BIBLIOTECAFaculdade de Ciências Farmacêuticas

Universidade de São Paulo

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Programa de Pós-Graduação em FarmáciaÁrea de Análises Clínicas

Alterações na resposta imune inata e adaptativa induzidas porEscherichia calí enterainvasora em modelo murino

Juliana Mata Khalil Amhaz

Tese para obtenção do grau deDOUTOR

Orientador:Prafa. Tit. Marina Baquerizo MartinezCo-orientador:Praf. Dr. Sandro Rogério de Almeida

São Paulo2007

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DEDALUS - Acervo - CQ

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Ficha CatalográficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e

Documentação do Conjunto das Químicas da USP.

Amhaz, luliana Mata KhalilAS15a Alterações na resposta imune inata e adaptativa induzidas

por Escherichia coli enteroinvasora em modelo murino I JulianaMota Khalil Amhaz. -- São Paulo, 2006.

118p.

Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticasda Universidade de São Paulo. Departamento de AnálisesClínicas e Toxicológicas.

Orientador: Martinez, Marina BaquerizoCo-orientador: Almeida, Sandro Rogério de

1. Microbiologia médica 2. Microorganismo patogênico3. Relação hospedeiro-parasita I. T. lI. Martinez. MarinaBaquerizo, orientador. III. Almeida, Sandro Rogério de,co-orientador.

616.01 COD

Juliana Mota Khalil Amhaz

Alterações na resposta imune inata e adaptativa induzidas porEscherichia cali enteroinvasora em modelo murino

Comissão Julgadorada

Tese para obtenção do grau de Doutor

Prafa. Tit. Marina Baquerizo Martinezorientador/presidente

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U~~a-~~~2°. examinador

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São Paulo, ~ ok ~e cJjXF':, .

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Agradecimentos

À Prafa. Tit. Marina Baquerizo Martinez, por ter me recebido em seulaboratório, e por estes dez anos de orientação.

Ao Praf. Dr. Sandra Rogério de Almeida, pela valiosa co-orientação epaciência nas correções finais da tese.

Ao Praf. Tit. Momtchilo Russo, por ter aceitado colaborar com este trabalho,pelas contribuições fundamentais e pela amizade.

Ao John, por todo o auxílio científico e por ter se tornado nestes anos o meumelhor amigo.

Ao Lucas, pelo auxílio valioso na execução dos experimentos e pelaamizade.

À Andyara, pela amizade e por me encorajar na reta final.

À Patrícia, Nilton e Marina, pelos bons momentos compartilhados.

À Estela, Antônio, Cristina, Priscila, Silvia e Vanessa, meus antigos colegasde laboratório, que estiveram presentes nos estágios iniciais dodesenvolvimento deste trabalho.

À Agda e a Carla, por terem guiado meus primeiras passos no laboratório.

Aos Professores Eisa Mamizuka, Primavera Borelli, Ana Campa e AntônioAltair, por permitirem a utilização de seu laboratório e pelo agradávelconvívio de todos estes anos.

Aos colegas do laboratório de Micologia, em especial ao Eliver e a Glória,pelo auxílio e amizade.

Aos colegas do laboratório de Parasitologia pelos empréstimos e convívioagradável.

À Karina, Esther e Eliane, do laboratório do Praf. Momtchilo, pelo auxílio nosensaios de FACS, NO e citocinas.

Ao Praf. Dr. Gustavo Amarante Mendes e sua aluna Jaqueline, pelo auxíliono ensaio de viabilidade dos macrófagos.

Ao Prof. Carlos Alberto Moreira Filho e a Patrícia Renovato Tobo, peloauxílio no ensaio de PCR em tempo real.

À Silvânia, Renata, Flávia e Fátima, do biotério do conjunto das químicas.

À Regina, do biotério do Instituto de Ciências Biomédicas.

Às secretárias do departamento de Análises Clínicas Ana, Sueli, Dora eEdna.

Às "meninas" da limpeza Dorlei, Cláudia, Carmem e Rose.

Ao Jorge e a Elaine, da secretaria de pós-graduação.

Ao José Edgar, pelo auxílio na análise densitométrica dos ensaios de RT­PCR.

À minha família, em especial aos meus tios Bene, Vicente e Eliza, por toda atorcida.

À Tânia, Lívia, Alexandre, Lígia e André, pela amizade de todos estes anos.

À Andrezza, mais que uma prima, uma grande amiga.

À FAPESP, pela bolsa de doutorado, pelo financiamento do projeto, e porinvestir no desenvolvimento da ciência no país.

Aos camundongos que foram sacrificados para a realização deste trabalho.

RESUMO

Durante uma infecção, uma complexa seqüência de eventos é inkiadaapós a invasão do hospedeiro por microrganismos patogênicos. Escherichíacolí enteroinvasora (EIEC), assim como Shigella, causa disenteria através dainvasão da mucosa do cólon, levando à destruição tecidual e inflamação. Paraque ocorra um processo infeccioso, porém, são necessários inóculos de 102

Shigella e 106 EIEC. Foram avaliados aspectos da resposta inflamatóriadesencadeada pela infecção por EIEC em modelo murino, comparativamentea Shigella. A infecção de macrófagos J774 por EIEC resultou em fagocitosebacteriana, comprometimento da viabilidade do macrófago e produção decitocinas. Macrófagos de camundongos C57BU6 infectados com EIECproduziram NO, que parece ser importante no controle da infecção. Foiobservado que camundongos INOS nocaute apresentaram maior produção decitocinas pró-inflamatórias e maior letalidade após infecção do que osselvagens. EIEC induziu a migração de granulócitos e monócitos para operitônio, e a secreção de citocinas por estas células. Houve proliferação delinfócitos em resposta aos antígenos solúveis de EIEC, mas não foi detectadaprodução de citocinas por estes linfócitos.Comparativamente a Shigella, EIECescapou mais lentamente do macrófago, induziu menor produção de citocinaspró-inflamatórias e NO, e menor ativação dos linfócitos T. Estes dadossugerem o desafio com EIEC desencadeia uma resposta menos severa nohospedeiro do que Shigella, o que explicaria a forma mais branda de disenteriae resolução mais rápida do processo infeccioso causado por EIEC.

ABSTRACT

During an infection, a complex sequence of events in iniciated afterinvasion of the host by pathogenic microorganisms. EnteroinvasiveEscherichia coli (EIEC) and Shigella cause dysentery by means of invading thecolonic mucosa, leading to tissue destruction and inflammation. In arder for aninfectious process to occur, inocula of 102 Shigella are necessary incontrast toe 106 EIEC. The infection of J774 macrophages by EIEC resulted inphagocytosis of the bacterium, a hindering of the viability of the macrophageand in the production of cytokines. Macrophages obtained from C57BU6 miceinfected with EIEC produced NO, which seems to be important for the control ifinfection. We observed that in iNOS knockout mice, both the production of pro­inflammatory cytokines and lethality were higher than that observed in wild-typemice. EIEC induced the migration of granulocytes and monocytes to theperitoneum as well as the secretion of cytokines by these cells. We observed aproliferation of Iymphocytes in response to inoculation with soluble EIECantigens, however, in this case, the production of cytokines was not detected.Compared to Shigella, EIEC was slower in escaping from the macrophage, andinduced a shyer production of pro-inflammatory cytokines and NO, as well aspromoted a smaller activation of T Iymphocytes. These data suggest that whenchallenged with EIEC, the host produces a less severe response than thatelicited by Shigella, which might explain why the infectious process with EIECproduces a milder form of dysentery with a quicker resolution.

SUMÁRIO

1. Introdução

1.1 - O sistema mononuclear fagocítico

1.2 - Ativação de macrófagos

1.2.1 - Reconhecimento do patógeno e fagocitose

1.2.2 - Os receptores "TolI-like"

1.2.3 - Produção de espécies reativas de nitrogênio

1.3 - Macrófago: ponte entre a imunidade inata e a adaptativa

1.3.1 - B7-1 e B7-2

1.3.2 - Geração da resposta adaptativa

1.4 - O macrófago e os enteropatógenos

1.5 - Disenteria bacilar

1.6 - Shígella spp.

1.6.1 - Geração da resposta imune na infecção por Shígella

1.6.2 - Participação dos linfócitos T na patogênese da shigelose

1.7 - Escherichía colí enteroinvasora

2. Objetivos

2.1 - Objetivo geral

2.2 - Objetivos Específicos

3. Material e Métodos

3.1 - Amostras Bacterianas

3.2 - Padronização do inóculo bacteriano

3.3 - Cultura celular

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3.4 - Obtenção dos macrófagos de camundongo 28

3.5 - Extração de RNA e síntese de DNA complementar 29

3.6 - PCR em tempo real 29

3.7 - RT-PCR semiquantitativo 30

3.8 - "Enzyme-Iynked immunosorbent assay" (ELISA) para quantificação 32das citocinas

3.9 - Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro') 33

3.9.1 - Sobrevivência bacteriana no interior dos macrófagos- 33

3.9.2 - Escape bacteriano após fagocitose e determinação da viabilidade 34dos macrófagos

3.9.3 - Produção de citocinas por macrófagos infectados 35

3.10- Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BU6 e 36C57BU6 iNOS KO (ensaios "in vitro")

3.10.1 - Produção de óxido nítrico (NO) 36

3.10.2 - Transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e do TLR4 36

3.10.3 - Produção de TNF-a e IL-10 37

3.11 - Interação entre EIEC e camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO 37"in vivo"

3.11.1 - Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção 37

3.11.2 - Análise da transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e 39do TLR4

3.11.3 - Produção de TNF-a e IL-10 39

3.11.4 - Determinação da mortalidade de camundongos C57BU6 e 39C57BU6 iNOS KO após infecção

3.12 - Resposta de linfócitos à infecção por EIEC 40

3.12.1 - Ensaio de linfoproliferação 40

3.12.1.1 - Obtenção de linfócitos 40

3.12.1.2 - Obtenção de Antígenos Solúveis 40

3.12.1.3 - Linfoproliferação 41

3.12.2 - Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4 42

3.12.3 - Determinação das subpopulações de linfócitos 42

4. Resultados 44

4.1 - Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro") 44

4.1.1 - Determinação do número de bactérias viáveis no interior de 44macrófagos J774 após fagocitose

4.1.2 - Determinação do escape bacteriano após fagocitose 45

4.1.3 - Determinação da viabilidade dos macrófagos infectados 46

4.1.4 - Cinética da transcrição dos genes de TNF-a, IL-1 e IL-10 por PCR 47em tempo real

4.1.5 - Determinação da produção de TNF-a, IL-1 e IL-10 por ELISA 50

4.2 - Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BU6 e 52C57BU6 iNOS KO (ensaios "in vitro")

4.2.1 - Determinação da produção de NO pelo método de Griess 52

4.2.2- Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, da enzima 53iNOS e do TLR4 por RT-PCR semiquantitativo

4.2.3 - Determinação da produção de TNF-a e IL-10 por ELISA 60

4.3 - Interação entre EIEC e camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO 63"in vivo"

4.3.1 - Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção 63

4.3.2 - Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, iNOS 68eTLR4 por RT-PCR semiquantitativo

4.3.3 - Determinação da produção de IL-1, IL-10 e IFN-y por ELISA 77

4.3.4 - Determinação da mortalidade de camundongos C57BU6 e 82C57BU6 iNOS KO após infecção

4.4 - Resposta de linfócitos à infecção por EIEC

4.4.1 - Linfoproliferação

4.4.2 - Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4

4.4.3 - Determinação das subpopulações de linfócitos

5. Discussão

6. Conclusões

7. Referências Bibliográficas

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática da patogênese da infecção porShigella

Figura 4.1 - Unidades Formadoras de Colônia de Shigella flexneriM9üT e EIEC FBC124/13 em lisados de macrófagosJ774 após diferentes intervalos de infecção.

Figura 4.2 - Unidades Formadoras de Colônia de Shigella flexneriM9üT e EIEC FBC124/13 no sobrenadante de culturasde macrófagos J774 após diferentes intervalos deinfecção.

Figura 4.3 - Determinação de alterações na viabilidade dosmacrófagos J774 em diferentes intervalos de infecçãopor Shigella flexneri M9üT e EIEC FBC124/13.

Figura 4.4 - Transcrição relativa do gene de TNF-y avaliada por PCRem tempo real.

Figura 4.5 - Transcrição relativa do gene de IL-1 avaliada por PCR emtempo real.

Figura 4.6 - Transcrição relativa do gene de IL-1ü avaliada por PCRem tempo real.

Figura 4.7 - Determinação, por ELISA de captura, da produção deTNF-y, IL-1 e IL-1ü por macrófagos J774 não infectadose infectados por sete horas com Shigella flexneri M9üT eEIEC FBC124/13.

Figura 4.8 - Determinação da produção de NO por macrófagosinfectados com Shigella M9üT e EIEC FBC124/13 pelométodo de Griess.

Figura 4.9 - Transcrição relativa do gene de TNF-a por macrófagos decamundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.10 -Transcrição relativa do gene de IL-1ü por macrófagos decamundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

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Figura 4.11 - Transcrição relativa do gene de IL-1 por macrófagos de 57camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.12 - Transcrição relativa do gene de IL-18 por macrófagos de 58camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.13 - Transcrição relativa do gene da TLR4 por macrófagos de 59camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.14 - Transcrição relativa do gene de TNF por macrófagos de 60camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.15 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de 61TNF-a por macrófagos de camundongos C57BU6 eC57BU6 iNOS após 4 horas de infecção.

Figura 4.16 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de 62IL-10 por macrófagos de camundongos C57BU6 eC57BU6 iNOS após 4 horas de infecção.

Figura 4.17 - Número de células em camundongos C57BU6 não 64infectados e após 12, 24 e 48 horas de infecção comShigella M90T e EIEC FBC124/13 determinado porcitometria de fluxo.

Figura 4.18 - Análise da transcrição de MHCII por macrófagos em 65peritônio de camundongos não infectados (linha preta)e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e 48h (linhaazul) de infecção com Shigella flexneri M90T e EIECFBC124/13.

Figura 4.19 - Análise da transcrição de CD80 por macrófagos em 66peritônio de camundongos não infectados (linhavermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e48h (linha azul) de infecção com Shigella flexneri M90Te EIEC FBC124/13.

Figura 4.20 - Análise da transcrição de CD86 por macrófagos em 67peritônio de camundongos não infectados (linhavermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e

48h (linha azul) de infecção com Shigella f1exneri M9DTe EIEC FBC124/13.

Figura 4.21 - Análise da transcrição de F4/8D por macrófagos em 68peritônio de camundongos não infectados (linhavermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e48h (linha azul) de infecção com Shigella f1exneri M9DTe EIEC FBC124/13.

Figura 4.22 - Transcrição relativa do gene de TNF-a por células 69peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.23 - Transcrição relativa do gene de IL-1D por células 71peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.24 - Transcrição relativa do gene de IL-1 por células 72peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.25 - Transcrição relativa do gene de IL-18 por células 73peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.26 - Transcrição relativa do gene de IFN-y por células 74peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo .

Figura 4.27 - Transcrição relativa do gene de TLR4 por células 75peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.28 - Transcrição relativa do gene de IP-1D por células 76peritoniais de camundongos C57BLl6 e C57BU6 iNOSKO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo.

Figura 4.29 - Transcrição relativa do gene da iNOS por células 77peritoniais de camundongos C57BU6 após 4 e 48horas de infecção, avaliada por RT-PCRsemiquantitativo.

Figura 4.30 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de 79TNF-a por células peritoniais de camundongosC57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas deinfecção.

Figura 4.31 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de IL- 8010 por células peritoniais de camundongos C57BU6 eC57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção.

Figura 4.32 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de 82IFN-y por células peritoniais de camundongos C57BU6e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção.

Figura 4.33 - SDS-PAGE dos antígenos secretados por EIEC 84FBC124/13 e Shigella M90T após 5 horas de incubaçãoem contato com células Hep-2.

Figura 4.34 - índice de proliferação de linfócitos de camundongos 85imunizados com Shigella flexneri M90T e EIEC FBC124/13.

Figura 4.35 - índice de proliferação de linfócitos de camundongos 88imunizados com Shigella flexneri M90T, EIECFBC124/13 e E.coJi K12 por sete dias e posteriormenteestimulados com 100 ~g de antígenos solúveis deM90T, EIEC e K12.

Figura 4.36 - Produção, de IL-10 e IFN-y por linfócitos de 89camundongos Balb/C imunizados com Shigella flexneriM90T e EIEC FBC 124/13 e posteriormenteestimulados por 72h com antígenos solúveis deShigella e EIEC, respectivamente.

Figura 4.37 - Citometria de fluxo de células dos Iinfonodos de 90camundongos infectados com Shigella M90T e EIECFBC24/13.

1 -INTRODUÇÃO

Durante uma infecção, uma complexa seqüência de eventos é iniciada

após a invasão do hospedeiro por microrganismos patogênicos (MEDZHITOV

& JANEWAY, 2000).

Para estabelecer e manter uma infecção, os patógenos microbianos têm

desenvolvido uma série de estratégias para invadir o hospedeiro, evitar ou

resistir à resposta imune, e colonizar sítios específicos do organismo

(COSSART & SANSONETTI, 2004; SANSONETTI & DI SANTO, 2007).

Por outro lado, o sistema imune inato é responsável por detectar os

primeiros sinais da infecção e mantê-Ia sob controle até que a imunidade

adaptativa instale uma resposta eficiente. As células componentes da

imunidade inata detectam as infecções bacterianas por meio de receptores

que se ligam a estruturas comumente expressas em microrganismos, mas não

nas células do hospedeiro. Esta ligação desencadeia uma cascata de

sinalização que leva, em última instância, à expressão de genes pró­

inflamatórios e secreção de uma série de mediadores (MEDZHITOV &

JANEWAY, 2000; GRASSL & FINLAY, 2007).

Neste contexto, as interações entre microrganismos e macrófagos

desempenham um papel crucial na patogênese de muitas infecções. Os

macrófagos são células fundamentais da resposta imune inata e adaptativa,

funcionando como "sentinelas" que guardam os pontos potenciais de infecção.

Os patógenos encontram os macrófagos assim que ganham acesso aos

tecidos do hospedeiro e o resultado deste encontro determina se o hospedeiro

2

vai produzir uma resposta imune eficiente ou se o patógeno vai estabelecer

com sucesso a infecção (NAVARRE & ZYCHLlNSKY, 2000).

1.1 - O sistema mononuclear fagocítico

O sistema mononuclear fagocítico é definido como uma linhagem celular

derivada de células progenitoras da medula óssea. É constituído por

monoblastos e promonócitos da medula óssea, monócitos do sangue e

macrófagos residentes. Estes últimos encontram-se amplamente distribuídos

em diferentes tecidos, exibindo uma grande heterogeneidade fenotípica e

funcional (PAULNOCK, 2000; HUME, 2006).

O macrófago origina-se do monócito sanguíneo, cuja célula precursora

na medula é o monoblasto. Após migração para sítios extravasculares o

monócito sofre um processo de maturação, sendo então denominado

macrófago residente. O processo de diferenciação resulta tanto em perda

como em aquisição de características fenotípicas e funcionais. (PAULNOCK,

2000; GORDON, 2002).

Os macrófagos podem se apresentar como células fixas em tecidos ou

como macrófagos livres. Alguns macrófagos tissulares recebem denominações

específicas, como células de Kupffer (fígado), microglia (sistema nervoso

central), células de Langerhans (pele). Macrófagos livres estão presentes em

uma série de localizações anatômicas, como espaço alveolar e cavidade

peritonial (PAULNOCK, 2000; GORDON, 2002).

A migração do monócito para os tecidos é mediada por moléculas

expressas na sua superfície e de células endoteliais. Estas moléculas,

3

denominadas moléculas de adesão, são agrupadas em três grandes famílias:

A superfamília das imunoglobulinas, das selectinas e das integrinas. A L­

selectina é expressa em leucócitos enquanto a P e a E selectinas são

expressas no endotélio. As ~2 integrinas são expressas na superfície dos

leucócitos e se ligam aos seus receptores da família das imunoglobulinas (as

"intracellular adhesion molecules", ICAM-1, 2 e 3), expressas na superfície de

células endoteliais. Em processos inflamatórios, um número maior de

monócitos migra através do endotélio vascular a fim de alcançar o sítio de

infecção (PANES e coL, 1999; MARSHALL & HASKARD, 2002).

Os fagócitos mononucleares participam de numerosos processos

homeostáticos e imunológicos. Sua atividade endocítica é responsável pela

remoção de células apoptóticas e debris celulares, e pela fagocitose de

microrganismos e apresentação de antígenos aos linfócitos para geração da

resposta imune celular e humoral (GORDON, 1998; UNDERHILL e coL, 1999).

Além disso, estas células possuem uma grande atividade secretora. Algumas

moléculas são secretadas constitutivamente, mas a maioria delas é produzida

apenas após ativação por produtos bacterianos, por exemplo. Entre as

moléculas secretadas estão os mediadores lipídicos, enzimas, citocinas, e

receptores de citocinas (PAULNOCK, 2000).

Citocinas são proteínas que desempenham funções fisiológicas e

inflamatórias. IL-3 e os CSF ("colony stimulating factor") , por exemplo, atuam

na hemopoiese, promovendo a proliferação e maturação de células miéloides,

granulócitos e monócitos (HUME, 2002). Outras citocinas são essenciais na

indução e resolução de processos inflamatórios. IL-1, IL-5, IL-18, TNF-a, IL12

'"

4

e IFN-y são exemplos de citocinas pró-inflamatórias que participam da ativação

de macrófagos e linfócitos T e estimulam o influxo celular. TGF-13 e IL-10,

citocinas anti-inflamatórias, têm como função principal limitar a magnitude da

infecção, inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias por macrófagos e

linfócitos (GORDON, 1998; PAULNOCK, 2000; GORDON, 2002).

1.2 - Ativação de macrófagos

O surgimento de anormalidades no tecido, como traumas, infecções ou

células neoplásicas ocasiona um rápido recrutamento de macrófagos. Os

macrófagos recrutados exibem diferenças fenotípicas dos residentes que

dependem da natureza e localização do estímulo. O termo genérico

"macrófago ativado" é comumente usado para descrever este processo,

(GORDON, 2002; HUME, 2006).

Macrófagos ativados apresentam aumento na capacidade microbicida e

tumoricida, resultante do aumento na produção de espécies reativas de

nitrogênio (RNI) e oxigênio (ROI). Apresentam, também, aumento na

capacidade de apresentar antígenos para as células T, pelo aumento na

expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC),

e moléculas co-estimulatórias, principalmente 87-1 e 87-2 (MEDZHITOV &

JANEWAY, 1997; NASCIMENTO e coL, 2003).

O processo de ativação celular está relacionado a um aumento na

expressão, ou ainda, à supressão de genes que codificam proteínas

essenciais para o desempenho de funções como fagocitose, processamento e

apresentação de antígenos, inativação e destruição de microrganismos,

5

ativação e proliferação dos próprios macrófagos e outros tipos celulares. Uma

análise do transcriptoma de macrófagos murinos mostrou que, em resposta a

estímulos como o LPS, há uma grande mudança no perfil de expressão de

genes. Os genes que são expressos em altos níveis no estado basal são

fortemente reprimidos pela ativação com LPS, enquanto a expressão de outros

genes é fortemente ativada (HUME, 2002). Entre os genes cuja expressão é

ativada por LPS, podemos citar genes que codificam citocinas (IL-1, TNFa, IL­

6, IL-12, IL-10, MIP, IP-10), fatores de transcrição, enzimas, (hidrolases,

colagenases), enzimas relacionadas à produção de óxido nítrico e

prostaglandinas (iNOs, arginase, cicloxigenases), moléculas relacionadas à

apresentação de antígeno (MHCII, 87.1, 87.2), entre outros.

1.2.1 - Reconhecimento do patógeno e fagocitose

Entre as estratégias para internalizar partículas desenvolvidas pelas

células ao longo da evolução das espécies está a fagocitose, mecanismo de

captura de partículas grandes dependente de actina. Em organismos

unicelulares a fagocitose é utilizada para aquisição de nutrientes, enquanto

que em metazoários é desempenhada principalmente por células fagocíticas

especializadas, como macrófagos, células dendríticas e neutrófilos (ADEREM

& UNDERHILL, 1999; ADEREM, 2002). Entretanto, outros tipos celulares,

como células epiteliais e fibroblastos, também apresentam a capacidade de

internalizar partículas, tanto em cultura quanto "in vivo". Estas células,

denominadas fagócitos não-profissionais, não possuem receptores de

imunoglobulinas e complemento, e também não secretam toda a gama de

6

citocinas secretadas pelos fagócitos especializados. Sua capacidade

fagocítica, portanto, é limitada (RABINOVICH, 1995). A fagocitose por células

do epitélio intestinal é importante na patogênese de algumas infecções, como

a shigelose (item 1.6).

O reconhecimento de componentes alterados do hospedeiro ou

estranhos é mediado por receptores de membrana do macrófago. A ligação do

componente ao receptor gera sinais intracelulares que são responsáveis pelo

rearranjo e polimerização da actina e coordenam as forças tracionais que

internalizam as partículas (ADEREM & UNDERHILL, 1999; ADEREM, 2002).

O reconhecimento de patógenos consiste em uma séria dificuldade para

a imunidade inata, devido à enorme variabilidade e alta taxa de mutação

característica dos microrganismos. Em contrapartida, o sistema imune inato

desenvolveu receptores que têm como alvos estruturas moleculares que (i)

são comuns a grandes grupos de patógenos, (ii) são produzidos por

patógenos, não pelo hospedeiro e (iii) são essenciais para a sobrevivência ou

patogenicidade do microrganismo. Estas estruturas são denominadas padrões

moleculares associados a patógenos (PAMPs) (MEDZHITOV & JANEWAY,

1997; MEDZHITOV & JANEWAY, 2000).

Os PAMPs são reconhecidos pelos receptores denominados receptores

de reconhecimento de padrões (PRRs). Membros de várias famílias de

proteínas funcionam como PRRs. As mais proeminentes são os domínios de

Lectina tipo C, os receptores "scavenger" e os domínios ricos em repetições de

leucina (LRR). Os PRRs são expressos em células que são a primeira linha de

defesa do organismo, como células epiteliais, e também em células

7

apresentadoras de antígeno, como macrófagos e células dendríticas

(ADEREM & UNDERHILL, 1999; MEDZHITOV & JANEWAY, 2000).

Os PRRs estão envolvidos na opsonização de vírus e bactérias para

fagocitose ou ativação de complemento; na fagocitose de patógenos por

APCs; ou na ativação de vias de sinalização que ativam fatores transcricionais,

como NF-K8 e AP-1, responsáveis pela indução da expressão de mediadores

inflamatórios, entre eles citocinas, moléculas de adesão e enzimas como a

cicloxigenase 2 (COX-2) (GORDON, 1998; MUKHOPADHYAY e coL, 2004).

1.2.2 - Os receptores "TolI-like"

A identificação dos receptores To11 foi um grande avanço na

compreensão sobre o reconhecimento microbiano pelo sistema imune inato.

Seu envolvimento na imunidade inata foi inicialmente descrito em Drosophila,

e, posteriormente foram identificados homólogos em humanos, denominados

receptores ''TolI-like" (TLR). Tanto as proteínas TolI de humanos quanto de

Drosophila são receptores transmembrânicos que contém um domínio LRR

(Leucine-rich repeat) extracelular e um domínio citoplasmático (responsável

pela sinalização intracelular) que é homólogo ao domínio citoplasmático do

receptor da IL-1 (IL-1R), e, portanto, é chamado de domínio ToII/IL-1R (TIR)

(MEDZHITOV &JANEWAY, 2000).

Foi demonstrado que Drosophilas que apresentavam mutações em

genes de diferentes proteínas TolI mostraram ser suscetíveis a diferentes tipos

de patógenos, como fungos e bactérias Gram-negativas. Da mesma maneira,

existem dez membros da família dos TLRs em humanos e 11 em roedores já

8

identificados, que permitem às células do sistema imune inato reconhecer

diversas estruturas de microrganismos (TAKEDA e coL, 2003).

O primeiro receptor "toll-like" identificado foi o TLR4. Foi demonstrado

que duas linhagens de camundongos hipo-responsivas ao LPS, C3H/HeJ e

C57BL1O/ScCr, apresentavam mutações no gene Tlr4, confirmando que este

receptor é fundamental no reconhecimento do LPS. Além do LPS, o TLR4

reconhece outros ligantes, como o Taxol, um produto vegetal, e algumas

proteínas de choque tóxico (HSP60 e HSP70) (PERERA e coL, 2001; TAKEDA

e coL, 2003).

A expressão dos TLRs varia de acordo com o tipo celular. Os monócitos

e macrófagos possuem mRNA para todos os TLRs, com exceção de TLR3. Os

TLRs são expressos também em células epiteliais. A expressão de TLR4 por

células intestinais é relativamente baixa, e provavelmente está relacionada à

ausência de uma resposta inflamatória severa no intestino, apesar da

constante exposição ao LPS (TAKEDA e coL, 2003).

1.2.3 - Produção de espécies reativas de nitrogênio

Os RNI são compostos pelo radical óxido nítrico (NO), que em meio

aquoso reage formando outros radicais (N02), ânions(N02-, N03-), óxidos

(N20 3) e peróxidos (ONOO}

O NO é gerado em uma reação na qual uma molécula de L-arginina é

oxidada produzindo uma molécula de L-citrulina e uma de NO. A enzima que

catalisa esta reação é a NO sintase, que existe em três isoformas: endotelial

(eNOS, também conhecida como NOS3), neuronal (nNOS, também conhecida

9

como NOS1) e induzível (iNOS) (RESTA-LENERT & BARRET, 2002). Grosso

modo, a expressão de eNOS e nNOS é constitutiva, e a produção de NO por

estas isoformas é pequena e responsável pelas funções fisiológicas no

indivíduo saudável. A iNOS, no entanto, produz grandes quantidades de NO

após estímulo (daí o nome induzível), geralmente de natureza inflamatória e

infecciosa.

A expressão da iNOS ocorre em vários tipos celulares e é estimulada

por várias citocinas, como IL-113, TNF-a., IFN-y e componentes microbianos,

como o LPS.

O NO produzido pela iNOS desempenha um importante papel em

processos patológicos, sendo um dos responsáveis pelo efeito microbicida e

tumoricida de macrófagos ativados. Este efeito ocorre pela inibição de enzimas

das células-alvo, como GAPDH, ribonucleotídeo redutase, complexos I e IV da

cadeia respiratória, além de modificação do DNA (MACMICKING e coL, 1997,

CONNELLY e coL, 2001).

O NO produzido por macrófagos mostrou ter efeito citostático ou

citotóxico sobre uma série de patógenos, sejam eles bactérias, fungos ou

parasitas. Foi demonstrado que camundongos com uma deleção no gene da

iNOS apresentaram um aumento na suscetibilidade a infecções por

Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocitogenes, Toxoplasma gondii e

Leishmania major (WAY & GOLDBERG, 1998; CHAKRAVORTIY e coL,

2002). Estudos envolvendo camundongos infectados com M. tuberculosis

mostraram uma correlação entre expressão da iNOS e subseqüente resolução

da infecção, enquanto a falha na expressão desta enzima foi associada à

10

progressão da infecção (SHILOH & NATHAN, 2000). A importância do NO na

eliminação de SalmoneJla por macrófagos murinos também está documentada

(BABU e coL, 2006).

O NO também é importante na fisiopatologia do processo inflamatório,

pois estimula a síntese de citocinas, como IL-6 e TNF-a (MACMICKING e coL,

1997; NASCIMENTO e coL, 2002). Na patogênese da infecção por L.major, foi

evidenciado o papel da iNOS como indutor da produção de IFN-y. No princípio

da infecção há um aumento na produção de IFN-a, que induz um pequeno

aumento na expressão da iNOS, necessário à maturação das células NK.

Estas células produzem IFN-y, que estimula o incremento da expressão de

iNOS, levando à eliminação do parasita (SHILOH & NATHAN, 2000).

A produção de RNI pelos macrófagos reflete não só no aumento da sua

capacidade microbicida, mas também afeta a suscetibilidade destas células a

apoptose. Foi observado que pequenas concentrações de RNI produzidos por

macrófagos ativados retardam a apoptose por inibição dos sítios ativos das

caspases, proteínas que participam de um dos mecanismos de apoptose.

Porém, em altas concentrações, os RNI podem reagir com uma série de alvos

moleculares, levando à morte dos macrófagos por apoptose ou necrose

(SHILOH & NATHAN, 2000).

Além de seus efeitos fisiológicos e pró-inflamatórios, o NO em altas

concentrações também tem efeito imunossupressor. Em macrófagos murinos,

a regulação da expressão da iNOS é controlada pelo fator transcricional NF­

KB. O NO produzido em resposta a estímulos bacterianos, como o LPS,

estimula a ativação do NF-KB, resultando em aumento da produção de

11

mediadores inflamatórios responsáveis pelo recrutamento e ativação de

células no local da infecção. A produção de NO por estas células leva à

inibição da ativação do NF-K8, diminuindo assim a expressão dos genes das

citocinas, moléculas de adesão, e da própria iNOS. Este mecanismo está em

acordo com a necessidade do hospedeiro em produzir uma resposta rápida à

infecção, porém esta resposta deve ser suprimida a tempo de minimizar o

dano ao próprio hospedeiro (CONNELLY e col., 2001).

1.3 - Macrófago: ponte entre a imunidade inata e a adaptativa

Além da sua função efetora, os macrófagos também participam da

coordenação da resposta imune, através da produção de citocinas e

quimiocinas, e apresentação de antígenos às células T.

A ativação dos linfócitos T é descrita como resultado de várias

interações entre células apresentadoras de antígenos e células T. O MHC

proporciona interações moleculares entre o peptídeo processado e o receptor

da célula T (TCR) (UNDERHILL e col., 1999, PAULNOCK, 2000).

As APCs, após fagocitose e processamento enzimático, expõem o

peptídeo bacteriano associado ao MHCII, proporcionando assim o

reconhecimento antigênico pelos linfócitos TCD4T

• Os linfócitos TCDS+

reconhecem os antígenos sintetizados pela própria célula hospedeira, como

nos casos de infecções virais, associados ao MHCI (PAULNOCK, 2000).

Entretanto, só a ligação do MHC ao TCR não é suficiente para estimular

o linfócito. É necessário um segundo sinal, fornecido tanto por fatores solúveis,

como a IL-2, quanto pelas interações entre as moléculas coestimulatórias,

12

expressas na superfície de linfócitos e APCs. Uma das principais interações

coestimulatórias descritas envolve a molécula C028 e a família B7 de ligantes

(MEOZHITOV & JANEWAY, 1997; ALBA SOTO E COL., 2003).

1.3.1 - 87-1 e 87-2

As glicoproteínas B7-1 (C080) e B7-2 (C086) pertencem à superfamília

das imunoglobulinas e estão presentes em células B, macrófagos e células

dendríticas. Elas se ligam a C028, cuja expressão na superfície das células T

é constitutiva, mas aumenta após ativação; e CTLA-4, expresso apenas após

ativação da célula T (FREEMAN e coL, 1993; LENSCHOW E COL., 1996).

As interações de C080 e C086 com C028 são essenciais para iniciar a

produção de citocinas, promover a expansão e diferenciação dos clones

específicos de células T, e determinar a polarização da resposta. Além disso, a

sinalização via C028 parece estar envolvida na prevenção da apoptose e na

manutenção dos níveis de proliferação (FREEMAN e coL, 1993; LENSCHOW

E COL., 1996; BOULOUGOURIS e coL, 1998).

Por outro lado, a ligação de CTLA-4 com os membros da família B7

parece ter efeitos de modulação negativa da ativação dos linfócitos T. A

ativação linfocitária resultante da interação MHCfTCR e C028/B7 resulta em

aumento da expressão de CTLA-4 que, ao se ligar a C080 e C086, transmite

sinais inativadores aos linfócitos T, num mecanismo auto-regulador

(LENSCHOW E COL., 1996; BOULOUGOURIS e coL, 1998).

13

A regulação da expressão de C080 e C086 é controlada por interações

célula-célula e também pela presença de citocinas no microambiente. A

produção de IFN-y está relacionada a um aumento na expressão destas

moléculas, enquanto a IL-10, por outro lado, inibe a expressão de C080 e

C086 (LENSCHOW E COL., 1996;).

1.3.2 - Geração da resposta adaptativa

O reconhecimento do MHCII pelo TCR gera respostas donais aos

patógenos, influenciadas por sinais recebidos pelas interações das moléculas

coestimulatórias. Na presença do sinal, ocorre a ativação, caracterizada pela

expansão clonal dos linfócitos T específicos ao antígeno, e aumento na

secreção de citocinas e expressão de receptores para citocinas. Na ausência,

não ocorre resposta e a célula T se torna tolerante ou anérgica (MEOZHITOV

& JANEWAY, 1997; UNOERHILL e coL, 1999).

As células efetoras da imunidade inata, como os macrófagos,

reconhecem os patógenos de uma maneira não-clonal pela ligação dos PRRs

aos PAMs, e assim induzem respostas efetoras apropriadas, discriminando o

self do non-self e também diferenciando os diversos tipos de patógenos. Os

linfócitos "naive", por outro lado, são pluripotentes, e não são especializados

em nenhum tipo de resposta em particular antes da ativação. Estas células vão

se tornar células efetoras distintas, dependendo dos sinais recebidos durante a

ativação, e estes sinais provêm das células efetoras do sistema imune inato

(MEOZHITOV &JANEWAY, 1997; MEOZHITOV & JANEWAY, 2000).

14

As citocinas que são produzidas nos primeiros estágios da resposta

inflamatória, pelas células T ativadas determinam o padrão da resposta

adaptativa. Citocinas do tipo 1 (IFN-y e IL-12) induzem a diferenciação de

células T em células Th1, enquanto as citocinas do tipo 2 (IL-10, IL-4),

induzem a via de diferenciação do tipo Th2. Portanto, a polarização da

resposta inflamatória depende da concentração das citocinas no

microambiente, das moléculas acessórias envolvidas na interação da APC

com o linfócito T e da concentração e natureza do antígeno (MEDZHITOV &

JANEWAY, 1997; PAULNOCK, 2000).

1.4 - O macrófago e os enteropatógenos

A mucosa intestinal possui uma série de folículos linfóides, isolados ou

em agregados (placas de Peyer) , responsáveis pelo reconhecimento de

microrganismos como comensais ou patógenos e também pela indução da

resposta imunológica. Para que os microrganismos estimulem a resposta

imune, eles devem ser transportados através da barreira epitelial até estes

folículos Iinfóides. O transporte é possível graças à existência das células M no

epitélio associado ao folículo (FAE). Este tipo celular especializado não possui

microvilosidades na sua superfície, mas sim domínios por onde ocorre a

endocitose de partículas e microrganismos. A membrana basolateral destas

células é extremamente invaginada, formando um bolso que contém linfócitos

T, linfócitos B, macrófagos e células dendríticas. Esta estrutura permite que as

superfícies apicais e basolaterais fiquem muito próximas, diminuindo a

distância que as vesículas endocíticas precisam percorrer para atravessar a

15

barreira epitelial. Assim, os antígenos endocitados são rapidamente

transportados até o interior do bolso, onde são fagocitados e apresentados aos

linfócitos B, resultando na produção de anticorpos IgA, que auxiliam na

regulação da microbiota endógena (NEUTRA e col.,1996; SANSONETII,

2004).

A colonização do trato gastrointestinal é benéfica para o hospedeiro,

pois a microbiota exerce uma função protetora, competindo por nutrientes e

receptores com os enteropatógenos; sintetiza vitaminas; e influencia no

desenvolvimento e maturação do sistema imune da mucosa.

A interação entre a microbiota e o sistema imune do hospedeiro é

complexa e baseia-se em um sistema de apresentação microbiana que resulta

em um estado de "inflamação fisiológica", caracterizado por tolerância às

bactérias comensais e mediado pela ação da IgA e do muco (SANSONETII,

2004; SANSONETII & DI SANTO, 2007).

Uma série de enteropatógenos utiliza as células M como rota de invasão

da mucosa intestinal. Ao se translocarem através destas células, no entanto,

são fagocitados por macrófagos residentes. Conseqüentemente, necessitam

de mecanismos de escape e sobrevivência para que a infecção seja

estabelecida com sucesso (NEUTRA e col., 1996; MARTINO e coI. , 2005).

A apoptose é um tipo de morte celular que ocorre em processos

fisiológicos, mas também em estados patológicos. Um dos mecanismos pelos

quais a célula entra em apoptose é pela ativação de uma cascata de proteases

intracelulares, denominadas caspases. Estas enzimas c1ivam muitas proteínas

celulares e ativam proteoliticamente outras caspases, levando a uma

16

amplificação irreversível do processo apoptótico (NAVARRE & ZYCHLlNSKY,

2000; NONAKA e coL, 2003).

Uma série de microrganismos utiliza a apoptose das células fagocíticas

como estratégia de sobrevivência. Macrófagos infectados por algumas

bactérias intracelulares facultativas, como Salmonella, Shigella, Yersinia e

algumas categorias de Escherichia coli sofrem apoptose (ZYCHLlNSKI e coL,

1996; HERSH e coL, 1998; FERNANOEZ-PRAOA e coL, 1998 MARTINO e coL,

2005).

Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis penetram no epitélio intestinal

via células M, e, ao encontrar os macrófagos residentes, secretam proteínas

através de um sistema de secreção do tipo três (SSTT). Estas proteínas

inativam o citoesqueleto de actina dos macrófagos, impedindo a fagocitose da

bactéria, e inibem a produção de TNF-a, essencial para o controle da infecção.

Por outro lado, as bactérias que foram fagocitadas escapam do macrófago

induzindo sua apoptose (OONNEMBERG, 2000; SANSONETTI & DI SANTO,

2007).

Salmonella, no entanto, apresenta outro padrão de interação, também

baseado na secreção de efetores por um SSTT. Após ser fagocitada pelos

macrófagos residentes, esta bactéria tanto pode causar apoptose quanto

remodelar o vacúolo fagocítico, sobrevivendo e multiplicando-se em seu

interior (OONNEMBERG, 2000; SANSONETTI & DI SANTO, 2007).

17

1.5 - Disenteria bacilar

A disenteria bacilar é uma doença inflamatória intestinal aguda que tem

como agentes principais Shigella sp. e Escherichia coli enteroinvasora (EIEC).

Estas bactérias invadem o epitélio do cólon de humanos, causando a

inflamação aguda que caracteriza a doença (SANSONETTI, 2001; PARSOT,

2005). As manifestações clínicas mais comuns são febre, cólicas intestinais e

emissão de fezes com sangue e mucopurulentas. A análise de biópsias do

cólon de pacientes com shigelose mostra um infiltrado de células inflamatórias

na camada epitelial, edema tissular e áreas destruídas do epitélio intestinal

(MARTINO e coL, 2005).

A disenteria bacilar é endêmica através do mundo, mas

aproximadamente 99% dos 160 milhões de casos anuais ocorrem em países

subdesenvolvidos, onde as condições sanitárias e sócio-econômicas são

desfavoráveis. O número de mortes anuais por disenteria bacilar é de

aproximadamente um milhão, ocorrendo principalmente em crianças com

idades entre um e cinco anos (KOTLOFF e coL, 1999; SANSONETTI, 2001).

Recentemente, foi divulgado um estudo sobre shigelose realizado em 6

países asiáticos: China, Vietnã, Tailândia, Bangladesh, Paquistão e Indonésia.

Os dados mostram que a incidência da disenteria bacilar permanece alta (40

indivíduos em 1000, por ano, em todas as faixas etárias, e 254 em 1000, por

ano, no grupo de crianças com menos de cinco anos). Porém, em desacordo

com estudos divulgados anteriormente, as taxas de mortalidade foram

menores. Contribuem para este fato as melhoras nas condições alimentares, o

18

acesso mais rápido aos primeiros cuidados, e a maior utilização de

antibióticos. (VON SEIDLEIN e coL, 2006, SANSONETII, 2006).

1.6 - Shigella spp.

O gênero Shigella é constituído de quatro espécies: S. boydii, S.

dysenteriae, S. flexneri e S. sonnei. A maioria dos estudos sobre

patogenicidade destes microrganismos foi realizada em S. flexneri, mas os

resultados podem ser aplicados às outras espécies e a EIEC. (PARSOT,

2005).

Uma das principais características da patogênese das infecções por

Shigella e EIEC é a capacidade de invasão, ou seja, a capacidade de induzir

sua própria fagocitose por células que normalmente não são fagocíticas, como

as células do epitélio intestinal (COSSART & SANSONETII, 2004). O

responsável por este fenótipo invasor é o plasmídio de virulência (PV-220 Kb).

Células sem o PV são avirulentas e não penetram em células epiteliais

(SANSONETII et ai., 1982a; SANSONETII, 2001; PARSOT, 2005).

Uma região de aproximadamente 30 kb do PV é essencial para a

entrada da bactéria na célula. Esta região alberga componentes de um SSTT,

translocons, efetores e ativadores de transcrição. Os genes do locus mxi-spa

são responsáveis pela síntese de elementos do SSTI, que é ativado através

do contato da bactéria com as células epiteliais. Este contato promove a

inserção do translocon (formado pelas Ipas B e C) na membrana da célula

eucariótica e secreção dos efetores para o interior da célula do hospedeiro.

Entre estes efetores estão os antígenos plasmidiais de invasão IpaA, IpaB ,

19

IpaC e IpaO , essenciais na internalização da bactéria e escape do fagossomo

(COSSART & SANSONETII, 2004; PARSOT, 2005).

O processo de invasão é complexo e ocorre em várias etapas. Shigella

inicialmente adere à superfície da célula epitelial, provavelmente pela ligação

da IpaB com o receptor C044. Esse contato é seguido da ativação do SSTI,

que promove a entrada dos efetores bacterianos no citoplasma da célula.

Ocorre, então, a reorganização dos filamentos de actina no sítio de ligação da

bactéria com a célula, levando à formação de um "bolso macropinocítico". O

evento seguinte é o fechamento deste bolso,_resultado da despolimerização da

actina (OONNENBERG, 2000; COSSART & SANSONETII, 2004). Uma vez

dentro da célula, o microrganismo escapa do vacúolo e ganha acesso ao

citoplasma, onde ocorre a multiplicação. O movimento bacteriano leva à

formação de protrusões, que penetram nas células adjacentes. O ciclo da

infecção é então completado pela lise da dupla membrana formada pela

protrusão, a fim de liberar a bactéria no citoplasma da célula vizinha. (PARSOT

& SANSONETII, 1995; COSSART & SANSONETII, 2004).

1.6.1 - Geração da resposta imune na infecção por Shigella

Ensaios envolvendo monocamadas celulares demonstraram que S.

f1exneri invade células epiteliais apenas por seu pólo basolateral, sendo

incapaz de fazê-lo pelo pólo apical. Para promover a infecção, portanto, a

bactéria necessitaria de outra rota de invasão. Utilizando-se alça ligada de

coelho, observou-se que cepas de Shigella translocam-se através das células

M, sendo esta então sua via preferencial de entrada no epitélio intestinal

20

(COSSART & SANSONETII, 2004; SANSONETII & DI SANTO, 2007). A

fagocitose da bactéria pelos macrófagos residentes resulta em apoptose como

resultado da ligação da IpaB com a caspase-1. Além disso, ocorre liberação de

IL-1 e IL-18 como resultado da c1ivagem de seus precursores pela caspase-1

(figura1) (ZYCHLlNSKI et aI., 1996; GUICHON et aI., 2001; SANSONETII,

2005; MARTINO e col., 2005; SANSONETII, 2007).

Translocation through M cel!

M cel! Epithelial cells

Paracellular entry

- Macrophage/Dendritic cel!apoptosis ~""=-'"'1i

- Initiation of inflammation

IL-8 (<.-.;~~acrOPhageslLymPhocytes~\..--' IpaBCA +-.~ 'Dendritic cells type 111 secretion

Polymorpho~uclear '" IL-1~ / O OLeukocyte -

Figura 1 - Representação esquemática da patogênese da infecção por

Shigella (COSSART & SANSONETTI, 2004).

Diversos estudos evidenciam o papel de uma série de citocinas no

estabelecimento, manutenção e resolução da infecção por Shigella.

21

A síntese de IL-1 tem papel fundamental na disseminação bacteriana e

na forte resposta inflamatória característica da infecção por Shigella. IL-1

juntamente com IL-8 são responsáveis pelo recrutamento de células do

sistema imune inato, como monócitos e principalmente neutrófilos

polimorfonucleares (PMN). A migração destas células para o local da infecção

causa desestabilização do epitélio intestinal, permitindo assim a passagem de

um maior número de microrganismos que irão invadir os enterócitos, levando à

destruição tecidual. (DONNENBERG, 2000; SANSONETII, 2001; MARTINO e

col., 2005).

Além da IL-1, a ligação da IpaB com a çaspase-1 também é responsável

pela clivagem e liberação de IL-18. Utilizando camundongos nocauteados no

gene da caspase 1 (casp-rf) SANSONETII e col. (2000) demonstraram que

IL-1J3 é responsável pela intensidade da inflamação aguda, enquanto IL-18 é

necessária para o controle da infecção. Esta citocina contribuiria para a

erradicação da bactéria, provavelmente pelo estímulo à síntese de IFN-y, que

ativa uma resposta do tipo Th1.

RAQIB e col. (1995) observaram a produção de IL-1a, IL-1J3, TNF-a, IL­

6, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-y e TGF-J3 em biópsia retaI de pacientes durante o

estágio agudo de shigelose. Além disso, foi possível observar um número

muito maior de células produzindo TNF-a, IL-6 e IFN-y na colite severa em

relação à moderada.

WAY e col. (1998) avaliaram a suscetibilidade para infecção pulmonar

por Shigella em diferentes linhagens de camundongos com deleções em

aspectos específicos do sistema imune. Foi observado um aumento de cinco

22

vezes na magnitude da susceptibilidade à infecção por Shigella em

camundongos nocauteados no gene do IFN-y (GKO -f) em relação aos

selvagens. Além disso, as manifestações inflamatórias foram bem mais

severas nos GKO -r, o que permite concluir que a citocina IFN-y tem grande

importância na proteção da infecção por este microrganismo. Foi verificado

também que animais com deficiência em células NK apresentaram uma

susceptibilidade maior à infecção, e os autores sugerem que estas células

provavelmente são as fontes do IFN-y produzido durante a infecção.

O papel do IFN-y no controle da infecção por S. flexneri já foi

demonstrado 0JVAY e coL, 1998; LE-BARILLEC e coL, 2005). Um dos

mediadores da ação desta citocina é o óxido nítrico. Porém, não foram

observadas diferenças na dose letal de S. flexneri entre camundogos tratados

e não-tratados com aminoguanidina (inibidor da iNOS), e também não houve

diferença na dose letal entre camundongos selvagens e nocauteados no gene

da iNOS (NOS2-f). Estes resultados permitem concluir que o "killing" de S.

flexneri em células infectadas in vitro e a resistência dos camundongos são

processos independentes de NO (WAY & GOLDBERG, 1998).

1.6.2 - Participação dos linfócitos T na patogênese da shigelose

Durante muito tempo acreditou-se que somente a resposta humoral

estava envolvida na defesa contra Shigella. Posteriormente, foi demonstrada a

participação dos linfócitos T na resposta inflamatória a este microrganismo.

Uma das primeiras observações foi a de que indivíduos com shigelose

apresentaram um aumento no número de células TCD4+ e TCD8+ (AZIM e

23

coI. ,1996). ISLAM e col. (1995) demonstraram que indivíduos com shigelose

apresentaram um aumento no número de linfócitos, bem como aumento da

expressão de certas moléculas de superfície. Foi observado, por exemplo, um

aumento inicial da expressão de CD25 (considerado um marcador inicial de

ativação de células T), seguido de um aumento de HLA-DR, marcador de

ativação tardia, o que confirma o envolvimento de uma resposta T específica

na infecção por Shígella.

Em estudo conduzido por LE-BARILLEC e col. (2005) observou-se que

camundongos RagOyO (deficientes em linfócitos B, Te NK) foram incapazes de

controlar a infecção, enquanto camundongos reconstituídos com linfócitos T a13

e camundongos RagO (deficientes em linfócitos B e T, mas possuidores de

linfócitos NK) controlaram a infecção de maneira similar aos camundongos

selvagens. O controle da infecção mostrou ser dependente da produção de

IFN-y, e esta produção ocorreu de maneira redundante, ou seja, foi produzida

independentemente por linfócitos T a13 e NK. Estes resultados indicam

claramente que os linfócitos desempenham um papel fundamental na proteção

de camundongos na infecção pulmonar primária por Shígella f1exnerí.

1.7 - Escherichia coli enteroinvasora

Na década de 60 observou-se que várias amostras de E. colí

compartilhavam com bactérias do gênero Shígella a capacidade de invadir e se

proliferar no interior de células epiteliais, e de induzir ceratonjuntivite ao serem

inoculadas em olho de cobaia, ensaio conhecido como teste de Serény

(SERÉNY, 1963; TRABULSI e coI. , 1965). Em vários casos, a disenteria

24

causada por essas amostras foi semelhante à disenteria provocada por

Shigella spp. (TRABULSI e coL, 1965), observações que foram confirmadas

posteriormente por DuPONT e coL (1971), em ensaios com voluntários. Essa

nova classe de enteropatógeno foi denominada de E colí enteroinvasora

(EIEC).

A primeira descrição de EIEC foi feita por EWING e GRAWATII (1947).

Uma amostra de Ecoli foi isolada a partir de fezes de soldados americanos

com diarréia, durante a segunda guerra mundial, e estudos posteriores

realizados por SERÉNY (1963) demonstraram se tratar de uma EIEC. No

Brasil, a primeira descrição foi feita por TRABULSI e coL (1965), que isolaram

das fezes de um paciente com enterite aguda uma amostra de Ecolí capaz de

produzir ceratoconjuntivite em cobaia.

As cepas de EIEC possuem características bioquímicas e genéticas

praticamente idêntica às de Shigella. Além disso, o mecanismo de invasão e

os sintomas da doença são semelhantes. Estudos com voluntários humanos

mostraram, contudo, que a dose infectante de EIEC é muito maior do que a de

Shigella. De fato, para que ocorra um processo infeccioso é necessário um

inóculo de 10 a 100 microrganismos para Shigella, enquanto para EIEC o

inóculo é de 106 (DuPONT e coL, 1971).

Uma possibilidade para explicar essas diferenças seria uma capacidade

maior de invasão por amostras de Shigella. Em testes de Serény realizados

em nosso laboratório pudemos observar que o desenvolvimento de

ceratoconjuntivite em cobaias inoculadas com Shigella ocorre após 48 horas,

enquanto que em cobaias inoculadas com EIEC são necessários de quatro a

25

cinco dias. No entanto, demonstrou-se que não há diferenças importantes

entre os PV das duas espécies (fORMAL e coL, 1983; LAN e coL, 2001). Além

disso, GIBOTII e coL (2004) observaram que os genes ipaA, ipaB, ipaC e ipaD

não possuem alterações que possam explicar as diferenças na dose infectante

e na severidade de sintomas da disenteria causada por EIEC e Shigella.

Devido à maior incidência, os estudos ficaram praticamente restritos a

amostras de Shigella. Além do processo de invasão, pouco se sabe acerca

das alterações provocadas no hospedeiro na infecção por EIEC. Nossa

proposta durante o presente trabalho é a de buscar uma maior compreensão

sobre a interação entre EIEC e o hospedeiro. Para tanto, foi escolhido o

modelo murino de infecção, onde foram avaliadas: (i) a fagocitose, escape

bacteriano e morte dos macrófagos; (ii) a ativação dos macrófagos, através da

produção de citocinas e NO; (ii) a ativação linfocitária, através da medida da

proliferação e produção de citocinas; e (iv) o influxo celular e produção de

citocinas no peritônio de animais após infecção. Esperamos, com os

resultados obtidos, ter contribuído para elucidar algumas diferenças de

patogenicidade entre Shigella e EIEC, e os resultados desse estudo com

certeza são uma ferramenta para a compreensão do mecanismo patogênico

de EIEC.

26

2 - OBJETIVOS

2.1 - Objetivo geral

Avaliação das alterações induzidas por EIEC no hospedeiro durante o

curso da inflamação, utilizando-se de modelos murinos in vivo e in vitro.

2.2 - Objetivos Específicos

• Determinar a cinética de fagocitose, morte celular e produção de citocinas

por macrófagos da linhagem J774 infectados com EIEC;

• Avaliar a produção de óxido nítrico e citocinas por macrófagos peritoniais

de camundongo, após infecção com EIEC;

• Caracterizar o influxo celular e a produção de citocinas pelas células

peritoniais de camundongos infectados com EIEC;

• Avaliar a proliferação e produção de citocinas por linfócitos T em resposta

ao estímulo com antígenos de EIEC;

• Observar diferenças na resposta do hospedeiro após desafio com Shigella

e EIEC que possam explicar o maior inóculo requerido para causar infecção e

os sintomas mais brandos da infecção por EIEC.

27

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Amostras Bacterianas

Foram utilizadas Shigella f1exneri M90T 5, cedida pelo Or. Philippe

Sansonetti, do Instituto Pasteur, e Escherichia coli enteroinvasora do sorogrupo

0124:H- (EIEC FBC 124/13), isolada de fezes diarréicas. As cepas foram

submetidas a teste de Serény (SERÉNY, 1963) para confirmação de sua

capacidade invasora. Nos ensaios de análise da transcrição dos genes de

citocinas por RT-PCR também foi utilizada Ecoli K12 (OH5a).

3.2 - Padronização do inóculo bacteriano

Para todos os ensaios de infecção descritos a seguir, as amostras

invasoras (Shigella e EIEC) foram semeadas em ágar vermelho congo (TSA +

0,2% de corante vermelho congo) e incubadas à 37°C por 48h, enquanto a

amostra não invasora (Ecoli K12) foi semeada em ágar MacConkey e

incubada à 37°C por 24h. A coloração vermelha das colônias de EIEC e

Shigella crescidas em ágar vermelho congo é resultado da precipitação do

corante pelas proteínas secretadas pelas bactérias. Esta propriedade é

utilizada para distinguir entre amostras invasoras (cujas proteínas se coram

com o vermelho congo ou colônias vc+) e não invasoras (incapazes de se corar

com o vermelho congo ou colônias vc} O fenótipo de precipitação do vermelho

congo atua como um marcador de virulência (MAURELLI e coL, 1984). Foram

selecionadas colônias vermelho-congo positivo e colônias de Ecoli K12

provenientes do ágar MacConkey para semeadura em caldo TSB. As amostras

foram incubadas em agitador (220 rpm, 37°C) por aproximadamente quatro

28

horas para obtenção da fase logarítmica, centrifugadas (1500 rpm, por cinco

minutos) e ressuspensas em solução fisiológica. A concentração bacteriana na

suspensão foi ajustada em espectrofotômetro, sendo de 108 células por

mililitro. A cada ensaio realizado, o número de bactérias do inóculo foi

confirmado através da semeadura de diluições da suspensão em ágar

MacConkey.

3.3 - Cultura celular

Macrófagos murinos da linhagem J774 1.6 foram cultivados em meio

RPMI (Cultilab), suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (R5) e penicilina ­

estreptomicina (0,1 g de estreptomicina e 100.000 UI de penicilina por litro). A

cultura celular foi mantida em estufa a 37°C, com atmosfera de 5% de CO2 .

3.4 - Obtenção dos macrófagos de camundongo

Para obtenção dos macrófagos utilizados nos ensaios "in vitro"

camundongos C57BU6 e C57BU6 nocauteados no gene da NO sintase

induzível (iNOS KO) foram sacrificados e submetidos a lavado peritonial com

PBS estéril gelado. A suspensão celular foi transferida para um tubo Falcon e o

número de células foi determinado através de contagem em Câmara de

Neubauer com o corante vital azul de tripan (0,1% em PBS), na proporção de

1:1. A seguir, a suspensão foi centrifugada por cinco minutos a 1.500 rpm. O

sobrenadante foi descartado e os macrófagos ressuspensos em meio R5 com

penicilina - estreptomicina. Alíquotas contendo 3x105 células foram distribuídas

em placa de 96 orifícios, que foi incubada por uma hora a 37°C, na presença

29

de 5% de CO2, possibilitando a aderência dos macrófagos. O meio de cultura

foi retirado, eliminando-se assim as células não aderentes, os orifícios foram

lavados com PBS, e foi adicionado R5 sem antibióticos. Estas células foram

utilizadas nos ensaios de produção de óxido nítrico e análise da transcrição

dos genes de citocinas por RT-PCR.

3.5 - Extração de RNA e síntese de DNA complementar

A extração do RNA total foi feita utilizando-se o RNeasy Mini Kit

(Quiagen), de acordo com as recomendações do fabricante. As amostras

foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,5% para análise da(

integridade do RNA. O RNA foi quantificado em espectrofotômetro a 260 e 280

nm e diluído para uma concentração final de 10ng/J.!L para a síntese de DNA

complementar (cDNA). Para a síntese de cDNA foi utilizado o kit Supercript

First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Como iniciador utilizou-

se oligo (Dt), que se hibridiza com a cauda de poly(A) encontrada na maioria

do RNA de eucariotos.

3.6 - peR em tempo real

O cDNA obtido conforme o item anterior foi amplificado por PCR em

tempo real, utilizando-se o sistema TaqMan. Este sistema baseia-se na

utilização de uma sonda (TaqMan probe) duplamente marcada, com um

fluorocromo "reporter" e um "quencher". A sonda é desenhada de modo a se

anelar com a sequência alvo, entre os iniciadores "forward" e "reverse". Na

forma inativada, a fluorescência do "reporter" é absorvida pelo "quencher".

30BIBLIOTECA

Faculdade de Ciências FarmacêuticasUniversidade de São Paulo

Durante a fase de extensão da PCR, a sonda é degradada pela atividade de

exonuclease da Taq DNA polimerase, separando os fluorocromos "quencher" e

"reporter". A quantidade de fluorescência liberada pelo "reporter" é diretamente

proporcional à quantidade de DNA gerada em cada ciclo da PCR

(OVERBERGH e coI. , 2003). A reação foi realizada em um equipamento ABI

Prism 7000 Sequence Detection System versão 1.6 (Applied Biosystems). Os

parâmetros da reação foram: 50°C /2 min, 95°C /10 min, 50 ciclos de 95° C/15

seg e 60°C /1 mino Foram adicionados 3 ~g of cDNA a 12.5 ~I de 2x TaqMan

PCR Master mix (Applied Biosystems), 100 nM de sonda fluorescente

específica (Applied Biosystems) e água livre de nucleases em um volume final

de 251..1L. Em cada reação realizada, foi utilizada a-actina como controle

endógeno. Os primers e sondas utlizados estão descritos na tabela 1.

Os dados foram normatizados para os níveis de a-actina e analisados

pelo método da curva padrão. Foi utilizado o método da comparação relativa

para quantificar os níveis de transcrição dos genes das citocinas.

Gene Primer 5' (5'-3') Sonda (5'FAM) Primer 3' (5'-3')

TNF-a CACAAGATGCTGGGACAGTGA ATGCACCACCATCAAGG CAGTGAATTCGGAAAGCCCATTTG

IL-1 GCAGGATTTTCTAGGTGGTCAGTTA CCTCTAGAGCACCATGCTAC ~GCTTCGTGGCTGTGGAAA

IL-10 CCTGTGTTTAAGCTGTTTCCATTGG CCCCTCCCATCATATAATATA AGCTTCAATTGCTTCCCAAGGA

a-actina CCCTGAAGTACCCCATTGAACATG CCAGATCTTCTCCATGTCGC ACGCAGCTCATTGTAGAAGGT

Tabela 3.1 - Primers e sondas utilizados no real-time PCR

3.7 - RT-peR semiquantitativo

A análise da transcrição dos genes das citocinas por RT-PCR

semiquantitativo foi avaliado em ensaios "in vitro" e "in vivo". O cDNA obtido de

31

acordo com o item 3.5 foi amplificado por reação de PCR. Os reagentes foram

utilizados nas seguintes concentrações: 1,5 mM de MgCh, 150 !-lM de DNTPs,

O,4!-lM de cada iniciador, 1,5 U de Taq DNA polimerase, tampão da enzima 1x

concentrado, 1 !-lI de cDNA e água miliQ estéril num volume final de 20!-lL.

As condições da PCR foram as seguintes: Etapa incial de desnaturação

por 5 minutos a 94°C, 30 ciclos com desnaturação por 45 segundos a 94°C,

anelamento por 45 segundos em temperatura adequada a cada par de

iniciadores e extensão por 1 minuto a 72°C, seguida de extensão final por 7

minutos a 72°C.

Os iniciadores utilizados estão descritos na tabela 2. Como controle

interno foi utilizado o gene da u-actina. Os produtos de PCR foram analisados

em gel de agarose, a 1,5% em tampão TBE. Os produtos da PCR foram

submetidos à separação eletroforética por 45 minutos a 100 volts. Em seguida,

o gel foi corado em solução contendo brometo de etídeo (O,5IJg/ml) e as

bandas visualizadas sob luz ultravioleta. As imagens foram adquiridas através

de um equipamento de fotodocumentação (Doc Print DP-001-FDC, Vilber

Lourmat, França). As imagens das bandas foram submetidas à análise

densitométrica com software apropriado (Scion Image). O nível de expressão

do gene de cada citocina foi calculado como a razão da intensidade da banda

do gene sobre a intensidade da banda da u- actina.

32

IIniciador ISeqüência

TNF-a F - 5'- CCTTIATTGTCTACTCCTCAG - 3'R - 5'- GGAAAGGTCTGAAGGTAGG - 3'

IL-1 F - 5'- CTCAAGAAGGAGAAGACT - 3'R - 5'- GATGGTTGGTGTIAGTIAC - 3'

IL-10 F - 5'-TACCTCAGTICCCATIC -3'R - 5'- GAAAGGACACCATAGC -3'

IL-18 F - 5'- ACTGTACAACCGCAGTAATACGG - 3'R - 5'- AGTGAACATIACAGATTTATCCC - 3'

INOs F - 5'- CATGGCTIGCCCCTGGAAGTTICTCT - 3'R - 5'- GCAGCATCCCCTCTGATGGTGCCATC - 3'

TLR4 F- 5'- GACCTCAGCTICAATGGTGC - 3'R - 5'-TATCAGAAATGCTACAGTGGATACC - 3'

IFN-y F- 5'- CTGTGATIGCGGGGTIG - 3'R - 5'- TTTCTITCAGGGACAGCCTG - 3'

IP-10 F- 5'- CGCGGATCCTCGCACCTCCACATAGCTTAC - 3'R - 5'- CGCGGATCCTGAGCAGAGATGTCTGAATC- 3'

a-actina F - 5'-TCCTICGTIGCCGGTCCACA - 3'R - 5'- CGTCTCCGGAGTCCATCACA - 3'

Tabela 3.2 - Iniciadores usados no RT-PCR semiquantitativo.

3.8 - "Enzyme-Iynked immunosorbent assay" (ELISA) para quantificação

das citocinas

A concentração das citocinas no sobrenadante de macrófagos foi

determinada por ELISA de captura (PEPROTECH), de acordo com as

recomendações do fabricante, a fim de confirmar que a transcrição dos genes

resultou em produção de proteína. Em resumo, placas de microtitulação de 96

poços foram sensibilizadas com o anticorpo primário diluído em PBS e

incubadas de um dia para o outro. Após lavagem com PBS acrescido de tween

20 a 0,05% as placas foram incubadas por uma hora com PBS com 1% de

albumina de soro bovino (BSA, SIGMA), para promover o bloqueio dos sítios

livres do plástico. As citocinas recombinantes utilizadas para realizar a curva

padrão foram diluídas em PBS contendo 1% de BSA. Após lavagem, a curva

33

padrão e as amostras foram incubadas por duas horas. As placas foram

lavadas e incubadas por duas horas com os anticorpos secundários

conjugados à biotina diluídos em PBS. Após nova lavagem, as placas foram

incubadas com conjugado estreptoavidina-peroxidase por 30 minutos. As

placas foram novamente lavadas e a revelação foi realizada com 0­

fenilenodiamina (1 mg/mL) diluída em tampão citrato de sódio (0,1 M, pH 4,5)

por 15 a 30 minutos. Para o bloqueio da reação foi utilizado ácido sulfúrico 4N,

e a leitura das densidades ópticas foi realizada em leitor automático, em

comprimento de onda de 450 nm. As concentrações de cada citocina nas

amostras foram calculadas mediante equação de regressão linear com base na

curva padrão obtida com diluições das citocinas recombinantes. Todas as

incubações foram realizadas em temperatura ambiente.

3.9 - Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro'1

3.9.1 - Sobrevivência bacteriana no interior dos macrófagos

Este ensaio foi realizado de acordo com a metodologia descrita por

FERNANDEZ-PRADA e col. (1997). Cerca de 24 horas antes do teste de

fagocitose, os macrófagos foram retirados dos frascos de cultura com a ajuda

de um espalhador Ccel! scraper"). A suspensão celular foi transferida para um

tubo Falcon e o número de células viáveis foi determinado através de

contagem em Câmara de Neubauer com o corante vital azul de tripan (0,1%

em PBS), na proporção de 1:1. A seguir, a suspensão foi centrifugada por

cinco minutos a 1.500 rpm. O sobrenadante foi descartado e os macrófagos

34

ressuspensos em meio R5 com penicilina - estreptomicina. As células foram

distribuídas em placas de cultura de 24 orifícios numa concentração de 106

células por orifício. Após 24 horas de incubação a 37°C em atmosfera úmida

com 5% de CO2 as placas foram centrifugadas (100 x g, por cinco minutos); o

meio foi retirado e os macrófagos lavados com PBS. Foi adicionado R5 sem

antibióticos e as monocamadas celulares foram infectadas com 107 bactérias.

As placas foram novamente centrifugadas para promover o contato bacteriano

com os macrófagos, e a seguir incubadas por zero, 30, 60 e 90 minutos. A

seguir, os macrófagos foram novamente lavados e incubados em meio R5

contendo gentamicina (50llg/ml), por 50 minutos, para matar bactérias

extracelulares e prevenir a reinfecção. O tempo zero foi determinado da

seguinte maneira: A placa foi centrifugada e os macrófagos foram

imediatamente lavados e incubados com gentamicina. A seguir, as células

foram novamente lavadas e lisadas com Triton X-100 a 10%. Diluições dos

lisados foram semeadas em ágar TSA e MacConkey (incubados a 37°C por

18-24 horas), para determinação das UFC.

3.9.2 - Escape bacteriano após fagocitose e determinação da viabilidade

dos macrófagos

Para avaliar o escape bacteriano após fagocitose, e se este escape era

acompanhado de perda de viabilidade dos macrófagos, foram feitas algumas

modificações no ensaio anterior. Os macrófagos foram infectados com Shigella

e EIEC na proporção 10 bactérias por macrófago por uma hora, e, a seguir,

incubados em meio R5 contendo gentamicina (50llg/ml), por 50 minutos. As

35

células foram então lavadas e incubadas em R5 sem antibióticos por 30, 60 e

120 minutos, e seis e oito horas. A seguir, alíquotas do sobrenadante foram

diluídas e semeadas em ágar TSA e MacConkey para determinação das UFC.

O meio foi retirado e os macrófagos foram ressuspensos em 300 J..l1 de tampão

HFS (0,1% de citrato de sódio, 0,1% de triton X - 100 e 50 J..lg/ml de iodeto de

propídio). A perda do DNA fragmentado dos núcleos apoptóticos foi

quantificada através de citometria de fluxo (FACScalibur, Beckton Dickinson).

Como controle negativo foram utilizadas monocamadas celulares não­

infectadas, para determinação das UFC e viabilidade dos macrófagos.

3.9.3 - Produção de citocinas por macrófagos infectados

A transcrição dos genes de TNF-a, IL-1 e IL-10 por macrófagos J774 foi

analisada após infecção com Shigella M90T e EIEC FBC124/13. Macrófagos

J774 foram cultivados em placas de 96 orifícios na concentração de 105

células por orifício, por 24 horas, a 37°C, na presença de 5% de COzo As

células foram infectadas com suspensões de Shigella e EIEC contendo 105

bactérias, por uma hora. O meio foi substituído por RPMI acrescido de 5% de

soro fetal bovino e 50J..lg/ml de gentamicina. Após zero, duas e seis horas de

incubação o meio foi retirado e as células recolhidas para a extração do RNA,

realizada de acordo com o item 3.5. Após a síntese do cDNA (item 3.5), a

transcição dos genes das citocinas foi avaliada por PCR em tempo real (item

3.6). A transcrição basal dos genes das citocinas foi determinada através da

extração de RNA de macrófagos não infectados. As concentrações TNF-a, IL­

1 e IL-10 foram determinadas no sobrenadante de monocamadas celulares

36

não-infectadas e infectadas (tempo de 7 horas), por ELISA de captura (item

3.8).

3.10 - Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BLl6 e

C57BLl6 iNOS KO (ensaios "in vitro'1

3.10.1 - Produção de óxido nítrico (NO)

Os macrófagos obtidos conforme o item 3.4 foram infectados com

suspensões bacterianas de Shigella ou EIEC contendo 104 e 105 bactérias e

incubados por 1 hora a 37°C, na presença de 5% de CO2 . Em seguida o meio

de cultura foi substituído por R5 com gentamicina (50/-lg/ml). Após 24 horas de

incubação, foram transferidos 50/-lL do sobrenadante de cada orifício para

outras placas, e a dosagem de N02- foi realizada pelo método de Griess. (Ding

e coL, 1988). Resumidamente, foi adicionado aos 50/-lL do sobrenadante 50/-lL

do reativo de Griess. A absorbância foi determinada em leitor de ELISA com

filtro de 550nm, contra branco constituído de meio de cultura e reativo de

Griess v/v. Os resultados foram expressos em /-lmoles de N02-, com base em

uma curva padrão feita com concentrações conhecidas de nitrato de sódio em

meio de cultura (5,10, 30 e 60 /-lmoles de N02- ). O limite de detecção do

método é de 5 /-lmoles de N02-.

3.10.2 - Transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e do TLR4

Os macrófagos de camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO obtidos

conforme o item 3.4 foram infectados com suspensões bacterianas de

37

Shigella, EIEC FBC 124/13 e E.coli K12 contendo 105 bactérias e incubados

por uma hora a 37°C, na presença de 5% de CO2 . Em seguida o meio de

cultura foi substituído por RPMI com 5% de soro fetal bovino e gentamicina

(50J.!g/ml). Após três horas de incubação, num total de quatro horas de

infecção, o meio foi retirado e as células recolhidas para a extração do RNA

(item 3.5). Também foi extraído RNA de macrófagos tratados por 4h com

10ng/ml de LPS de Escherichia coli (SIGMA) O cONA obtido conforme o item

3.5 foi utilizado para determinação da transcrição dos genes das citocinas IL-1,

TNF-a, IL-10 e IL-18, da enzima iNOS e do receptor transmebrânico "toll like

receptor 4" (TLR4) (item 3.7).

3.10.3 - Produção de TNF-a e IL-10

Para confirmação de que a transcrição gênica resultou em produção de

proteína, os sobrenadantes das culturas dos macrófagos não infectados e

infectados por quatro horas, (cuja transcrição gênica foi avaliada por RT-PCR

no item 3.10.2) foram recolhidos para determinação da concentração de TNF-a

e IL-10, por ELISA de captura (item 3.8).

3.11 - Interação entre EIEC e camundongos C57BLl6 e C57BLl6 iNOS KO

"in vivo"

3.11.1 - Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção

Lotes de dois camundongos C57BLl6 foram inoculados

intraperitonialmente com suspensões de EIEC FBC124/13 ou Shigella M90T

38

contendo 107 bactérias. Após 12, 24 e 48 horas de infecção os animais foram

sacrificados e submetidos a lavado peritonial com meio RPMI gelado. O

número de células foi determinado através de contagem em Câmara de

Neubauer com azul de tripan e alíquotas contendo 106 células foram

transferidas para placas de 96 orifícios com fundo em U. Foi feita uma lavagem

com "Staining Buffer" (1 % de soro fetal bovino e 0,05% de azida em PBS). A

seguir foram adicionados os marcadores numa diluição de 1:100 em "Staining

Buffer". Após 30 minutos de incubação em gelo as amostras foram lavadas

com "Staining Buffer", centrifugadas (1300 rpm, cinco minutos), ressuspensas

em "Staining Buffer" e analisadas em citômetro de fluxo (FACScalibur; Becton

Oickinson). Todo o procedimento foi realizado em banho de gelo.

Os seguintes anticorpos monoclonais, com os respectivos fluorocromos

foram utilizados: anti-C04 (Cychrome) e anti-C08 (PE), marcadores de

linfócitos T, anti-B220 (Cychrome), marcador de linfócitos B, anti-F4/80

(FITC), marcador de macrófagos, anti-RB6 (PE), marcador de granulócitos, e

anti-MHCII (FITC), anti-C080 (FITC) e anti-C086 (FITC), moléculas

expressas na superfície de macrófagos. As células peritoniais receberam as

seguintes marcações: tripla marcação de C04 com C08 e F4/80; dupla

marcação de RB6 com F4/80, dupla marcação de F4/80 com B220, e dupla

marcação de F4/80 com MHCII, de F4/80 com C080 e de F4/80 com C086.

39

3.11.2 - Análise da transcrição dos genes das citocinas, da enzima iNOS e

do TLR4

Camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS Kü foram inoculados

intraperitonialmente com 107 bactérias. Após quatro e 48 horas de infecção os

animais foram sacrificados e submetidos a lavado peritoníal com meio RPMI

gelado. O número de células foi determinado através de contagem em Câmara

de Neubauer com azul de tripan. A extração do RNA das células totais do

peritônio e a obtenção do cDNA foram realizadas de acordo com o item 3.5 e o

RT-PCR semiquantitativo foi realizado de acordo com o item 3.7.

3.11.3 - Produção de TNF-a e IL-10

Para confirmação de que a expressão gênica resultou em produção de

proteína, a concentração de TNF-a e IL-10 foi determinada no lavado peritonial

dos animais não infectados, e após quatro e 48 horas de infecção, por ELISA

de captura (item 3.8).

3.11.4 - Determinação da mortalidade de camundongos C57BLl6 e

C57BLl6 iNOS KO após infecção

Camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS Kü foram inoculados

intraperitonialmente com suspensões de Shigella M90T, EIEC FBC124/13 e

E.coli K12 contendo 107 e 108 bactérias (item 3.2), a fim de determinar se a

ausência de produção de NO ocasionaria alterações na mortalidade dos

animais.

40

3.12 - Resposta de linfócitos à infecção por EIEC

3.12.1 - Ensaio de linfoproliferação

3.12.1.1 - Obtenção de linfócitos

Lotes de três camundongos Balb/C foram inoculados com suspensões

bacterianas de Shigella e EIEC na concentração de 106 bactérias por coxim

plantar. Sete dias após a inoculação os camundongos foram sacrificados e

seus linfonodos inguinais e poplíteos extraídos. Os Iinfonodos foram

macerados em placa, para dispersão das células, com meio RPMI. As células

foram centrifugadas (1500 rpm, por cinco minutos) e ressuspensas em RPMI.

Estas células foram utilizadas nos ensaios de linfoproliferação e determinação

de população de linfócitos.

3.12.1.2 - Obtenção de Antígenos Solúveis

Como agente indutor de proliferação linfocitária foram utilizados

antígenos solúveis, entre eles os Antígenos de Invasão Plasmidial (Ipas). Estes

antígenos foram obtidos pelo estímulo do contato bacteriano com células

epiteliais.

Células Hep-2 foram cultivadas em meio MEM, suplementado com 10%

de Soro Fetal Bovino e penicilina - estreptomicina, em garrafas de 75cm2. Após

obtenção da confluência celular o meio foi substituído por MEM com 10% de

soro fetal bovino sem antibióticos. Foram adicionados dois ml de suspensão

bacteriana de Shigella ou EIEC na fase logarítmica de crescimento. Após cinco

41

horas de incubação o meio foi recolhido e centrifugado (8000 rpm, 10 minutos).

Foram adicionados fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF; Sigma Aldrich) numa

concentração de 50 Ilg/ml, e EDTA (Sigma Aldrich) numa concentração de 0,5

11M, a fim de se inibir a atividade de proteases. O sobrenadante foi filtrado (filtro

Millipore, 0.22 IJm), e concentrado 10 vezes (Ultrafree 15, Millipore). A

concentração protéica nas amostras foi determinada pelo método de Bradford.

Para confirmação da presença de Ipas na amostra, foi realizada eletroforese

em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%, seguida de reação de

Westernblot. Utilizou -se anticorpos monoclonais anti - Ipa B, anti - Ipa C e anti

- Ipa O (título: 1/100) e conjugado antimouse IgG marcado com peroxidase

(Sigma), num título de 1:1000.

3.12.1.3 - Linfoproliferação

As células dos linfonodos foram centrifugadas (1500 rpm, 10 minutos),

ressuspensas em RPMI suplementado com 2,5% de soro humano e

distribuídas em placas de 96 orifícios, na concentração de 3x105 células por

orifício. Para obtenção de uma curva de proliferação adicionou-se aos orifícios

as seguintes concentrações de antígeno: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e

100 Ilg. Os linfócitos de animais inoculados com Shigella foram estimulados

com antígenos de Shigella e os inoculados com EIEC receberam antígenos de

EIEC. A placa foi mantida em estufa umidificada a 37 ac, em atmosfera de 5%

de CO2 , por 72 horas. Os controles positivos foram incubados na presença de

41lg de Concanavalina A (ConA, SIGMA).

42

Cerca de 16 horas antes de coletar as células foi adicionado à cultura

1!J.Ci por poço de metil-3H-timidina. As células foram coletadas com o auxílio de

um coletor automático (Cell Harvester, LKB Wallac 1295-001), e a

incorporação da timidina mensurada através da emissão de radiações beta

(Liquid Scintillation Counter, 1205 betaplate, Wallac).

Após determinação da curva de proliferação, foi realizado novo ensaio

de linfoproliferação. Os animais foram inoculados com Shigella, EIEC e E.coli

K12 para a obtenção de linfócitos (conforme descrito no item 3.12.1.1). Os

linfócitos foram então estimulados com os antígenos solúveis bacterianos na

concentração de 100 !J.g. Os linfócitos de animais inoculados com Shigella

foram estimulados com antígenos de Shigella, EIEC e K12, o mesmo

acontecendo com os linfócitos de animais inoculados com EIEC e K12. Os

controles positivos foram incubados na presença de 4!J.g fitohemaglutinina

(SIGMA).

3.12.2 - Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4

Em ensaio paralelo à linfoproliferação, os sobrenadantes das células

dos linfonodos estimuladas com os antígenos solúveis bacterianos foram

recolhidos após 72 horas de incubação para determinação das concentrações

de IFN-y, IL-10 e IL-4 por ELISA de captura (item 3.8).

3.12.3 - Determinação das subpopulações de linfócitos

As células dos linfonodos foram centrifugadas (1500 rpm, 10 minutos) e

o sedimento ressuspenso em PBS Dulbeco com 5% de Soro Fetal Bovino.

43

Alíquotas contendo 5 x 105 células foram transferidas para tubos eppendorf

onde foram adicionados os marcadores, numa diluição de 1:100, incubando-se

em seguida por 30 minutos em gelo. A suspensão foi centrifugada (1000rpm,

dois minutos), e o sedimento ressuspenso em PBS Oulbeco com 5% de Soro

Fetal Bovino. As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo

(FACScalibur Becton Oickinson).

As células receberam dupla marcação: anticorpos monoclonais anti-C03

(PE) e Anti-C04 (FITC), ou anti-C03 (PE) e anti-C08 (FITC).

44

4 - RESULTADOS

4.1 -Interação entre EIEC e macrófagos J774 (ensaios "in vitro"

4.1.1 - Determinação do número de bactérias viáveis no interior de

macrófagos J774 após fagocitose

Para comparar a viabilidade de EIEC e Shigella no interior dos

macrófagos após fagocitose foi feita a determinação das UFC em diferentes

intervalos de tempo. A gentamicina não penetra no macrófago, assim,

apenas as bactérias não fagocitadas são mortas pela ação do antibiótico.

Pode-se observar na figura 4.1. que não há diferenças na captura

inicial das duas bactérias pelos macrófagos (p=0,5). Após 30 minutos de

infecção, porém, há um aumento significativo de UFC de EIEC no interior

dos macrófagos, se comparado a Shigella (p=0,007). Nos tempos

subseqüentes há um decréscimo no número de UFC obtidas dos

macrófagos infectados com ambas as bactérias, sugerindo o escape

bacteriano do macrófago. Observa-se, porém, que o número de UFC de

EIEC recuperada do macrófago é sempre maior que o número de UFC de

Shigella (p=0,036 após uma hora de infecção e p=0,06 após 90 minutos).

12000 l

I10000 -

8000 -!

EU 6000u.=>

4000

2000 ~

O

O

*

0,5

Tempo (horas)

*

*

1,5

.M90T

• FBC124/13

45

FigA.1- Unidades Formadoras de Colônia de Shigella flexneri M90T e EIEC FBC124/13 em

lisados de macrófagos J774 após diferentes intervalos de infecção. Os dados representam

as médias e os desvios-padrão de infecções em triplicata e são representativos de dois

experimentos independentes. * - Intervalos de infecção onde a diferença no número de

UFC de Shigella e EIEC é estatisticamente significativa (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

4.1.2 - Determinação do escape bacteriano após fagocitose

Os resultados obtidos no experimento de escape bacteriano após

fagocitose em macrófagos J774 são mostrados na figura 4.2. De acordo

com o gráfico, o número de UFC de Shigella M90T no sobrenadante é maior

que o número de UFC de EIEC em todos os intervalos de infecção. Em 30

minutos (p=0,0013) e uma hora (p=O,006) de incubação em meio sem

gentamicina o número de UFC de Shigella no sobrenadante é praticamente

quatro vezes maior que o número de UFC de EIEC. Em duas horas o

número de UFC de Shigella é dez vezes maior que o número de UFC de

EIEC (p<0,0001) e, em seis horas, não houve diferenças significativas entre

o número de UFC das duas bactérias.

50000

45000

40000

35000 -

30000 -EÜ 25000u..::::> 20000

15000

10000 -

5000 -

O -

0.5

*

*

2

Tempo (horas)

6

.M90T

• FBC124/13

46

Fig.4.2- Unidades Formadoras de Colônia de Shigella f1exneri M90T e EIEC FBC124/13 no

sobrenadante de culturas de macrófagos J774 após diferentes intervalos de infecção. Os

dados representam médias e desvios padrão de infecções em duplicata e são

representativos de dois experimentos independentes. * - Intervalos de infecção onde a

diferença no número de UFC de Shigella e EIEC é estatisticamente significativa (p<0,05

segundo o teste t não pareado).

4.1.3 - Determinação da viabilidade dos macrófagos infectados

Para determinar se a infecção ocasionaria alterações na viabilidade

dos macrófagos foi utilizado o tampão HFS, que avalia o nível de

fragmentação do DNA celular. O número de macrófagos não viáveis em

monocamadas de células não-infectadas foi ao redor de 5% (dados não

mostrados). Em macrófagos infectados observou-se que o número de

macrófagos não viáveis é maior em monocamadas infectadas com ShigelJa

do que naquelas infectadas com EIEC (figura 4.3). Em duas horas de

incubação em meio sem gentamicina a porcentagem de macrófagos não

viáveis na infecção por Shigella é aproximadamente duas vezes maior do

que na infecção por EIEC (p=O,006). Em quatro horas a porcentagem de

47

macrófagos não viáveis é de 85% em monocamadas infectadas por

Shigel/a, e de 42% em monocamadas infectadas por EIEC (p=O,0003). No

tempo de seis horas observa-se 93% de macrófagos não viáveis na infecção

por Shigel/a, contra 75% de macrófagos não viáveis na infecção por EIEC

(p=O,02). Após oito horas de incubação em meio sem gentamkina o número

de macrófagos não viáveis é semelhante na infecção por Shigel/a (94%) e

.M90T

• FBC124/13

---,

864

*

2

*

1.5

EIEC (98%).

120

CIl

"Qj 100>

'l1l.;:I

o 801l1lc:CIlo 60Cl~'0L-U 40l1l

EQ)

"O 20~o

o -j----,--

0,5

Tempo (horas)

Fig. 4.3- Determinação de alterações na viabilidade dos macrófagos J774 em diferentes

intervalos de infecção por Shigella flexneri M90T e EI EC FBC124/13. Os dados

representam médias e desvios padrão de infecções em triplicata e são representativos de

três experimentos independentes. * - Intervalos onde a diferença na porcentagem de

macrófagos não-viáveis após infecção por Shigella e EIEC é estatisticamente significativa

(p<0,05 segundo o teste t não pareado).

4.1.4 - Cinética da transcrição dos genes de TNF-a, IL-1 e IL-10 por PCR

em tempo real

A transcrição dos genes das citocinas TNF-a,( IL-1 e IL-10 por

macrófagos J774 infectados e não infectados foi quantificada por PCR em

48

tempo real (figuras 4, 5 e 6). A transcrição do gene de TNF-a em

macrófagos infectados com EIEC foi 3,8 vezes maior do que a transcrição

em macrófagos não infectados (transcrição basal) após uma hora de

infecção (p=O,018), 4,5 vezes maior após três horas e cinco vezes maior

após sete horas de infecção (p=O,02). Os macrófagos infectados com

Shigella apresentaram transcrição deste gene seis vezes maior que a

transcrição basal após uma hora (p=O,04), 7,5 vezes maior após três horas

(p=O,017) e quatro vezes maior após sete horas de infecção (p=O,009)

(figAA).

:]---~--~-~7h3h

~~1h

.M90T

• FBC124/13

25 1

20 I15

10TNF

30 l

II

25 1I

:g 20 J:;:;oCll

~ 15 ~

~ Iz 10 .•I- I

I

:~(-) 1 3 7

Tempo (horas)

Fig. 4.4 - Transcrição relativa do gene de TNF-a avaliada por PCR em tempo real. Os

gráficos de barras mostram a transcrição do gene por macrófagos J774 não infectados e

após diferentes intervalos de infecção por Shigella f1exneri M9üT e EIEC FBC124/13. Os

gráficos de linhas mostram a cinética de transcrição em macrófagos infectados por EIEC

( • ) e Shigella ( ... ). Os dados representam médias e desvios padrão de três experimentos

independentes.

49

A transcrição do gene de IL-1 em macrófagos infectados com EIEC

foi três vezes maior do que a transcrição basal após uma hora de infecção,

10 vezes maior após três horas (p=0,012), e 12,6 vezes maior após sete

horas (p=0,014). Na infecção por Shigella observamos um aumento de 3,8

vezes na transcrição deste gene em relação à transcrição basal após uma

hora de infecção, 12 vezes após três horas (p=0,004) e oito vezes após sete

horas (p=0,009) (figA.5).

7h3h1h

.M90T

• FBC124/13

---,

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

oJ---~---~---~

0,1

0,05

° I I I

IL-1

-:::; 0,15-

0,45

0,4 -

0,35

.~ 0,3...g 0,25J!lii 0,2

(-) 3 7

Tempo (horas)

Fig. 4.5 - Transcrição relativa do gene de IL-1 avaliada por PCR em tempo real. Os gráficos

de barras mostram a transcrição do gene por macrófagos J774 não infectados e após

diferentes intervalos de infecção por Shigella f1exneri M9üT e EIEC FBC124/13. Os gráficos

de linhas mostram a cinética de transcrição em macrófagos infectados por EI EC (. ) e

Shigella ("'). Os dados representam médias e desvios padrão de três experimentos

independentes.

o aumento na transcrição do gene de IL-10 em relação à transcrição

basal só foi significativo após três horas de infecção por EIEC (p=0,018).

'i0

Apesar de este aumento ocorrer também na infecção por Shigella, ele não

foi considerado estatisticamente significativo (fig. 4.6).

Os macrófagos infectados por Shigella apresentaram maior transcrição dos

genes de TNF e IL-1 após uma e três horas de infecção, enquanto que após

sete horas de infecção a transcrição dos genes destas duas citocinas foi

maior na infecção por EIEC. Entretanto, não houve diferenças significativas

entre os macrófagos infectados por Shigella ou EIEC.

---,

0,12 1

I0,08 1

IL-100,04

°.M90T 1h 3h 7h

• FBC124/13

0.2

10,16 -I

Cllc::g 0,12-Cll

~Cll

Õ 0,08....~

0,04

o(-) 3 7

Tempo (horas)

Fig. 4.6 - Transcrição relativa do gene de IL-10 avaliada por PCR em tempo real. Os

gráficos de barras mostram a transcrição do gene por macrófagos J774 não infectados e

após diferentes intervalos de infecção por Shigella flexneri M90T e EIEC FBC124/13. Os

gráficos de linhas mostram a cinética de transcrição em macrófagos infectados por EIEC

( • ) e Shigella ( "'). Os dados representam médias e desvios padrão de três experimentos

independentes.

4.1.5 - Determinação da produção de TNF-a, IL-1 e IL-10 por ELISA

Os sobrenadantes das culturas de macrófagos não infectados e

infectados por sete horas com Shigella e EIEC (cuja transcrição dos genes

51

foi avaliada no ensaio anterior) foram utilizados no ELISA de captura para

determinação da concentração de TNF-a, IL-1 e IL-10. Os resultados

obtidos confirmaram que a transcrição do RNA mensageiro resultou em

produção das três citocinas (figA.7). Houve um aumento de 13 vezes na

produção de TNF-a por macrófagos infectados por EIEC (p=O,001) e de 15

vezes em macrófagos infectados por Shigella (p=O,007) em relação à

produção basal. A produção de IL-1 por macrófagos infectados por EIEC foi

1,2 vez maior do que a produção basal. Em macrófagos infectados por

Shigella esta produção foi 3,8 vezes maior. Não foi detectada produção

basal de IL-10. A produção desta citocina foi significativa em macrófagos

infectados por EIEC (p=O,007) e Shigella (p=O,004). Assim como no ensaio

de PCR em tempo real, não houve diferenças significativas na produção de

citocinas por macrófagos infectados por Shigella ou EIEC.

TNF IL-1

200 l 300 l250 ~

160200

_ 120.§ 150E

Õl Clo- 80

o-

100

40 50

o o(-) flfeOT FBC124/13 (-) flfeOT FBC124/13

IL-10

30°1250

I200

.§ 150Clo-

100

50

o(- ) flfeOT FBC124/13

52

Fig. 4.7- Determinação, por ELISA de captura, da produção de TNF-a, IL-1 e IL-1ü por

macrófagos J774 não infectados e infectados por sete horas com Shigella f1exneri M9üT e

EIEC FBC124/13. Os dados representam médias e desvios padrão de duplicatas e são

representativos de dois experimentos independentes.

4.2 - Interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BLl6 e

C57BLl6 iNOS KO (ensaios Itin vitra '1

4.2.1- Determinação da produção de NO pelo método de Griess

A oxidação do NO a N02- em meio aquoso permite a detecção da

produção de NO pelo reativo de Griess. Observou-se que macrófagos de

camundongos C57BU6 nocauteados no gene da NO sintase induzível

(iNOS KO) não produziram quantidades detectáveis de NO (figA.8).

Macrófagos de camundongos C57BU6 selvagens infectados com 105 EIEC

produziram significativamente mais NO do que os não infectados (p=0,009),

enquanto macrófagos infectados com 104 (p=0,0003) e 105 (p<0,0001)

Shigella produziram significativamente mais NO que os não infectados. Os

macrófagos infectados com Shigella produziram significativamente mais NO

do que aqueles infectados com EIEC nos dois inóculos testados (p= 0,0006

quando o inóculo foi de 104, e p= 0,0003 quando o inóculo foi de 105

).

53

*

o C57BL16 iNOs KO

.C57BL16

(105)(104

)(105)(104

)

30 -.

25

20

i'2. 15bz

10

5

O

(-)

... v v

Shigella M90T EIEC FBC124/13

Fig. 4.8 - Determinação da produção de NO por macrófagos infectados com Shigella M90T

e EIEC FBC124/13 pelo método de Griess.Os dados representam médias de triplicatas e

são representativos de dois experimentos independentes. * - Macrófagos infectados por

Shigella produzem significativamente mais NO que aqueles infectados por EIEC (p<O,OS

segundo o teste t não pareado).

4.2.2 - Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, da

enzima iNOS e do TLR4 por RT-peR semiquantitativo

Neste ensaio, a transcrição relativa de genes de citocinas por

macrófagos de camundongos C57BU6-e C57BU6 iNOS KO infectados por 4

horas com EIEC, Shigella, E.coli K12 (proporção de uma bactéria por

macrófago) e estimulados com LPS (10 ng/ml) foi avaliada por RT-PCR

54

semiquantitativo. Foi utilizado um software (Scion Image) para análise

densitométrica dos produtos de RT-PCR (figuras 4.9 a 4.15).

Pode-se observar que em camundongos selvagens o estímulo com

LPS resultou em aumento significativo da transcrição dos genes de TNF

(p=0,01), IL-1 (p=0,008), IL-18 (p=0,005), TLR4 (0,003) e IP-10 (p=0,05), em

relação aos macrófagos não infectados (transcrição basal).

A transcrição do gene de TNF foi significativa na infecção por EIEC

(p=0,0004) e Shigella (p=0,008), em relação à transcrição basal (fig. 4.9),

em macrófagos de camundongos selvagens. Macrófagos infectados com

EIEC apresentaram maior transcrição deste gene do que macrófagos

infectados com Shigella (p=0,008).

Em macrófagos de camundongos nocauteados no gene da NO

sintase induzível (iNOS KO), o aumento na transcrição do gene do TNF em

relação à transcrição basal é evidente em valores absolutos. Porém, estas

diferenças não foram consideradas estatisticamente significativas, devido ao

elevado valor do desvio padrão da transcrição basal (fig. 4.9).

55

TNF iNOS KO1,4 1

1,2

CIIC~oCII 08~ ,

~ 0,6LI.zI- 0,4

0,2

O

\:,

TNF

s- ,,~

$3 ~0"

«<o

.+,-'l,~

<v'?

~0v

1,2

CIIC:g 0,8CII

~ 0,6~~ 0,4I-

0,2

O

\:, ~$'(:) ';),,,~

0"rf«<o

.+,-'l,~

<v'?

Fig. 4.9 - Transcrição relativa do gene de TNF-a por macrófagos de camundongos C57BU6

e C57BL/6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

* - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene de TNF-a entre

macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não pareado).

De maneira semelhante ao TNF-a, a transcrição do gene de IL-10 em

macrófagos de animais selvagens foi significativa na infecção por EIEC

(p=0,0006) e Shigella (p=0,001), em relação à transcrição basal (fig. 4.10).

Macrófagos infectados com EIEC apresentaram maior transcrição deste

gene do que macrófagos infectados com Shigella (p=0,01).

Em macrófagos de camundongos nocaute o aumento na transcrição do

gene da IL-10 foi significativamente maior que a transcrição basal na

infecção por EIEC (0,021) e Shigella (p=0,027). Não houve diferenças

significativas na transcrição deste gene entre EIEC, Shigella e E.coli K12

(fig.4.10).

56

1,4 lIL-10

1,2 ~*

CllI • • .- IL-10 iNOS KO

c

1,2

:;:;o: 0,8

Cll

-~ 0,6

c~ 0,8

~ 0,4

Cll

~ 0,6~

0,2

~ 0,4

°

:::!0,2

°f..~OjÇ)o ~"O:> . +-'], -$0 0 RJrS- ').,,0:> +-'],

0"rv ~ ~ "tf ~«<Q <v~ «'<)0 <v~

Fig. 4.10 - Transcrição relativa do gene de IL-10 por macrófagos de camundongos CS7BLl6

e CS7BLl6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

* - Diferenças estatisticamente sign ificativas na transcrição do gene de IL-10 entre

macrófagos infectados por Shigel/a e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não pareado).

o aumento da transcrição do gene da IL-1 em relação à transcrição

basal foi significativo na infecção por EIEC (p=O,OOS), Shigella (p=O,02S) e

E.coli K12 (p=O,007). No entanto, não houve diferenças significativas na

transcrição deste gene entre EIEC, Shigella e E.coli K12 (fig. 4.11). Em

camundongos nocaute não houve diferenças significativas na transcrição do

gene de IL-1 na infecção pelas três bactérias, em relação à transcrição

basal.

57

IL-1 IL-1 iNOS KO

.+,'1­~

<v9

~"fl:Jv"rv

«<Q

fo-.$'\:)

1,6

1,4

1,2l'CI.:ül'CI

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0,4

0,2

O

~,«0v.+,'1­

~<v9

'}.,,,fl:J

V"rf«<Q

fo-.$'\:)

1,6 1

I1,4

1,2l'CIc::p.,l'CI

:! 0,8ni;;: 0,6~

0,4

0,2

O

0

Fig. 4.11 - Transcrição relativa do gene de IL-1 por macrófagos de camundongos C57BU6 e

C57BU6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

o aumento na transcrição do gene da IL-18 em relação à transcrição

basal foi significativo em macrófagos de camundongos selvagens na

infecção por EIEC (p=O,014) e Shigella (p=O,028). Não houve diferenças

significativas entre a transcrição do gene desta citocina entre macrófagos

infectados com EIEC, Shigella e E.coli K12 (fig. 4.12).

Curiosamente, em macrófagos de camundongos nocaute foi

observada uma inibição da transcrição do gene da IL-18 após infecção por

EIEC (p=O,027) e E.coli K12 (p=O,028) nos dois ensaios realizados. (fig.

4.12). A inibição da transcrição deste gene na infecção por Shigella foi

considerada pouco significativa (p=O,09), devido ao elevado desvio padrão.

Não foram observadas diferenças significativas na inibição da transcrição de

IL-18 entre EIEC, Shigella e E.coli K12.

58

IL-18 iNOS KO1,4 .,

1,2 l IL-181,2

nscns :;::;cu~ 0,8 : 0,8ns -.1! 0,6 ~ 0,6::§ 0Cl

~ 0,4 ...~

~ 0,4

0,2 0,2

° °0 s- ~,,~ +,1- ~0 0 s- ,,~ .+,1-$3 ~ ~ v $3 ~ ~0" 0° 0" <v':J««) <v. ««)

Fig. 4.12 - Transcrição relativa do gene de IL-18 por macrófagos de camundongos C57BU6

e C57BU6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

Ao contrário do observado na transcrição gênica das citocinas, a

transcrição do receptor transmembrânico TLR4 após infecção, em relação à

transcrição basal, foi significativo apenas em macrófagos infectados por

E.coli K12 (p=O,03) (fig. 4.13). Em macrófagos de camundongos nocaute

não houve aumento significativo na transcrição deste gene após infecção

por Shigella, EIEC e E.coli K12, devido aos elevados valores de desvio

padrão (figA.13).

59

TLR4 iNOS KO

1,6I TLR41,4 ~ 1,4

la 1,2 1,2t::

:;:;1

la<.> t::la :;:;

~ 08<.>: 0,8

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0,2 0,2

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Fig. 4.13 - Transcrição relativa do gene de TLR4 por macrófagos de camundongos C57BU6

e C57BU6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

o aumento na transcrição do gene da enzima iNOS em relação à

transcrição basal foi significativo na infecção por Shigella (p=O,01) e E.coli

K12 (p=O,04). A transcrição do gene da iNOS em macrófagos infectados por

Shigella foi maior do que em EIEC (p=O,02)(fig. 4.14).

60

*

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OZ

1,6 l

o

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B,§. ~,,":J . +,-'"~ ,,'1: (t

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Fig. 4.14 - Transcrição relativa do gene da iNOS por macrófagos de camundongos CS7BU6

e CS7BU6 iNOS KO após 4 horas de infecção, avaliada por RT-peR semiquantitativo. Os

dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes.

* - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene de iNOS entre

macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não pareado).

4.2.3 - Determinação da produção de TNF-a e IL-10 por ELISA

Os sobrenadantes das culturas de macrófagos não infectados e

infectados por quatro horas com Shigella, EIEC e E.coli K12, e estimulados

com LPS (cuja transcrição dos genes foi avaliada no ensaio anterior) foram

utilizados no ELISA de captura para determinação da concentração de TNF-

a e IL-10. De maneira semelhante ao ocorrido nos ensaios com macrófagos

J774, confirmou-se que a transcrição dos genes resultou em produção de

proteína (figuras 4.15 e 4.16).

Em relação aos macrófagos de camundongos selvagens não-

infectados (produção basal da citocina), a produção de TNF-a foi

significativamente maior em macrófagos infectados por Shigella (p=0,001),

EIEC (p=0,002), E.coli K12 (0,003) e estimulados com LPS (p=0,0001).

Macrófagos infectados com EIEC produziram mais TNF-a que

61

aqueles infectados com Shigella (p=O,043); estes resultados vão de

encontro aos obtidos no ensaio de transcrição gênica. Os macrófagos de

camudongos iNOS nocaute infectados por Shigella (p=O,001), EIEC

(p=O,0002) e E.coli K12 (p=O,001) produziram significativamente mais TNF

comparando-se aos macrófagos não-infectados, e a diferença na produção

desta citocina entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC também foi

significativa (p=O,002) (fig. 16).

4000 l TNF

3500

3000 " ... - TNFiNOSKO2500

_ 2500 IlIIIIiiIII 11 ~ 11 2000-§, 2000

Q.

1500 J • • • • E 1500

~ 10001000

500500

o o

0 S- ,,"3 .+,'" ~C:J 0 S- ,,"3 .+,'".$S :f' v .$S :f' ~

0" ~ 0" <vy«.<Q <vy «.<Q

Fig. 4.15 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de TNF-a por macrófagos de

camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 horas de infecção. Os dados

representam médias e desvios padrão de duplicatas e são representativos de dois

experimentos independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na produção de

TNF-a entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

62

A produção de IL-10 foi maior na infecção por Shigella (p<O,0001),

EIEC (p<O,0001), e E.coli K12 (p=O,0014), em relação à produção basal

desta citocina. Macrófagos infectados com EIEC produziram mais IL-10 que

aqueles infectados com Shigella (p=O,0016). Os macrófagos de

camundongos iNOS nocaute produziram significativamente mais IL-10

quando infectados com Shigella (p=O,005), EIEC (p=O,001) e E.coli K12

(p=O,001) comparando-se aos macrófagos não-infectados (fig.17). Neste

caso, também houve diferença significativa na produção de IL-10 entre

macrófagos infectados por EIEC e Shigella (p=O,02).

IL-10 iNOS KO

IL-10*

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xl~,,":J

0"rv~<Q

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9000

8000

7000

6000

5000

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3000

2000

1000

o0«C:Jv. ~'l­

(J>xl

*

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0"rv~<Q

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3000

1000

500

o

3500

2500

E 2000

~ 1500

Fig. 4.16 - DeterminaçãO, por ELISA de captura, da produção de IL-10 por macrófagos de

camundongos C57BLl6 e C57BLl6 iNOS KO após 4 horas de infecção. Os dados

representam médias e desvios padrão de duplicatas e são representativos de dois

experimentos independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na produção de

IL-10 entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

63

4.3 - Interação entre EIEC e camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO

"in vivo"

4.3.1 - Determinação do influxo celular para o peritônio após infecção

A análise dos resultados obtidos na citometria de fluxo pode ser

observada na figura 4.17. A infecção intraperitonial com ShigeJla e EIEC

resulta em influxo celular, uma vez que o número de células aumentou da

ordem de 106 para 107. Os granulócitos são a população predominante em

todos os tempos de infecção por ShigeJla e EIEC. Camundongos infectados

por ShigeJla, porém, permanecem com o número destas células aumentado

mesmo após 48 horas de infecção, enquanto que, em na infecção por EIEC,

observa-se um decréscimo a partir de 24 horas.

Observa-se também o influxo de macrófagos para o peritônio após

infecção com as duas bactérias. No peritônio de camundongos infectados com

Shigella o número de macrófagos praticamente não se altera após 12 e 24

horas de infecção, no entanto, após 48 horas, este número é três vezes maior

do que em camundongos não-infectados. A infecção por EIEC estimulou um

padrão semelhante de influxo de macrófagos; no entanto, após 48 horas o

número de macrófagos na infecção por Shigella é aproximadamente 1,3 vez

maior que na infecção por EIEC.

O número de linfócitos no peritônio de animais infectados com Shigella

e EIEC diminuiu em relação aos não-infectados. Na infecção por Shigella esta

diminuição é observada após 12 e 24 horas de infecção; após 48 horas o

64

número de linfócitos é semelhante ao número encontrado em camundongos

não-infectados. Na infecção por EIEC a diminuição ocorre apenas após 12

horas de infecção; nos tempos subseqüentes os valores são restaurados aos

valores basais.

EIEC FBC124/13_ Macrófagos

_ Neulrófilos

_ Linfócitos

24h 48h

2000,

o 1600~

'".!!!1200:>

:c;;".."C 800e..E

400.:>Z

o12 24 48 (-) 12h

Shigella flexneri M90T2000,

f 1600I

'".!!!1200:>

:c;;".."C 800·e..E

.:> 400Z

o(-)

Tempo de infecção (horas) Tempo de infecção (horas)

FigA.17 - Número de células em camundongos C57BL/6 não infectados e após 12, 24 e 48

horas de infecção com Shigella M9üT e EIEC FBC124/13, determinado por citometria de fluxo.

Os dados são representativos de dois experimentos independentes.

Foi realizada também marcação com anti-MHCII, anti-C080 e anti-

C086, moléculas que formam o complexo de ligação ao linfócito T, e são um

indicativo do estado de ativação dos macrófagos. Além disso, foi analisada

isoladamente a transcrição do marcador de macrófagos F4/80 (figuras de 4.18

a 4.21).

A infecção por Shigella e EIEC induz a modulação positiva da

transcrição de MHCII na superfície dos macrófagos peritoniais. No entanto,

macrófagos de camundongos infectados com Shigella apresentaram maior

expressão desta molécula do que os macrófagos de camundongos infectados

com EIEC, em todos os tempos de infecção (figA.18)

65

M1

11102Fl1-M1C 11

FBC124/13M90T~l

o1 '"MHCII __ M90T

-- FBC124/1~1 I MI I ov

250 l200 ::::====---:: q

I

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100 -

50· =' ~ IIL~ü"··'~I.. ... 1 1"1. I ;:>

O -I o' r '-"'~"ILW ~\

lJO 10 ' 1~2 103 lIi4 o11)012 24 48 Fl1-M1C 11

Terrpo de infecção (horas)

Fig. 4.18 - Análise da expressão de MHCII por macrófagos em peritônio de camundongos não

infectados (linha preta) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e 48h (linha azul) de infecção

com Shigella f1exneri M9üT e EIEC FBC124/13. Os gráficos e histogramas são

representativos de dois experimentos independentes.

Também se observa aumento na expressão da molécula co-

estimulatória C080 (87-1) em todos os tempos de infecção por Shigella e

EIEC, em relação aos controles negativos. Após 12 horas de infecção, a

expressão desta molécula é maior em macrófagos de camundongos infectados

com EIEC, e, nos tempos subseqüentes, maior na infecção por Shigella

(figA.19).

- ,.

-..1.:_ dadf. c; (.;i'" ;.\..,~ 66

coso M90T FBC124/13

_M90T :B ] <:>500, I c

_FBC124/13

~<:>

400 '"M1 ] I M1

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11l 300

A.l/lic: IA IA

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12 24 481(;0 . ... "io1 . .. ';'02 .... ";'03 ";Ô4

FL2-CD80 FL2-CD80

Tempo de infecção (horas)

Fig. 4.19 .. Análise da expressão de C080 por macrófagos em peritônio de camundongos não

infectados (linha vermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e 48h (linha azul) de

infecção com Shigella flexneri M90T e EIEC FBC124/13. Os gráficos e histogramas são

representativos de dois experimentos independentes.

Curiosamente, houve diminuição da expressão da molécula co-

estimulatória CD86 (87-2) em macrófagos de camundongos infectados com as

duas bactérias em relação aos não infectados. Esta modulação negativa foi

maior em camundongos infectados com EIEC em todos os tempos de infecção

(fig. 4.20).

67

M90T FBC124/13

104

M1

10 1 - - - -;02 - -i03

FL2-CD86

oM

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oN

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o104 11)0

M1

101 ... '1()2 - - -i03FL2-CD86

oN

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~

IAC...,:3~

OV

g, i

__M90T

___ FBC124/13 :!3

CD86

~

Tempo de infecção (horas)

12 24 48

O+1-----.-----------,-----,

40

160

120

lO<:

;3 80~

Fig. 4.20 - Análise da expressão de CD86 por macrófagos em peritônio de camundongos não

infectados (linha vermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e 48h (linha azul) de

infecção com Shigella flexneri M90T e EIEC FBC124/13. Os gráficos e histogramas são

representativos de dois experimentos independentes.

A expressão de F4/80 também decresce após 12 horas de infecção

pelas duas bactérias, em relação aos não infectados. Na infecção por Shigella,

os valores da expressão de F4/80 continuam baixos nos tempos

subseqüentes, enquanto na infecção por EIEC este vaiare é praticamente

restaurado ao nível basal após 48 horas de infecção (fig. 4.21).

68

M90T FBC124/13F4/80

-+-tv'9üT o o~ ~

__ F8C124/13

500o oo:>

/lro

400 -

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o12 24 48

100

101 10

2 104 o

100

101

102

Terrpo de infecção (horas) FL1-F4180FL 1-F4180

Fig. 4.21 - Análise da expressão de F4/8ü por macrófagos em peritônio de camundongos não

infectados (linha vermelha) e após 12h (linha verde), 24h (linha rosa) e 48h (linha azul) de

infecção com Shigella flexneri M9üT e EIEC FBC124/13. Os gráficos e histogramas são

representativos de dois experimentos independentes.

4.3.2 - Análise da transcrição relativa dos genes das citocinas, iNOS

eTLR4 por RT-PCR semiquantitativo

Neste ensaio foi avaliada a transcrição relativa de genes das citocinas

TNF-a, IL-10, IL-1, IL-18 e IFN-y, da quimiocina IP-10, do TLR4 e da enzima

iNOS por células peritoniais totais de camundongos C57BLl6 e C57BLl6

iNOS KO infectados por 4 e 48 horas com EIEC, Shigella, E.coli K12 (107

bactérias) por RT-PCR semiquantitativo. Foi realizada análise densitométrica

com software apropriado (Scion Image) (fig. 4.22 a 4.30).

A transcrição do gene do TNF-a após 4 horas de infecção foi

significativamente maior em células peritoniais de animais selvagens

infectados com Shigella (p=0,03), EIEC (p=0,003) e E.coli K12 (p=0,052),

em relação à transcrição basal (camundongos não infectados) (fig. 4.22). A

transcrição do gene do TNF-a foi maior por células de camundongos

infectados com Shigella do que com EIEC (p=0,02) e maior na infecção por

69

ShigeIJa do que na infecção por Ecoli K12 (p=O,02). Após 48 horas de

infecção, apenas o aumento na transcrição deste gene por camundongos

infectados com ShigeIJa foi significativo (p=O,001). Camundongos infectados

com ShigeIJa apresentaram maior transcrição deste gene do que aqueles

infectados com Ecoli K12 (p=O,002).

Em camundongos nocauteados no gene da iNOS também houve

aumento significativo da transcrição do gene de TNF-a após 4 horas de

infecção por ShigeIJa (p=O,003), EIEC (p=O,004) e Ecoli K12 (p=O,005);

porém, após 48 horas, este aumento foi significativo apenas após infecção

por EIEC (p=O,02), provavelmente devido aos altos valores de desvio padrão

obtidos na transcrição do gene de TNF-a em animais infectados com

ShigeIJa e Ecoli K12 (fig. 4.22).

*1,6

1,4

<11 1,2c:13 1lO

J! 08lii 'Li: 0,6zI- 0,4

, 0,2

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TNF iNOS KO1,2

~ 1~ 0,8

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~0 0"« «<Q

Fig. 4.22 - Transcrição relativa do gene de TNF-a por células peritoniais de camundongos

C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene de

TNF-a entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

70

o aumento na transcrição do gene de IL-10 por células de

camundongos selvagens após 4 horas foi significativo na infecção por EIEC

(p=O,008), Shigella (p=O,01) e EcoJi K12 (p=O,027) em relação à transcrição

basal (fig. 4.23). EIEC induziu uma maior transcrição deste gene do que

Shigella (p=O,014) e EcoJi K12 (p=O,007), e Shigella estimulou maior

transcrição deste gene que EcoJi K12 (p=O,03). Curiosamente, após 48

horas de infecção, a bactéria que mais induziu a transcrição de gene de IL­

10 em relação à transcrição basal foi Shigella (p=O,018). A transcrição deste

gene foi maior em camundongos infectados com Shigella do que naqueles

infectados com EcoJi K12 (p=O,OOS).

Em células de camundongos iNOS nocauteados, o aumento na

transcrição do gene de IL-10 foi significativa na infecção por Shigella

(p=O,002), EIEC (p=O,007) e EcoJi K12 (p=O,018). Porém, nestes

camundongos o aumento na transcrição é semelhante em camundongos

infectados com Shigella e EIEC, e maior em camundongos infectados com

Shigella do que naqueles infectados com EcoJi K12 (p=O,OOS), e também

maior em camundongos infectados com EIEC do que na infecção por EcoJi

K12 (p=O,017). Após 48 horas de infecção o aumento na transcrição do

gene de IL-10 foi significativo apenas na infecção por EIEC, (p=O,011) em

relação à transcrição basal, e não há diferenças entre a transcrição deste

gene nas células peritonias de camundongos infectados com Shigella, EIEC

e EcoJi K12 (fig.4.23).

71

1,8* IL-10 IL-10 iNOS KO

1,61,6

1,41,4

11l

~ 1,215 1,2u

~11l 1 1~ 11l~ 0,8 ~ 0,8o 11l:::; 0,6 ~ 0,6

0,4 ~ 0,40,2 0,2

O O

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Fig. 4.23 - Transcrição relativa do gene de IL-10 por células peritoniais de ~mundongosC57BU6 e C57BLl6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene de IL­

10 entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

Em camundongos selvagens a transcrição do gene de IL-1 foi

significativamente maior que a transcrição basal na infecção por Shigella

(p=O,003) e EIEC (p=O,006) (fig. 4.24). A transcrição do gene de IL-1 foi

maior em camundongos infectados com Shigella do que naqueles infectados

com EIEC (p=O,04) e E.coli K12 (p=O,02). As células peritoniais de

camundongos infectados por 48 horas com Shigella foram as únicas a

apresentar aumento significativo da transcrição do gene de IL-1 em relação

à transcrição basal (p=O,003), e Shigella induziu maior transcrição deste

gene do que E.coli K12 (p=O,006). Entre os camundongos nocaute o

aumento na transcrição do gene de IL-1 em relação à transcrição basal foi

maior na infecção por EIEC (p=O,002) e Shigella (p=O,005). EIEC induziu

maior transcrição deste gene que Shigella (p=O,01). Após 48 horas não

72

houve diferenças significativas no aumento da transcrição deste gene em

células de camundongos infectados comparando-se à transcrição basal;

também não houve diferenças entre a transcrição do gene de IL-1 na

infecção por Shigella, EIEC e Ecoli K12 (fig. 4.24).

IL-1 iNOS KO

1,4

1,2

.~ 113til 0,8~~ 0,6~

~ 0,4

0,2

o

IL-1*

1,6 1I

1,4

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~ 0,8~~ 0,6~

0,4

0,2

o 1-

*

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Fig. 4.24 - Transcrição relativa do gene de IL-1 por células peritoniais de camundongos

CS7BU6 e CS7BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene de IL-1

entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não pareado).

o aumento na transcrição do gene da IL-18 em relação à transcrição

basal foi significativo após quatro horas de infecção por Shigella (p=O,021) e

pouco significativo na infecção por Ecoli K12 (p=O,051) (fig. 4.25). Shigella

induziu maior transcrição deste gene que Ecoli K12 (p=O,04). Após 48 horas

de infecção não houve aumento significativo na transcrição do gene de IL-18

na infecção por EIEC, Shigella e Ecoli K12 em relação à transcrição basal.

73

Entre os camundongos nocaute, após 4 horas de infecção a transcrição do

gene da IL-18 foi significativamente superior à transcrição basal apenas em

camundongos infectados com EIEC (p=O,006). EIEC induziu maior

transcrição deste gene que Ecoli K12 (p=O,04). Após 48 horas, observamos

que a única bactéria que induziu um aumento significativo na transcrição

deste gene foi Ecoli K12 (p=O,04) (fig. 4.25).

IL-18 iNOS KO

o ~ ~ ~ 'b'<::- c§' <§'~ ,,':> ,,'I- ~bl ,:>b/ bl

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1,4 1I

1,2'"É 1o: 0,8

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1,4 l IL-181,2 ~

'".!: 113: 0,8"=~ 0,6

:::; 0,4

0,2

°

Fig. 4.25 - Transcrição relativa do gene de IL-18 por células peritoniais de camundongos

C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes.

Em camundongos selvagens, a transcrição do gene de IFN-y foi

significativamente maior que a transcrição basal após 4 horas de infecção

com Shigella (p=O,004) e EIEC (p=O,01); não houve diferenças significativas

na transcrição deste gene por células de camundongos infectados com

Shigella, EIEC e Ecoli K12. Após 48 horas, apenas camundongos

infectados com Shigella apresentaram aumento significativo na transcrição

deste gene (p=O,03), e neste tempo de infecção também não houve

diferenças significativas na transcrição entre as células de camundongos

74

infectados com as três bactérias (fig.4.26). Na infecção de camundongos

nocaute, o aumento da transcrição do gene de IFN-y em relação à

transcrição basal só foi significativo em células de camundongos infectados

por 4 horas com EIEC (0,006). O aumento na transcrição não foi significativo

após 48 horas de infecção com nenhuma bactéria, provavelmente devido

aos altos valores dos desvios padrão (fig.4.26).

1,4IFN-y

1,6IFN- Y iNOS KO

1,2

1,4

coc 1

ê 1,2

·ü~ 0,8

n 1co

':li 06

ª 0,8

- '~ 0,4

coZ 0,6

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0,2

- 0,4

o0,2

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~0 0"~ ~«)

Fig. 4.26 - Transcrição relativa do gene de IFN-y por células peritoniais de camundongos

C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes.

A transcrição do gene do receptor transmembrânico TLR4 em

camundongos selvagens foi maior em macrófagos infectados por Shigella

(p=0,03) e Ecoli K12 (p=O,OS) após 4 horas de infecção, em relação à

transcrição basa!. Shigella induziu maior transcrição deste gene que EIEC

(p=O,OS). Após 48 horas apenas Ecoli K12 (p=O,OS) induziu aumento

significativo da transcrição deste gene. Ecoli K12 induziu maior transcrição

do gene do TLR4 que EIEC (p=0,007) (fig. 4.27). Camundongos nocaute só

apresentaram aumento significativo na transcrição do gene de TLR4 após

75

48 horas de infecção por Ecoli K12 (p=O,02) em relação à transcrição basal

(fig. 4.27).

1,4

1,2

.~ 1Õ(1J 08(1J ,

~ 06~ ,

~ 0,4

I- 0,2

o

TLR4TLR4 iNOS KO

1,2

~ 1

~ 0,8

'* 0,6

~ 0,4

~ 0,2o

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Fig. 4.27 - Transcrição relativa do gene de TLR4 por células peritoniais de camundongos

C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na transcrição do gene do

TLR4 entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não

pareado).

Após 4 horas de infecção a transcrição do gene da quimiocina IP-10

foi significativamente maior do que a transcrição basal na infecção por

Shigella (p=O,OOOS), EIEC (p=O,002) e Ecoli K12 (p=O,007), e, após 48

horas, o aumento na transcrição foi significativo apenas na infecção por

Shigella (p=O,OOS) e Ecoli K12 (p=O,04). Em camundongos nocauteados no

76

gene da iNOS houve aumento significativo da transcrição do gene de IP-10

após 4 horas de infecção por Shigella (p=O,003), EIEC (p=O,01) e E.coli K12

(p=O,009); após 48 horas, este aumento foi significativo na infecção por

EIEC (p=O,OS) e E.coli K12 (p=O,003) (figA.28).

2

1,8

1,6

~ 1,4

:g 12co '

J!! 1ro~ 0,8

~ 0,6

0,4

0,2

° I -

IP-10 2

1,8

1,6

~ 1,4

~ 1,2

J!! 1ro~ 0,8

~ 0,6

0,4

0,2

°I -

IP-10 iNOS KO

o ~~ ~~ ~ ~~ ':).~ ':).~RlÇ) ~" +,'1.- s} ",,,~ ,,'1.-~ ,,'V ~Oj rf ~

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~, ~~ ~~ ~ ~~ $' $'RlÇ) ~" +,'1.- s} ,,~ ,,'1.-~ ,,'V $':f ~

~v 0"« «(()

Fig. 4.28 - Transcrição relativa do gene de IP-10 por células peritoniais de camundongos

C57BU6 e C57BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR

semiquantitativo. Os dados representam médias e desvios padrão de dois experimentos

independentes.

o aumento na transcrição do gene da enzima iNOS em relação à

transcrição basal foi significativo após 4 horas de infecção por Shigella

(p=O,003) e EIEC (p=O,01). Shigella induziu maior transcrição deste gene

que EIEC (p=O,02). Após 48 horas de infecção houve aumento significativo

na transcrição do gene da iNOS apenas em camundongos infectados com

77

Shigella (p=O,02). Neste tempo de infecção não houve diferenças

significativas no aumento da transcrição deste gene entre as células

peritonias de camundongos infectados com as três bactérias (fig 4.29).

1,6 11,4

:g 1,2

U 1tU

~ 0,8tU

~ 0,6

~ 0,4

0,2

° I ..

iNOS

o ~ ~ ~ ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ b<V

Rl<:::l ~..... ~ ~ .....~ ....."),~ ~ $' #- ~

~0 0.....~ ~<Q

Fig. 4.29 - Transcrição relativa do gene da iNOS por células peritoniais de camundongos

C57BU6 após 4 e 48 horas de infecção, avaliada por RT-PCR semiquantitativo. Os dados

representam médias e desvios padrão de dois experimentos independentes. * - Diferenças

estatisticamente significativas na transcrição do gene do iNOS entre macrófagos infectados

por Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não pareado).

4.3.3 - Determinação da produção de TNF-a, IL-10 e IFN-y por ELISA

Os sobrenadantes dos lavados peritoniais de camundongos C57BU6

e C57BU6 iNOS nocaute, não infectados e infectados por 4 e 48 horas com

Shigella, EIEC e E.coli K12 (cuja transcrição dos genes das células foi

78

avaliada no ensaio anterior) foram utilizados no ELISA de captura para

determinação da concentração de TNF-a, IL-10 e IFN-y (figA.30 a 4.32).

Em relação às células peritoniais de camundongos selvagens não­

infectados (produção basal da citocina), a produção de TNF-a foi

significativa após 4 horas de infecção por .Shigella (p=O,03) e EIEC

(p=O,0007). A produção de TNF-a foi maior em células de animais

infectados com Shigella do que em células infectadas com Ecoli K12

(p=O,04), e também maior na infecção por EIEC do que na infecção por

Ecoli K12 (p=O,002). A diferença na produção de TNF-a por camundongos

infectados por EIEC e Shigella foi pouco significativa (p=O,OS2),

provavelmente devido ao alto desvio padrão obtido nas dosagens de TNF-a

na infecção por Shigella. Após 48 horas de infecção houve aumento

significativo da produção de TNF por células de camundongos infectados

por Shigella (p-O,OOOS), EIEC (p=O,0009) e Ecoli K12 (p=O,03). Houve maior

produção de TNF por camundongos infectados com Shigella em relação

àqueles infectados com EIEC (p=O,002) e Ecoli K12 (p=O,008).

Os camudongos iNOS nocaute infectados por 4 horas com Shigella

(p=O,003), EIEC (p=O,003) e Ecoli K12 (p=O,04S) produziram

significativamente mais TNF-a comparando-se aos não-infectados, e a

diferença na produção desta citocina entre camundongos infectados com as

três bactérias não foi significativa. Após 48 horas de infecção houve

aumento significativo de produção de TNF-a na infecção por Shigella

(p=O,009) e EIEC (p=O,003). A produção desta citocina foi significativamente

maior na infecção por Shigella do que na infecção por EIEC (p=O,OS).

79

o ~ ~ ~ n.~ c§' c§'~ ~ ~ b<V ~ ~

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TNF TNFiNOS KO

2400, ** 2000

1600

~ 1200a.

800

400

O

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2oo0~I

1600

~ 1200a.

800

400

O

~,

Fig. 4.30 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de TNF-a por células

peritoniais de camundongos C57BU6 e C57BLl6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção.

Os dados representam médias e desvios padrão de duplicatas e são representativos de

dois experimentos independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na produção

de TNF-a entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não

pareado).

A produção de IL-10 foi maior após 4 horas de infecção por Shigella

(p=O,008), EIEC (p=O,005), e Ecoli K12 (p=O,001), em relação à produção

basal desta citocina. Houve maior produção de IL-10 em células de

camundongos infectados com Shigella do que naquelas infectadas com

Ecoli K12 (p=O,02); a produção desta citocina também foi maior na infecção

por EIEC do que por Ecoli K12 (p=O,0003). Após 48 horas de infecção a

produção de IL-10 foi significativamente superior à produção basal apenas

na infecção por Shigella (p=O,006). Camundongos infectados com Shigella

produziram mais IL-10 do que aqueles infectados com EIEC (p=O,005) e

80

Ecoli K12 (p=O,006) (fig. 4.31).

A produção de IL-10 após 4 horas de infecção em camundongos

nocaute foi significativamente superior à produção basal na infecção por

Shigella (p=O,002), EIEC (p=O,04) e Ecoli K12 (p=O,02). A produção de IL-

10 foi maior em camundongos infectados com Shigella do que naqueles

infectados por EIEC (p=O,001) e Ecoli K12 (p=O,001). Após 48 horas de

infecção não houve produção significativa de IL-10 em camundongos

infectados por qualquer uma das três bactérias (fig. 4.31).

6000, IL-10

IL-10 iNOS KO

7000

5000 *I *6000

5000

1 3000

E 4000

c-C»

2000

c. 3000

1000

2000

o

1000

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Fig. 4.31 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de IL-10 por células

peritoniais de camundongos CS7BLl6 e CS7BLl6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção.

Os dados representam médias e desvios padrão de duplicatas e são representativos de

dois experimentos independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na produção

de IL-10 entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não

pareado).

As células de camundongos selvagens infectados por 4 horas com

Shigella (p=O,007), EIEC (p=O,004) e Ecoli K12 (p=O,03) apresentaram

aumento significativo na produção de IFN-y em relação à produção basal

81

(fig. 4.32). Não houve diferenças na produção desta citocina entre

camundongos infectados com Shigella e EIEC, porém a diferença foi

significativa entre camundongos infectados com Shigella e Ecoli K12

(p=O,02), e EIEC e Ecoli K12 (p=O,009). Após 48 horas de infecção houve

aumento significativo da produção de IFN-y por células de camundongos

infectados por Shigella (p=IO,03) e EIEC (p=O,01). As células peritonias de

camundongos infectados com Shigella e EIEC produziram quantias

semelhantes de IFN-y, mas camundongos infectados com Shigella

produziram mais IFN-y do que aqueles infectados com Ecoli K12 (p=O,04).

Os camudongos iNOS nocaute infectados por 4 horas com Shigella

(p<O,0001), EIEC (p=O,03) e Ecoli K12 (p=O,04) produziram

significativamente mais IFN-y comparando-se aos não-infectados. Observou­

se maior produção de IFN-y, na infecção por EIEC, se comparada à infecção

por Shigella (p=O,04) e Ecoli K12 (p=O,04). As células de camundongos

infectados com Shigella e Ecoli K12 produziram quantias semelhantes de

IFN-y. Após 48 horas de infecção houve aumento significativo de produção

de IFN-y apenas na infecção por Ecoli K12 (p=O,03) em relação à produção

basal; camundongos infectados por esta bactéria produziram mais IFN-y do

que os infectados por Shigella (p=O,002), e EIEC (p=O,002).

82

4500 1

4000

3500

IFN-y 30001600

1400 E 2500-..

1200 ~ 20001000

~ 800 1500O-

600 1000400

200500

O O

IFN-y iNOS KO

*

Fig. 4.32 - Determinação, por ELISA de captura, da produção de IFN-y por células

peritoniais de camundongos CS7BU6 e CS7BU6 iNOS KO após 4 e 48 horas de infecção.

Os dados representam médias e desvios padrão de duplicatas e são representativos de

dois experimentos independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na produção

de IFN-y entre macrófagos infectados por Shigella e EIEC (p<O,OS segundo o teste t não

pareado).

4.3.4 - Determinação da mortalidade de camundongos C57BU6 e C57BU6

iNOS KO após infecção

Lotes de quatro camundongos C57BU6 e C57BU6 iNOS KO foram

inoculados intraperitonialmente com suspensões de EIEC FBC124/13 e

Shigella M90T contendo 107 e 108 bactérias. Os resultados são mostrados

na tabela 1. Observa-se que a infecção por E.coli K12 não foi letal para os

camundongos em nenhuma das duas concentrações testadas. O inóculo de

108 foi letal para 100% dos animais selvagens e nocautes inoculados com

83

Shigella e EIEC, após 48 horas de infecção. O inóculo de 107 não foi letal

para os animais selvagens inoculados com EIEC e Shigella, porém foi letal

para 25% dos camundongos nocaute infectados com Shigella, e para 75%

dos camundongos nocaute infectados com EIEC.

C57BU6 C57BU6 iNOS KO

Shigella M90T (1 Of) 0% 25%

Shigella M90T (1 O!l) 100% 100%

EIEC FBC 124/13 (10 f) 0% 75%

EIEC FBC 124/13 (10!l) 100% 100%

E.coli K12 (10 f) 0% 0%

E.coli K12 (10!l) 0% 0%

Tabela 4.1 - Porcentagem de mortalidade em camundongos C57BL/6 e

C57BL/6 iNOS KO infectados com inóculos de 107 e 108 Shigella f1exneri

M90T, EIEC FBC124/13 e E.coli K12 por 48 horas.

4.4 - Resposta de linfócitos à infecção por EIEC

4.4.1 - Linfoproliferação

Neste ensaio foi avaliada a proliferação da população celular dos

linfonodos de animais previamente imunizados no coxim plantar com EIEC e

Shigella, e posteriormente estimulados com os antígenos solúveis secretados

por estas bactérias (fig 4.33) Para tanto, inicialmente foi obtida uma curva de

proliferação, onde foram testadas as concentrações antigênicas de 10 a 100

84

I-Ig (fig.23). Observou-se que, em relação aos controles negativos (linfócitos

de animais imunizados que não foram posteriormente estimulados com os

antígenos bacterianos) houve um aumento na proliferação de linfócitos de

animais imunizados com Shigella e EIEC e posteriormente estimulados com

os antígenos.

2 3

67 ...

43'" •

30 ...

20 ...

Fig. 4.33 - SOS-page dos antígenos secretados por EIEC FBC124/13 e Shigel/a M90T apóscinco horas de incubação em contato com células Hep-2. 1- Padrão de peso molecular; 2­

Antígenos secretados por Shigel/a M90T (100 fl9); 3- Antígenos secretados por EIECFBC124/13 (100 fl9).

Entre os linfócitos de animais que foram imunizados com Shigella e

posteriormente estimulados com antígenos de Shigella este aumento foi

significativo quando os linfócitos foram estimulados com 20l-lg de antígenos

(p=0,019); 30l-lg (p=0,0038); 40l-lg (p=O,0005), 50l-lg (p<0,0001), 60l-lg

(p=O,0002), e 70l-lg, 80l-lg, 90l-lg e 100l-lg de antígenos (p=0,0001 para todos).

Entre os linfócitos de animais que foram imunizados com EIEC e

posteriormente estimulados com antígenos de EIEC este aumento foi

significativo quando os linfócitos foram estimulados com 10l-lg de antígenos

85

(p=O,010); 20jJg (p=O,004); 30jJg (p=O,012), 40jJg (p=O,0093), 50jJg (p=O,028),

60jJg (p=O,017), 80jJg (p=O,02) e 90jJg de antígenos (p=O,04).

Além disso, observa-se claramente pelo gráfico que os linfócitos de

camundongos imunizados com Shigella e estimulados com antígenos de

Shigella proliferaram mais do que aqueles imunizados com EIEC e

estimulados com antígenos de EIEC. Esta diferença foi significativa quando os

linfócitos foram estimulados com 10jJg de antígeno (p=O,031); 20jJg

(p=O,0073); 30jJg (p=O,0019); 40jJg (p=O,0004), e 50jJg, 60jJg, 70jJg, 80jJg,

90jJg e 100jJg de antígeno (p=O,0001 para todos). Além disso, pode-se

observar que mesmo quando os linfócitos foram estimulados com

Concanavalina A aqueles provenientes de camundongos imunizados com

Shigella proliferaram mais do que aqueles imunizados com EIEC (p=O,007).

200000 -,

II * *

• M90T

• FBC124/13

*

Ê 160000a.~

.8~ 120000·E *

* **

80000

l **

* I40000

o -r----,----,----,----,----,----,----,----,-...".-,-

\:.' f;:-'?- "Ç) '1"Ç) fl:JÇ) b<Ç) ~Ç) roÇ) "Ç) coÇ) q,Ç) Ç)Ç)

cP "Concentração de antígenos solúveis (I-Ig)

L-

oa.Cf)Q)

100­ro

E·13

FigA.34- Proliferação de linfócitos de camundongos imunizados com Shigella fiexneriM90T e EIEC FBC 124/13 por sete dias e posteriormente estimulados com diferentesconcentrações de antígenos solúveis de Shigella e EIEC. CanA - 41Jg. Os dados sãomédias e desvios-padrão de triplicatas e são representativos de dois experimentos

independentes. * - Diferenças estatisticamente significativas na proliferação de linfócitosestimulados com antígenos de Shigella e EIEC (p<O,05 segundo o teste t não pareado).

86

Avaliou-se posteriormente a capacidade de proliferação linfocitária após

estímulo com antígenos secretados por uma bactéria diferente da que o

animal foi imunizado. Os linfócitos de animais inoculados com Shigella foram

estimulados com antígenos de Shigella, EIEC e Ecoli K12, o mesmo

acontecendo com os linfócitos de animais inoculados com EIEC e Ecoli K12

(fig.24).

Entre os linfócitos de camundongos imunizados com Shigella, o maior

índice de proliferação ocorreu após estímulo com antígenos de Shigella

(p<O,0001), seguida do estímulo com antígenos de Ecoli K12 (p=O,002). O

menor índice de proliferação ocorreu após estimulo com antígenos de EIEC

(p=O,0004), comparando-se aos controles negativos. As diferenças entre os

índices de proliferação foram significativas entre linfócitos estimulados com

antígenos de Shigella e EIEC (p=O,0016) e Shigella e Ecoli K12 (p=O,0196), e

pouco significativas entre linfócitos estimulados com antígenos de EIEC e

Ecoli K12 (p=O,065).

Entre os linfócitos de animais imunizados com EIEC, observou-se

comportamento semelhante. O maior índice de proliferação ocorreu após

estímulo com antígenos de Shigella (p=O,0004), seguido do estímulo com

antígenos de Ecoli K12 (p=O,001) e EIEC (p=O,001). Neste caso, as

diferenças entre os índices de proliferação foram significativas entre linfócitos

estimulados com antígenos de Shigella e EIEC (p=O,0006) e EIEC e Ecoli

K12 (p=O,00180). Não houve diferenças significativas entre os índices de

Iinfoproliferação induzidos pelos antígenos de Shigella e Ecoli K12.

87

Finalmente, os linfócitos de camundongos imunizados com antígenos

de Ecoli K12 apresentaram maior índice de proliferação quando estimulados

com antígenos de Ecoli K12 (p<O,0001), seguido dos estimulados com

antígenos de Shigella (p=O,0001), e EIEC (p=O,001). Novamente não houve

diferenças significativas entre os índices de linfoproliferação induzidos pelos

antígenos de Shigella e Ecoli K12. Porém, a linfoproliferação induzida pelos

antígenos de Shigella (p=O,0004) e Ecoli K12 (p=O,0003) foram

significativamente maiores do que a induzida pelos antígenos de EIEC.

Neste ensaio foi utilizada a fitohemaglutinina como controle positivo, e

os linfócitos dos camundongos imunizados com as três bactérias proliferaram

de maneira semelhante após este estímulo (a diferença entre estes índices de

proliferação não foi significativa).

88

Shigella M90T E1EC FBC 124/13

~, * ~l~000 6000050000 50000

E 40000 í E 40000

~~ _. I ~:~j í. - •~\ :A~ [):,ç} ~,,":> ~'), ~\ ;<::-4.,,0 _~ç} ~,,":> "~'"

«~ ~ ,,'I: ~ « ~. ,(I) (j>ú cP ~ú ,-,Y

~<Q <v" ~ v

antígenos solúveis (100 I1g) antígenos solúveis (100 I1g)

E.coli K1270000~000

50000

~=j li2000010000

O

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~~~ ~,,":>0,(1)

~<Q

I...*

_~o

«~.,~\

antigenos solúveis (100 Ilg)

Fig. 4.35 - Proliferação de linfócitos de camundongos imunizados com Shigella flexneri

M90T, EIEC FBC124/13 e E.coli K12 por sete dias e posteriormente estimulados com

100 /lg de antígenos solúveis de M90T, EIEC e K12. Fitohemaglutinina - 41Jg. Os dados

representam média e desvio padrão de triplicatas e são representativos de um

experimento. * - Diferenças estatisticamente significativas na proliferação de linfócitos

estimulados com antígenos de Shigella e EIEC (p<0,05 segundo o teste t não pareado).

4.4.2 - Produção de IFN-y, IL-10 e IL-4

o resultados podem ser vistos na figura 9. O ELISA de captura

detectou produção de IFN-y e IL-10 apenas no sobrenadante de linfócitos de

camundongos imunizados com Shigel/a e estimulados por 72 horas com 100

J.lg de antígenos solúveis de Shigella. Os linfócitos de animais imunizados com

EIEC não produziram estas citocinas "nem mesmo quando estimulados com

100 J.lg de antígenos solúveis de EIEC. Não foi detectada produção de IL-4,

por linfócitos de camundongos imunizados com Shigel/a e EIEC, tanto nos

89

controles negativos quanto nos linfócitos estimulados por 72 horas com os

antígenos (dados não mostrados).

1FN-r

'\~~"O:>

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1200

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Fig. 4.36 - Produção, de IL-1ü e IFN-y por linfócitos de camundongos Balb/C imunizados com

Shigella f1exneri M9üT e EIEC FBC 124/13 e posteriormente estimulados por 72h com

antígenos solúveis de Shigella e EIEC, respectivamente. Os dados representam médias e

desvios padrão de duplicatas e são representativos de um experimento.

4.2.4 - Determinação das subpopulações de linfócitos

As células dos linfonodos de animais imunizados com Shigella e EIEC

foram marcadas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD4, ou anti-CD3 e anti-CD8.

Os resultados obtidos através de citometria de fluxo podem ser observados

na figura 8. Pode -se observar através dos gráficos que tanto em linfonodos

de animais imunizados com Shigella quanto com EIEC a população linfocitária

predominante é a de TCD4+ (histogramas A e C). A porcentagem de linfócitos

TC8+ é menor do que a de TCD4+ nos linfonodos de animais inoculados com

90

ambas as bactérias (histogramas B e O). Não houve diferenças significativas

na porcentagem de células TC04+ e TCOS+ entre camundongos imunizados

com Shigella e EIEC.

A M90T B

c FBC124/13 D

50 1

I40 -

12 30::J

:a>~ 20o

10

orv190T F8C124/13

• TCD4+

o TC08+

Fig.4.37 - Citometria de fluxo de células dos linfonodos de camundongos infectados

com Shigel/aM9üT e EIEC FBC24/13.A e C - Dupla marcação CD3 (FL2-PE) e

CD4 (FL1-FITC); B e D - Dupla marcação CD3 (FL2-PE) e CD8 (FL1-FITC). Os

resultados são representativos de dois experimentos independentes.

91

5 - DISCUSSÃO

Shigella sp e Escherichia coli enteroinvasora são os agentes

etiológicos da disenteria bacilar, doença intestinal aguda com incidência de

aproximadamente 160 milhões de casos anuais, 99% deles em países

subdesenvolvidos (KOTLOFF e coL, 1999; SANSONETTI, 2001).

EIEC e Shigella apresentam o mesmo perfil bioquímico, o mesmo

plasmídeo de virulência e causam síndromes semelhantes, porém, a dose

infectante de EIEC é muito maior. Os estudos sobre a relação entre EIEC e

o hospedeiro são praticamente inexistentes; nossa proposta, portanto, foi a

de elucidar alguns aspectos desta interação. Foram avaliados parâmetros da

resposta imune inata, como fagocitose e escape bacteriano de macrófagos,

influxo celular para o peritônio após infecção e produção de citocinas e óxido

nítrico por macrófagos infectados. Além disso, a resposta imune adaptativa

foi avaliada através da proliferação e produção de citocinas por linfócitos

ativados. Estes estudos foram realizados utilizando-se modelos murinos, in

vitro e in vivo, e comparativamente a Shigella.

Os primeiros estudos foram conduzidos em macrófagos murinos da

linhagem J774. Este modelo de infecção foi utilizado em uma série de

estudos envolvendo apoptose e produção de citocinas na infecção por

Shigella e outros patógenos, como Mycobacterium tuberculosis, Salmonella

typhimurium e Escherichia colí enteroagregativa (ZYCHLlNSKI e coL, 1992;

FERNANDEZ-PRADA e coL, 1998; MUSSO e coL, 2001; SERAFíN-LOPEZ

e coL, 2004; KALUPAHANA e coL, 2005).

92

A fagocitose foi avaliada pela determinação do número de bactérias

viáveis intracelulares após infecção (fig.4.1). Não foram observadas

diferenças na captura inicial das duas bactérias, uma vez que no tempo zero

(as monocamadas foram infectadas, centrifugadas e em seguida lavadas e

incubadas com gentamicina) o número de UFC de Shigella e EIEC no

interior do macrófago foi praticamente o mesmo. Após 30 minutos e uma

hora de infecção, contudo, há um número significativamente maior de UFC

de EIEC no interior dos macrófagos em relação a Shigella. Estes resultados

são similares aos obtidos por FERNANDEZ-PRADA e colaboradores (1997),

que observaram um maior número de UFC de amostras avirulentas de

Shigella flexneri em relação à amostra virulenta.

Para determinar se as diferenças no número de UFC no interior dos

macrófagos eram resultado de sua ação microbicida, ou do escape

bacteriano, foi feita também a determinação do número de bactérias viáveis

no sobrenadante após infecção (fig.4.2). Os dados obtidos mostram que

EIEC e Shigella escapam do macrófago, e corroboram os resultados

anteriores, uma vez que o número de UFC de Shigella no sobrenadante foi

significativamente maior que o número de UFC de EIEC após 30, 60 e 120

minutos de incubação em meio sem gentamicina.

Foi demonstrado que Shigella causa morte dos macrófagos. Os

estudos conduzidos com monócitos humanos são controversos, uma vez

que alguns autores afirmam que esta morte ocorre por oncose

(FERNANDEZ-PRADA e coL, 1998), enquanto outros afirmam ocorrer por

93

apoptose (HATHAWAY e coL, 2002). Porém, em macrófagos murinos, a

indução de apoptose na infecção por Shigella flexneri está bem

documentada (ZYCHLlNSKI, 1992; FERNANDEZ-PRADA, 1998;

SANSONETII,2000).

Observou-se em nosso estudo que a infecção com EIEC e Shigella

alterou a viabilidade dos macrófagos, o que provavelmente ocorreu em

decorrência do escape bacteriano (fig. 4.3). A porcentagem de células não

viáveis foi dependente do tempo de infecção. EIEC apresentou

significativamente menor capacidade de alteração da viabilidade que

Shigella, após 2, 4 e 6 horas de infecção. Nos tempos de 2 e 4 horas,

especialmente, nota-se que há o dobro de macrófagos não viáveis na

infecção por Shigella, confirmando mais uma vez o maior potencial

patogênico desta bactéria.

A ativação de macrófagos é essencial na resposta inflamatória, tanto por

sua atividade microbicida quanto pelo estímulo da secreção de citocinas e

outros mediadores que orquestram a resposta imune (PARSOT &

SANSONETII, 1995; FERNANDEZ-PRADA, 1997; SANSONETII, 2001).

Em nosso estudo foi caracterizada a cinética de transcrição dos genes

das citocinas TNF-a, IL-1 e IL-10 por macrófagos J774 infectados com EIEC e

Shigella. Houve um aumento significativo da transcrição do mRNA da citocina

TNF-a, após uma, três e sete horas de infecção por Shigella, e após uma e

sete horas de infecção por EIEC, em relação à transcrição basal (fig. 4.4). A

transcrição do mRNA de IL-1 foi significativa após três e sete horas de infecção

por Shigella e EIEC (fig. 4.5). Por fim, somente macrófagos infectados com

94

EIEC mostraram aumento significativo na transcrição do mRNA de IL-10 em

relação à transcrição basal (fig. 4.6). Não foram encontradas diferenças

significativas, no entanto, na transcrição do mRNA das três citocinas entre

macrófagos infectados com Shigella e EI EC. A produção destas citocinas foi

confirmada por ELISA.

A rápida produção in vitro de TNF-a e IL-1 por macrófagos em resposta

ao estímulo bacteriano está de acordo com a função destas citocinas na fase

aguda da resposta imune. A síntese de TNF-a está associada ao influxo celular

e também ao aumento das funções microbicidas do próprio macrófago, num

processo de ativação autócrina. Além disso, D'HAUTEVILLE e col. (2002)

observaram que amostras de S. flexneri que apresentavam mutações no

lipídeo A induziam menor produção de TNF-a do que as amostras selvagens,

resultando em inflamação menos severa e preservação da barreira intestinal. A

produção de IL-1 estimula o recrutamento de leucócitos e induz a produção de

outras citocinas (SERAFiN-LOPEZ e col., 2004). O papel da IL-1 no processo

de migração celular relacionado à ruptura da barreira intestinal na shigelose

está bem estabelecido (SANSONETTI, 2000). A produção de IL-10

provavelmente representa uma tentativa da célula em evitar uma resposta

imune descontrolada (DEMUTH e col., 1996).

Os resultados obtidos nos ensaios in vitro, analisados em conjunto,

demonstraram que o encontro de EIEC com macrófagos J774 resulta em

fagocitose; a bactéria escapa do macrófago induzindo apoptose, e este

processo é acompanhado de síntese de citocinas TNF-a, IL-1 e IL-10.

95

Ao comparar a interação dos macrófagos com EIEC e Shigella pode-se

sugerir que esta última apresenta menor capacidade de escape e indução de

apoptose do que Shigella, apesar da fagocitose ocorrer de maneira

semelhante. EIEC, portanto, ficaria por mais tempo no interior do macrófago,

estando sujeita à ação microbicida da célula. Não foram observadas

diferenças, no entanto, no estímulo à síntese de citocinas, tanto nos ensaios

de PCR em tempo real quanto no ELISA.

No modelo de infecção que utiliza macrófagos J774, portanto, as

diferenças patogênicas entre EIEC e Shigella podem ser explicadas pela

maior permanência de EIEC no macrófago, mas não por diferenças na

produção de citocinas. Este resultado é surpreendente, pois se deveria

esperar que a bactéria mais patogênica estimulasse uma maior produção de

citocinas, ou, pelo menos, uma maior produção de IL-1, uma vez que a

ligação da IpaB com a caspase-1 resulta em ativação da cascata apoptótica e

também na clivagem do precursor de IL-1 em sua forma ativa (ARONDEL e

col., 1999; SANSONETTI & DI SANTO, 2007). Porém, é importante

considerar que os macrófagos J774 apresentam diferenças fisiológicas de

macrófagos provenientes de animais. Além disso, em um processo infeccioso,

a produção de citocinas é regulada por múltiplos fatores além da presença do

patógeno.

Os estudos com linhagens celulares são bastante úteis na avaliação

da relação entre o microrganismo e o hospedeiro. Este modelo apresenta

algumas vantagens em relação a estudos com animais, como a relativa

facilidade de manipulação e a garantia de obtenção de um número

96

abundante de células. No entanto, apresentam limitações, por se tratar de

células modificadas e também porque a interação entre o patógeno e o

hospedeiro ocorre em um ambiente fechado, sem a influência do

microambiente. Assim, nos propusemos a avaliar outro modelo de infecção,

estudando a interação entre EIEC e macrófagos de camundongos C57BU6.

Inicialmente foi avaliada a produção de NO por macrófagos peritoniais

de camundongos C57BU6 e C57BU6 nocauteados no gene da iNOS.

Observou-se menor produção de NO por células infectadas com EIEC,

comparativamente a Shigella, e a produção foi dependente do inóculo

bacteriano (fig. 4.8).

Uma vez que houve diferenças na produção de NO na infecção pelas

duas bactérias, nos propusemos a avaliar o papel do NO na resposta do

hospedeiro à infecção por EIEC. Para tanto, inicialmente foi comparada a

transcrição dos genes das citocinas IL-1, TNF-a, IL-10, IL-18, da enzima iNOs

e do receptor transmembrânico TLR4 por macrófagos de camundongos

C57BU6 selvagens e nocauteados no gene da iNOS, após 4 horas de infecção

por Shigella EIEC e E. colí K12. Nosso objetivo foi o de avaliar se a diferença

na produção de NO estaria associada a diferenças na produção de citocinas.

E.coli K12, uma Escherichia coli que não apresenta plasmídeo de invasão, foi

acrescentada ao ensaio para avaliar se a ativação transcricional do macrófago

seria dependente apenas do LPS ou também da secreção dos antígenos de

invasão pelo SSTI. Em nossos ensaios também foi utilizado LPS como

controle positivo da transcrição, uma vez que PERERA e coI. (2001)

97

descreveram aumento na transcrição de genes como os de TNF-a e iNOS por

macrófagos de camundongos C57BU6 estimulados com LPS.

Observou-se um aumento significativo da transcrição dos genes de

TNF-a, IL-10, IL-1 e IL-18 em macrófagos de camundongos C57BU6

selvagens infectados com EIEC, enquanto os camundongos infectados com

Shigella apresentaram aumento significativo na transcrição dos mesmos

genes, além de iNOS (figs. 4.9 a 4.14). Macrófagos infectados com Ecoli

K12 apresentaram aumento apenas na transcrição dos genes de IL-1 e iNOS.

Estes resultados estão em acordo com os obtidos nos ensaios com

macrófagos J774, mostrando que a infecção bacteriana induz a ativação da

transcrição de citocinas pelos macrófagos. No entanto, foi observado que

EIEC induz uma transcrição significativamente maior de TNF-a e IL-10,

comparativamente a Shigella, e que esta última induz maior ativação da

transcrição da enzima iNOS do que EIEC. Demonstra-se, assim, que a maior

produção de NO por macrófagos infectados com Shigella é decorrente de

uma maior transcrição da enzima NO sintase induzível.

Um resultado interessante é a transcrição significativa do gene do

TLR4 por macrófagos infectados com Ecoli K12, o que não ocorreu na

infecção por Shigella e EIEC. Este resultado sinaliza que a ativação

transcricional dos macrófagos pela Ecoli K12 ocorre primordialmente pela

ação do LPS, enquanto que as bactérias invasoras ativam a transcrição dos

genes das citocinas também por outras vias, provavelmente relacionadas aos

antígenos de invasão (SAMANDARI e col., 2000).

98

Os ensaios conduzidos com macrófagos de camundongos iNOS

nocaute não apresentaram resultados satisfatórios, uma vez que a análise

estatística foi prejudicada pelas diferenças entre os dois experimentos

independentes. Apesar disso, pode-se sugerir que a produção elevada de IL­

10 pelos macrófagos dos camundongos nocaute após infecção, observada no

ensaio de ELISA de captura, inibiu a produção das citocinas pró-inflamatórias

(fig. 4.16). Foi demonstrado que a produção de IL-10 por monócitos humanos

inibiu a transcrição de genes de citocinas pró-inflamatóiias pelos próprios

monócitos, num mecanismo de regulação autócrina (DE WAAL MALEFYT e

coL, 1991).

Estes resultados, analisados em conjunto, nos permitem sugerir que

em macrófagos de camundongos C57BU6 EIEC estimula uma maior

produção de TNF-a e IL-10 (dados corroborados pelos resultados obtidos no

ensaio de ELISA). Este resultado novamente nos surpreendeu porque,

embora haja diferenças no estímulo à síntese de citocinas pelos macrófagos

infectados com as duas bactérias, a bactéria que mais estimulou a síntese de

TNF-a e IL-1D foi justamente a que provoca um quadro mais brando de

disenteria. Este dado poderia ser sugestivo de que embora a produção de

TNF-a seja necessária para a patogênese da infecção, a produção de IL-1D

estaria relacionada a uma maior resposta anti-inflamatória do hospedeiro na

infecção por EIEC, comparativamente a Shigella;

Num modelo in vitra, que analisa isoladamente a relação entre

macrófagos e patógenos, a produção de citocinas poderia ou não estar

relacionada com a maior patogenicidade da bactéria. Ao analisar a transcrição

99

de genes de citocinas por macrófagos derivados de medula óssea infectados

com diferentes genotipos de M. tuberculosis, CHACON-SALlNAS e col.

(2005) observaram que o genotipo mais virulento foi o que induziu maior

transcrição das citocinas pró-inflamatórias, enquanto a transcrição de IL-10 foi

pequena. DEMUTH e col. (1996) observaram que o aumento na transcrição

dos genes de IL-1, TNF-a e IL-10 em macrófagos derivados de medula óssea

foi semelhante na infecção pela espécie virulenta L. monocytogenes e pela

avirulenta L. innocua. Estudos conduzidos com monócitos humanos

mostraram que a infecção com uma cepa de Shigella flexneri M90T selvagem

inibiu a transcrição dos genes de IL-1 e TNF-a, enquanto a infecção com uma

cepa de M90T sem plasmídeo de invasão induziu a transcrição destes genes

(HATHAWAYe col., 2002).

Sabe-se, que, in vivo, a interação de alguns enteropatógenos com os

macrófagos residentes da lâmina própria é fundamental para o

estabelecimento da infecção. Yersinia, por exemplo, pode inibir a fagocitose,

ou ser fagocitada e induzir a apoptose do macrófago com concomitante

bloqueio da produção de TNF-a, garantindo sua sobrevivência; Salmonella

pode promover apoptose do macrófago ou modificar o vacúolo fagocítico de

modo a propiciar a sobrevivência no seu interior; Shigella por outro lado, induz

apoptose do macrófago com liberação de citocinas pró-inflamatórias, ativando

assim a resposta imune.

Na infecção por Shigella, a elicitação da resposta imune resulta no

rompimento da barreira, facilitando a invasão nas áreas adjacentes ao ponto

inicial de translocação (SANSONETTI, 2004). Por outro lado, as células

[; I ~: i.. I O r r: c AFaculdade de Ciências Farmacêutici]~

Universidade de São Pauln

100

recém-migradas, como neutrófilos polimorfonucleares e monócitos, podem

eliminar a bactéria. Numa tentativa de entender a importância das diferentes

linhagens celulares na resposta à infecção e avaliar possíveis diferenças

entre o padrão de resposta gerado por EIEC e Shigella foram iniciados

estudos de indução de resposta in vivo.

Inicialmente determinou-se, por citometria de fluxo, a população celular

presente no peritônio de camundongos C57BU6 não infectados e infectados

por 12, 24 e 48 horas com Shigella e EIEC (fig.4.17).

Em animais não infectados, observou-se que a população

predominante é a de macrófagos (os macrófagos peritoniais residentes),~

~ seguida de linfócitos, provavelmente linfócitos B1 (YANG e coL, 2007). Em%~

animais não infectados praticamente não foram encontrados neutrófilos nesta

cavidade (cerca de 2% da população total).

Houve um aumento de uma ordem de grandeza (100 para 10') no

número de células da cavidade peritoniaL O influxo foi predominantemente de

neutrófilos, na infecção pelas duas bactérias. A migração de neutrófilos para o

peritônio em resposta à infecção por outros enteropatógenos já foi

documentada (YANG e coL, 2002).

Neutrófilos polimorfonucleares são células citotóxicas que têm papel

importante na eliminação bacteriana. Os patógenos fagocitados são

eliminados pela ação de enzimas proteolíticas e espécies reativas de oxigênio

(BRINKMANN e coL, 2004). Foi demonstrado que a elastase produzida pelos

neutrófilos degrada antígenos como as Ipas produzidas por Shigella; além

disso, os neutrófilos aprisionam a bactéria em estruturas filamentosas

101

extracelulares ricas em moléculas antimicrobianas, conhecidas como

"neutrophil extracellular traps" (NETs) (WEINNRAUCH e coL, 2002;

BRINKMANN e coL, 2004). Estas células, portanto, não apenas contribuem

para a ruptura da barreira intestinal, mas também participam da resolução da

infecção. Na infecção por Shigella, o número de neutrófilos permaneceu alto,

mesmo após 48 horas de infecção, porém, em animais infectados com EIEC,

o número destas células começa a diminuir a partir de 24 horas de infecção.

A população de linfócitos sofreu uma redução em seu número após

infecção por Shigella e EIEC, sugerindo sua morte por apoptose.

ZICHLlNSKY e coL (1996) demonstraram a ocorrência de apoptose de

linfócitos T e B na infecção por Shigella in vivo. A partir de 12 horas, na

infecção por EIEC, e 24 horas, na infecção por Shigella, o número de linfócitos

começa a se aproximar dos níveis basais, o que sugere o recrutamento de

células B e T para o foco da infecção.

O número de macrófagos praticamente não se altera nos primeiros

tempos de infecção, porém a partir de 24 horas de infecção observa-se um

aumento no número destas células.

No que diz respeito à expressão de moléculas de ativação por

macrófagos, foi possível observar que a infecção por EIEC e Shigella induziu

um aumento na expressão de MHCII e C080 (figs. 4.18 e 4.19), e uma

diminuição da expressão de C086 (fig. 4.20). Enquanto a modulação positiva

de MHCII e C080 foi maior na infecção por Shigella, a modulação negativa de

C086 foi maior na infecção por EIEC.

102

o MHCII e as moléculas co-estimulatórias participam da apresentação

do antígeno ao linfócito T são um indicativo do estado de ativação dos

macrófagos.

Macrófagos peritoniais de camundongos infectados com Neisseria

meningifidis apresentaram modulação positiva da expressão de C080 e C086,

o mesmo ocorrendo com macrófagos J774 infectados com Salmonella

Typhimurium (Mukhopadhyay e coL, 2004; Kalupahana e col., 2005). ALBA

SOTO e coL, (2003), no entanto, mostraram que macrófagos e células

dendríticas de camundongos infectados com Tripanosoma cruzi apresentaram

modulação negativa da expressão de C086. A ligação das moléculas co­

estimulatórias C080 e C086 a seus ligantes C028 e CTLA-4, expressos em

linfócitos, ocorre em uma série de processos infecciosos (LENSCHOW e coL,

1996; ALBA SOTO e coL, 2003). FREEMAN e coL (1993) demonstraram que a

expressão de C086 ocorre mais precocemente do que a expressão de C080.

Os autores sugerem que a ligação de C086 a C028/CTLA-4 influencia se o

linfócito T vai desenvolver uma resposta eficiente ou vai se tornar anérgico.

Sua modulação negativa, portanto, pode contribuir para supressão da resposta

imune. (ALBA SOTO e coL, 2003).

Nota-se também uma diminuição da expressão de F4/80 (figA.21). Este

marcador é especifico para macrófagos e já foi demonstrado que macrófagos

residentes do peritônio expressam níveis elevados de F4/80 (GOROON, 1998;

HAMERMAN, 2001). A diminuição da expressão em 12 horas com aumento nos

tempos subseqüentes representaria um aumento de monócitos recém-migrados

em resposta ao estímulo inflamatório. Portanto, a partir dos dados obtidos,

103

pode-se inferir que os macrófagos residentes são mortos após a infecção

bacteriana, e tem início uma migração de monócitos.

Os resultados obtidos na caracterização das células envolvidas na

infecção por Shigella e EIEC demonstram que estas duas bactérias, em um

primeiro momento, estimulam de maneira semelhante o influxo celular. Os

macrófagos, no entanto, parecem estar menos ativados em camundongos

infectados com EIEC, se compararmos a modulação da transcrição do MHCII e

moléculas co-estimulatórias. Observa-se também que na infecção por EIEC o

número de granulócitos começa a diminuir a partir de 24 horas, o número de

linfócitos é restaurado ao valor basal após 24 horas e, após 48 horas, o número

de macrófagos e a transcrição de F4/80 também estão mais próximos dos

valores basais do que na infecção por Shigella. Estes dados sugerem que a

resolução da infecção ocorre mais precocemente em animais infectados com

EIEC.

O padrão de citocinas produzidas pelas células componentes da

imunidade inata influencia o perfil da resposta imune adaptativa subseqüente

(MEDZHITOV & JANEWAY, 2000). Uma série de citocinas está envolvida na

patogênese da infecção por Shigella. Indivíduos portadores de shigelose

apresentaram produção de IL-1a, IL-1p, TNF-a, IL-6, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-y e

TGF-p (RAQIB e coL, 1995). O papel de certas citocinas, como IL-1, IFN-y e IL­

18 no processo inflamatório desencadeado por Shigella está bem

documentado. A IL-1, como já foi dito, contribui para a colonização bacteriana,

graças ao estímulo ao influxo celular. O IFN-y, por sua vez, é fundamental no

controle da infecção, como foi demonstrado elegantemente por LE-BARILLEC

104

e col. (2005). A IL-18 seria necessária para gerar uma resposta inflamatória

capaz de erradicar o patógeno, uma vez que camundongos nocauteados no

gene desta citocina não controlam o crescimento bacteriano, e,

conseqüentemente, a inflamação. (SANSONETTI e coI. , 2000). A IL-18,

juntamente com a IL-12, induz a produção de IFN-y, ativando uma resposta do

tipo Th 1. Com o propósito de estabelecer o perfil de citocinas ligado ao

desenvolvimento da imunidade a EIEC, foi feita a determinação da transcrição

dos genes das citocinas IL-1, TNF-u, IL-10, IL-18, IFN-y, IP-10, da enzima iNOs

e do receptor transmembrânico TLR4 por células peritoniais totais de

camundongos não infectados e infectados com EIEC, Shigella e E.coli K12 por

4 e 48 horas (figs. 4.22 a 4.29). Avaliou-se, desta maneira, a produção in vivo

de citocinas pelas células residentes do peritônio, logo após o desafio com os

patógenos (tempo de 4 horas), e também pelas células que migraram para o

peritônio em resposta ao estímulo inflamatório (tempo de 48 horas).

Assim como nos ensaios in vitro, observou-se que a infecção bacteriana

resultou em ativação da transcrição, no hospedeiro, de genes relacionados à

resposta inflamatória.

Após 4 horas de infecção, as células p~ritoniais de camundongos

selvagens infectados com Shigella apresentaram transcrição significativamente

maior dos genes das citocinas pró-inflamatórias TNF-u e IL-1, da enzima iNOS

e do receptor TLR4 que aqueles infectados com EIEC. EIEC, no entanto,

induziu a maior transcrição da citocina anti-inflamatória IL-10. A produção de

IFN-y foi maior na infecção pelas bactérias invasoras, em relação à E.coli K12;

a transcrição do gene da quimiocina IP-10 foi semelhante na infecção pelas

105

três bactérias. Após 48 horas de infecção, no entanto, o que se observa é que

apenas células de camundongos infectados com Shigella apresentaram

produção significativa das citocinas TNF-a, IL-1, IL-10, IFN-y, IP-10 e iNOS.

De maneira semelhante ao ocorrido in vitro, os ensaios realizados com

camundongos nocauteados foram prejudicados pelos elevados valores de

desvio padrão, especialmente no tempo de infecção de 48 horas. No tempo de

infecção de 4 horas, no entanto, observou-se que a infecção por EIEC induziu

um aumento na transcrição do gene de IL-1 significativamente maior que

Shigella; que apenas camundongos infectados com EIEC apresentaram

aumento significativo na transcrição de IL-18 e IFN-y; e que EIEC e Shigella

induziram de maneira semelhante a transcrição do gene de IL-10. Nos estudos

in vivo, portanto, a ausência da produção de NO interferiu no perfil

transcricional de camundongos infectados com EIEC, que produziram menos

IL-10, mais IL-18, IFN-y e IL-1, enquanto camundongos infectados com Shigella

produziram mais IL-10, e menos IL-18, IFN-y e IL-1.

A quimiocina IP-10 é produzida por macrófagos e regula o tráfego de

macrófagos, linfócitos e células NK para os sítios de inflamação (HAMERMAN

& ADEREM, 2001; PERERA e coL, 2001). A transcrição do gene da IP-10 foi

semelhante em macrófagos infectados com as três bactérias, sugerindo que

macrófagos secretam esta quimiocina em resposta a um estímulo bacteriano,

assim como documentado por HAMERMAN & ADEREM (2001), seja esta

bactéria invasora ou não. Não houve diferença na transcrição do gene da IP-10

entre camundongos selvagens e nocaute.

106

o ensaio de determinação da dose letal demonstrou que, enquanto o

inóculo de 10' bactérias não provocou a morte de nenhum animal selvagem

infectado com Shigella ou EIEG, em camundongos nocaute este inóculo foi

letal para 75% dos animais infectados com EIEG, e para 25% dos animais

inoculados com Shigella (tabela 4.1).

Foi demonstrado por WAY & GOLDBERG (1998) que o controle da

infecção por Shigella ocorre independente da produção de NO. Em seu estudo,

estes autores observaram que, embora tenha havido aumento de NO após

desafio intranasal com S.f1exneri, não houve diferenças na letalidade entre

animais selvagens e iNOS nocaute.

Estes resultados analisados em conjunto sugerem a hipótese de que as

diferenças na produção de citocinas entre camundongos selvagens e nocaute

estariam relacionadas à eficiência da resposta imune em controlar a infecção.

Macrófagos infectados com EIEG produzem pequenas quantidades de NO,

mas, ao que parece, mesmo esta pequena quantidade exerce efeito protetor,

uma vez que na ausência da produção de NO há um aumento da letalidade

desta bactéria. Na ausência de NO observou-se um aumento da produção de

citocinas pró-inflamatórias por esta bactéria, o que provavelmente estaria

relacionado à exacerbação da resposta inflamatória com conseqüente morte do

hospedeiro. A ausência de NO, no entanto, parece não influir na letalidade de

Shigella, e o aumento da produção de IL-10 por camundongos nocauteados

poderia estar relacionado a um efeito anti-inflamatório, protegendo o

hospedeiro.

107

A ativação de linfócitos é uma etapa importante da resposta inflamatória,

pois linfócitos ativados produzem citocinas, proliferam-se em clones específicos

e estimulam a ativação de macrófagos. Diversos autores demonstraram o

envolvimento dos linfócitos T na resposta do hospedeiro a Shigella (ISLAM e

coI. , 1995; AZIM e col., 1996;. ISLAM e col.; 2000; LE-BARILLEC e col.;2005).

No estudo da linfoproliferação foi utilizado o sobrenadante de cultura de

células Hep-2 incubadas com bactérias como possível antígeno indutor (fig.

4.33). Os resultados obtidos mostram que os antígenos destas duas bactérias

estimulam diferentemente a proliferação linfocitária (fig. 4.34). Houve maior

proliferação das células estimuladas com os antígenos de Shigella para todas

as concentrações testadas, enquanto que EIEC estimulou muito pouco a

linfoproliferação.

Em seguida, foi avaliada a capacídade de proliferação linfocitária após estímulo

com antígenos secretados por uma bactéria diferente da que o animal foi

imunizado (fig. 4.35). Observou-se que a imunização com Shigella foi a mais

eficiente em estimular o desenvolvimento de uma resposta T específica, uma

vez que a posterior estimulação com antígenos solúveis de Shigella resultou

em aumento significativo da proliferação. A imunização com EIEC foi a mais

ineficiente em estimular a geração de memória imunológica nos linfócitos T,

pois, embora o estímulo com antígenos de EIEC tenha resultado em

proliferação significativa, ela foi menor do que a proliferação induzida pelos

antígenos de Shigella e E.coli K12.

Além disso, a imunização resultou em reação cruzada a antígenos

compartilhados pelas três bactérias, já que linfócitos de animais imunizados por

108

uma bactéria também proliferaram significativamente em resposta ao estímulo

com antígenos solúveis de outras bactérias. Linfócitos de animais imunizados

com EIEC, surpreendentemente, proliferaram mais em resposta a antígenos

solúveis de Shigella e E.coli K12 do que em resposta a antígenos da própria

EIEC. Este dado sugere que, além da imunização com EIEC conferir uma

resposta T específica de menor magnitude, existem diferenças entre os

antígenos secretados por estas três bactérias.

A maior capacidade de Shigella em estimular a ativação dos linfócitos T

também pôde ser demonstrada pela maior produção de IFN-y e IL-10 por

linfócitos de animais imunizados com Shigella e posteriormente estimulados

com antígenos de Shigella. Não foi detectada produção de citocinas por

linfócitos de animais imunizados com EIEC e posteriormente estimulados com

antígenos de EIEC (fig. 4.36).

A produção de IFN-y e IL-10 em resposta a estímulo com Ipas por

células mononucleares de voluntários previamente infectados com Shigella

dysenteriae foi demonstrada elegantemente por SAMANDARI e col. (2000),

que sugerem a indução de uma resposta imune específica, adquirida e

predominantemente Th1 por esta bactéria.

Os resultados obtidos neste estudo trazem contribuições relevantes

acerca da caracterização da resposta inflamatória que a infecção por EIEC

desencadeia no hospedeiro. Foi demonstrado que o encontro de EIEC com

macrófagos murinos resulta em (i) fagocitose, (ii) escape bacteriano, e (iii)

alterações na viabilidade do macrófago. Este aumento de macrófagos não­

viáveis pode estar relacionado à ocorrência de apoptose. Ocorre síntese de

109

citocinas pró-inflamatórias, e também da citocina anti-inflamatória IL-10. EIEC

induz a migração de granulócitos e monócitos para o peritônio, e as células

peritoniais respondem à infecção secretando citocinas pró-inflamatórias, e

também IL-10. A infecção por EIEC induz ativação dos macrófagos,

evidenciada pela produção de citocinas, pelo aumento na expressão de MHCII

e CD80, e pela produção de NO. O NO parece ser importante no controle da

bactéria, uma vez que camundongos nocauteados apresentam maior produção

de citocinas pró-inflamatórias e maior letalidade após administração de um

inóculo que não mata camundongos selvagens. Finalmente, a infecção por

EIEC parece ativar fracamente a resposta adaptativa, uma vez que a

proliferação de linfócitos em resposta aos antígenos solúveis de EIEC foi

pequena, e não foi detectada produção de citocinas por estes linfócitos. A

modulação negativa da expressão de CD86 pode contribuir para que não

ocorra ativação eficiente do linfócito T.

No que concerne às diferenças patogênicas entre EIEC e Shigella,

podemos destacar que o escape de EIEC do macrófago se dá mais

lentamente que o escape de Shigella. Além disso, na infecção por Shigella

parece haver um maior estímulo dos mecanismos imunes inatos, como

produção de NO. Neste ponto, a maior produção de TNF-a e IL-10

observadas nos ensaios ex vivo poderiam estar relacionadas com um uma

eliminação mais eficiente da bactéria pelo macrófago. Nos ensaios in vivo, foi

observada uma maior produção de citocinas pró-inflamatórias na infecção por

Shigella, enquanto EIEC estimulou uma maior produção de IL-10. O NO

parece ter um papel importante no controle da infecção por EIEC, embora a

110

eliminação de Shigella pareça ocorrer independente desta via. O maior

número de neutrófilos e macrófagos no peritônio e a maior produção de

citocinas, observados após 48 horas de infecção por Shigella, sugerem que o

hospedeiro controla mais rapidamente a infecção por EIEC. Shigella também

mostrou ser mais eficiente na geração da resposta adaptativa, uma vez que

os linfócitos de animais previamente imunizados com esta bactéria mostraram

proliferação e produção significativa de citocinas após estímulo com antígenos

de Shigella.

O tipo e a magnitude da resposta imune elicitada por um microrganismo

vivo depende de inúmeros fatores, como as moléculas de superfície e os

produtos por ele secretados. Nossos resultados demonstram que bactérias

que possuem LPS, mas não são invasoras, induzem uma menor produção de

citocinas do que aquelas que, além do LPS, secretam antígenos de invasão.

Estes antígenos, portanto, não estão apenas relacionados à invasão

bacteriana, mas também à ativação dos mecanismos inatos de defesa.

Finalmente, é importante ressaltar que Shigella e EIEC são patógenos

entéricos. Portanto, por mais que o modelo de infecção peritonial tenha se

mostrado valioso no estudo da relação de EIEC com as células de defesa do

hospedeiro, e que tenha permitido a observação de diferenças patogênicas

entre as duas bactérias, certamente alguns aspectos importantes deixaram de

ser abordados.

111

5 - Conclusões

• Macrófagos J774 e macrófagos peritoniais de camundongos C57BU6 são

ativados após infecção com EIEC; os macrófagos J774 fagocitam a bactéria e

secretam citocinas, e a infecção resulta em decréscimo da viabilidade dos

macrófagos. Os macrófagos de camundongos C57BU6 produzem NO e

aumentam a transcrição dos genes de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a, IL-1,

IL-18) e anti-inflamatória (IL-10).

• A infecção por EIEC induz influxo celular e produção de citocinas pelas

células peritoniais. A infecção também gera uma resposta T específca.

• A ausência de NO resulta em aumento da letalidade de EIEC. Este dado

pode estar relacionado ao aumento de citocinas pró-inflamatórias observado

em camundongos nocaute, ou à necessidade de NO para o controle da

infecção por EIEC.

• In vitra, a infecção por Shigella resulta em maior número de macrófagos

não viáveis em menor tempo do que a infecção por EIEC. In vivo, há maior

produção de citocinas inflamatórias e, após 48 horas de infecção, a

produção de citocinas e o número de granulócitos são menores na infecção

por EIEC do que na infecção por Shigella. Além disso, a indução de uma

resposta T específica foi menos eficiente na infecção por EIEC. Estes

dados sugerem que o hospedeiro desenvolve uma resposta menos severa

112

em resposta à infecção por EIEC, e que esta bactéria é eliminada mais

rapidamente. Os resultados obtidos ajudam a explicar a necessidade de

um inoculo de 106 EIEC para causar infecção, em contraste com o inóculo

de Shigella, que é de 10 a 100 bactérias.

• Existem diferenças na infecção conduzida in vitro e in vivo no que

concerne à produção de citocinas, evidenciando a importância do

microambiente na fisiopatologia da infecção.

• A ativação da produção de citocinas é menor quando o hospedeiro é

desafiado com uma bactéria Gram-negativa, cujo único fator de virulência é

o LPS, em comparação a bactérias dotadas de plasmídeo de invasão. Os

antígenos de invasão, portanto, não apenas permitem a entrada de

Shigella e EIEC na célula epitelial, mas também interferem nos

mecanismos de defesa.

113

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFaculdade de Ciências Farmacêuticas

Comissão de Ética em Experimentação Animal

orCEEA n009

CERTIFICADO

Certificamos que o Projeto "Estudo da resposta celular induzida por

Escherichia coli Enteroinvasora (EIEC) no Processo Inflamatório"

(Protocolo nO}O), sob a responsabilidade do(a) Sr(a). Juliana Mota

Khalil Amhaz e do orientador(a) Marina Baquerizo Martinez, está de

acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotado

pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi

aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal

(CEEA) desta Faculdade, em 02/06/2003.

São Paulo, 03 de junho de 2003.

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Pro! Assoe. Elfriede Marianne BacchiCoordenadora da CEEA

Av. Prof. L1neu Prestes, 580 - Bloco 13 A - Cidade Universitária - CEP 05508-900 - São Paulo - SPFone: (11) 309136n I Fax: (11) 3031-8986 - e-mail: rtrlgo@usp.br