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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Escuela de Formación Profesional de Ciencias Biológicas

“SCREENING FITOQUÍMICO Y ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO

ETANÓLICO DE CUATRO PLANTAS MEDICINALES, IQUITOS-PERÚ”.

Requisito para optar el título profesional de

BIÓLOGO

AUTORES:

David Martin Ruiz Ruiz

Bryan Jordy Arévalo Rodríguez

IQUITOS – PERÚ

2018

TESIS

ii

JURADO CALIFICADOR Y DICTAMINADOR

iii

ASESOR

iv

v

DEDICATORIA

A todos los futuros tesistas que deseen realizar

investigaciones sobre screening fitoquímico y actividad

antibacteriana de diferentes extracto de plantas medicinales

mediante pruebas bioquímicas, para que les sirva como una

línea de información, y posteriormente sea aplicada en otros

trabajos dentro de las políticas de salud pública que posee el

Estado orientados a tomar medidas de prevención y

tratamiento de las mismas.

vi

AGRADECIMIENTO

Al Blgo. Freddy Orlando Espinoza Campos Mgr., nuestro asesor por el apoyo

incondicional en la elaboración de nuestra tesis.

Al Dr. José Aranda, Director encargado del Instituto de Medicina Tradicional (IMET),

por abrirnos las puertas para realizar nuestra tesis profesional.

Al Ing. Jorge Villacrez, jefe encargado del Instituto de Medicina Tradicional (IMET),

por permitirnos realizar las pruebas bioquímicas en el laboratorio de Microbiología

y Farmacología.

Al Químico farmacéutico William Vigo, jefe responsable del laboratorio de

Farmacología, por autorizar la utilización de materiales bioquímicos, y el

desenvolvimiento de nuestra tesis.

A los trabajadores del IMET por prestar su ayuda en la recolección de las plantas

medicinales.

vii

ÍNDICE

JURADO CALIFICADOR Y DICTAMINADOR………………………………………….…………………. ii

ASESOR……………………………………………………………………………………………………..……..…… iii

ACTA DE SUSTENTACIÓN DE TESIS N° 035..………………………………….………………..……. iv

DEDICATORIA……………………………………………………………………………………………………….. vi

AGRADECIMIENTO………………………………………………………………………………………………. vii

ÍNDICE……………………………………………………………………………………………….………………… viii

I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1

II. OBJETIVOS ................................................................................................. 3

2.1. Objetivo general ............................................................................................ 3

2.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 3

III. REVISIÓN DE LITERATURA .......................................................................... 4

3.1. Aspectos generales de Opuntia ficus indica “tuna” ..................................... 4

3.1.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 4

3.1.2. Datos ambientales ................................................................................. 4

3.1.3. Descripción botánica ............................................................................. 5

3.1.4. Usos ........................................................................................................ 5

3.2. Aspectos generales de Erythrina fusca “amasisa” ....................................... 7

3.2.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 7

3.2.2. Datos ambientales ................................................................................. 7

3.2.3. Descripción botánica ............................................................................. 9

3.2.4. Usos ........................................................................................................ 9

3.3. Aspectos generales de Cassia reticulata "retama” .................................... 10

3.3.1. Clasificación taxonómica ..................................................................... 10

3.3.2. Datos ambientales ............................................................................... 11

3.3.3. Descripción botánica ........................................................................... 12

3.3.4. Usos ...................................................................................................... 13

viii

3.4. Aspectos generales de Physalis angulata "bolsa mullaca" ........................ 13

3.4.1. Clasificación taxonómica ..................................................................... 13

3.4.2. Datos ambientales ............................................................................... 14

3.4.3. Descripción botánica ........................................................................... 14

3.4.4. Usos ...................................................................................................... 15

IV. MATERIALES Y MÉTODOS. ........................................................................ 16

4.1. Descripción del área de estudio. ................................................................. 16

4.2. Procedimientos ........................................................................................... 16

4.2.1. Tamizaje fitoquímico ........................................................................... 16

4.2.1.1. Identificación de alcaloides .......................................................... 18

4.2.1.2. Identificación de triterpenos y esteroides ................................... 19

4.2.1.3. Identificación de quinonas ........................................................... 19

4.2.1.4. Identificación de cumarinas ......................................................... 20

4.2.1.5. Identificación de azúcares reductores ......................................... 21

4.2.1.6. Identificación de saponinas .......................................................... 21

4.2.1.7. Identificación de fenoles y taninos ............................................... 21

4.2.1.8. Identificación de aminoácidos y aminas ...................................... 22

4.2.1.9. Identificación de glicósidos cardiotónicos.................................... 22

4.2.1.10. Identificación de flavonoides....................................................... 23

4.2.1.11. Identificación de mucílagos ......................................................... 23

4.2.1.12. Identificación de principios amargos - astringentes ................... 23

4.2.2. Elaboración del extracto ...................................................................... 24

4.2.2.1. Preparación de pulverizado .......................................................... 24

4.2.2.2. Preparación del extracto etanólico .............................................. 24

4.2.3. Antibiograma ....................................................................................... 25

4.2.3.1. Preparación de las concentraciones ............................................. 25

4.2.3.2. Preparación de los discos de sensibilidad .................................... 25

4.2.3.3. Prueba de sensibilidad.................................................................. 26

4.2.4. Procesamiento de la información. ....................................................... 27

V. RESULTADOS ........................................................................................... 28

5.1. Screening fitoquímico ................................................................................. 28

5.2. Determinación de la humedad ................................................................... 31

5.3. Determinación del rendimiento de extracto .............................................. 32

5.4. Antibiograma ............................................................................................... 34

ix

5.5. Prueba de la normalidad ............................................................................. 36

5.6. Prueba t de Student para muestras relacionadas ....................................... 36

5.7. Análisis factorial de la varianza mixto ......................................................... 37

VI. DISCUSIÓN ............................................................................................... 39

VII. CONCLUSIONES ........................................................................................ 46

VIII. RECOMENDACIONES ................................................................................ 47

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ................................................................ 48

X. ANEXO ..................................................................................................... 54

x

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna”, Cassia reticulata

“retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata “bolsa mullaca” ....... 30

Cuadro 2. Porcentaje de humedad .......................................................................... 31

Cuadro 3. Determinación del rendimiento del extracto Opuntia ficus indica “tuna”,

Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata

“bolsa mullaca” ................................................................................................. 33

Cuadro 4. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos .................................. 34

Cuadro 5. Análisis de la prueba de la normalidad ................................................... 36

Cuadro 6. Análisis de prueba t de Student de muestras relacionadas .................... 37

Cuadro 7. Análisis factorial de la varianza mixto (un factor inter y un factor intra) 38

xi

LISTA DE GRÁFICOS

Grafico 1. Porcentaje de humedad .......................................................................... 32

Gráfico 2. Rendimiento de los extractos. ................................................................ 33

Gráfico 3. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en disco de 500 mg/ml, 400

mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp. ............................................... 35

Gráfico 4. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en disco de 500 mg/ml, 400

mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp. ............................................... 35

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Antibiograma de Escherichia coli ATCC 35218 frente a extracto etanólico

de Opuntia ficus indica “tuna”” .................................................................. 71

Figura 2. Antibiograma de Escherichia coli O157-H7 frente a extracto etanólico de

Opuntia ficus indica “tuna” ......................................................................... 71

Figura 3. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC 51299 frente a extracto

etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” .................................................... 71

Figura 4. Antibiograma de Pseudomonas sp. frente a extracto etanólico de Opuntia

ficus indica “tuna” ....................................................................................... 71

Figura 5. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de Opuntia

ficus indica “tuna” ....................................................................................... 71


de Physalis angulata “bolsa mullaca” ......................................................... 72


Physalis angulata “bolsa mullaca”. ............................................................. 72


etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca” ......................................... 72

Figura 10. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de

Physalis angulata “bolsa mullaca” .............................................................. 72


de Erythrina fusca “amasisa” ...................................................................... 73

xiii


Erythrina fusca “amasisa” ........................................................................... 73


etanólico de Erythrina fusca “amasisa” ...................................................... 73

Figura 15. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de

Erythrina fusca “amasisa” ........................................................................... 73


de Cassia reticulata “retama” ..................................................................... 74


Cassia reticulata “retama” .......................................................................... 74


etanólico de Cassia reticulata “retama” ..................................................... 74

Figura 19. Antibiograma de Pseudomonas sp. frente a extracto etanólico de Cassia

reticulata “retama” ..................................................................................... 74

Figura 20. Antibiograma de Salmonella typhi frente a extracto etanólico de Cassia

reticulata “retama” ..................................................................................... 74

xiv

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Mapa de ubicación del laboratorio donde se realizaron los ensayos

microbiológicos y fitoquímicos (Ciudad de Iquitos)…………………………………………….. 54

Anexo 2. Esquema de tamizaje fitoquímico………………………………………………………… 55

Anexo 3. Identificación de alcaloides………………………………………………………………….. 56

Anexo 4. Identificación de triterpenos y esteroides (ensayo de Liberman –

Burchard)……………………………………………………………………………………………………………. 56

Anexo 5. Identificación de quinonas (ensayo de Borntrager)……………………………….57

Anexo 6. Identificación de cumarinas (ensayo de Baljet)……………………………………..57

Anexo 7. Identificación de azúcares reductores (ensayo de Fehling)…………………… 57

Anexo 8. Identificación de saponinas (ensayo de la espuma)……………………………… 57

Anexo 9. Identificación de fenoles y taninos (ensayo de cloruro férrico)……………..58

Anexo 10. Identificación de aminoácidos y aminas (ensayo de ninhidrina)…………. 58

Anexo 11. Identificación de glicósidos cardiotónicos (ensayo de Kedde)……………..59

Anexo 12. Identificación de flavonoides (ensayo de Shinoda)…………………………….. 59

Anexo 13. Identificación de mucílago…………………………………………………………………. 60

Anexo 14. Identificación de principios amargos – astrigentes…………………………….. 60

Anexo 15. Preparación de las concentraciones…………………………………………………… 61

Anexo 16. Preparación de los discos de sensibilidad…………………………………………… 61

Anexo 17. Prueba de sensibilidad……………………………………………………………………….. 62

Anexo 18. Proceso de preparación de extractos…………………………………………………. 62

Anexo 19. Definición de términos básicos…………………………………………………………… 63

xv

Anexo 20. Screenig fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna” loretana……………..67

Anexo 21. Screenig fitoquímico Cassia reticulata “retama”………………………………… 68

Anexo 22. Screenig fitoquímico Physalis angulata “bolsa mullaca”……………………. 69

Anexo 23. Screenig fitoquímico Erythrina fusca “amasisa”………………………………… 70

Anexo 24. Antibiograma.......................................................................................... 71

Anexo 25. Datos etnobotánicos de las plantas investigadas................................... 75

Anexo 26. Antimicrobiana por el método de disco difusión-INS............................. 75

xvi

RESUMEN

Se investigó la actividad antibacteriana in vitro de los extractos etanólico, y

se realizó el análisis fitoquímico de sus extractos etanólico, hexánico y acuoso de

cuatro plantas del nor-oriente peruano: Opuntia ficus indica (penca), Erythrina

fusca (corteza), Cassia reticulata (fruto), y Physallis angulata (planta entera). Las

especies fueron recolectadas en el departamento de Loreto. La actividad

antibacteriana se evaluó mediante el método de difusión en agar; las bacterias

patógenas utilizadas fueron Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7,

Enterococcus faecalis ATCC 51299, Pseudomonas sp., y Salmonella typhi. La

composición fitoquímica de las plantas investigadas que reveló la presencia de

compuestos fenólicos, taninos, saponinas, aminoácidos-aminas, cumarinas-

lactonas, y azúcares reductores. De los extractos investigados, sólo Physallis

angulata presentó actividad antibacteriana específica contra Pseudomonas sp.,

con halo promedio de 8mm. La prueba de la normal obtuvo un nivel de

significancia de 0,087, lo cual demuestra que no hubo diferencias significativas

entre los extractos respecto al antibiograma.

Palabras claves: Screening fitoquímico, actividad antibacteriana, plantas

medicinales.

1

I. INTRODUCCIÓN

Los antibióticos son una de las herramientas más utilizadas para controlar las

infecciones (1). El abuso de antibiótico debido a las reinfecciones puede ocasionar

resistencia bacteriana (2). Actualmente se ha producido un aumento alarmante en la

incidencia de enfermedades infecciosas resistentes a múltiples fármacos, siendo

necesario la búsqueda de nuevas sustancias antimicrobianas de otras fuentes, como

las plantas (3). Desde tiempos inmemoriales se han utilizado las plantas para el

tratamiento de diversas enfermedades (4). Se conoce muy poco, sobre el uso

tradicional de plantas en medicina (5).

El conocimiento de las propiedades medicinales de las plantas deben

contribuir a resolver, en parte, los problemas de salud de la población menos

favorecida y cuyas posibilidades de curarse son limitadas por el alto costo de los

fármacos (5). En el Perú, como en otros países en vías de desarrollo, las plantas

medicinales representan aún la principal herramienta terapéutica en medicina

tradicional. La flora peruana ofrece grandes posibilidades para el descubrimiento de

nuevos compuestos (6).

Las poblaciones de nuestros países se amparan cada vez más en el uso de la

gran variedad de plantas con propiedades medicinales, complementando o

solucionando sus problemas de salud (7). En respuesta a la necesidad de conseguir

alternativas eficaces para el control de las infecciones bacterianas, se ha recurrido a

la fitoquímica y fitofarmacología, logrando encontrar nuevas moléculas (8). De esta

1

2

forma se determinó que plantas como de Schinus molle “molle” y Silybum

marianum “cardo” (11) poseen actividad antibacteriana y potencian la acción de

sustancias antimicrobianas (10; 11; 12; 13).

En nuestro país el estudio de las plantas medicinales se viene desarrollando

de manera lenta. Se considera que existen grandes vacíos de información en el

estudio de las propiedades antimicrobianas de las plantas medicinales de nuestra

región; y que el abuso de antibióticos durante décadas ha ocasionado resistencia

bacteriana, los cuales han llevado a la necesidad de conseguir nuevos compuestos

antimicrobianos. En este contexto, la presente investigación determinó el screening

fitoquímico y actividad antibacteriana del extracto etanólico de cuatro plantas

medicinales, con la finalidad de encontrar nuevos compuestos antimicrobianos que

ayuden a tratar enfermedades bacterianas resistentes a antibióticos convencionales

y, que a partir de estos nuevos compuestos, se produzcan medicamentos

tradicionales de bajo costo y de fácil acceso a la población amazónica.

3

II. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Conocer los componentes fitoquímicos y actividad antibacteriana del

extracto etanólico de cuatro plantas medicinales.

2.2. Objetivos específicos

Determinar la composición fitoquímica de Opuntia ficus indica "tuna",

Erythrina fusca “amasisa”, Cassia reticulata “retama" y Physalis

angulata "bolsa mullaca".

Determinar la sensibilidad de Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia

coli O157:H7 Salmonella typhi, Enterococcus faecalis ATCC 51299 y

Pseudomonas sp. frente al extracto etanólico de Opuntia ficus indica

"tuna", Erythrina fusca “amasisa”, Cassia reticulata “retama" y Physalis

angulata "bolsa mullaca".

4

III. REVISIÓN DE LITERATURA

3.1. Aspectos generales de Opuntia ficus indica “tuna”

3.1.1. Clasificación taxonómica

Reino : Plantae

División : Magnoliophyta

Clase : Magnoliopsida

Orden : Caryophillales

Familia : Cactaceae

Subfamilia : Opuntioideae

Género : Opuntia

Especie : Opuntia ficus indica

Nombres comunes : tuna, higo erguido chumbo, cactus, pera

espinoso, nepal

3.1.2. Datos ambientales

Su hábitat son las laderas rocosas, márgenes de ríos y zonas urbanas

Andinas, resistentes a la sequía (14). Permanece vigorosa en condiciones calientes y

secas crece bien en climas áridos. Se ha introducido en muchas partes del mundo,

5

incluyendo África, el sur de Europa y el sur Asia. Cuenta con una amplia distribución

en Australia (11).

Bien adaptado a las tierras áridas y con una diversidad de climas y están

naturalizado en varias zonas de todo el mundo, incluyendo la cuenca del

Mediterráneo, Oriente Medio, África del Sur, Australia y la India. En África del Sur,

zonas del Mediterráneo y Sudamérica (15).

3.1.3. Descripción botánica

Opuntia ficus indica “tuna” puede crecer hasta 2 metros de altura y producir

flores amarillas limón en la primavera y el verano, seguido por los frutos rojos

purpúreas, resistente a la sequía debido a su naturaleza suculenta, la falta de hojas

y tallos gruesos que se dividen en segmentos (almohadillas o articulaciones) que

son planas, pieles duras, la fruta que es a menudo espinoso y forma de pera. El alto

contenido de azúcar y ácido da a la fruta de cactus un sabor ácido dulce. Utilizan la

mayoría de sus tejidos internos para el almacenamiento de agua y sus partes

exteriores para reducir la pérdida de agua y daños por el pastoreo y por animales

(14).

3.1.4. Usos

La Opuntia ficus indica “tuna” es utilizado en la medicina tradicional debido

a su papel en el tratamiento de una serie de enfermedades y condiciones,

incluyendo efectos anti-inflamatorios, propiedades hipoglucemiantes, la inhibición

6

de úlcera péptica, los efectos neuroprotectores, acciones antioxidantes y también

es utilizado para el tratamiento de quemaduras y asma (14). El fruto y el tallo de

Opuntia ficus indica “tuna” activan los movimientos intestinales y sirven para el

tratamiento del estreñimiento (efecto diurético inflamatorio; efecto anti-úlcera

prevención de la diabetes (11).

También es utilizado en el tratamiento de diabetes, hipertensión,

hipercolesterolemia, dolor reumático, mucosa gástrica y el asma, en muchos países

en el mundo. Hoy en día, es el foco de muchos estudios, ya que contienen

compuestos bioactivos (fitoquímicos), conocidos por sus propiedades relacionadas

con la salud. Se ha estado revelando una correlación positiva entre una dieta rica

en nopal y un menor riesgo de enfermedades asociadas con el estrés oxidativo,

como la diabetes, el cáncer, cardiovasculares y las enfermedades

neurodegenerativas (15).

Además Opuntia ficus indica “tuna” se emplea en la salud, la nutrición y la

cosmética en forma de té, mermelada, zumo y aceite extraído de las semillas de

nopal, flores de cactus y frutas se dan como agentes anti-ulcerogénicos o

antidiarreicos; siendo flores también administrarse como un medicamento anti-

hemorroides oral y savia penca como un tratamiento para la tos ferina, uso como

antidiabéticos y efectos anti-glicación (16).

7

3.2. Aspectos generales de Erythrina fusca “amasisa”


Reino : Plantae



Orden : Fabales

Familia : Fabaceae

Subfamilia : Faboideae

Tribu : Phaseoleae

Género : Erythrina

Especie : Erythrina fusca

Nombres comunes : amasisa, gallito, elequeme bucayo y pízamo;

árbol de coral


Erythrina fusca “amasisa” crece en zonas tropicales, con precipitación

pluvial de 1800 a 3500mm/año: temperaturas entre 20 y 26°C. Suelo: Se adapta a

una amplia variedad de suelos, desde arenosos - con muy baja fertilidad natural

8

hasta franco arcillo-limosos de buena fertilidad natural. También se encuentra en

laderas escarpadas. Especie pionera en áreas ribereñas inundables, también está

presente en zonas pantanosas y con elevada intensidad lumínica. Comparte su

hábitat con las siguientes especies: caña brava, cetico, gramalote, punga, raya balsa

y tangarana, entre otras (17).

Se distribuye en la zona tropical y la región subtropical del mundo y se ha

utilizado en tradicional medicina para el tratamiento de diversas enfermedades,

especialmente infecciones microbianas. Esta planta es conocida por ser una fuente

rica de alcaloides bioactivos y los flavonoides, principalmente isoflavonas,

terocarpans, flavanonas e isoflavanones. Se han encontrado que estos flavonoides

muestran una variedad de efectos biológicos, como la actividad antimicrobiana;

actividad anti-inflamatoria y la actividad anti-plasmodial (18).

La Erythrina fusca “amasisa” no presenta problemas fitosanitarios, pero es

poco empleada en sistemas de producción agrícola en la región amazónica del

Perú; sin embargo, presenta un buen potencial para recuperar y proteger áreas

degradadas. En sistemas inundables, puede emplearse como cerco vivo o árbol

para linderos en plantaciones lineales puras o intercalado con pandisho, poma rosa,

huito, ubos y shimbillo. Las especies de amasisa sin espina son empleadas como

árboles de sombra para el cultivo del café (17).

9


Erythrina fusca “amasisa” es un árbol que alcanza de 10 a 20 metros de altura

y de 20 a 60 centímetros de diámetro. Copa redondeada a umbelada, con follaje

disperso. Tronco con espinas cónicas, a veces anchas y aplanadas. Corteza externa

de color blanco-grisáceo. Ramitas terminales de color verde, con espinas en forma

de aguijón. Hojas trifolioladas, alternas, con el folíolo terminal grande y los otros

dos más pequeños, verdes en el haz y verde-grisáceas en el envés. Folíolos de 5-15

centímetros de largo y de 3-9 de ancho, ovados a oblongos, con ápice obtuso a

redondeado, bordes enteros, base redondeada o ligeramente cordada. El peciolo

pulvinado en la base, presenta dos glándulas en el punto de unión de los dos

folíolos basales (19).

3.2.4. Usos

Se usa contra úlceras; mientras que el líquido obtenido de un cocimiento de

la corteza se emplea en Baños de asiento para las hemorroides, como también en

contra de micosis; la toma del cocimiento de las hojas se usa contra infecciones

urinarias e Inflamación de la próstata (5). También se usa en lavados como

cicatrizante y contra la celulitis, el emplasto en inflamaciones; el cocimiento de las

raíces es usado como sudorífico; el cocimiento de las flores es usado para tratar la

tos; y el cocimiento de las hojas para tratar la inflamación renal (17).

Las especies de Erythrina podría tener analgésico, anti-inflamatorio y

actividad anti-bacteriana. La corteza y las hojas se utilizan principalmente para

10

curar enfermedades tales como dolor de muelas, dolor de oído, esguinces,

ligamentos tensas, abscesos, bronquitis, tuberculosis, infecciones respiratorias,

llagas purulentas y para desinfectar heridas (20).

3.3. Aspectos generales de Cassia reticulata "retama”


Reino : Plantae



Subclase : Rosidae

Orden : Fabales

Familia : Fabaceae

Subfamilia : Caesalpinioideae

Tribu : Cassieae

Subtribu : Cassiinae

Género : Cassia

Especie : Cassia reticulata

Nombres comunes : retama, laureño, matapasto

11


Cassia reticulata “retama” es una planta tropical, con alta precipitación

pluvial y elevada humedad relativa. Distribuida desde México hasta Bolivia. En el

Perú se encuentra en los departamentos de Loreto, Amazonas y Junín. Es una

especie rústica poco exigente en condiciones de suelo, la especie crece

abundantemente. Habita en terrenos inundables y no inundables, chacras nuevas y

pastizales, en campo abierto y sombreado. Es resistente a la inundación. En suelos

no inundables, se puede asociar con especies forestales como tornillo, moena y

marupa. En restingas bajas puede intercalarse con cedro, capirona y lupuna (17).

Es una especie leñosa pionero que es común en sitios inundables

perturbados ricos en nutrientes del Amazonas y sus afluentes. Se produce

principalmente cerca de los canales de los ríos y en los pastizales abandonados en

las llanuras de inundación. Se limita a los lugares más altos en el gradiente de las

inundaciones que obtienen anegadas durante un máximo de 7 meses al año. La

duración del período de aguas altas no es crucial, ya que esta especie es

extremadamente tolerante a la inundación, sobrevive al mantener algunas hojas

por encima de la superficie del agua. Es de crecimiento rápido y auto compite con

hierbas y otros pioneros leñosos por su rápido crecimiento. La distribución

geográfica es a lo largo de las llanuras aluviales amazónicas de ríos de aguas

blancas, pero también crece en sitios húmedos en la tierra firme, por ejemplo, en la

12

ciudad de Manaos. Se encuentra típicamente en los sitios que son húmedos y con

alta aporte de nutriente (21).


Es un arbusto de 3 a 5 m o árbol pequeño de 6 a 8 m. Hojas de 7 a 13 cm de

largo por 2 a 4 cm de ancho, articular, pinnadas, foliolos oblongos en número de 9 a

12 pares, redondeadas en la base y ápice. Inflorescencia racimosa, terminal o axilar.

Flores amarillas. Fruto linear oblongo de 15 cm de largo por 2 cm de ancho,

delgado, plano y glabro (17). Arbolillo de hasta 15 m de alto; las partes jóvenes

incluyendo las hojas inferiores y los racimos, puberulentos o pilosos. Hojas

pinnadas, foliolos 9-12 par, anchamente oblonga u obovada; oblicua, redondeada u

obtusa en ambas puntas, ordinariamente de 7-10 cm de largo y 2-4 cm de ancho.

Flores amarillas, sépalos grandes, casi 12 cm de largo (5)

La Cassia reticulata “retama” tiene hojas compuestas con 8-14 pares de

folíolos que son obovadas-oblongas, obtusas, mucronada, glabras por ambas

partes. Las flores son grandes, de color amarillo, frutos son legumbres largas,

agrandados en cada lado, crenulados. Las ramas son muchos, difundidas de forma

irregular en ángulo, con la bifurcación a partir de baja en el tallo. El dosel es muy

densa y amplia. Los árboles de 4.8 m de altura tienen las copas densas con

diámetros que alcanzan 6.04 m. La especie es rica en compuestos secundarios (21).

13

3.3.4. Usos

El cocimiento de las hojas se usa como anti diarreico; y junto a flores y su

raíz sirve como antiparasitario, y para el tratamiento de infecciones urinarias y

diurético; se toma el cocimiento (2 horas) de las flores como agua de tiempo. No es

conveniente administrar a las mujeres embarazadas (5). El jugo de las hojas,

mezclado con jugo de limón, es utilizado como un remedio para la tiña. La planta es

una cura de picaduras venenosas y afecciones cutáneas como las enfermedades

fúngicas (21).

3.4. Aspectos generales de Physalis angulata "bolsa mullaca"


Reino : Plantae



Orden : Solanales

Familia : Solanaceae

Subfamilia : Solanoideae

Tribu : Physaleae

Subtribu : Physalinae

14

Género : Physalis

Especie : Physalis angulata

Nombre común : bolsa mullaca, tomatillo


Physalis angulata “bolsa mullaca” se multiplica profusamente en climas

tropicales húmedos, aunque también se adapta a clima templado. Suelos de textura

arcillo-limosa, rico en materia orgánica y con pH alrededor de 7. Es una especie

pionera y predominante en suelos inundables en los cuales comparte su hábitat

principalmente con amasisa, caña brava y gramalote, entre otros. Crece y se

dispersa abundantemente en áreas bien iluminadas. En el Perú se encuentra en los

departamentos de Loreto, Piura, La Libertad, San Martín, Lima, Huánuco, Cajamarca

y Junín. Además, se encuentra en toda la Amazonía (17).


Physalis angulata “bolsa mullaca” es una hierba anual de hasta 1 m de

altura, perenne en zonas subtropicales, tallo ramificado, grueso, fistuloso, verde o

parduzco, glabro y carnoso, triangular en la parte inferior y cuadrangular en la

superior, así como en las ramas. Hojas alternas, ovadas, ovado-lanceoladas, ovada

oblonga, cuneadas en la base. Flores solitarias de 8 a 10 mm, en forma de campana

largo de color crema; cáliz sub-angulado y fructífero que amplía para cubrir la fruta

y cuelga hacia abajo como una linterna, pedúnculo recurvado sin mácula y con

15

anteras violáceas. Fruto en baya amarillo verdosa y de apariencia a perla de color

amarillo en una pequeña cápsula, forma linterna y muy delicioso para comer.

Semillas reniformes, comprimidas, rubescentes, de 1,5 mm de longitud. En el Perú

se distribuye ampliamente en siguientes departamentos: Amazonas, Cajamarca,

Huánuco, Junín, La Libertad, Loreto, Madre de Dios, Pasco, San Martín y Ucayali (5;

17).

3.4.4. Usos

La raíz de Physalis angulata “bolsa mullaca” con miel se usan para tratar

diabetes mediante maceración en agua caliente; infusión de raíz para hepatitis,

diurético; inflamaciones y desinfectante con el cocimiento de hojas y frutos se

fricciona la zona afectada. Se aplican también directamente las hojas frescas y

trituradas; asma, fruto para sarna (5). Se usa para tratar el asma, problemas

urinarios, el reumatismo, y los tumores; como también artesanía, ornamental y de

alimentos, el uso más común y el más importante es en la preparación de salsas (22).

También se usa como acaricida; diurético en infusión de las hojas; asadas en

forma de emplastos para abscesos y micosis dérmica; infusión de la parte aérea de

la planta se usa para el asma; infusión de las raíces para inflamaciones, otalgias;

como también son comestibles, generalmente consumidos en estado fresco. En

Centroamérica tiene procesamiento industrial, elaborándose conservas en almíbar

(17).

16

IV. MATERIALES Y MÉTODOS.

4.1. Descripción del área de estudio.

La investigación experimental se llevó a cabo en las instalaciones del

Instituto de Medicina Tradicional (IMET-EsSalud), el laboratorio de fitoquímica,

ubicada en el pasaje San Lorenzo N° 205, con coordenadas (18 M 691818 E –

9583702 S), con una altura de 116 msnm, en la ciudad de Iquitos, capital del

Departamento de Loreto, provincia de Maynas, distrito de San Juan Bautista. Es una

zona considerada bosque húmedo tropical y presenta temperatura media anual de

26°C.

4.2. Procedimientos

4.2.1. Tamizaje fitoquímico

El método que se utilizó para el tamizaje de las muestras fue el descrito por

el Departamento de Farmacognosia de la Universidad Médica de Budapest

(Hungría) y por el Departamento de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y

Alimentos de la Universidad de la Habana, adoptado por el Departamento de

Fitoquímica del IMET-EsSALUD, con el protocolo de estudio respectivo.

Técnica Operatoria: Se maceró al medio ambiente 5 gramos del pulverizado

en 50 ml de éter dietílico durante 48 horas de cada uno de las 4 plantas

medicinales, Cassia reticulata “retama” (fruto), Opuntia ficus indica “tuna” (penca),

Physalis angulata “bolsa mullaca” (planta entera) y Erythrina fusca “amasisa”

17

(corteza). Luego se filtró el extracto etéreo y se distribuyó alícuotas de 5 ml en 6

tubos de ensayo, concentrando los tubos a sequedad en Baño María, para

identificar: alcaloides, triterpenos-esteroides, quinonas, cumarinas, carotenos.

El residuo libre de éter dietílico de la etapa anterior, se secó y se maceró 50

ml de etanol al 95% durante 24 a 48 horas, luego se filtró el extracto etanólico y el

filtrado se distribuyó en alícuotas de 5 ml en 5 tubos de ensayos para identificar:

azúcares reductores, saponinas, aminoácidos y aminas, cumarinas, fenoles y

taninos.

El resto de este extracto etanólico fue llevado a sequedad, disuelto en agua

esterilizada, y luego mezclado con 10 ml de HCl al 10%. Se calentó y se filtró por

dos veces. Con 1 ml del filtrado se realizó la prueba para alcaloides y el resto se

ajustó a pH 9 con amoníaco, se añadió 0.9 gramos de sulfato de sodio, se filtró y se

extrajo 2 veces con 15 ml de cloroformo. Con 2 ml de la fase acuosa se identificó

flavonoides.

La fase clorofórmica se distribuyó en alícuotas de 5 ml en 3 tubos de ensayo

y se concentró a sequedad para identificar glicósidos cardiotónicos, flavonoides y

quinonas. El residuo libre de etanol se maceró con 50 ml de agua destilada durante

24 a 48 horas, luego se filtró y distribuyó en alícuotas de 5 ml en 8 tubos de ensayo,

para identificar alcaloides, azúcares reductores, fenoles y taninos, saponinas,

flavonoides, mucílagos, principios amargos y principios astringentes y glicósidos.

18

En el esquema Nº 01 (Anexo 2) se muestra el flujograma para la obtención

de los diferentes extractos empleados en el tamizaje fitoquímico. La identificación

de la presencia o ausencia de los metabolitos secundarios, estuvo sujeta a la

aplicación de los siguientes ensayos:

4.2.1.1. Identificación de alcaloides

Se realizó tres ensayos para determinar la presencia de alcaloides: ensayo

de Dragendorff, ensayo de Mayer y el ensayo de Wagner (Anexo 3). La fracción fue

disuelta en 1 ml de solución de ácido clorhídrico al 1%, con ausencia de solvente

orgánico se mezcló con una gota del reactivo; luego se midió su nivel de

opalescencia considerándose (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) de color

rojo ladrillo (Dragendorff), blanco (Mayer) y marrón (Wagner). En el caso de

acuoso, a la alícuota se le añadió una gota de ácido clorhídrico concentrado y se

procedió de la misma forma.

Ensayo de Dragendorff

Reactivo: En un matraz Erlenmeyer de 125 ml se disolvió 8g de nitrato de

bismuto pentahidratado con 20 ml de ácido nítrico (cuya densidad sea de 1.18

g/ml, al 30%). En otro matraz se colocó 27.2g de yoduro de potasio con 50 ml de

agua. Mezclamos las dos soluciones y dejamos en reposo durante 24 horas. Se

decantó la solución (para separar residuos de cristales de nitrato de potasio) y se

completó con agua a 100 ml.

19

Ensayo de Mayer

Reactivo: solución A: 1,36 g de cloruro de mercurio (II) (HgCl2) + 60 ml de

agua destilada. Solución B: 5 g de yoduro de potasio (KI) + 10 ml de agua destilada.

Se mezcló las soluciones y se aforó a 100 ml.

Ensayo de Wagner

Reactivo: 1.27 g de yodo resublimado + 2 g de yoduro de potasio en 20 ml

de agua destilada; se mezcló y aforó a 100 ml.

4.2.1.2. Identificación de triterpenos y esteroides

Ensayo de Liberman - Burchard

En un tubo de ensayo se colocó 1 ml de fracción disuelta en cloroformo con

1 ml de anhídrido acético y se mezcló bien (Anexo 4). Un ensayo positivo se tuvo

por un cambio rápido de coloración:

Rosado – azul, muy rápido.

Verde intenso – visible, aunque rápido.

Verde oscuro – negro, final de la reacción.

4.2.1.3. Identificación de quinonas

Ensayo de Borntrager

20

La fracción fue disuelta en 1 ml de cloroformo y se agitó con 1 ml de

solución de hidróxido de sodio, de potasio o de amonio al 5 % en agua. Si la fase

acuosa alcalina (superior) se coloreaba de rosado a rojo, el ensayo se consideraba

positivo a naftaquinona y antraquinona (Anexo 5).

El ensayo no excluye presencia de quinonas, ya que pueden encontrarse en

forma de glicósidos, siendo necesaria la hidrólisis previa de los mismos para su

posterior detección.

4.2.1.4. Identificación de cumarinas

Ensayo de Baljet

Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos con

agrupamientos lactónicos en particular cumarinas, aunque otros compuestos

lactónicos dieron positivo al ensayo, como: las lactosas sesquiterpénicas,

cardiotónicos, etc. Cuando la alícuota del extracto no se encontró en alcohol, se

evaporó el solvente en Baño María y disolvió en la menor cantidad de alcohol (1

ml). En estas condiciones se adicionó 1 ml del reactivo (reactivo A es una solución

de ácido pícrico al 1% en etanol y el reactivo B es una solución al 10% de hidróxido

de sodio), se consideró un ensayo positivo porque apareció un precipitado rojo o

coloración roja (Anexo 6).

21

4.2.1.5. Identificación de azúcares reductores

Ensayo de Fehling

El residuo se dividió en 1 a 2 ml de agua cuando la fracción no fue acuosa, se

adicionó 2 ml de reactivo (solución A: sulfato cúprico; solución B: hidróxido de

sodio y una sal orgánica llamada tartrato de sodio y potasio, sal de Seignette), se

calentó la mezcla en Baño de agua durante 10 a 30 minutos. El ensayo se consideró

positivo poque la solución se coloreó de rojo (Anexo 7).

4.2.1.6. Identificación de saponinas

Ensayo de la espuma

Permitió reconocer la presencia de saponinas tanto del tipo esferoidal como

triterpénica. Cuando la alícuota se encontraba en alcohol, se diluyó con 5 veces su

volumen en agua y se agitó la muestra fuertemente durante 2 minutos. El ensayo

se consideró positivo cuando apareció espuma de 2 mm de altura en la superficie

del líquido y persistente por más de 2 minutos (Anexo 8).

4.2.1.7. Identificación de fenoles y taninos

Ensayo de cloruro férrico

A la fracción disuelta en 1 ml de etanol, se añadió 0.5 ml de una solución de

cloruro férrico al 5% en solución salina. La aparición de un color o precipitado verde

22

oscuro indicó la presencia de fenoles y/o taninos. En el extracto acuoso se adicionó

acetato de sodio previo al ensayo (Anexo 9).

4.2.1.8. Identificación de aminoácidos y aminas

Ensayo de ninhidrina

Se tomó una alícuota de extracto en alcohol, si el extracto se encontró en

otro solvente orgánico, se evaporó a sequedad; en ambos casos se mezclaron con 2

ml de solución al 0,2% de ninhidrina en alcohol. La mezcla se calentó de 5 a 10

minutos en Baño de agua. Este ensayo se consideró positivo porque se observó un

color azul violáceo (Anexo 10).

4.2.1.9. Identificación de glicósidos cardiotónicos

Ensayo de Kedde

La fracción se disolvió en 1 ml de alcohol etílico, se mezcló con 1 ml del

reactivo (solución A ácido dinitrobenzoico al 2% en metanol; solución B hidróxido

de potasio al 5, 7% en agua) y se dejó reposar durante 5 – 10 minutos. Un ensayo

es positivo cuando se observa una coloración violácea persistente durante 1 a 2

horas (Anexo 11).

23

4.2.1.10. Identificación de flavonoides

Ensayo de Shinoda

A 2 ml de fracción acuosa o el residuo disuelto en 2 ml de agua, se le

adicionó 1 ml de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de magnesio metálico

o zinc metálico. Cuando la reacción terminó (en unos 5 minutos), se añadió 1 ml de

alcohol amílico y se agitó (Anexo 12).

El ensayo se consideraba positivo cuando el alcohol amílico se coloreaba de

amarillo, anaranjado o rojo, intenso en todos los casos.

4.2.1.11. Identificación de mucílagos

Permitió reconocer en los extractos vegetales la presencia de estructuras

tipo polisacáridos, que formó un coloide hidrófilo que aumentó la densidad del

agua cuando se extrajo.

Para ello una alícuota del extracto se enfrió de 0 a 5°C y la solución tomó

una consistencia gomosa al tacto, el ensayo fue positivo (Anexo 13).

4.2.1.12. Identificación de principios amargos - astringentes

El ensayo se realizó tomándole el sabor a Ia gota del extracto acuoso del

vegetal (Anexo 14).

24

4.2.2. Elaboración del extracto

4.2.2.1. Preparación de pulverizado

Se colectó hojas, y corteza (cortada en pequeños fragmentos) de Cassia

reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa mullaca”

y Erythrina fusca “amasisa”; y se envolvió con papel, estos fueron secados en una

estufa a 80°C por 72 horas; se volvió a pesar, y luego con un molino manual se

pulverizó. El pulverizado fue guardado en frascos oscuros hasta que se utilizó

(Anexo 18).

4.2.2.2. Preparación del extracto etanólico

Se pesó 50 gramos de pulverizado de cada uno de las 4 plantas medicinales,

Cassia reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa

mullaca” y Erythrina fusca “amasisa”; y se remojó en 500 ml de alcohol a 90°, se

maceró por 24 horas. Las suspensiones fueron filtradas poniendo algodón en un

embudo (2 veces) y luego fue filtrado con un papel filtro en un embudo de vidrio. El

extracto fue concentrado a 37ºC, se puso 5ml de extracto en una cápsula de

porcelana previamente pesada y se secó por medio de Baño María; una vez seco se

volvió a pesar la cápsula de porcelana con el extracto seco. Para calcular el

rendimiento se utilizó la siguiente formula:

Rendimiento de extracto (RE)

𝑅𝐸 = (𝑃𝑖 − 𝑃𝑓

𝑃𝑖) 𝑥100

25

Concentración de extractos (CE)

𝐶𝐸 = (𝑃𝑒

𝑃𝑠)𝑥100

4.2.3. Antibiograma

4.2.3.1. Preparación de las concentraciones

Se realizó los cálculos de las concentraciones de los extractos de Cassia

reticulata “retama”, Opuntia ficus indica “tuna”, Physalis angulata “bolsa mullaca”

y Erythrina fusca “amasisa”.

Se pesó 10 g de extracto seco y se puso en 10 ml de agua destilada estéril y

se obtuvo la solución stock a una concentración de 1000 mg/ml.

A partir de esta solución stock se procedió a preparar las siguientes diluciones a las

concentraciones siguientes: 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400

mg/ml y 500 mg/ml (Anexo 15).

4.2.3.2. Preparación de los discos de sensibilidad

Los discos de sensibilidad se prepararon utilizando papel Watman Nº 3, se

empleó un perforador convencional. Estos discos se esterilizaron en autoclave a

121ºC y 15 libras de presión por 15 minutos. Cada uno de los discos fueron

embebidos con 15 μl de una disolución determinada preparada anteriormente con

los extractos vegetales, estas se dejaron secar por 24 horas (Anexo 17).

26

4.2.3.3. Prueba de sensibilidad

Se replicaron las cepas bacterianas (en estudio) en agar nutritivo y luego se

incubaron a 37ºC por 24 horas; después se replicaron las cepas en caldo tripticasa

de soya (tryptic soy broth tsb por sus siglas en ingles), y se utilizaron discos de

gentamicina de 10 μg como control para las enterobacterias, y discos de

ciprofloxacino 5 μg de potencia como control positivo en el caso de Enteroccus

faecalis (ATCC 51299).

Se preparó la suspensión de cada bacteria en caldo tripticasa de soya,

extrayendo de 3 a 5 colonias. Luego se incubaron de 3 a 6 horas, hasta que se

alcanzó el grado 0.5 de turbidez en la escala de Mc Farland.

Mientras tanto, las suspensiones de las cepas bacterianas se incubaron. Una

vez que las suspensiones alcanzaron el grado 0.5 de turbidez en la escala de Mc

Farland se procedió a tomar una alícuota de 50 μl de cada suspensión y se

diseminaron sobre las placas con agar Müller Hinton antes preparado, utilizando

para esto una espátula de vidrio Nº 8.

Sobre las siembras de las bacterias en placas se colocaron los discos de

sensibilidad (50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml y 500

mg/ml) de los extractos de Opuntia ficus indica “tuna”, Erythrina fusca “amasisa”,

Cassia reticulata "retama”, Physalis angulata "bolsa mullaca".

27

La lectura de la prueba se realizó midiendo el halo de inhibición producida

por los discos de sensibilidad y se utilizó además para este propósito un vernier

convencional. Los datos se interpretaron según el método de Kirby – Bauer (Anexo

17 y 26).

4.2.4. Procesamiento de la información.

Los datos fueron procesados en Microsoft Excel 2010 y en

IBM.SPSS.Statistics.v22.x86. Se realizó análisis de correlación y se aplicó el Diseño

Factorial con medidas repetidas. Los resultados fueron presentados en cuadros e

índices estadísticos.

28

V. RESULTADOS

5.1. Screening fitoquímico

El extracto hexano de Opuntia ficus indica “tuna” fue positivo a cumarinas y

lactonas. El extracto etanólico fue positivo a fenoles y taninos, a saponinas (++),

cumarinas (+), aminoácidos y aminas (+++). El extracto acuoso fue positivo a

fenoles y taninos (+), saponinas (++), principios amargos y astringentes (+) y a

azucares reductores (+).

El extracto hexano de Cassia reticulata “retama” fue positivo a quimonas

(+), cumarinas y lactonas (+), mucílagos (+), saponinas (++), cumarinas (++) y a

aminoácidos-aminas (++). El extracto etanólico fue positivo a quimonas (+),

cumarinas (+), fenoles y taninos (+), saponinas (+++), cumarinas (+), y a

aminoácidos-aminas (+++). El extracto acuoso fue positivo a fenoles y taninos (+),

saponinas (+), principios amargos y astringentes (+) y a azucares reductores (+).

El extracto de hexano de Physalis angulata “bolsa mullaca” fue positivo a

triterpenos y esteroides positivo (++), cumarinas/lactonas (+++). El extracto

etanólico fue positivo a saponinas (+++), cumarinas (+++), aminoácidos-aminas (+)

triterpenos y esteroides (++). El extracto acuoso fue positivo a saponinas (+);

principios amargos y astringentes (+), azucares reductores (+).

Extracto hexano de Erythrina fusca “amasisa” fue positivo a quimonas (+/2)

y a curarinas /lactonas (+). El extracto etanólico fue positivo a fenoles y taninos (+),

29

quimonas (+), saponinas (++), cumarinas (++), aminoacidos-aminas (++). El extracto

acuoso fue positivo a fenoles y taninos (++), saponinas (++), principios amargos y

astringentes (+) y a azucares reductores (+/2) (Cuadro 1).

30

Cuadro 1. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna”, Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata “bolsa

mullaca”

Tipo de extracto

Especie vegetal Fenoles y taninos

Saponinas Pincipios amargos y astringentes

Cumarinas/Lactonas Triterpenos/ Esteroides

Amionoácidos-aminas

Azúcares reductores

Mucílago

Cloruro férrico

De la espuma

Baljet Liberman/ Burchard

Ninhidrina Fehling

E Cassia reticulata (F)

(+) (++) (-) (+) (-) (+++) (-) (-)

Opuntia ficus indica (H)

(++) (++) (-) (+) (-) (+++) (-) (-)

Physalis angulata (PE)

(-) (+++) (-) (+++) (-) (-) (-) (-)

Erythrina fusca (C)

(+) (++) (-) (++) (-) (++) (-) (-)

H Cassia reticulata (F)

(-) (++) (-) (+) (-) (-) (-) (-)


(-) (-) (-) (++) (-) (-) (-) (-)


(-) (-) (-) (+++) (++) (-) (-) (-)

Erythrina fusca (C)

(-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-)

A Cassia reticulata (F)

(+) (+) (+) (-) (-) (-) (++) (-)


(+) (++) (+) (-) (-) (-) (+) (+)


(-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (-)

Erythrina fusca (C)

(++) (++) (+) (-) (-) (-) (+) (-)

Partes estudiadas: H, hojas; F, fruto; PE, planta entera; C, corteza Tipo de extracto: E, etanólico; H, hexano; A, acuoso

31

5.2. Determinación de la humedad

Se obtuvo el porcentaje de humedad de cada una de las plantas estudiadas,

Cassia reticulata tuvo una humedad de 75.92%, Physalis angulata de 90.16% y

Erythrina fusca de 91.40%; para lo cual se utilizó fruto verde de Cassia reticulata,

planta entera de Physalis angulata y corteza de Erythrina fusca; no se calculó la

humedad de Opuntia ficus indica porque es una planta que tiene alto contenido de

agua. Se determinó la humedad para conocer qué cantidad de planta era necesario

utilizar para conseguir suficiente extracto liofilizado y emplearlo en las diferentes

concentraciones en el antibiograma (Cuadro 2).

Cuadro 2. Porcentaje de humedad

Planta Parte usada Peso

fresco (g)

Peso

seco (g) Humedad %

Cassia reticulata fruto verde 231.942 55.843 75.92

Physalis angulata planta entera 236.572 23.270 90.16

Erythrina fusca corteza 1620.485 139.414 91.40

32

Grafico 1. Porcentaje de humedad

5.3. Determinación del rendimiento de extracto

Se hicieron cuatro repeticiones por extracto etanólico de cada planta, en las

cuales se colocaron 5 ml de cada extracto concentrado en placas petri, que luego

fueron puestos a secar en estufa.

En el caso del extracto etanólico de Cassia reticulata “retama” se obtuvo

rendimientos de 3.14% a 3.64% obteniendo un promedio de 3.38 % (Cuadro 2). En

el caso del extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” se obtuvo


el caso del extracto etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca” se obtuvo


75.92%

90.16% 91.40%

0.00%

10.00%

20.00%

30.00%

40.00%

50.00%

60.00%

70.00%

80.00%

90.00%

100.00%

Cassia reticulata "retama" Physalis angulata "bolsamullaca"

Erythrina fusca "amasisa"

humedad

33

el caso del extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” se obtuvo rendimientos

de 0.95% a 1.13% obteniendo un promedio de 1% (Cuadro 3, Gráfico 2).

Cuadro 3. Determinación del rendimiento del extracto Opuntia ficus indica “tuna”,

Cassia reticulata “retama”, Erythrina fusca “amasisa”, Physalis angulata

“bolsa mullaca”

Extracto etanólico Peso de

placa sin

extracto (g)

Peso de placa

con extracto

seco (g)

Rendimiento

%

Opuntia ficus indica “tuna” 43.12 43.9 3.87%

Cassia reticulata “retama” 26.12 26.8 3.38%

Erythrina fusca “amasisa” 17.92 18.12 1%

Physalis angulata “bolsa mullaca” 18 18.98 4.92%

Gráfico 2. Rendimiento de los extractos.

34

5.4. Antibiograma

Los extractos etanólico de Opuntia ficus indica “tuna”, Erythrina fusca

“amasisa” y Cassia reticulata “retama”, no presentaron actividad antibacteriana

frente Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7, Enterococcus faecalis

ATCC 51299, Pseudomonas sp., y Salmonella typhi. Physalis angulata “bolsa

mullaca” presentó efecto antibacteriano ante a Pseudomonas sp., a 300 mg/mL,

400 mg/mL y 500 mg/mL de potencia del disco del extracto con un halo promedio

de 8 mm (gráficos 3 y 4). Escherichia coli ATCC 35218 se mostró resistente a

gentamicina con un halo de 9 mm; Escherichia coli O157-H7 se mostró sensible a

gentamicina con un halo de 20 mm, con 22 mm en Pseudomonas sp., y con 23 mm

en Salmonella typhi; Enterococcus faecalis ATCC 51299 se mostró sensible a

ciprofloxacino con un halo de 22 mm (Cuadro 4).

Cuadro 4. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos

Especies de plantas Partes de plantas

ensayadas*

Tipo de extracto

Diámetro de la zona de halo (mm)

Actividades antibacterianas**

E.c ATCC 35218

E.c O157:H7

E. f. ATCC 51299

P.sp. S.t

Cassia reticulata F Etanólico 0 0 0 0 0

Opuntia ficus indica H Etanólico 0 0 0 0 0

Physalis angulata PE Etanólico 0 0 0 8 0

Erythrina fusca C Etanólico 0 0 0 0 0

Controles

Gentamicina (10μg /ml) 9 20 - 20 23

Ciprofloxacino (5μg /ml) - - 22 - -

*F: fruto; H: hoja; PE: planta entera; C: corteza.

35

**Especies de bacterias: E.c. ATCC 35218, Escherichia coli ATCC 35218; E.c. O157:H7, Escherichia coli O157:H7; E.f. ATCC 51299, Enterococcus faecalis ATCC 51299; P.sp., Pseudomonas sp.; S.t., Salmonella typhi.

Gráfico 3. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en discos de 500 mg/ml, 400

mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp.

Gráfico 4. Efecto antibacteriano de Physallis angulata en discos de 500 mg/ml, 400

mg/ml y 300 mg/ml frente a Pseudomonas sp.

109 9 9 9

78

98 8

7 7 78 8

0

2

4

6

8

10

12

50

0 m

g/m

L

50

0 m

g/m

L

50

0 m

g/m

L

50

0 m

g/m

L

50

0 m

g/m

L

40

0 m

g/m

L

40

0 m

g/m

L

40

0 m

g/m

L

40

0 m

g/m

L

40

0 m

g/m

L

30

0 m

g/m

L

30

0 m

g/m

L

30

0 m

g/m

L

30

0 m

g/m

L

30

0 m

g/m

L

Physallis angulata

Pseudomonas sp.

68 7 8 88 8 8 8 8

10 10 9 10 9

18 18

22

19 20

0

5

10

15

20

25

FIT 1 FIT 2 FIT 3 FIT 4 FIT 5

Pseudomona sp

Physallis angulata 300 mg/mL Physallis angulata 400 mg/mL

Physallis angulata 500 mg/mL GENTAMICINA

36

5.5. Prueba de la normalidad

Al realizar el procesamiento de la información, en primer lugar, se realizó la

prueba de normalidad para el promedio de los extractos, con el estadístico Z de

Kolmogorov-Smirnov, requisito para utilizar pruebas estadísticas paramétricas

como en Análisis de Varianza (ANOVA) y el análisis factorial, los resultados se

aprecian en el Cuadro 8, del que podemos deducir que el valor calculado de Z-KS =

0,149 y una significancia bilateral (p) de: 0,087; la misma que fue mayor del 5% (p >

0.05), lo que indica que los valores de los extractos provienen de una población

distribuida normalmente (Cuadro 5).

Cuadro 5. Análisis de la prueba de la normalidad

EXTRACTO Kolmogorov-Smirnova

Estadístico gl Sig.

Physallis angulata 0,149 30 0,087

5.6. Prueba t de Student para muestras relacionadas

Para contrastar las hipótesis planteadas se aplicó la prueba t de Student

para muestras relacionadas (cuadro 6). Los resultados muestran que no existe

diferencia significativa entre los extractos con respecto al resultado del

antibiograma, pero si existe diferencia entre las bacterias Escherichia coli O157:H7,

Escherichia coli ATCC 35218, Salmonella typhi, Pseudomonas sp. y Enterococcus

37

faecalis ATCC 51299, lo cual indica que el tamaño del halo en el antibiograma varia

significativamente según la especie bacteriana; además podemos observar que la

concentración del disco empleado presentan diferencia significativas entre sí

respecto al tamaño de halo; por lo que se debe usar el disco con mayor halo

presentes en el antibiograma para posible tratamiento contra estos tipos de

bacterias (Cuadro 6).

Cuadro 6. Análisis de prueba t de Student de muestras relacionadas

Diferencias relacionadas

Media Desviación

típ. T gl

Sig. (bilateral)

Par 1 Extracto - Antibiograma

0,387 6,113 1,676 699 0,094

Par 2 Bacteria - Antibiograma

0,887 6,155 3,814 699 0,000

Par 3 Disco - Antibiograma

1,887 5,265 9,483 699 0,000

5.7. Análisis factorial de la varianza mixto

Por otro lado al realizar el análisis factorial mixto para la varianza de los

factores se concluye que, no existe diferencia significativa entre las medidas 1, 2, 3,

4 y 5 del factor 1; así mismo el factor 1 con la interacción de los diferentes

tratamientos no presentan diferencias significativas, esto nos indica que no existe

un extracto del tratamiento mejor que las otras; concluyendo que en los resultados

del antibiograma en los diferentes extractos que se encontraron, la formación de

un halo no son diferentes entre sí (Cuadro 7).

38

No existe diferencia significativa entre las combinaciones de los factores, es

decir, no existe una combinación de los extractos que tenga un mejor efecto

antibacteriano frente a las cepas de estudio; por lo tanto ningún extracto es mejor

que los otros. Tampoco existe diferencia significativa entre los efectos intra

específicos de los extractos. Las medidas entre ellas son similares confirmando la

hipótesis planteada.

Cuadro 7. Análisis factorial de la varianza mixto (un factor inter y un factor intra)

Contrastes multivariadosa

Efecto Valor F Gl de la

hipótesis Gl del error

Sig.

factor1 Lambda de Wilks

0,996 0,022b 4 23 0,999

factor1 * VAR3

Lambda de Wilks

0,677 0,810 12 61 0,639

a. Diseño: Intersección + VAR3 Diseño intra-sujetos: factor1 b. Estadístico exacto

c. El estadístico es un límite superior para la F el cual ofrece un límite inferior para el nivel de significación. VAR3 = combinaciones de los tratamientos

39

VI. DISCUSIÓN

Las plantas investigadas son usadas de diversa manera en la medicina

popular, tal como se observa en el anexo 25, muchas de ellas se usan en problemas

infecciosos causados por bacterias y hongos. Los resultados de la prueba de

difusión en agar nos demuestra que Physalis angulata “bolsa mullaca” tuvo

actividad antibacteriana específica contra Pseudomonas sp. Esto avala el potencial

que tiene esta planta como antimicrobiano; así como una acertada selección

basada en gran parte en su quimiotaxonomía y uso etnomedicinal.

En el presente estudio, en Opuntia ficus indica no se reportó la presencia de

flavonoides, fue positivo a la prueba de fehling, el cual indicó la presencia de

azúcares reductores (glucosa o fructosa); no se reportó la presencia de quimonas

(naftaquinona y antraquinona). Semejante resultado presentó Ginestra et al.

(2009), quienes además reportaron la presencia de flavonoides (debido al lugar de

procedencia de la planta utilizada). También reportaron monosacáridos como

ramnosa, fucosa, arabinosa, xilosa, manosa, galactosa, glucosa. Repo de Carrasco et

al. (2008), en un estudio de la Universidad Nacional Agraria La Molina, Perú,

también reportaron la presencia de compuestos fenólicos en Opuntia ficus indica

“tuna”, betalaínas, minerales, carotenos, como también antocianinas los cuales dan

capacidad antioxidante.

El extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna” no mostró actividad

antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157:H7,

40

Pseudomonas sp., Salmonella typhi y Entrococcus faecalis.; pero estudios realizados

por Shafiei et al. (2013), reportaron que el fruto de Opuntia “tuna” tiene efectos

antibacterianos contra Escherichia coli (PTCC 1270), Escherichia coli (PTCC 1330) y

Staphylococcus aureus (PTCC 1764), a concentraciones 10, 20 y 40 mg/ml

respectivamente. Lee et al. (2011), reportaron la inhibición del crecimiento de

Escherichia coli como también de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, y

Salmonella typhimurium. Alta actividad antibacteriana para 10 mg/disco, mostraron

efectos de inhibición de crecimiento contra Lactobacillus brevis, Lactobacillus

plantarum, y Leuconostoc mesenteroides. La medición de los recuentos de células

viables de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, y Salmonella

typhimurium indicaron efectos de supresión de la concentración de 3% del extracto

de etanol 95% de Opuntia “tuna”. Mientras que Kim et al. (2005), en un estudio en

la Universidad Nacional Pusan, Busan-Corea, reportaron que el extracto metanólico

de Opuntia ficus indica “tuna” presenta actividad antimicrobiana contra bacterias

patógenas, incluyendo bacterias antibióticos resistentes (MRSA, Pseudomonas

aeruginosa, VRE) y Propionibacterium acnes, levaduras y hongos. El extracto retuvo

la actividad después del tratamiento térmico durante 15 min a 100°C y 121°C, y

después de un almacenamiento prolongado, hasta 10 semanas período de

almacenamiento a 4°C y 25°C, también de forma estable retiene su actividad.

Mostró un mejor efecto de inhibición del crecimiento de Escherichia coli que lo hizo

el benzoato de sodio a la misma concentración. En el presente estudio no se

reportó actividad antimicrobiana contra cepas de Pseudomonas sp. y Escherichia

41

coli, esto se debe a diferencias en la compocicion fitoquimica de Opuntia por

diferencias geográficas del lugar de procedencia de las plantas.

En la presente investigación, Physalis angulata “bolsa mullaca” presentó

triterpenos y esteroides concordando con los resultados obtenidos por Pietro et al.

(2000), quienes reportaron la presencia de esteroides (physalin), y también se

encontró cumarinas/lactonas, saponinas, aminoacidos-aminas; principios amargos

y astringentes y azucares reductores. Similar resultado presentaron Donkor et al.

(2012), quienes reportaron en P. angulata “bolsa mullaca” la presencia de

carbohidratos, lípidos, minerales, vitaminas y fitoesteroles. También contiene

estructuras de tipo acrilato. Con los anólidos se definen clásicamente como un

grupo de esteroides del tipo ergostano C28 con una C-22, 26 δ-como grupo lactona.

También tiene fisalinas B, E, F, G, H e I, pero también reporta la presencia de

flavonoides glicósidos (myricetin 3-O-neohesperidosido).

En el presente estudio el extracto etanólico de Physalis angulata “bolsa mullaca”

mostró actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp., a 300 mg/ml de potencia

del disco del extracto presentó halo antibacteriano de 7 mm; a 400 mg/ml, presentó

halo de 8mm; a 500 mg/ml, presentó halo de 9 mm. No mostró actividad

antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7 y

Salmonella typhi. Estos resultados difieren con los resultados reportados por

Donkor et al. (2012), los cuales reportaron que la fruta de Physalis angulata

muestran actividad antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa y

42

Staphylococcus aureus a concentración utilizada (100 mg g-1, 125 mg g-1 y 150 mg

g-1) con zonas de inhibición entre 34,5 mm y 50,5 mm en comparación al

antibiótico estándar (cloramfenicol), que dio una media de inhibición zona diámetro

de 79,8 mm a 100 mg g-1 de concentración, tal investigación concuerda en parte

con nuestros resultados, dado que Physalis angulata “bolsa mullaca” mostró

actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp. (300 mg/ml, 400 mg/ml y 500

mg/ml) con una media de halo de 8 mm. Pietro et al. (2000), en la Universidad de

Ribeirão Preto, São Paulo-Brasil, demostraron que los extractos de CHCl3 crudo a

partir de las partes aéreas (500 g/ml) de Physalis angulata “bolsa mullaca” causó la

inhibición del crecimiento total de Mycobacterium tuberculosis células Rv H37. Por

otra parte, 32 g/ml y 625 g/ml de las fracciones que contienen esteroides (Physalin)

eran necesarias para inhibir 100% de Micobacterium tuberculosis y Micobacterium

avium, respectivamente. Purificada Physalin B mostró valores de MIC contra

Micobacterium tuberculosis H37 Rv cepa de 32 g/ml. López et al. (2006), mostraron

que el extracto de etanol de la fruta de P. angulata “bolsa mullaca” tiene mejor

actividad bacteriana respecto a la raíz contra Staphylococcus aureus ATCC 6538,

mostrando respuesta significativa cuando se compara a la ampicilina, que se

preparó en agua a concentraciones que van desde 0,25 hasta 4.090 g/ml. El

extracto mostró una inhibición de 11,17 mm, igualando la gama de linealidad de la

curva del antibiótico, que varió desde 9,60 hasta 20,30 mm. Mientras que Hwang et

al. (2004), reportaron que el extracto etanólico de las flores de P. Angulata “bolsa

mullaca”, exhiben notable actividad antibacteriana contra Streptococcus mutans, en

43

el ensayo bactericida mostró que el extracto de metanol de P. angulata tuvo efecto

frente a S. mutans en 2 min a 50 mg/ml de concentración. Rengifo Salgado et al.

(2013), reporton que Physalis angulata “bolsa mullaca” posee propiedades

antimicrobianas contra Bacillus subtilis y Klebsiella pneumoniae. La fruta y raíz

presenta actividad contra Staphylococcus aureus ATCC 6538 mostrando respuesta

significativa cuando se compara a la ampicilina. El extracto etanólico de las flores

exhiben notable actividad antibacteriana contra Streptococcus mutans que causan

la caries dental. El extracto etanólico de la fruta muestran actividad antibacteriana

contra Staphylococcus aureus.

El análisis fitoquímico preliminar del extracto de Erythrina fusca “amasisa”,

reveló la presencia de compuestos fenólicos, taninos, saponinas, cumarinas y

lactonas, aminoácidos y aminas, no se reportó la presencia de flavonoides; mientras

que Innok et al. (2010), en estudios realizados en la Universidad Ramkhamhaeng,

Bangkok-Tailanda, reportaron flavonoides fuscacarpanos (A-C), faseolidina,

eritribissina A, eritrabissina I, demetilmedicarpina, erivarina D, eripoegina I,

hidroxicristacarpona, orientanol A, upinifolina, lonchocarpol, agenisteina,

liquiritigenina, isoliquiritigenina, vestitona, 8-oxo-(+) erisodina, erisopina e

eritrabissina; esto puede deberse a que en el presente estudio se realizó utilizando

la corteza y no el tallo de Erythrina “amasisa”; de igual forma Rukachaisirikul et al.

(2007), en la Universidad Ramkhamhaeng, Bangkok-Tailandia, reportaron la

presencia de flavonoides (isoflavonoides pterocarpanos). También Chaca et al.

(2005), en la Universidad de Botswana, Botswana, aislaron de la madera del tronco

44

de Erythrina “amasisa” 7,30-dihidroxi-40- dos isoflavonas y una flavanona metoxi-

50- (c, c-dimetilalilo) de isoflavonas (erylatissin A), 7,30-dihidroxi-600600-dimetil-

400500-dehydropyrano [200300: 40,50] isoflavona (erylatissin B), - 7,30-dihidroxi-

40-metoxi-50- (c, c-dimetilalil) flavanona (erylatissin C).

En el presente estudio el extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” no

mostró actividad antibacteriana contra Pseudomonas sp., Escherichia coli ATCC

35218, Escherichia coli O157-H7, Salmonella typhi y Enterococcus faecalis ATCC

51299, concordando con resultados obtenidos por Innok et al. (2010), quienes

reportaron que Erythrina fusca “amasisa es inactivo” contra Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 (PA) y Escherichia coli ATCC 25922 (CE); pero reportaron

actividad antibacterial fuerte, moderada y débil según el compuesto contra

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (SA), meticilina Staphylococcus aureus (MRSA),

con valores de MIC de 4 g/ml; 8 a 64 g/ml de 128 g/ml, y ≥200 mg. Rukachaisirikul

et al. (2007), reportaron efecto antibacterial de flavonoides de Erythrina “amasisa”

contra cepas de Streptococcus con un rango de MIC de 0,78 a 1,56 g/ml, y cepas de

Staphylococcus, incluyendo cepas resistentes a los medicamentos (MRSA y VRSA),

con un rango de CIM de 0,39 a 1,56 g/ml. Compuesto erycristagallin mostró el más

alto nivel de actividad contra todas las cepas ensayadas VRSA, con un rango de MIC

de 0,39 a 1,56 g/ml, lo cual fueron resistentes a ambos antibióticos. Demostrando

que estos agentes fitoquímicos tienen una potente actividad antibacteriana,

especialmente contra la cepas de SARM y VRSA. Chaca et al. (2005), reportaron que

45

estos compuestos muestran actividad antimicrobiano contra Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Candida micoderma. En el presente

estudio el extracto etanólico de Erythrina fusca “amasisa” no mostró actividad

antibacteriana contra Escherichia coli ATCC 35218 y Escherichia coli O157-H7.

El análisis fitoquímico preliminar de Cassia reticulata “retama” reveló la

presencia de saponinas, aminoácidos y aminas, flavonoides y azúcares reductores;

el extracto etanólico no mostró actividad antibacteriana contra Escherichia coli

ATCC 35218, Escherichia coli O157-H7, Pseudomonas sp. y Salmonella typhi. El cual

contradice los resultados obtenidos por Ruiz et al. (2009), sobre Cassia reticulata

“retama” que reportaron efecto inhibidor sobre Pseudomonas aeruginosa,

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus

subtilis. Los resultados concuerdan con los obtenidos por Somchit et al. (2003), en

la Universidad Putra Malasia, Malasia, quienes reportaron que Escherichia coli es

resistente al extracto; también reportaron actividad anti-bacteriana contra

Staphylococcus aureus y se detectó sólo con los extractos de hojas usando agua y

etanol. El extracto de agua exhibió una mayor actividad antibacteriana que el

extracto de etanol a partir de hojas (zonas de inhibición de 11/14 y 9/11 mm,

respectivamente). Khan et al. (2001), en la Universidad de Tecnología, Papua New

Guinea, reportaron para el extracto de metanol de Cassia alata “retama” amplio

espectro de actividad antibacteriana contra diferentes especies del genero Bacillus,

Staphylococcus, Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, entre otras.

46

VII. CONCLUSIONES

Se conoció los componentes fitoquímicos y la actividad antibacteriana del

extracto etanólico de cuatro plantas medicinales Opuntia ficus indica “tuna”

(penca), Erythrina fusca “amasisa” (corteza), Cassia reticulata “retama”

(fruto), y Physallis angulata “bolsa mullaca” (planta entera).

Se determinó la composición fitoquímica de las cuatro plantas medicinales,

Opuntia ficus indica (penca), Erythrina fusca (corteza), Cassia reticulata

(fruto), y Physallis angulata (planta entera); y la presencia de diferentes

metabolitos secundarios siendo cumarinas y lactonas, fenoles y taninos,

saponinas, aminoácidos y aminas los principales componentes fitoquímicos

encontrados.

Se determinó la sensibilidad de Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli

ATCC 35218, Salmonella typhi, Enterococcus faecalis ATCC 51299 y

Pseudomonas sp., frente al extracto etanólico de las cuatro plantas

medicinales: Opuntia ficus indica (penca), Erythrina fusca (corteza), Cassia

reticulata (fruto), y Physallis angulata (planta entera). De estos extractos el

que presentó efecto antibacteriano fue el extracto etanólico de Physalis

angulata "bolsa mullaca" frente a Pseudomonas sp., con un halo promedio

de 8mm, lo que muestra que la bacteria es resistente de acuerdo al manual

de antibiograma por el método de disco difusión-INS, para Pseudomonas sp.,

que establece: halos menores o iguales a 12mm es resistente al antibiótico.

47

VIII. RECOMENDACIONES

Realizar ensayos toxicológicos del extracto de las plantas

estudiadas.

Realizar aislamiento y purificación de los compuestos químicos

presentes en el extracto para determinar la capacidad

antibacteriana de cada uno de ellos.

Determinar las interacciones sinérgicas y antagónicas existente

entre los diferentes compones fitoquímicos presentes en los

extractos.

48

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54

X. ANEXO

Anexo 1. Mapa de ubicación del laboratorio donde se realizaron los ensayos microbiológicos y fitoquímicos (Ciudad de Iquitos)

Fuente: Google Earth

55

Anexo 2. Esquema de tamizaje fitoquímico

56

Anexo 3. Identificación de alcaloides

Anexo 4. Identificación de triterpenos y esteroides (ensayo de Liberman – Burchard)

5 ml del ext- H2O +

1 ml HCL 1% 1 ml

1 ml

1 ml

+

+

+

5 gotas de Rx. Dragendorh

5 gotas de Rx. Mayer

5 gotas de Rx. Wagner

Color precipitado (rojo-anaranjado)

Color precipitado (blanco-crema)

Color precipitado (marrón-carmelita)

(+)

(+)

(+)

2 ml del ext- DCM

1 ml

1 ml Anh. Acético +

3 gts H2CO4 cc.

Triterpenos

(rojo-rosado)

(+)

Esteroides

(verde-azul-negro)

(+)

57

Anexo 5. Identificación de quinonas (ensayo de Borntrager)

Anexo 6. Identificación de cumarinas (ensayo de Baljet)

Anexo 7. Identificación de azúcares reductores (ensayo de Fehling)

Anexo 8. Identificación de saponinas (ensayo de la espuma)

2 ml del ext- H2O Fehling A + Fehling B

(1 ml) (1 ml) +

BM

15 minutos

Color pp. Color rojo o solución color rojo.

1 ml del ext- ET-OH +

5 ml H2O

Agitar 60 seg.

Espuma 2 mm a más

(+)

2 ml del ext- ET-OH +

Sol. Ác. Pícrico + NAOH 10% (1 ml) (1 ml)

Color precipitado

(rojo-oscuro-anaranjado)

(+)

Rx. Baljet

2 ml del ext- DCM

1 ml

RX. BORNTRAGER

1 ml NAOH 5%

+ Fase acuosa

(rosado-rojo)

(+)

58

Anexo 9. Identificación de fenoles y taninos (ensayo de cloruro férrico)

Anexo 10. Identificación de aminoácidos y aminas (ensayo de ninhidrina)

+ 2 ml del ext- H2O 1 ml Acetato-Na

1 ml

+ 5 gotas de Rx.

FeCl3 5%

Inclinar el tubo

(+) Color (verde-negro-

azul)

2 ml del ext- ET-OH

+

2 ml de Rx. ninhidrina en alcohol 0,2 % BM

5-10 Minutos

Color azul violáceo

(+)

59

Anexo 11. Identificación de glicósidos cardiotónicos (ensayo de Kedde)

Anexo 12. Identificación de flavonoides (ensayo de Shinoda)

2 ml del ext- ET-OH

BM Cc/seq

+ 2 ml de H2O

1 ml

+

1 ml HCLcc 35%

Mg

Consumo de todo el

Mg

1 ml OH-AMÍLICO Fase amílica

(anillo anaranjado-rojo)

(+)

2 ml del ext- ET-OH

+ Solución A + Solución B

(1 ml) (1 ml)

Rx. Kedde

Dejar reposar 5-10 minutos

Coloración violácea durante 1-2 horas

(+)

60

Extracto H2O

Filtrar

Degustar sabor

amargo

Anexo 13. Identificación de mucílago

Anexo 14. Identificación de principios amargos – astringentes

1 ml del ext- ET-OH Enfriar

a 0-5°C

Consistencia gomosa al

tacto

(+)

61

Anexo 15. Preparación de las concentraciones

Anexo 16. Preparación de los discos de sensibilidad

+

10 gr. Extracto seco

10 ml agua destilada

1000 mg/ml Solución Stock

100 mg/ml

300 mg/ml

200 mg/ml

400 mg/ml

500

mg/ml

600

mg/ml

62

Anexo 17. Prueba de sensibilidad

Anexo 18. Proceso de preparación de extractos

63

Anexo 19. Definición de términos básicos

Adaptación: Acción y el efecto de adaptar o adaptarse, un verbo que hace

referencia a la acomodación o ajuste de algo respecto a otra cosa.

Agar: Se trata de una sustancia de tipo gelatinosa que se obtiene a partir de

ciertas algas. El agar es un polisacárido compuesto por galactosa, un azúcar

simple. Cuando se disuelve en agua a alta temperatura y luego se lo enfría,

adquiere su consistencia de gelatina. Esta sustancia se emplea en diversos

contextos. El agar puede utilizarse para espesar preparaciones gastronómicas

y para aclarar la cerveza, por ejemplo. Además sirve como medio de cultivo

para el desarrollo de hongos y de bacterias.

Antibiótico: Sustancia química que producen ciertos hongos y que destruye

microorganismos, especialmente las bacterias.

Antimicrobiano: Medicamento o sustancia que mata o inhibe el crecimiento

de microorganismos.

Antioxidante: Sustancia que impide la formación de óxidos.

Antiradical: Contra aquellas sustancias químicas (radicales libre) muy

reactivas que introducen oxígeno en las células, produciendo la oxidación de

sus partes.

Difusión: Es un proceso físico irreversible, en el que partículas materiales se

introducen en un medio que inicialmente estaba ausente, aumentando la

entropía (desorden molecular) del sistema conjunto formado por las

partículas difundidas o soluto y el medio donde se difunden o disuelven.

64

Dilución: Es la reducción de la concentración de una sustancia química en

una disolución.

Eficacia: Capacidad para producir el efecto deseado o de ir bien para

determinada cosa.

Etanol: Es un tipo de compuesto químico, conocido popularmente como

alcohol etílico, el cual en una situación de presión y de temperatura normal,

se caracteriza por ser un líquido incoloro e inflamable en un punto de

ebullición de 78°C.

Extracto: Es una sustancia muy concentrada obtenida por extracción de una

parte de una materia prima, a menudo usando un solvente como etanol o

agua.

Fármaco: Sustancia que sirve para curar o prevenir una enfermedad, para

reducir sus efectos sobre el organismo o para aliviar un dolor físico.

Fitofarmacología: Es el estudio de los productos químicos de las plantas.

Fitoquímico: Está formado por el prefijo fitos que significa “planta”, y la

palabra químicos, es decir, textualmente, significaría “Los productos

químicos de las plantas”. Los fotoquímicos son sustancias que se encuentran

en los alimentos de origen vegetal, biológicamente activas, que no son

nutrientes esenciales para la vida (por lo menos a corto plazo), pero tienen

efectos positivos en la salud.

Fitosanitario: De la prevención y curación de las enfermedades de las plantas

o relacionado con ello.

65

Fitoterapia: Significa desde el punto de vista etimológico, terapia con

plantas, y se define como la ciencia que estudia el uso de productos de

origen vegetal con fines terapéuticos, para prevenir, atenuar o curar un

estado patológico. El concepto fitoterapia se acostumbra a aplicar a la

utilización terapéutica de productos con una actividad suave o moderada,

con márgenes terapéuticos amplios, con tratamientos menos agresivos y que

hacen de la Fitoterapia una terapia suave. Desde esta visión, la fitoterapia se

considera muy adecuada en el tratamiento de afecciones leves o moderadas,

y en afecciones crónicas.

Inhibición: Reducir, impedir o anular el crecimiento bacteriano.

Halo: Circulo generalmente claro que se forma alrededor de los discos de

sensibilidad al aplicarlo sobre el crecimiento bacteriano mediante ensayos

sobre efectos antibacterianos o antifúngicos en placas Petri conteniendo

algún medio de crecimiento o agar.

Hidroalcohólico/Hidroetanólico: Descripción de una solución en la que el

disolvente es una mezcla de agua y alcohol.

Inducir: Provocar una reacción.

Infección: Invasión y multiplicación de agentes patógenos en los tejidos de

un organismo.

In vitro: Dentro del vidrio.

Metabolito: Es cualquier sustancia producida durante el metabolismo

(digestión u otros procesos químicos corporales). El término metabolito

66

también se puede referir al producto que queda después de la

descomposición (metabolismo) de un fármaco por parte del cuerpo.

Metanol: Es un compuesto químico del grupo de los alcoholes, también

conocido bajo el nombre de alcohol metílico, siendo además, el alcohol más

sencillo del grupo. Su fórmula es CH3OH.

Potenciar: Aumentar el poder o la eficacia.

Producto Fitoterapéutico: Es el producto medicinal empacado y etiquetado,

cuyas sustancias activas provienen de material de la planta medicinal o

asociaciones de estas, presentado en estado bruto o en forma farmacéutica

que se utiliza con fines terapéuticos. También puede provenir de extractos,

tinturas o aceites. No podrá contener en su formulación principios activos

aislados y químicamente definidos. Los productos obtenidos de material de

la planta medicinal que haya sido procesado y obtenido en forma pura no

serán clasificados como producto fitoterapéutico.

Reemergente: Que vuelve a emerger.

Sensibilidad: Capacidad que tienen las bacterias de soportar los efectos de

los antibióticos o biocidas destinados a eliminarlas o controlarlas.

Susceptibilidad: Susceptible es un término que viene del latín “susceptibĭlis”.

Susceptible indica la probabilidad que algo suceda, está vinculado a aquello

capaz de ser modificado o de recibir impresión por algo o alguien.

Tradicional: De la tradición o que está relacionado con ella por el modo de

transmitirse o por su permanencia de generación en generación.

67

a) b) c) d) e) f) g)

h) i) j) k) l) m)

Anexo 20. Screening fitoquímico de Opuntia ficus indica “tuna” loretana.

a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo; d)

Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo (+);

g) Fehling positivo (+); h) saponinas positivo (++); i) fenoles y taninos positivo

(+); j) aminoácidos y aminas positivo (+++); k) glicósidos cardiotónicos

negativo; l) flavonoides negativo; m) mucilago positivo (+).

68

a) b) c) d) e) f)

g) h) i) j) k) l)

Anexo 21. Screening fitoquímico Cassia reticulata “retama”


Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo (+);

g) Fehling positivo (++); h) saponinas positivo (++); i) fenoles y taninos

positivo (++); j) aminoácidos y aminas positivo (+); k) glicósidos cardiotónicos

negativo; l) flavonoides negativo.

69

a) b) c) d) e) f)

g) h) i) j) k) l)

Anexo 22. Screening fitoquímico Physalis angulata “bolsa mullaca”


Liberman – Burchard positivo (++); e) Borntrager negativo; f) Baljet positivo

(+++); g) Fehling positivo (+); h) saponinas positivo (+); i) fenoles y taninos

negativo; j) aminoácidos y aminas positivo (+); k) glicósidos cardiotónicos

negativo; l) flavonoides negativo.

70

a) b) c) d) e) f)

h) i) j) k) l)

Anexo 23. Screening fitoquímico Erythrina fusca “amasisa”

a) Rx. Dragendorff negativo; b) Rx. Mayer negativo; C) Rx. Wagner negativo;

d) Liberman – Burchard negativo; e) Borntrager negativo; f) Baljet

positivo (+); g) Fehling negativo; h) saponinas positivo (+); i) fenoles y

taninos positivo (++); j) aminoácidos y aminas positivo (++); k) glicósidos

cardiotónicos negativo; l) flavonoides negativo.

71

Anexo 24. Antibiograma.

Figura 1. Antibiograma de Escherichia coli

ATCC 35218 frente a extracto etanólico

de Opuntia ficus indica “tuna”.


O157:H7 frente a extracto etanólico de

Opuntia ficus indica “tuna”.

Figura 3. Antibiograma de Enterococcus faecalis

ATCC 51299 frente a extracto etanólico de

Opuntia ficus indica “tuna”.

Figura 4. Antibiograma de Pseudomonas sp.,

frente a extracto etanólico de Opuntia ficus

indica “tuna”.

Figura 5. Antibiograma de Salmonella typhi frente a

extracto etanólico de Opuntia ficus indica “tuna”.

72

Figura 6. Antibiograma de Escherichia coli ATCC

35218 frente a extracto etanólico Physalis

angulata “bolsa mullaca”.


O157:H7 frente a extracto etanólico Physalis


Figura 8. Antibiograma de Enterococcus faecalis ATCC

51299 frente a extracto etanólico Physalis angulata

“bolsa mullaca”.

Figura 9. Antibiograma de Pseudomonas sp.,

frente a extracto etanólico Physalis



extracto etanólico Physalis angulata “bolsa mullaca”.

73


35218 frente a extracto etanólico Erythrina fusca

“amasisa”.

Figura 12. Antibiograma de Escherichia

coli O157:H7 frente a extracto etanólico

Erythrina fusca “amasisa”.

Figura 13. Antibiograma de Enterococcus

faecalis ATCC 51299 frente a extracto etanólico

Erythrina fusca “amasisa”.

Figura 14. Antibiograma de Pseudomonas

sp., frente a extracto etanólico Erythrina

fusca “amasisa”.

Figura 15. Antibiograma de Salmonella typhi frente

a extracto etanólico Erythrina fusca “amasisa”.

74


35218 frente a extracto etanólico Cassia reticulata

“retama”.

Figura 17. Antibiograma de Escherichia

coli O157:H7 frente a extracto etanólico

Cassia reticulata “retama”.

Figura 18. Antibiograma de Enterococcus faecalis

ATCC 51299 frente a extracto etanólico Cassia

reticulata “retama”.

Figura 19. Antibiograma de

Pseudomonas sp. frente a extracto

etanólico Cassia reticulata “retama”.


extracto etanólico Cassia reticulata “retama”.

75

Anexo 25. Datos etnobotánicos de las plantas investigadas

Nombre Científico

Familia Nombre común

Parte usada

Sitio de recolección*

Usos populares

Cassia reticulata

fabaceae retama fruto IMET Tratamiento de

infecciones urinarias y diurético

Opuntia ficus indica

cactácea. tuna cladiodo o penca

IMET Tratamiento de la tos seca

y abscesos

Physalis angulata

solanaceae bolsa

mullaca planta entera

IMET

Tratamiento de diabetes, hepatitis, asma,

paludismo, sarna; antinflamatorio y

desinfectante, se usa además como diurético.

Erythrina fusca

fabaceae amasisa corteza IMET Tratamiento de úlceras, hemorroides, micosis y

antiséptico.

*Sitio de recolección: IMET, Instituto de Medicina Tradicional, Región de Loreto, ciudad de Iquitos.

Anexo 26. Antimicrobiana por el método de disco difusión-INS.

ANTIBIOGRAMA DE Enterococcus spp.

MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton

INOCULO: Método del crecimiento o suspensión directa de la colonia

DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA

Grupo I:

Ampicilina

Gentamicina (disco con contenido de

120 mg)

Estreptomicina (disco con contenido

de 300 mg)

Vancomicina

Grupo II:

Teicoplanina

Rifampicina

Cloramfenicol

Tetraciclina

76

Eritromicina

Nitrofurantoína (1)

Norfloxacina (1)

Ciprofloxacina (1)

Levofloxacina (1)

(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vías

urinarias

Resistencias Naturales: Los enterococos son resistentes a Oxacilina, Cefalosporinas,

Clindamicina, y Cotrimoxazol.

Los enterococos presentan una resistencia de bajo nivel a los Aminoglucósidos, lo

cual no suprime la sinergia con los betalactámicos, por tanto deben utilizarse discos

con mayores concentraciones de antibiótico que las habituales buscando detectar

una resistencia de alto nivel que si elimina el efecto sinérgico.

Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus son resistentes a los

glicopéptidos.

Incubación: 35°C

Lectura: A las 16 – 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina

77

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS CRÍTICOS

Antibióticos y diámetros críticos

Reglas para la lectura e interpretación del antibiograma

Disco de Ampicilina:

a. Si la cepa es sensible a Ampicilina lo es también a Penicilina, la Amoxicilina,

asociaciones de penicilinas e inhibidores de betalactamasas, e Imipenem.

b. En caso de resistencia a Ampicilina, se recomienda la realización del test de la

nitrocefina para la detección de una penicilinasa. Esta resistencia enzimática a

Ampicilina (test de la nitrocefina positivo) es cruzada con Penicilina y Amoxicilina.

78

Discos de Vancomicina y Teicoplanina: Si la cepa es intermedia a Vancomicina y/o

Teicoplanina, se recomienda la medición de la CIM de estos antibióticos para

descartar una posible resistencia.

Discos de Gentamicina y Estreptomicina: Si la cepa es intermedia a Gentamicina y/o

Estreptomicina, se recomienda la medición de la CIM de estos antibióticos para

descartar una posible resistencia de alto nivel.

Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de

Tetraciclina es válido también para Doxiciclina y Minociclina.

Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de

Eritromicina es válido también para Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.

CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Staphylococcus aureus ATCC 25923

ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa

MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton.

INOCULO: Método del crecimiento o suspensión directa de la colonia. Ajustar a la

turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland.


Grupo I:

Ceftazidima

Imipenem y/o Meropenem

Gentamicina

Amikacina

Ciprofloxacina

Grupo II:

Aztreonam

79

Cefoperazona/sulbactam

Cefepime

Norfloxacina (1)

Ofloxacina (1)

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vías urinarias

Resistencias Naturales: Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina,

Ampicilina, Amoxicilina, Cefalosporinas de primera y segunda generación,

Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, Ácido Nalidíxico y

Ácido Pipemídico.

INCUBACIÓN: 35°C

LECTURA: A las 16 – 18 h.



Reglas para la lectura e interpretación del antibiograma

80

Disco de Ceftazidima: Si la cepa tiene susceptibilidad intermedia (I) o resistente (R) a

Ceftazidima debe informarse también como intermedia (I) o resistente (R) al

Aztreonam aun cuando el resultado del disco indique sensibilidad (resistencia

cruzada).

Disco de Aztreonam: Una resistencia aislada del Aztreonam en relación con una

sensibilidad conservada para los otros betalactámicos (cefalosporinas y

carbapenems) es posible y debe informarse como tal.

Discos de carbapenems:

a. Si una resistencia disociada entre Meropenem e Imipenem (sensible a uno y

resistente al otro) es detectada deberá verificarse la técnica y repetirse la prueba. Si

la resistencia disociada se confirma, la cepa deberá ser enviada al INS.

b. Una resistencia aislada a Imipenem y/o Meropenem en relación con una

sensibilidad conservada para otros betalactámicos (cefalosporinas, monobactams y

combinaciones cefalosporina / inhibidor de betalactamasas) es posible y debe

informarse como tal.

Cepa de Referencia para el control de calidad interno:

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae

MEDIO DE CULTIVO: Agar Müller Hinton

INOCULO: Método de crecimiento o suspensión directa de la colonia. Ajustar a la

turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala de Mc. Farland.

81


Grupo I:

Ampicilina

Cefalotina

Ampicilina / Sulbactam o Amoxicilina /

Ácido Clavulánico.

Cefuroxima

Cefotaxima o Ceftriaxona

Gentamicina

Amikacina

Ácido Nalidíxico (1)

Norfloxacina (1)

Ciprofloxacina

Cotrimoxazol

(Trimetoprim/Sulfametoxazol)

Nitrofurantoína (1)

Grupo II:

Cefoxitina

Aztreonam

Ceftazidima

Cefixima

Cefoperazona/Sulbactam

Cefepime o Cefpirome

Imipenem o Meropenem

Cloramfenicol

Ofloxacina (1)

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vías urinarias.

Antibióticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp. y Shigella spp.

aisladas de coprocultivos:

Ampicilina

Cloramfenicol

Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol)

Ciprofloxacina

Cefotaxima

82

Resistencias Naturales: Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina,

Macrólidos, Clindamicina y Glicopéptidos.

Klebsiella spp es resistente a las Aminopenicilinas.

Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes son resistentes

a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas,

Cefalosporinas de primera generación y Cefuroxima.

Serratia marcescens es resistente a las Aminopenicilinas,

Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera

generación y Cefoxitina.

Proteus mirabilis es resistente a Nitrofurantoína.

Proteus vulgaris es resistente a las Aminopenicilinas, Cefalosporinas de primera

generación, Cefuroxima y Nitrofurantoína.

Morganella morganii es resistente a las Aminopenicilinas,


generación, Cefuroxima y Nitrofurantoína.

Providentia stuartii es resistente a las Aminopenicilinas,


generación, Gentamicina (bajo nivel) y Nitrofurantoína.

INCUBACIÓN: 35°C

LECTURA: 15-18 h



83

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