento de las moléculas. Los enlaces covalentes que involucran átomos de

hidrógeno fueron restringidos mediante el algoritmo SHAKE, lo que permitió realizar

cálculos de interacciones atómicas cada 2 fs (10-15 segundos). Antes de realizar las

simulaciones es necesario equilibrar el sistema. Este paso consiste en llevar al sistema

a la temperatura y presión requeridas, además de eliminar efectos estéricos mediante

la minimización del sistema. El equilibrio del sistema debe realizarse de forma gradual

relajando primero al solvente y después al soluto, ya que de esta forma se evita la

introducción de cambios conformacionales drásticos en el soluto. La Tabla 3 resume


28

los pasos que se siguieron para realizar las corridas de equilibrio y de producción. El

sistema fue equilibrado fijando el soluto y relajando el solvente con 20000 pasos de

minimización y 20 ps de simulación. El soluto fue relajado gradualmente en corridas

de 10 ps con restricciones armónicas decrecientes (100, 10, y 1 kcal mol-1 Å-2),

minimizando por 1000 pasos entre cada periodo de simulación. Por último, el sistema

fue simulado por 5 ns a 310 K y una presión constante de 1 atm. Las coordenadas

fueron grabadas cada 5 ps (10-12 segundos) durante el periodo de equilibrio, y cada 10

ps en la corrida de producción.

Tabla 3. Etapas de la simulación.

Procedimiento Tiempo1/pasos Condiciones Restricciones al soluto2

Minimización 20000 pasos Soluto fijo

DM3 20 ps 310 K/1 atm Soluto fijo

Minimización 1000 pasos 100 mol-1 Å-2‡

DM 10 ps 310 K/1 atm 100 mol-1 Å-2

Minimización 1000 pasos 10 mol-1 Å-2

DM 10 ps 310 K/1 atm 10 mol-1 Å-2

Minimización 20000 pasos 1 mol-1 Å-2

DM 10 ps 310 K/1 atm 1 mol-1 Å-2

Minimización 100 pasos Ninguna

DM 5 ns 310 K/1 atm Ninguna

1. Los ciclos de minimización/DM tuvieron una duración en tiempo real de 2 a 3 horas. La simulación de 5 ns tuvo una duración en tiempo real de aproximadamente 24 horas.

2. DM. Dinámica molecular 3. Restricciones armónicas


29

55555555........ RRRRRRRREEEEEEEESSSSSSSSUUUUUUUULLLLLLLLTTTTTTTTAAAAAAAADDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS YYYYYYYY DDDDDDDDIIIIIIIISSSSSSSSCCCCCCCCUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN

Las simulaciones de la dinámica molecular

estructural de proteínas. En estas simulaciones

acuerdo a las leyes mecánicas de atracción y repulsión, así como

ambientales definidas (presencia de solvente, temperatura y

el modelaje de proteínas, las simulaciones

nativa debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig.

al., 2008]. Asimismo, estas simulaciones permiten detectar y

atómicas relevantes en la función de las proteínas, como la interacción con los

sustratos. Estas dos aplicaciones de la simulación de dinámicas moleculares

permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cof

inferir a partir de éstas el mecanismo catalítico que sigue la enzima

al., 2009].

Figura 10. Espectro conformacional explorado en la simulación de dinámicas moleculares. El modelo inicial de una proteína podría no tenerTécnicas como la minimización (flecha no necesariamente representan la estructura nativa. La dinámica molecular explora un mayor espectro conformacional (flecha azul)conformación nativa.

5.1. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA

De acuerdo a la base de datos del PDB, l

M.HaeIII y M.HhaI (PDB: 1DCT y 3MHT)

moldes para deducir la estructura


30

de la dinámica molecular son de gran utilidad en el análisis

En estas simulaciones se permite el movimiento atómico de

las leyes mecánicas de atracción y repulsión, así como

definidas (presencia de solvente, temperatura y presión constantes)

el modelaje de proteínas, las simulaciones permiten la adquisición de la conformación

debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig.

. Asimismo, estas simulaciones permiten detectar y cuantificar interacciones


Estas dos aplicaciones de la simulación de dinámicas moleculares

permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cof

stas el mecanismo catalítico que sigue la enzima [Castelán

. Espectro conformacional explorado en la simulación de dinámicas El modelo inicial de una proteína podría no tener la conformación nativa.

Técnicas como la minimización (flecha naranja) permiten obtener mínimos locales, los cuales no necesariamente representan la estructura nativa. La dinámica molecular explora un mayor

(flecha azul), con lo que se incrementa la posibilidad de obtener la

Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA

De acuerdo a la base de datos del PDB, las MTasas más parecidas a M.HgiDII son

1DCT y 3MHT), por lo que éstas fueron seleccionadas

deducir la estructura de M.HgiDII. La baja identidad de aminoácidos que


en el análisis

se permite el movimiento atómico de

las leyes mecánicas de atracción y repulsión, así como condiciones

presión constantes). En

conformación

debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig. 10) [Senet et

cuantificar interacciones


Estas dos aplicaciones de la simulación de dinámicas moleculares

permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cofactor, e

[Castelán-Vega et

. Espectro conformacional explorado en la simulación de dinámicas la conformación nativa.

) permiten obtener mínimos locales, los cuales no necesariamente representan la estructura nativa. La dinámica molecular explora un mayor

e se incrementa la posibilidad de obtener la

más parecidas a M.HgiDII son

seleccionadas como

La baja identidad de aminoácidos que

estas MTasas comparten con M.HgiDII (aproximadamente 1

alineamiento de secuencias fuera el paso crí

11).

Figura 11. Validez del modelaje por homología en relación con el porcentaje de identidad en los alineamientosidentidad mínimo requerido para obtener un modelo confiable es cede [Bourne & Weissig, 2003].

Basados en el conocimiento de que todas las DNA

contienen varios motivos conservados

los alineamientos para hacer coincidir

y se añadieron restricciones estructurales basad

secundaria. Este procedimiento resultó en un

catalítico de aproximadamente 27%

apropiado para el modelaje por homología

correspondiente al TRD fue la que representó mayor dificultad para el alineamiento

debido a la variabilidad intrínseca de esta zona. Como

Métodos, se realizaron varias modificaciones al alineamiento en la zona del TRD pero

manteniendo fija la posición del motivo TL. Por cada modificación al alineamiento se

creó un modelo estructural, el cual fue evaluado por el

con las modificaciones hasta que el perfil ANOLEA del modelo resultante indicara


31

stas MTasas comparten con M.HgiDII (aproximadamente 19%)

alineamiento de secuencias fuera el paso crítico durante el proceso de modelaje

. Validez del modelaje por homología en relación con el porcentaje de identidad en los alineamientos. En el caso de M.HgiDII (354 amnoácidos), el porcentaje de identidad mínimo requerido para obtener un modelo confiable es cercano al 20%.

Basados en el conocimiento de que todas las DNA-MTasas descritas a la fecha

contienen varios motivos conservados [Jeltsch, 2002], se realizaron modificaciones en

los alineamientos para hacer coincidir todos los motivos catalíticos en las tres MTasas,

restricciones estructurales basadas en la predicción de estructura

secundaria. Este procedimiento resultó en un grado de identidad para

talítico de aproximadamente 27% el cual, como se observa en la Fig. 12

para el modelaje por homología [Bourne & Weissig, 2003


debido a la variabilidad intrínseca de esta zona. Como se menciona en la sección de



creó un modelo estructural, el cual fue evaluado por el servidor ANOLEA;



hizo que el

el proceso de modelaje (Fig.

. Validez del modelaje por homología en relación con el porcentaje de En el caso de M.HgiDII (354 amnoácidos), el porcentaje de

rcano al 20%. Modificado

MTasas descritas a la fecha

modificaciones en

todos los motivos catalíticos en las tres MTasas,

s en la predicción de estructura

para el dominio

2, resultó más

2003]. La región


se menciona en la sección de



servidor ANOLEA; se continuó



32

energías favorables para todos los aminoácidos (<10 E/kT). Procedimientos similares

que involucran modificaciones reiterativas a los alineamientos, basadas en el puntaje

de los modelos resultantes, han sido aplicados con éxito en las MTasas M.SssI y

M.BssHII [Koudan et al., 2004; Bujnicki, 2000] debido a la variabilidad intrínseca del

TRD en estas enzimas.

Figura 12. Alineamiento múltiple de M.HgiDII con los moldes M.HaeIII y M.HhaI. La predicción de estructura secundaria se muestra arriba de las secuencias de aminoáciods (H para hélices α, y E para plegamientos β). Los motivos conservados de aminoácidos se muestran bajo las secuencias. El TRD se muestra como una barra con líneas cruzadas bajo las secuencias. Los alineamientos fueron formateados con BoxShade (www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html).

El alineamiento final mostró una elevada similitud en el dominio catalítico a nivel de

estructura primaria y secundaria (Fig. 12). La secuencia de M.HgiDII es más larga que

la de los moldes, y la mayoría de los residuos adicionales se localizó en el TRD (Fig. 12,

caja con patrón cruzado). La comparación estructural del modelo de M.HgiDII y las

estructuras de M.HaeIII y M.HhaI mostró una desviación media cuadrática (RMSD,

root mean square deviation) de 2.8 y 4.7 Å, respectivamente.


33

Aunque la especificidad de M.HgiDII (GTCGAC) ha sido confirmada

experimentalmente [Kröger et al., 1984], todavía se desconoce cuál de las citosinas de

la secuencia de reconocimiento es el blanco de metilación. Comparando

estructuralmente a M.HgiDII y los moldes, los cuales metilan la citosina interna de la

secuencia de reconocimiento, se halló que el acceso al sitio catalítico de M.HgiDII

coincide con la citosina interna, lo que indica que esta base es el blanco de la

metilación en esta enzima. De esta forma, creamos una estructura de DNA que

contiene la secuencia de reconocimiento de M.HgiDII con la citosina interna traslocada

al sitio catalítico.

El complejo ternario fue sometido a simulaciones de dinámica molecular, y el sistema

fue monitoreado mediante la evolución del RMSD del carbono α y el radio de giro de

M.HgiDII (Rg) (Fig. 13). El valor de RMSD determina la variación de la estructura de

M.HgiDII conforme pasa el tiempo de simulación. El valor Rg también mide la

variación de la estructura de M.HgiDII, pero a diferencia del valor de RMSD, donde se

compara la desviación estructural en relación a la estructura inicial del sistema, el Rg

mide la distancia promedio de todos los átomos al centro geométrico de la molécula

conforme avanza la simulación. Estos dos valores son útiles para determinar el

equilibrio del sistema, el cual se alcanza cuando dichos valores alcanzan un valor

constante. La Fig. 13 muestra la evolución de los valores RMSD y Rg durante la

simulación; puede observarse que el sistema comienza a equilibrarse

aproximadamente durante el primer nanosegundo (1000 ps) de simulación. El modelo

final del complejo ternario fue obtenido a partir de la estructura minimizada (1000

pasos) promedio en un nanosegundo en la parte final de la simulación (Fig. 13). Se

eligió esta zona porque presentó variaciones mínimas en los valores de RMSD y Rg.


34

Figura 13. Monitoreo de RMSD y Rg de M.HgiDII durante la simulación. La línea negra indica la evolución del RMSD, mientras que la gris muestra la evolución del Rg. El rectángulo muestra la sección empleada para obtener la estructura final del complejo ternario.

5.2. Evaluación de la calidad del modelo

El modelo final del complejo ternario, después de la simulación y una ronda final de

minimización, fue evaluado en cuanto a sus características energéticas y

estereoquímicas. El análisis global de estas características determina el éxito en el

proceso de modelaje. El análisis energético global del modelo con ProSA-Web mostró

un puntaje Z de -7.18 (Fig. 14), lo que indica que no hay alteraciones significativas en

relación con estructuras nativas de tamaño similar al de M.HgiII [Wiederstein & Sippl,

2007]. El análisis de Verify3D indicó una concordancia secuencia-estructura

razonablemente buena porque ninguno de los aminoácidos tuvo un puntaje negativo

(puntaje promedio = 0.36). El análisis estereoquímico de Procheck mostró que no

hubo contactos o puntajes inapropiados en cuanto a los parámetros de cadena

principal y grupos funcionales, y la gráfica de Ramachandran mostró que el 99.3% de

los aminoácidos residió en regiones permitidas (87.8% en las regiones más

favorables) (Fig. 14). Como regla general una estructura proteica se considera

aceptable si al menos el 90% de sus aminoácidos se encuentra dentro de las regiones

permitidas de la gráfica de Ramachandran. De esta forma, el procedimiento que

seguimos para modelar a M.HgiDII resultó en una estructura confiable para

determinar las interacciones relevantes para la catálisis enzimática y el

reconocimiento de DNA por parte de M.HgiDII.


35

Figura 14. Evaluación de la calidad de la estructura de M.HgiDII. (A) Resultado obtenido con ProSA-Web. La energía total de M.HgiDII se encuentra dentro de la región considerada como aceptable de acuerdo a resultados experimentales (zona azul). (B) Gráfica de Ramachandran. Las zonas más favorables se muestran en rojo, y las regiones aceptables se muestran en amarillo y beige. (C) Perfil energético por ANOLEA. En verde se muestran los aminoácidos con energías menores a cero y en rojo los que presentan energías mayores a cero.


36

5.3. Descripción general de la estructura

El modelo final de M.HgiDII muestra dos dominios estructurales: El dominio catalítico

y el TRD; la unión de estos dos dominios forma un surco donde se llevan a cabo las

interacciones con el DNA (Fig. 15). El cofactor SAM está situado en el sitio catalítico de

la enzima, muy cercano a la citosina blanco de metilación. El dominio catalítico

contiene un núcleo de plegamientos β rodeado por hélices α (Fig. 15a). La hoja β

contiene siete plegamientos (6 ↑ 7 ↓ 5 ↑ 4 ↑ 1 ↑ 2 ↑ 3 ↑) arreglados en dos

subdominios. El primer subdominio forma el sitio de unión a SAM, y está formado por

una serie de plegamientos β paralelos (1 ↑ 2 ↑ 3 ↑); en la Fig. 15b se muestra que este

subdominio está situado en izquierdo de la hoja β. El segundo subdominio forma el

sitio de unión de citosina, y está formado por cuatro plegamientos β (6 ↑ 7 ↓ 5 ↑ 4 ↑);

el plegamiento 7 está insertado de manera anti-paralela. Este tipo de arreglo es común

a todas las MTasas descritas a la fecha [Cheng & Roberts, 2001]. La hoja β contiene

una capa de hélices α en ambos lados, formando un dominio tipo Rossmann

característico de las MTasas dependientes de SAM [Kozbial & Mushegian, 2005].

El TRD de M.HgiDII se parece al de M.HaeIII [Reinisch, 1995] en que ambas MTasas

muestran una pobre organización a nivel de estructura secundaria. Casi todas las

interacciones con el DNA son mediadas por varias asas del TRD, y son las que darían la

especificidad a la enzima. Un asa del dominio catalítico (aminoácidos 80-88) contacta

la hélice de DNA a través del surco menor (Fig. 15). Este contacto hace que la enzima

envuelva totalmente una de las cadenas del DNA, confinando de esta forma a la

citosina blanco dentro del sitio catalítico. En M.HhaI se ha observado que en ausencia

de DNA o en presencia de DNA no específico, el asa equivalente a la de M.HgiDII se

encuentra dentro del sitio catalítico, pero que en presencia de DNA específico, esta

región sufre un cambio conformacional y se inserta en el DNA [Klimasauskas et al.,

1994; Estabrook & Reich, 2006]; además, se ha visto que este cambio está acoplado a

la traslocación de la citosina [Estabrook & Reich, 2006]. M.HgiDII podría tener el

mismo mecanismo de ajuste inducido, dada la similitud estructural entre ambas

enzimas.

Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM.por estructura secundaria (rojo, hélice color magenta con superficie semitransparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul. y (b) son imágenes rotadas 90PyMOL (http://www.pymol.org).

5.4. Interacciones dentro del sitio catalítico

El análisis de la trayectoria mostró que M.HhiDII

citosina blanco (Fig. 16). Los aminoácidos

y Thr269 (TRD) interactuaron con el oxígeno exocíclico

Arg162 también interactuó con el

hidrógeno estable con el nitr

IV) y Glu116 (motivo VI) hicieron contactos con el nitr

Estas interacciones mantuvieron a la citosina en la orientaci

contactos óptimos con Cys79 y SAM.

sido demostrada en M.HhaI, en la cual la sustitución de Arg165 (equivalente a Arg162

de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilación

et al., 2006]. El papel de Arg160 en la catálisis


37

Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM. La proteína está coloreada ecundaria (rojo, hélice α; amarillo, plegamiento β). SAM está mostrado en

color magenta con superficie semi-transparente. El DNA está mostrado como superficie semitransparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul. y (b) son imágenes rotadas 90o de la misma estructura. Las imágenes fueron generadas con PyMOL (http://www.pymol.org).

Interacciones dentro del sitio catalítico

l análisis de la trayectoria mostró que M.HhiDII establece varios contactos

Los aminoácidos Arg160 (motivo VIII), Arg162 (motivo VIII),

y Thr269 (TRD) interactuaron con el oxígeno exocíclico (O2) de la citosina (

Arg162 también interactuó con el fosfato de la citosina, y formó un puente de

geno estable con el nitrógeno N3 de la citosina. Ala77 (cadena principal; motivo

IV) y Glu116 (motivo VI) hicieron contactos con el nitrógeno exocíclico N4 (

Estas interacciones mantuvieron a la citosina en la orientación apropiada para tener

actos óptimos con Cys79 y SAM. La importancia de este tipo de interacciones


de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilación

. El papel de Arg160 en la catálisis también ha sido demostrado en M.SssI,


La proteína está coloreada á mostrado en

transparente. El DNA está mostrado como superficie semi-transparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul. (a)

de la misma estructura. Las imágenes fueron generadas con

establece varios contactos con la

Arg160 (motivo VIII), Arg162 (motivo VIII),

de la citosina (Tabla 4);

y formó un puente de

Ala77 (cadena principal; motivo

ógeno exocíclico N4 (Tabla 4).

ón apropiada para tener

interacciones ha


de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilación [Shieh

ha sido demostrado en M.SssI,


38

otra C5mC MTasa, en la cual la mutación de Arg230 (equivalente a Arg160 de

M.HgiDII) con alanina afecta la actividad de metilación [Darii et al., 2009].

Tabla 4. Distancias interatómicas relevantes para la actividad catalítica de M.HgiDII.

Par atómico1 Distancia promedio2 (Å)

Arg160 – O2 2.8

Arg162 – O2 3.1

Thr269 – O2 3.1

Arg162 – O1P 3.3

Arg162 – N3 3.1

Ala77 – N4 2.9

Glu116 – N4 2.8

Val118 – C4 5.9

Cys79 – C6 3.5

SAM-CH3 – C5 3.5

1. A excepción de Ala77, todos los aminoácidos contactaron a la citosina blanco a través de sus grupos funcionales.

2. Distancia promedio en un nanosegundo de simulación.

Aunque la valina del motivo VI no está involucrada directamente en la catálisis, su

substitución causa alteraciones en la actividad de metilación [Estabrook et al., 2004;

Darii et al., 2009]. Análisis mutacionales y experimentos de unión a DNA en M.HhaI

han sugerido que este residuo podría ser importante para el ensamble correcto del

sitio catalítico, y que también podría participar en el mecanismo de traslocación de la

base. En el caso de M.HgiDII, Val118 (motivo VI) estuvo posicionada a una distancia

promedio de 5.9 Å de la citosina blanco (carbono C4; Tabla 4), interactuando con la

base a través de interacciones hidrofóbicas.


39

Figura 16. Interacciones en el sitio catalítico de M.HgiDII. El esqueleto de la citosina blanco y del SAM está mostrado en blanco, y los aminoácidos en verde. Los puentes de hidrógeno están mostrados en amarillo; las líneas que conectan Cys79 y C6, y C5 y el grupo metilo del SAM están mostradas en rojo.

El análisis de la trayectoria mostró que además de interactuar con la citosina, Val118

también bloqueó el paso de moléculas de agua desde el sitio de unión a DNA hacia el

sitio catalítico. Este bloqueo crea un ambiente libre de agua en la región donde Cys79

interactúa con C6 (Fig. 17). Por lo tanto, se propone que aparte de su contribución a

orientar la citosina, Val118 podría también participar como una barrera que evita el

paso de moléculas hacia el sitio catalítico, lo que de otra forma podría interferir con la

catálisis.

Figura 17. Canales de agua en el sitio catalítico de M.HgiDIIpresentes en el sitio catalítico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla. Puede apreciarse que Val118 impide el paso de agua al interior del sitio catalítico.

De acuerdo al mecanismo catalítico mostrado en la Fig.

residuo de ácido glutámico (Glu119 en M.HhaI) permite el ataque de la cisteína a C6; el

flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que

grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostró que au

contactó a C6 (Tabla 4), y que el grupo metilo de SAM interactuó con

Glu116 no hizo contactos directos con N3; en vez de ello, interactuó con N4 y el grupo

amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podrían no s

para la actividad catalítica de

citosina (Fig. 16) podría compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha

propuesto que las interacciones con O2 pueden desequilibrar la densidad

anillo de citosina y, por tanto,

et al., 1995; Kumar et al., 1997

la presencia de interacciones entre O2, Arg160 y Arg16

proceso catalítico es la interacción de moléculas de agua con N3.


40

. Canales de agua en el sitio catalítico de M.HgiDII. Las moléculas de agua tes en el sitio catalítico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla.

Puede apreciarse que Val118 impide el paso de agua al interior del sitio catalítico.

De acuerdo al mecanismo catalítico mostrado en la Fig. 6, la protonación de N3 por


flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que

grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostró que au

), y que el grupo metilo de SAM interactuó con


amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podrían no s

actividad catalítica de M.HgiDII, y la gran cantidad de contactos en O2 de la

) podría compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha

propuesto que las interacciones con O2 pueden desequilibrar la densidad electrónica en el

, permitir el ataque en C6 por el residuo de cisteína

1997]. Este mecanismo parece plausible para M.HgiDII debido a

la presencia de interacciones entre O2, Arg160 y Arg162. Otro factor que puede auxiliar

es la interacción de moléculas de agua con N3. Durante la simulación, N3


Las moléculas de agua tes en el sitio catalítico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla.

Puede apreciarse que Val118 impide el paso de agua al interior del sitio catalítico.

, la protonación de N3 por un


flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que éste ataque al

grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostró que aunque Cys79

), y que el grupo metilo de SAM interactuó con C5 (Tabla 4),


amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podrían no ser necesarias

, y la gran cantidad de contactos en O2 de la

) podría compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha

electrónica en el

permitir el ataque en C6 por el residuo de cisteína [Gabbara

. Este mecanismo parece plausible para M.HgiDII debido a

2. Otro factor que puede auxiliar al

Durante la simulación, N3


41

estuvo contactado por moléculas de agua provenientes de uno de los canales presentes en el

sitio catalítico (Fig. 17). La participación de moléculas de agua en la activación de N3 ha

sido propuesta en un estudio de dinámica molecular en M.HhaI [Lau & Bruice, 1999];

también se ha demostrado que una molécula de agua es responsable de la activación en N3

en una mutante parcialmente activa de M.HhaI (Glu119Ala) [Shieh & Reich, 2007].

Tomando en cuenta lo anterior, el mecanismo de acción de M.HgiDII diferiría del de

M.HhaI en el paso de activación de la citosina (Fig. 18). Las interacciones en O2 serían

predominantes para la activación del anillo de citosina, y la participación de moléculas de

agua en ayudaría al proceso de activación. A pesar de que Glu116 no participa directamente

en el proceso catalítico, aun resulta indispensable para la catálisis debido a que orienta y

estabiliza la citosina blanco y el SAM.

Figura 18. Mecanismo de acción de M.HgiDII. La numeración atómica se muestra en el esquema (d). (a) Activación del anillo de citosina por interacciones entre O2, y Arg160 y Arg162 facilitan el ataque nucleofílico en C6 por Cys81. (b) Flujo de electrones hacia el anillo de pirimidina activa el C5, el cual ataca al grupo metilo del SAM. (c) Un anión hidróxido del agua deprotona la posición C5, causando el rompimiento del enlace covalente entre Cys81 y la citosina. (d) Los productos finales de la reacción: C5mC, y S-adenosil metionina.

El paso final en el proceso de metilación es la liberación de la citosina catalizada por

deprotonación en C5. Simulaciones de dinámica molecular de M.HhaI han mostrado

que un canal de agua en el sitio catalítico provee moléculas de hidróxido del solvente

que pueden deprotonar C5 [Zhang & Bruice, 2006; Lau & Bruice, 1999]. Sugerimos

que el mismo mecanismo toma lugar en M.HgiDII, la cual también mostró un canal de

agua que alcanzó el C5 de la citosina (Fig. 17).

N

N

NH2

O

DNA S-

Cys81

SCys81

N

NH

NH2

O

DNA

Ade

S+

R

CH3

SCys81

N

N C

NH2

O

DNA

CH3

H OH-

N1

N32

4

5

6

NH2

O

DNA

CH3

S-

Cys81

Ade

S

R Ade

S

R

(a) (b) (c) (d)

H2O?H2O?

Arg160

Arg162

Arg160

Arg162

Arg160

Arg162Arg160

Arg162


42

M.HgiDII interactuó con SAM orientándolo para que interactuara de manera correcta

con la citosina blanco. La parte de adenina estuvo bordeando el canal de agua en el

sitio catalítico; el nitrógeno N6 de SAM interactuó con Ser52 (motivo III), N1 con Ile53

(cadena principal; motivo III), y los hidroxilos de la ribosa con Asp31 (motivo II) (Fig.

16). Adicionalmente, el anillo de purina tuvo interacciones hidrofóbicas con Phe9

(motivo I). La parte de metionina estuvo en un área inaccesible al solvente, y se

mantuvo firmemente unida al sitio catalítico mediante interacciones con sus grupos

amino y carboxilo; el grupo amino de SAM interactuó con Glu116, mientras que el

grupo carboxilo interactuó con las cadenas principales de aminoácidos del motivo I

(Cys10, Gly13, Gly14, Leu15), y del motivo X (Val325).

A pesar de que los análisis mostrados en este trabajo son de tipo teórico, existe una

gran cantidad de evidencia experimental y teórica que apoya el mecanismo catalítico

propuesto para M.HgiDII. La existencia del complejo covalente entre M.HhaI y el DNA

(análogo al intermediario (b) mostrado en la figura 18) ha sido demostrada mediante

análisis de derivados fluorados en la posición C5 de la citosina blanco [Klimasauskas

et al., 1994; Reinisch, 1995]. La relevancia de las interacciones entre residuos de

arginina y el O2 de la citosina ha sido demostrada mediante análisis mutacionales en

M.HhaI [Shieh et al., 2006] y mediante el empleo de inhibidores análogos de la citosina

[Kumar et al., 1997]. Por último, la participación de moléculas de agua en la activación

de N3 ha sido propuesta gracias al análisis estructural de mutantes parcialmente

activas de M.HhaI [Shieh & Reich, 2007].

5.5. Interacciones con la secuencia blanco

M.HgiDII interactuó con todas las bases de la secuencia de reconocimiento,

estableciendo contactos tanto con el esqueleto del DNA como con las nucleobases (Fig.

19). Casi todos los contactos con el DNA fueron establecidos a través del surco

principal, el cual estuvo localizado en la interface proteína-DNA (Fig. 15); un asa

(aminoácidos 225 – 246) interactuó con el surco menor varias bases río abajo de la

secuencia blanco (Fig. 15); estas interacciones fuera de la secuencia de

reconocimiento probablemente no contribuyan a la especific

útiles para estabilizar la unión con el DNA. Los aminoácidos del asa 80

interactuaron a través del surco menor, principalmente con el esqueleto del DNA;

Tyr85, sin embargo, estableció contactos directos con la guanina huérfana. E

primer reporte que indica un papel de esta asa en el reconocimiento específico del

DNA, por lo que se requieren estudios adicionales para esclarecer el papel de Tyr85

en este proceso. En M.HhaI, el asa equivalente

MTasa se une a su DNA espec

Figura 19. Interacciones con la secuencia blancodiferentes a la citosina blanco. La secuencia de reconocimiento (con la excepción de la citosina blanco, que está en negro. Los contactos polares se muestran como sigue: Interacciones directas mediadas por grupos fcontinuas; interacciones directas mediadas por cadendiscontinuas; los contactos van der Waals se muestran como flechas continuas grises; los círculos con W interna representan contactos mediados por agua; catión-π.


43

reconocimiento probablemente no contribuyan a la especificidad, aunque pueden ser

útiles para estabilizar la unión con el DNA. Los aminoácidos del asa 80


Tyr85, sin embargo, estableció contactos directos con la guanina huérfana. E



En M.HhaI, el asa equivalente se mueve hacia el DNA solo cuand

MTasa se une a su DNA específico [Estabrook et al., 2009; Zhou et al., 2009

. Interacciones con la secuencia blanco. Solo se muestran interacciones con bases diferentes a la citosina blanco. La secuencia de reconocimiento (GTCGAC) se muestra en gris, con la excepción de la citosina blanco, que está en negro. Los contactos polares se muestran como sigue: Interacciones directas mediadas por grupos funcionales, flechas negras continuas; interacciones directas mediadas por cadenas principales, flechas negras discontinuas; los contactos van der Waals se muestran como flechas continuas grises; los círculos con W interna representan contactos mediados por agua; π representa interacciones


idad, aunque pueden ser

útiles para estabilizar la unión con el DNA. Los aminoácidos del asa 80–88


Tyr85, sin embargo, estableció contactos directos con la guanina huérfana. Este es el



se mueve hacia el DNA solo cuando la

2009].

Solo se muestran interacciones con bases GTCGAC) se muestra en gris,

con la excepción de la citosina blanco, que está en negro. Los contactos polares se muestran ncionales, flechas negras

as principales, flechas negras discontinuas; los contactos van der Waals se muestran como flechas continuas grises; los

representa interacciones

El motivo TL de M.HgiDII está form

Thr267 interactuó con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig.

20). De manera similar a la treonina del motivo TL

este aminoácido puede ser importan

adecuadamente la citosina blanco dentro del sitio catalítico de M.HgiDII.

20 puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el

interior de la proteína, y por lo tanto no

motivo TL, en el que la treonina contacta al DNA y el aminoácido hidrofóbico se

inserta en la proteína también se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251)

grupo hidrofóbico podría dar estabilidad estruc

interacción del residuo de treonina con el DNA.

Figura 20. Motivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaIestructura de M.HgiDII; en medio se muestra la estructura de M.HaeIII; y muestra la estructura de M.HhaI. en color verde, los de M.HaeIII en el DNA en la estructura de M.HgiDII

Los aminoácidos localizados

interactuaron con las tres bases de la parte derecha del sitio de reconocimiento (GTC,

o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras q

aminoácidos localizados en el extremo amino terminal de Thr267 interactuaron con el

resto de las bases (Fig. 19

aminoácidos a ambos lados del motivo TL ha sido identificada en varias MTasas de


44

El motivo TL de M.HgiDII está formado por Thr267 e Ile268. Durante la simulación,

Thr267 interactuó con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig.

a la treonina del motivo TL en M.HhaI [Vilkaitis

este aminoácido puede ser importante para sujetar la cadena de DNA y

la citosina blanco dentro del sitio catalítico de M.HgiDII.

puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el

interior de la proteína, y por lo tanto no interactúa con el DNA. Esta disposición del


inserta en la proteína también se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251)

grupo hidrofóbico podría dar estabilidad estructural a la proteína, permitiendo así la

interacción del residuo de treonina con el DNA.

otivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaI. El panel izquierdo muestra la estructura de M.HgiDII; en medio se muestra la estructura de M.HaeIII; y a la derecha se

ctura de M.HhaI. Los aminoácidos del motivo TL de M.HgiDII están mostrados en color verde, los de M.HaeIII en gris, y los de M.HhaI en amarillo. El contacto entre Thr267 y

en la estructura de M.HgiDII está representado por una línea discontinua.

Los aminoácidos localizados hacia el extremo carboxilo terminal de Thr267


o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras q


19). Esta distribución de interacciones que involucra



Durante la simulación,

Thr267 interactuó con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig. 16 y

Vilkaitis et al., 2000],

sujetar la cadena de DNA y posicionar

la citosina blanco dentro del sitio catalítico de M.HgiDII. En la figura

puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el

. Esta disposición del


inserta en la proteína también se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251). El

tural a la proteína, permitiendo así la

El panel izquierdo muestra la a la derecha se

M.HgiDII están mostrados . El contacto entre Thr267 y

o por una línea discontinua.

carboxilo terminal de Thr267


o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras que los


). Esta distribución de interacciones que involucra



45

citosina [Vilkaitis et al., 2000; Lauster et al., 1989], y como se discute más adelante, es

una región importante para definir la especificidad en este grupo de enzimas.

Los aminoácidos Arg258 y Arg279 participaron en interacciones catión-π con dos

guaninas en la secuencia de reconocimiento (Fig. 19). Las interacciones catión-π se

establecen entre un anillo aromático (nucleobase) y una carga positiva (p. ej. el grupo

guanidinio de la arginina) orientada de forma perpendicular al anillo aromático.

Aunque los residuos de arginina también pueden establecer interacciones catión-π

con las otras nucleobases del DNA, tienen preferencia por guaninas [Wintjens et al.,

2000], por lo que este tipo de interacciones pueden ser relevantes para el

reconocimiento específico del DNA. Se ha demostrado que un residuo de arginina en el

TRD de M.HhaI (Arg240) es esencial para la discriminación de la secuencia, cambio

conformacional y catálisis [Estabrook et al., 2009], por lo que se requiere de estudios

adicionales para establecer si Arg258 o Arg279 en M.HgiDII tienen funciones similares

como en M.HhaI.

Las moléculas de agua jugaron un papel importante en las interacciones con el DNA.

De hecho, varios de los contactos específicos con las nucleobases fueron puentes de

hidrógeno mediados por agua (Fig. 19). Una red de moléculas de agua en la interface

DNA-proteína contribuye a estabilizar la interacción DNA-proteína mediante la

eliminación de repulsiones electrostáticas entre las dos macromoléculas [Reddy et al.,

2001]. Adicionalmente, las moléculas de agua pueden actuar como una extensión de

los grupos funcionales de los aminoácidos para que estos puedan alcanzar

nucleobases que de otra forma serían inaccesibles debido a restricciones

conformacionales, o permitir interacciones entre dos átomos aceptores o donadores al

eliminar interacciones electrostáticas desfavorables [Reddy et al., 2001]. Las

interacciones mediadas por agua han sido descritas en varias proteínas de unión a

DNA, y son un mecanismo común en el reconocimiento específico del DNA [Reddy et

al., 2001; Rhodes et al., 1996].


46

5.6. Aminoácidos conservados en el TRD de MTasas relacionadas a M.HgiDII

Para estudiar la relevancia de los aminoácidos que realizaron interacciones

específicas con el DNA, se realizaron alineamientos con del TRD de M.HgiDII con

MTasas similares obtenidas de la base de datos REBASE. Todas las MTasas eran

enzimas putativas, y 20 de ellas tenían una secuencia de reconocimiento asignada por

la REBASE idéntica a la de M.HgiDII; la asignación de especificidad que hace REBASE

está basada en la similitud del TRD con enzimas caracterizadas experimentalmente.

El alineamiento múltiple (Fig. 21) mostró el siguiente motivo altamente conservado:

Cx5Gx6Y(GA)R(MLI)x7T(IML)TTx5-6GxGR(FY)xH, el cual incluye al motivo TL

(subrayado), y todos los aminoácidos del TRD que interactuaron con el DNA. Este

resultado refuerza la importancia de esta región en el reconocimiento específico del

DNA, y podría ser de utilidad para predecir la especificidad de nuevas MTasas.

Figura 21. Alineamiento multiple del TRD de M.HgiDII y MTasas relacionadas. Las secuencias asignadas de acuerdo a la REBASE se muestran después del nombre de la MTasa. El sombreado representa 100% identidad (fondo negro), o cambios altamente conservativos (fondo gris). Los aminoácidos que interactuaron con el DNA se marcan con triángulos negros. El motivo TL se muestra sobre el alineamiento.

Motivo TL

M.Sci3XORFEP GTCGAC LLDCYKKPSGATYTSVYGRIKRTDVAPTLTTQF-TRYGTGRYGHYE

M.BloAORF1145P GTCGAC LLECQKKTTGSTFKSFYGRMEWDKPSPTITTQS-YNPGTGRFTHPE

M.LweSORF291P GTCGAC LPNCYKRKSGESYKSVYGRLEWDKPSSTITTQF-VGYGNGRFGHPE

M.LmoAP GTCGAC LPNCYKRKSGESYKSVYGRLEWDKPSSTITTQFVVGYGNGRFGHPE

M.Kpn342ORF3378P GTCGAC RAECHKKDSGMTYKSVYGRMIWDDTSPTITTQC-YGYGNGRFGHPE

M.XfaTORF577P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE

M.XfaM23ORF606P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE

M.XfaOORFC725P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE

M.RpaHORF2193P GTCGAC RVACHKTGSGKTYPSVYGRMSWDKPSPTITTQF-YGFGNGRFGHPE

M.PnaORF4973P GTCGAC VAECHRKASGRHSAGVYGRMEWDKPAPTMTTLC-IGYGNGRFGHPQ

M.HauORF528P GTCGAC IAECHKKESGESYGSVYGRMEWDKVAPTITTQC-NGYGNGRFGHPE

M.VspLGPORF1649P GTCGAC RAKCHTKDSGKGYASVYGRMSWNEPSPTMTTQC-YGFGNGRFGHPS

M.SfuMORF3845P GTCGAC VADCHKKSSGKTYPSVYGRMTWDDPAPTMTTQF-FGFGNGRFGHPE

M.PpuWORF680P GTCGAC RAPCHRKSSGKTYPSVYGRMRHDEPGPTMTTLC-YGFGNGRFGHYD

M.MspELB17ORFEP GTCGAC MAECHRKATGKTYVSVYARMSWDKVSPTITTQS-YGFGNGRFGHPD

M.Nme53442ORF1094P GTCGAC RAACHRKKKGQSYKRIYGRMEWDKPAPTMTTLC-IGFGNGRFGHPE

M.Mca43617ORFAP GTCGAC VAECHKKSSGKTYGSVYGRMSWDKPAPTMTTLC-TGYGNGRFGHPE

M.TerORF4678P GTCGAC IAKCHTKSSGKSYPSVYGRMEWDSPSPTITTQC-FGFGNGRFGHPE

M.EsaSS113P GTCGAC VADCHKSKSGKTYASVYGRMEWDKPAPTMTTQC-FGFGNGRFGHPE

M.KpnMORF4707P VADCHRTDKGKTYSSVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE

M.VeiORF1175P GTCGAC VAECHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE

M.Bps1106ORF3681P IAECHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE

M.AspJSORF2196P VADCHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE

M.HgiDII GTCGAC 240 IAECHKKESGESYGSVYGRMEWDKVAPTITTQC-NGYGNGRFGHPE 285

▲▲ ▲▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲▲ ▲▲ ▲


47

La utilidad de la región que rodea al motivo TL para predecir la especificidad ha sido

descrita para MTasas con secuencias de reconocimiento de 4 pb [Neely & Roberts,

2008]. Sin embargo, esto no ha sido posible en el caso de MTasas con secuencias de

reconocimiento más largas (6 pb) debido a que se han encontrado MTasas con

secuencias de reconocimiento totalmente diferentes pero que presentan alta similitud

en la región que rodea al motivo TL [Neely & Roberts, 2008]. Nuestro análisis de

interacciones entre M.HgiDII y los alineamientos con MTasas relacionadas sugiere que

un motivo más largo podría predecir mejor la especificidad en este tipo de MTasas;

adicionalmente, el hallazgo de que el asa 80 – 88 podría hacer contactos específicos

con el DNA indica que esta región también podría tomarse en cuenta para predecir la

especificidad en nuevas MTasas.


48

66666666........ CCCCCCCCOOOOOOOONNNNNNNNCCCCCCCCLLLLLLLLUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIOOOOOOOONNNNNNNNEEEEEEEESSSSSSSS


49

� La estrategia que se siguió en el procedimiento de modelamiento por

homología permitió obtener un modelo confiable de M.HgiDII en complejo con

SAM y DNA (Fig. 14).

� Se determinó que M.HgiDII metila la citosina interna de su sitio de

reconocimiento (GTCGAC).

� El análisis de las trayectorias sugirió que las interacciones entre el O2 de la

citosina y las interacciones mediadas por agua en N3 podrían ser relevantes

para la catálisis en M.HgiDII.

� Se halló un canal de agua en el sitio catalítico de M.HgiDII, lo que apoya la

hipótesis de la participación de moléculas de agua en el mecanismo catalítico

de esta enzima.

� Adicionalmente, se describió una nueva función para Val118 en la catálisis de

la metilación como barrera del solvente hacia el sitio catalítico.

� Se describió por primera vez que aminoácidos del sitio catalítico pueden

participar activamente en el reconocimiento activo del DNA.

� El hallazgo de aminoácidos del domino catalítico de M.HgiDII que interactúan

específicamente con la secuencia blanco, y de la identificación de regiones del

TRD que son altamente conservadas en las MTasas relacionadas a M.HgiDII,

contribuirán a entender mejor el mecanismo del reconocimiento específico del

DNA, y permitirán el diseño y refinamiento de algoritmos dirigidos a predecir

especificidades en nuevas MTasas.


50

77777777........ GGGGGGGGLLLLLLLLOOOOOOOOSSSSSSSSAAAAAAAARRRRRRRRIIIIIIIIOOOOOOOO DDDDDDDDEEEEEEEE TTTTTTTTÉÉÉÉÉÉÉÉRRRRRRRRMMMMMMMMIIIIIIIINNNNNNNNOOOOOOOOSSSSSSSS


51

Ambiente no local de un aminoácido. Todos los átomos diferentes del hidrógeno en un radio de 7 Å que pertenecen a aminoácidos alejados 11 residuos en la misma cadena, o que pertenezcan a otra cadena proteica. En la siguiente dirección electrónica se puede ver un esquema: http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/anolea/environment.html

Campo de fuerza. Conjunto de funciones y parámetros que describen los potenciales energéticos en un sistema de átomos.

Canal de agua. Túnel o conducto en la estructura de una proteína que permite la entrada de moléculas de agua al interior de la proteína.

Conformación nativa. Conformación en la cual una molécula tiene su actividad biológica intacta.

Dominio tipo Rossmann. Dominio estructural característico de proteínas que unen nucleótidos. Se compone de dos o tres plegamientos β unidos por dos hélices α.

Enzima putativa. Proteína con supuesta actividad enzimática pero que no ha sido comprobada experimentalmente.

Epigenética. Estudio de los factores heredables, independientes de la secuencia genética, que afectan la expresión genética. Algunos factores epigenéticos son la metilación del DNA o la metilación de las histonas.

Espectro conformacional. Conjunto de conformaciones de una proteína, que van desde la forma desnaturalizada hasta la conformación nativa.

Minimización por gradiente conjugado. Método de obtención de la conformación con la menor energía local.

Minimización. Proceso de obtención de la conformación con la menor energía potencial.

Modelaje por homología. Procedimiento para la obtención de la estructura de una proteína a partir de moldes caracterizados estructuralmente mediante el análisis de alineamientos de secuencias.

Motivo. Secuencia corta de aminoácidos que se encuentra altamente conservada en algún grupo particular de proteínas.

Restricción armónica. Método para restringir parcialmente el movimiento de los átomos en un sistema de simulación de dinámica molecular.


52

Secuencia palindrómica. Segmento de DNA que presenta la misma secuencia en ambas cadenas cuando se lee del extremo 5’al 3’. Por ejemplo, la secuencia GTCGAC es palindrómica porque su secuencia complementaria también es GTCGAC.

Simulación de la dinámica molecular. Predicción computacional del comportamiento de los átomos bajo leyes físicas de atracción y repulsión en condiciones específicas de reacción (temperatura, presión, volumen) por un tiempo finito.

Sistema de cómputo en racimo. Arreglo de computadoras o procesadores conectados a través de redes de alta velocidad que trabajan en conjunto para resolver operaciones lógicas o matemáticas de manera altamente eficiente.

TIP3P. Modelo simplificado de la molécula de agua en el cual se definen tres puntos de interacción molecular, los cuales corresponden a los átomos que conforman la molécula del agua. La simplicidad de este modelo permite su uso en simulaciones de dinámica molecular.

Trayectoria. Conjunto de coordenadas que definen las posiciones de los átomos durante la simulación de la dinámica molecular.


53

88888888........ BBBBBBBBIIIIIIIIBBBBBBBBLLLLLLLLIIIIIIIIOOOOOOOOGGGGGGGGRRRRRRRRAAAAAAAAFFFFFFFFÍÍÍÍÍÍÍÍAAAAAAAA


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