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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA – ANÁLISES CLÍNICAS
Caracterização molecular da resistência aos carbape nêmicos
em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileir os
Mónica Alejandra Pavez Aguilar
Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka
São Paulo
2009
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA – ANÁLISES CLÍNICAS
Caracterização molecular da resistência aos carbape nêmicos
em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileir os
Mónica Alejandra Pavez Aguilar
Dissertação para obtenção do grau de MESTRE Orientadora: Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka
São Paulo
2009
Mónica Alejandra Pavez Aguilar
Caracterização molecular da resistência aos carbapenêmicos em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros
Comissão Julgadora da
Dissertação para obtenção do grau de Mestre
Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka
orientador/presidente
____________________________ 1o. examinador
____________________________ 2o. examinador
São Paulo, _________ de _____.
……Agradeço a Deus, pela minha vida.
Á minha família, na distancia, por apoiar todos meus sonhos. Ao Álvaro por caminhar de meu lado em nossa escolha de vida.
AGRADECIMENTOS
Á professora Elsa Masae Mamizuka, minha orientadora, pelo apoio e dedicação constantes. Minha sincera gratidão. Ao Professor Nilton Lincopan, pela dedicação no desenvolvimento deste trabalho. Minha sincera gratidão Aos professores Luis Salazar e Sergio Bravo Escobar da Universidad de La Frontera, pela constante orientação e apoio na minha formação profissional e científica. Á Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome de seu diretor, Prof. Tit. Jorge Mancini Filho Ao Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, em nome de seu chefe, Profa. Tit. Ana Campa. Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq), pela bolsa concedida a partir de Setembro de 2007. Aos professores, funcionários e auxiliares do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. Aos centros hospitalares que aportaram as cepas para a realização deste estudo. Hospital Servidor Público de São Paulo, Centro Oncológico Infantil Boldrini de Campinas-SP, Laboratório Médico Análises Clínicas de São Paulo, Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, Hospital da Beneficência Portuguesa, Laboratório Richet de Rio de Janeiro e Laboratório Clínico Endomed Ltda. de São Paulo. Aos diversos laboratórios de rotina e pesquisa que colaboraram na realização deste trabalho. Aos membros da banca de qualificação, Dr. Jorge Sampaio, Dr. Marcelo Brochhi e a Dra. Elsa Masae Mamizuka, pela importante contribuição na realização desta dissertação. As minhas colegas do Laboratório de Microbiologia Clínica, pelo apoio, compreensão e amizade. Aos meus amigos Lara Mendes de Almeida e Carlos Pires, pela revisão do texto e comentários na elaboração deste trabalho.
SUMÁRIO
Pag.
RESUMO.................................................................................................
1
ABSTRACT..............................................................................................
2
LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................
3
LISTA DE TABELAS................................................................................
4
LISTA DE FIGURAS................................................................................
5
1. Introdução ..........................................................................................
6
2. Objetivos .............................................................................................
35
3. Material e Métodos 3.1 Amostras Bacterianas........................................................................ 36 3.2 Condições de cultura......................................................................... 37 3.3 Confirmação fenotípica da resistência............................................... 37 3.4 Análise fenotípica de porinas da membrana externa (OMP)............. 41 3.5 Extração de DNA bacteriano.............................................................. 43 3.6 Confirmação molecular dos determinantes de resistência e estudo do contexto genético..............................................................
44
3.7 Tipagem molecular............................................................................. 48 3.8 Transferência dos genes de resistência............................................
51
4. Resultados 4.1 Estudo da sensibilidade antimicrobiana............................................. 54 4.2 Triagem de β-lactamases................................................................... 58 4.3 Análises das porina (OMP)................................................................ 60 4.4 Confirmação molecular dos genes de resistência............................. 63 4.5 Tipagem molecular............................................................................. 66 4.6 Transferência dos genes de resistência............................................
72
5. Discussão ...........................................................................................
75
6. Conclusões .........................................................................................
94
7. Referências .........................................................................................
96
ANEXOS...................................................................................................
114
1
RESUMO__________________________________________________________ PAVEZ, M. Caracterização molecular da resistência aos carbapenêmicos em enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros.125 f. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo , São Paulo, 2009. Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão : A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. Palavras chaves: Resistência aos carbapenêmicos. β-lactâmicos. Carbapenemases. AmpC. Proteínas de membrana externa (OMPs). Impermeabilidade de membrana.
2
Abstract___________________________________________ ______________
PAVEZ, M. Molecular characterization of carbapenem resistance in enterobacteria isolated in Brazilian hospitals.125p. Dissertation (Master Degree) – School of Pharmace utical Sciences, Universidade de São Paulo , São Paulo, 2009.
Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods : 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results : 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTX-M enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.
Key words: Carbapenem resistance, β-lactams, carbapenemases, AmpC, outer membrane proteins (OMPs), membrane impermeability.
3
LISTA DE ABREVIATURAS______________________________ _____________
SENTRY Programa de vigilância epidemiológica
MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection
ESBL β-lactamases de espectro estendido
PBP Proteínas ligadoras de Penicilina
CAZ Ceftazidima
FOX Cefoxitina
IMP Imipenem
Bla Gene β-lactamases
MBL Metalo-β-lactamases
OMP Proteína de membrana externa
CIM Concentração inibitória mínima
UFC Unidade Formadora de Colônia
APB Ácido Fenil-Borónico
PBS Tampão de fosfato de Sódio
PMSF Fenil-Metil-Sulfonil-Fluoreto
SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
LB Luria-Bertani
MR Multiresistência
CS Regiões conservadas
DNA Acido desoxirribonucléico
Tn Transposons
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
IS Seqüência de inserção
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
ATCC American Type Culture Collection
ERIC-PCR Enterobactérial Repetitive Intergenic Consensus PCR
PFGE Electroforese de Campo Pulsado
PCR Reação em cadeia polimerase
ITU Infeção do tratto urinario
4
LISTA DE TABELAS___________________________________ ______________
Tabela 1. Classificação das β-lactamases segundo Bush, Jacoby, Medeiros (1995) e Ambler (1980).................................. p. 17
Tabela 2. Origem de AmpC Cromossômicas e Plasmidiais e taxa de similiraridade dos diferentes grupos a que pertencem ..................................................................... p. 21
Tabela 3. Amostras bacterianas .................................................... p. 36
Tabela 4. Seqüência dos primers, temperatura de anelamento e tamanho de produtos de PCR para a identificação das β-lactamases ................................................................. p. 46
Tabela 5. Primers para a identificação e caracterização de integrons ....................................................................... p. 47
Tabela 6. Sensibilidade antimicrobiana de 28 isolados de Enterobactérias a doze antimicrobianos isolados ou combinados .................................................................... p. 55
Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima dos antibióticos β-lactâmicos com e sem a adição dos inibidores EDTA e APB frente as 28 amostras de Enterobactérias ......... p. 57
Tabela 8. Bioensaio e Triagem de β-lactamases nas 28 amostras de enterobactérias ......................................................... p. 59
Tabela 9. Avaliação da presença ou ausência da proteína de membrana externa OMP de 36kDa ............................... p. 62
Tabela 10. Avaliação dos genes de β-lactamases das 28 amostras: carbapenemases, ESBL e AmpC e o tamanho aproximado dos integrons carregados ............ p. 65
Tabela 11. Transformação por choque térmico para os representantes de cada determinate de resistência identificado .................................................................... p. 73
5
LISTA DE FIGURAS___________________________________ ______________
Figura 1 Representação esquemática de um integron de classe 1 ........................................................................ p. 32
Figura 2 Screening AmpC. Teste de dupla difusão e de disco combinado com APB ..................................................... p. 60
Figura 3 Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Perfil de Porinas de membrana externa (OMP) ............ p. 61
Figura 4 Eletroforese em gel de agarose dos perfis de amplificação pela técnica de ERIC-PCR ....................... p. 67
Figura 5 Perfil de restrição XbaI de 27 isolados estudados, obtidos pela técnica de PFGE ....................................... p. 68
Figura 6 Diversidade genética mostrada no dendrograma gerados por ERIC-PCR (a) e PFGE (b) das cepas de K. Pneumoniae, E. aerogenes e E. coli provenientes dos diversos centros hospitalares ........... p. 71
Figura 7 Extração de plasmideo dos transformantes .................. p. 74
6
1. INTRODUÇÃO
1.1 Infecções causadas por espécies da Família Enterobacteriaceae
Nas últimas décadas, as bactérias Gram-negativas têm adquirido um papel
importante nas infecções hospitalares, sendo consideradas como um dos
principais agentes etiológicos e um problema para a Saúde Pública devido a sua
prevalência e altos índices de resistência associados à mortalidade. Estudos
multicêntricos realizados pelo SENTRY (programa de monitoramento de
patógenos e resistência em infecções hospitalares e adquiridas na comunidade)
ou MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) têm
destacado a participação de alguns gêneros da família Enterobacteriaceae,
definindo assim os grupos CESP (Citrobacter, Enterobacter, Serratia e
Providencia) e os produtores de β- lactamases de espectro ampliado (ESBL) (i.e.,
Klebsiella pneumoniae, Escherichia. coli) como uma urgência clínica e
epidemiológica (Kiffer et al., 2005; Bell et al., 2007; Jones 2003), porém,
atualmente, novos grupos tem sido definidos para incluir espécies produtoras de
novas β-lactamases adquiridas como as carbapenemases e AmpC plasmidial
(Deshpande et al., 2006a, Deshpande et al., 2006b).
Tanto o SENTRY como o programa MYSTIC têm mostrado que, em
pacientes da unidade de cuidados intensivos na América do Sul, Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae são os agentes mais prevalentes desta família sendo
descritos como segundo e quarto patógenos mais freqüentemente isolados no ano
de 2002, respectivamente, seguidos pelo gênero Enterobacter (Kiffer et al., 2005,
Fedler et al., 2006).
7
Klebsiella pneumoniae é uma importante causa de infecção hospitalar (IH)
principalmente associada à pneumonia decorrente da colonização de pacientes
hospitalizados, diretamente proporcional aos dias de internação, podendo ser
isolada de nasofaringe, mãos e fezes com uma freqüência de 20%, 42% e 77%,
respectivamente (Podschun & Ullman, 1998). No Brasil tem sido relatado que
12,1% – 16,9% das infecções em unidades de cuidados intensivos (UCI) são
causadas por K. pneumoniae (Oplustil et al., 2005; Kiffer et al., 2005), sendo a
segunda enterobactéria mais prevalente depois da Escherichia coli (Sader, et al.,
2004) ocupando o quarto lugar na ocorrência de infecções hospitalares. Por outro
lado, relatos do programa SENTRY têm mostrado que K. pneumoniae está entre
os cinco patógenos mais freqüentes na América Latina, sendo a segunda, terceira
e quarta causa de infecção do trato urinário (ITU), trato respiratório inferior e
septicemias, respectivamente, em pacientes internados em hospitais brasileiros
(Sader, et al., 2001).
Membros do gênero Enterobacter são considerados patógenos emergentes
nas infecções hospitalares, ocupando o terceiro lugar de prevalência na família
Enterobacteriaceae no mundo (Fedler, et al., 2006, Turner 2009). Na América
latina, o gênero Enterobacter ocupa o quinto lugar dentre os patógenos mais
isolados em pacientes pediátricos (Fedler, et al., 2006). Por outro lado, no Brasil,
este gênero é responsável por 6% - 8,5% das infecções hospitalares em pacientes
pertencentes à unidade de cuidados intensivos, sendo a terceira enterobactéria
mais prevalente em infecções do trato urinário, tecidos moles e septicemias
(Sader, 2001).
8
Dentre as enterobactérias, Escherichia coli tem sido a espécie mais
prevalente em infecções hospitalares no mundo ocupando o segundo lugar depois
de Staphylococcus aureus. Contudo, na América Latina, E.coli ocupa o primeiro
lugar na lista dos patógenos mais freqüentes em infecção hospitalar (Fedler et al.,
2006) principalmente associada à ITU (infecção do trato urinário). No Brasil, este
patógeno é responsável por 48% das ITUs; 11,2% das infecções de corrente
sangüínea e 7,2% das infecções de tecidos moles (Sader et al., 2001).
Além da alta prevalência em casos de infecções, a aquisição de
mecanismos de resistência aos novos antimicrobianos tem levado estes
microrganismos, principalmente K. pneumoniae e Enterobacter spp., a alcançar
notoriedade como patógenos causadores de surtos de infecção hospitalar
(Ardanuy et al., 1998). Assim, a seleção de cepas multirresistentes tem
ocasionado o predomínio destas espécies nas infecções hospitalares (Kiffer et al.,
2005). Atualmente, o principal problema é a emergência e disseminação de β-
lactamases de espectro estendido (ESBL), AmpC plasmidiais e a hiperprodução
de AmpC cromossômicas, o que tem restringido o uso de cefalosporinas de amplo
espectro e cefamicinas (Turner, 2009, Deshpande, 2006b).
A freqüência de isolados produtores de ESBL varia muito de região para
região, sendo mais alta na América Latina (Kiffer et al., 2005, Fedler et al., 2006).
Por exemplo, nos Estados Unidos a prevalência de amostras de K. pneumoniae
produtoras de ESBL não ultrapassa 5%, na Europa varia entre 20 e 25 % e na
América Latina a prevalência varia entre 35 e 40% (Fedler et al., 2006).
Apesar de sua alta prevalência, E. coli não apresenta muitos determinantes
de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, principalmente aos carbapenêmicos,
9
o que é confirmado pela baixa porcentagem de isolados resistentes a este grupo
de antibiótico (Deshpande, et al., 2006). De fato, tem sido relatada uma baixa
prevalência de ESBL (< 5 %) nesta espécie (Fedler et al. 2006). Ao contrário, a
freqüência de isolamento de K. pneumoniae produtora de ESBL tem sido
alarmante, principalmente no Brasil, onde alguns estudos têm relatado que a
porcentagem de isolamento desse patógeno é de 50% (Sader et al., 2001).
Além da alta prevalência de ESBL, a presença da enzima AmpC diminui
ainda mais as opções terapêuticas contra estes isolados. A freqüência de isolados
produtores desta enzima tem sido atualmente descrita na Europa em baixa
porcentagem (5,9%), sendo o Enterobacter spp. um exemplo clássico de
hiperprodutor de AmpC cromossomoal (Turner 2009). Em relação à presença de
AmpC plasmidial, Deshpande e colaboradores (2006) reportaram a ocorrência
apenas para E. coli em uma porcentagem de 1,8% (Deshpande, et al., 2006b),
porém, não existem relatos que demostrem a incidência real deste determinante
de resistência.
Desta forma, no tratamento de infecções causadas por enterobactérias
produtoras de ESBL e AmpC, os únicos antibióticos ativos são os
carbapenêmicos, considerados a última alternativa terapêutica, uma vez que
resistem à degradação da maioria das enzimas β-lactamases, incluindo ESBL e
AmpC, apresentam elevada afinidade pelas proteínas ligadoras de penicilina
(PBPs) e uma excelente permeabilidade na membrana externa (Woodford et al.,
2000). Para enterobactérias, índices de sensibilidade têm sido associados a uma
porcentagem de 97% a 100% (Sader, et al., 2004, Deshpande et al. 2006, Turner
2009).
10
Em contrapartida, nos últimos anos, o isolamento de bactérias Gram-
negativas resistentes aos antibióticos carbapenêmicos vem sendo descrito em
diversas partes do mundo (Nordmann & Poirel, 2002). No Brasil, em abril de 2003,
identificou-se o primeiro isolado de metalo-β-lactamase produzida por Klebsiella
pneumoniae (Lincopan et al., 2005), sendo o primeiro relato de diversos isolados
que apresentaram um padrão de resistência similar, mostrando, dessa forma, o
surgimento de novos determinantes de resistência em hospitais brasileiros
(Lincopan et al., 2006, Peirano et al., 2009, Pavez et al., 2008, Zavazcki, et al.,
2009).
1.2 Antibióticos Carbapenêmicos
Os carbapenêmicos são antibióticos β-lactâmicos com amplo espectro de
atividade e desenvolvidos para atender as necessidades médicas na terapia de
doenças infecciosas. Assim como todo antibiótico β-lactâmico, esses agem
inibindo a síntese da parede bacteriana pela sua ligação e inativação das
proteínas ligadoras de penicilinas - PBPs. Estes antibióticos atuam na fase extra-
citoplasmática da síntese da parede bloqueando a transpeptidação, ligação
covalente das cadeias lineares de fragmentos precursores do peptidoglicano
catalisada pelas transpeptidases (também chamadas PBPs). O antibiótico β-
lactâmico é um análogo estereoquímico do segmento ativo das PBPs, o que torna
essas enzimas indisponíveis para o funcionamento, desestruturando a camada de
peptidoglicano da célula bacteriana e predispondo a bactéria à lise celular
(Sampaio, 2007 In. Neto et al., 2007).
11
Nas Enterobactérias, existem diversas proteínas ligadoras de penicilina com
atividade transpeptidase (PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3) e duas com atividade D-
alanina carboxipeptidase (PBP4 e PBP5). O efeito do antibiótico sobre a bactéria
varia de acordo as afinidades do antimicrobiano pelas diferentes PBPs. Os
antibióticos carbapenêmicos inibem a atividade transpeptidase das PBP1a, PBP1b
e PBP2 e a atividade das D-alanina carboxipeptidases PBP4 e PBP5, levando à
formação de um esferoplasto com uma subseqüente plasmólise e morte
bacteriana. Uma diferença dos antibióticos carbapenêmicos dos demais β-
lactâmicos é a pouca afinidade pela PBP3, o que não induz o crescimento
filamentoso septado das bactérias, seguido de uma lenta lise celular (Rodloff
2006). A terapia com imipenem também permite reduzir a quantidade de
lipopolisacarideos liberados durante a lise bacteriana, efeito clinicamente relevante
quando comparado à terapia com ceftazidima. Os pacientes que receberam
imipenem apresentaram níveis menores de endotoxinas e uma tendência à
normalização mais rápida dos níveis de citocinas (Prins et al., 1995).
Os antibióticos carbapenêmicos atualmente usados são o imipenem,
meropenem, ertapenem e, mais recentemente, o doripenem. O imipenem,
primeiro antibiótico carbapenêmico descoberto, apresenta uma estrutura de
amidina derivada da tianomicina com substituições de grupos metila para
incrementar a atividade bactericida e fornecer estabilidade contra as enzimas β-
lactamases. Uma desvantagem desse antibiótico é a sua rápida degradação pela
enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) localizada nos túbulos renais, necessitando,
portanto, da administração combinada com um inibidor de DHP-1 como a
cilastatina em proporção de 1:1. Mais tarde, os antibióticos meropenem e
12
ertapenem demonstraram maior estabilidade para DHP-1, permitindo a
administração sem a cilastatina (Zhanel et al., 2007).
Os antibióticos do grupo dos carbapenêmicos tais como imipenem e
meropenem possuem um amplo espectro de ação in vitro, o que inclui atividade
contra cocos Gram-positivos, bacilos Gram-negativos e bactérias anaeróbias, com
exceção de Enterococcus faecium, Staphylococcus meticilina resistentes e
Stenotrophomona maltophila (Zhanel et al., 2007, Mohr, 2008). O seu uso é
direcionado para uma variedade de infecções, incluindo infecção intra-abdominal
complicada, infecção de pele e partes moles, pneumonia adquirida na
comunidade, pneumonia nosocomial e infecção complicada do trato urinário.
Atualmente, o antibiótico meropenem foi aprovado pelo FDA (US Food and Drug
Administration) para o tratamento de outras doenças além das relatadas, como
meningites bacterianas em crianças maiores de três meses e para a terapia de
febre neutropênica (Mohr 2008). Quanto ao ertapenem, esta droga apresenta um
espectro de ação mais limitado que o imipenem e meropenem, tendo uma
eficiência limitada contra os bacilos Gram-negativos não fermentadores,
principalmente contra Pseudomona aeruginosa, o que restringe seu uso para
tratamentos de infecções adquiridas na comunidade.
Por último, Doripenem, novo antibiótico carbapenêmico que se encontra
em fase final de estudo, combina os espectros de ação de imipenem e
meropenem com uma atividade mais potente contra Pseudomona aeruginosa
(Zhanel et al., 2007).
Os antibióticos carbapenêmicos têm sido considerados terapia de escolha
pela sua estabilidade, espectro de ação e poucos relatos de resistência, além de
13
serem drogas bem toleradas pelos pacientes, sendo os efeitos adversos mais
comuns, complicações no sítio da infusão e toxicidade gastrintestinal (Nicolau,
2008). Na última década, porém, os índices de resistência têm aumentado de
forma proporcional ao seu uso, como uma resposta adaptativa das bactérias e,
muitas vezes, como conseqüência do seu uso indiscriminado (Neto et al., 2007).
1.3. Mecanismos de resistência aos antibióticos car bapenêmicos na família
Enterobacteriaceae
A resistência aos antibióticos carbapenêmicos tem surgido lentamente em
membros da família Enterobacteriaceae, com taxas inferiores a 1% para a maioria
das espécies pertencentes a essa família, mesmo após 20 anos de uso de
imipenem. Porém, esse perfil de sensibilidade está começando a mudar nas
Enterobactérias, pois essas têm desenvolvido sofisticados mecanismos de
resistência contra os antibióticos β-lactâmicos. As três maiores estratégias de
resistência relatadas para os carbapenêmicos são: I) limitação do acesso
intracelular da droga através da sua membrana externa, por meio da
impermeabilidade ao antibiótico associada a uma produção de enzimas de tipo
AmpC e ou ESBL, II) a degradação do antibiótico por meio de enzimas
hidrolisadoras da droga como a produção de carbapenemases do tipo serina e
metalo-β-lactamases, e III) proteção dos alvos da droga por meio da alteração das
PBPs (Davin-Regli et al., 2008).
14
1.3.1. Impermeabilidade de membrana associada à pr odução de enzimas
β-lactamases.
Na família Enterobacteriaceae, a permeabilidade de membrana é a chave
na sensibilidade aos antibióticos. A membrana externa é a primeira linha de
defesa contra compostos tóxicos, na qual o ingresso de substâncias na célula é
controlado pelas porinas de membrana externa (OMPs), proteínas capazes de
formar canais constituídos de água no seu interior, o que permite a difusão
passiva de solutos hidrofílicos através da membrana externa (Nikaido 2003).
As OMPs das bactérias Gram-negativas têm sido classificadas e
caracterizadas segundo a atividade, estrutura funcional e sua regulação e
expressão (Pagès et al. 2008). A primeira caracterização da membrana externa foi
feita em Escherichia coli e serve como padrão de comparação para as OMPs
caracterizadas em diferentes espécies da família Enterobacteriaceae. As
enterobactérias produzem três porinas maiores com importância na resistência
bacteriana: OmpC e seu homólogo OmpK36 de 36 kDa em K. pneumoniae e
Enterobacter spp. e Omp1 em Serratia marcescens, OmpF e seu homólogo
OmpK35 de 35 kDa em Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp. e Omp2 em S.
marcescens e, uma terceira proteína, denominada OmpA que atua fracamente na
resistência bacteriana. Estas porinas são caracterizadas como canais de natureza
não específica com leve preferência a cargas positivas (Nikaido 2003, Pagès et
al., 2008).
Diversos estudos clínicos têm demonstrado que a resistência a
antimicrobianos está relacionada com modificações no perfil das OMPs tanto no
tamanho como na redução dos níveis de expressão ou à presença de porinas
15
mutadas. Estas mudanças na proteína têm sido relacionadas à presença de
sequências de inserção no gene que codifica a OMP, o que leva à produção de
proteínas com atividade funcional diminuída, a uma conformação diferente da
porina ou a uma deleção dessa (Doumith, et al., 2009) o que restringe a entrada
do antibiótico, diminuindo assim a sua concentração interna, o que pode conferir a
resistência aos antibióticos β-lactâmicos (Pagès et al., 2008).
A resistência aos antibióticos carbapenêmicos por perda ou diminuição de
expressão da porina tem sido relatada em diversas regiões do mundo e em
diferentes espécies da família Enterobacteriaceae, principalmente em Klebsiella
pneumoniae, Enterobacter spp. e Escherichia coli. A seleção in vivo de mutantes
deficientes de porina são originadas de espécies produtoras de AmpC ou ESBL
que foram expostas a terapias prévias com antibióticos carbapenêmicos (Crowley
et al., 2002, Bradford et al., 1997, Poirel et al., 2004, Kaczmarek et al., 2006,
Palasubramaniam et al., 2007, Pavez et al., 2008, Elliot et al., 2006).
1.3.1.1 Enzimas β-lactamases
A produção dessas enzimas, em geral, é o mecanismo de resistência aos β-
lactâmicos mais prevalente e importante na família Enterobacteriaceae. Diferentes
tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de estabelecer um
sistema de classificação foram propostas. Atualmente, têm sido consideradas
duas classificações (Tabela 1):
- Classificação de Ambler com base na estrutura molecular e na homologia na
seqüência de aminoácidos resultando em quatro grandes grupos, A- ESBL,
16
penicinilases e carbapenemases de tipo serina, B- Metalo-β-lactamase, C- AmpC
ou cefalosporinases, D- Oxacilinases (Ambler 1980).
- Classificação de Bush com base na atividade enzimática resultando em quatro
grupos com vários subgrupos, principalmente no grupo 2, que relaciona substrato
preferencial, características estruturais e propriedades inibitórias (Bush et al.,
1995).
17
Tabela1. Classificação das β-lactamases segundo Bush, Jacoby, Medeiros (1995) e Ambler
(1980).
NOTA: Adaptado de Bush, 2001. ND: Não determinadas
1.3.1.2 Enzimas β-Lactamases de espectro estendido - ESBL
As ESBL pertencem à classe A de Ambler e estão distribuídas no grupo 2
de Bush, são enzimas capazes de hidrolisar a maioria dos β-lactâmicos com
Classificação Bush, Jacoby, Medeiros, 1995
Classificação Ambler, 1980
Características Grupo
Funcional Subgrupos
maiores Classe
molecular
1 C
Enzimas cromossômicas e plasmidiais produzidas por bactérias Gram-negativas.Conferem resistência a todos os β-lactâmicos, exceto carbapenêmicos. Não são inibidas pelo ác. clavulânico.
2 2a A
Penicinilases produzidas por Staphylococcus spp. e Enterococcus spp.. Conferem altos níveis de resistência à penicilina.
2b A β-lactamases de amplo espectro de bactérias Gram-negativas. Inclui TEM-1 e SHV-1.
2be A
β-lactamases de espectro estendido. Conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos (ESBLs).
2br A
β-lactamases resistentes aos inibidores de β-lactamases derivadas de TEM (IRT) e uma enzima derivada de SHV.
2c A Enzimas que hidrolisam carbenicilina.
2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina). São levemente inibidas pelo ác. clavulânico.
2e A Cefalosporinases inibidas pelo ác. clavulânico.
2f A
Enzimas que hidrolisam carbapenêmicos. Possuem uma serina no seu sítio ativo e são inibidas inibidas pelo ác. clavulânico.
3 3a, 3b, 3c B
Metalo-β-lactamases que conferem resistência aos carbapenêmicos e todos os tipos de β-lactâmicos com exceção de monobactâmicos. Não são inibidas pelo ác. clavulânico.
4 ND Penicilinases miscelâneas não seqüenciadas, não categorizadas em nenhum dos grupos detalhados.
18
exceção das cefamicinas, carbapenêmicos e inibidores (Bush, 2001). Essas
enzimas foram derivadas de mutações nos genes blaTEM-1 e blaSHV-1 que resultam
na substituição de aminoácidos, alterando o substrato específico delas. O primeiro
relato de ESBL ocorreu no ano 1982 em Liverpool, Inglaterra, em uma amostra de
Klebsiella oxytoca (Payne et al. 1990). Atualmente estão descritas mais de 200
ESBL conhecidas (www.lahey.org/studies) e essa alta prevalência epidemiológica
das ESBL é refletida na expansão clonal, sua localização plasmidial e em
repetidos eventos mutacionais (Livermore & Woodford, 2006).
Recentemente, um grupo crescente de enzimas vem contribuindo com a
epidemiologia das ESBL, as β-lactamases de tipo CTX-M. Estas enzimas
apresentam como substrato preferencial a cefotaxima e a ceftriaxona e são
codificadas pelo gene blaCTX-M, localizado em plasmídios (Denton, 2007). Em um
estudo realizado no Rio de Janeiro, Brasil, constatou-se que a enzima CTX-M é a
segunda ESBL mais freqüente entre as espécies da família Enterobacteriaceae,
estando em primeiro lugar, a ESBL do tipo SHV (Bonnet et al., 2000). Ao contrário,
um estudo direcionado para avaliar a freqüência de ESBL em isolados de
enterobactérias causadoras de ITU na comunidade relatou uma baixa freqüência
de amostras produtores de ESBL (1,48%) com um predomínio de TEM > SHV >
CTX-M (Minarini et al., 2007).
1.3.1.3. β-lactamases de tipo AmpC
A expressão de β-lactamase de tipo AmpC tem tido impacto clínico, uma
vez que espécies intrinsecamente produtoras dessa enzima apresentam alta
resistência para a maioria dos antibióticos β-lactâmicos com exceção das
cefalosporinas de quarta geração (e.g., cefepime) e carbapenêmicos, porém,
19
essas enzimas têm contribuído com a seleção de mutantes resistentes ao
imipenem, as quais exibem fraca atividade hidrolítica combinada com uma deleção
de porina do tipo OmpC ou OmpF, consideradas a principal via de ingresso deste
antibiótico na célula bacteriana (Thomson & Smith, 2000, Thomson & Bonomo,
2005). Esta classe de β-lactamases, produzidas exclusivamente por bactérias
Gram-negativas, pertencem ao grupo funcional 1 da classificação de Bush e são
descritas como cefalosporinases não inibidas por ácido clavulânico. Na
classificação de Ambler pertencem ao grupo C (Bush 2001).
A atividade das enzimas do tipo AmpC inclui oxyminocefalosporinas, assim
como, penicilinas e monobactâmicos e algumas dessas enzimas são fracas
hidrolisadoras de imipenem quando expressas em grandes quantidades (Poirel et
al. 2008). A principal diferença quando comparadas às ESBL é que enzimas do
tipo AmpC hidrolisam as cefamicinas (i.e., cefoxitina) como conseqüência da
geometria de seu sítio ativo. As enzimas do tipo AmpC não são sensíveis aos
inibidores de β-lactamases comercialmente disponíveis como o ácido clavulânico,
sulbactam ou tazobactam, porém são inativadas por oxacilinas e inibidas de forma
reversível pelo ácido borônico (Bavuvois, Wouters. In:Bonomo, Tolmasky., 2007).
Inicialmente as β-lactamases de tipo AmpC foram relatadas como enzimas
de origem cromossômica constitutivas para diversas espécies pertencentes à
família Enterobacteriaceae, incluindo Enterobacter cloacae, Enterobacter
aerogenes, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens, Hafnia
alvei e Escherichia coli, sendo essa última espécie produtora de baixos níveis
basais. A diferença de E.coli produtora de AmpC cromossômica dos demais
membros da família Enterobacteriaceae é que a produção desta enzima constitui
20
uma expressão não induzível. Nos últimos anos, a produção de enzimas de tipo
AmpC tem contribuído com o alto índice de resistência aos β-lactâmicos em
espécies que apresentam altos níveis de expressão constitutiva, devido a uma
derepressão das AmpC cromossômicas ou pela aquisição de AmpC mediadas por
plasmídios (Yagi et al., 2005, Perez-Perez & Hanson, 2002).
As AmpC plasmidiais (AmpCp) surgiram a partir de diversas AmpC
cromossômicas. A primeira AmpCp descrita foi a enzima MIR-1, originada da β-
lactamase AmpC de Enterobacter cloacae. Desde esse primeiro relato, a
descrição de AmpC plasmidial tornou-se mais prevalente (Bradford, et al., 1997).
A classificação das enzimas AmpC plasmidiais está baseada na codificação de
origem cromossômica, diferenciando-se seis grupos com similaridade genética.
Estes grupos incluem ACC (originado de H. alvei), FOX (origem desconhecido),
MOX (origem desconhecido), DHA (originada de M. morganii), CIT (originada de
C. freundii) e EBC (originada de E. cloacae) presentes na tabela 2 (Perez-Perez &
Hanson, 2002).
21
Tabela 2. Origem de AmpC Cromossômicas e Plasmidiais e taxa de similiraridade dos
diferentes grupos a que pertencem.
Grupos (% Similaridade)
Origem bacteriana AmpC cromossômico AmpC plasmidiais
ACC (94,3) Hafnia alvei ACC-1, ACC-2
FOX (94,2) ND FOX-1, FOX-2, FOX-3, FOX-4,
FOX-5
MOX (89,4) ND CMY-1, CMY-8, CMY-9, CMY-10, CMY-11, , MOX-1, MOX-2
DHA (95,7) Morganella morganii DHA-1, DHA-2
CIT (98,6) Citrobacter freundii
LAT-1, LAT-2, LAT3, LAT-4, CMY-2, CMY-3., CMY-4, CMY-
5, CMY-6, CMY-7, BIL-1
EBC (84,2) Enterobacter cloacae ACT-1, MIR-1
Adaptado de Perez-Perez et al. 2002. ND, não determinado.
Os genes de AmpC de origem plasmidial são encontrados majoritariamente
em isolados nosocomiais de K. pneumoniae e E. coli e relatados em diversas
regiões da Europa, Ásia e América do Norte. Na América do Sul, o primeiro relato
de uma enzima AmpC plasmidial ocorreu no ano 1994, na Argentina, isolada de
uma amostra de Klebsiella pneumoniae produtora de FOX-1. Anos depois, foi
relatada a enzima CMY-2 na Argentina e, mais recentemente, identificada em uma
E. coli isolada em São Paulo, Brasil (Gonzalez et al., 1994, Rapaport et al., 2007,
Pavez et al., 2008).
Finalmente, a resistência por impermeabilidade de membrana é atribuída
também ao mecanismo de efluxo, caracterizado pela expulsão da droga do interior
da bactéria como conseqüência de uma hiperexpressão de sistemas de bombas
de efluxo. As bombas de efluxo, associadas à resistência aos antimicrobianos de
22
importância clínica, geralmente pertencem às famílias RND (resistence-nodulation
division) e MFS (major facilitator superfamily) (Piddock, 2006, Davin-Regli et al.,
2008). Este mecanismo de efluxo contribui para a resistência intrínseca e
adquirida em Enterobactérias.
Os sistemas de efluxo são normalmente formados por três proteínas de
membrana: i) bomba de efluxo presente na membrana citoplasmática ii) canal
expulsador presente na membrana externa e iii) proteína de fusão que liga os
outros dois componentes. (Piddock, 2006). Em P. aeruginosa, o sistema Mex tem
sido descrito como mecanismo de resistência a diversos antimicrobianos, entre
eles, ao meropenem. Porém, em enterobactérias, nenhum sistema de efluxo
descrito contribui com a expulsão dos antibióticos β-lactâmicos (Ogawa, 2006).
1.3.2.Carbapenemases
Dentre as diferentes classes de β-lactamases, as carbapenemases
pertencem à família mais versátil pela ampla atividade hidrolítica à maioria dos
antibióticos β-lactâmicos, além de apresentar uma fraca inibição por inibidores de
β-lactamases comercias (Queenan & Bush, 2007).
As carbapenemases pertencem, na sua maioria, a duas classes
moleculares, distinguíveis pela conformação de seu sítio ativo, as
carbapenemases de classe A e as metalo-β-lactamases de classe B de Ambler.
As oxacilinases, β-lactamases de classe D, também hidrolisam antibióticos
carbapenêmicos, porém sua prevalência em Enterobactérias é baixa, sendo
freqüentemente relatadas em Acinetobacter spp. (Gülmez, et al. 2008,Walther-
Rasmussen & Høiby 2007).
23
1.3.2.1 Carbapenemases de classe A
As serino-carbapenemases do grupo funcional 2f de Bush têm aparecido de
forma esporádica nos isolados clínicos, desde a primeira descoberta há 20 anos.
Estas β-lactamases apresentam uma serina na posição 70 de seu sítio ativo e têm
sido detectadas em Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia
marcescens e Klebsiella spp., como isolados únicos ou em pequenos surtos.
As três grandes famílias de serino-carbapenemases de classe A incluem as
enzimas NMC/IMI, SME e KPC que se caracterizam por hidrolisar uma variedade
de antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenêmicos, cefalosporinas, penicilinas
e aztreonam e podem ser inibidas pelo ácido clavulânico e tazobactam. O quarto
tipo de enzima desta classe são as GES, originalmente denominadas como ESBL,
porém as novas variantes descobertas demonstraram uma leve hidrólise de
imipenem (Queenan & Bush. 2007).
Carbapenemases NMC, IMI e SME são enzimas codificadas por genes de
localização cromossômica que apresentam um perfil de resistência para
carbapenêmicos, mas estranhamente são sensíveis às cefalosporinas. Estas β-
lactamases podem ser induzidas em resposta ao uso de imipenem e cefoxitina.
Estes mecanismos têm sido descritos em isolados muito esporádicos,
particularmente em duas espécies de enterobactérias, Serratia marcescens (SME)
e Enterobacter cloacae (NMC e IMI) (Queenan et al., 2006, Pottumarthy et al.,
2003, Rasmussen et al., 1996). Sua baixa prevalência está relacionada com a sua
localização, sem apresentar nenhuma associação com elementos móveis
(Queenan & Bush. 2007).
24
A enzima KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) é a serino-
carbapenemase de maior importância. O primeiro relato dessa enzima ocorreu em
2001 nos Estados Unidos, seu nome refere-se à espécie na qual a KPC-1 foi
identificada, tempos depois uma variante KPC-2 foi descrita em Klebsiella sp e
Salmonella entérica, porém uma recente correção da seqüência KPC-1 indicou
que blaKPC-1 e blaKPC-2 são idênticas (Yigit et al., 2008). Mutações do gene
estrutural da enzima KPC-2 têm resultado em três novas variantes blaKPC-3, blaKPC-
4 e blaKPC-5 (Woodford et al. 2004, Wolter et al., 2008), as quais apresentam
diferentes perfis de hidrólise. As enzimas KPC-2 e KPC-3 são altamente
eficientes em hidrolisar nitrocefin, cefalotina e cefaloridina, porém são menos
eficientes contra carbapenêmicos e cefotaxima (Alba et al., 2005). As enzimas
KPC-5 e KPC-4 apresentam melhor eficiência contra ceftazidima e uma maior
inibição pelo ácido clavulânico, mas a hidrólise de carbapenêmicos é menor do
que em KPC-2 (Wolter et al., 2008).
As enzimas KPCs têm sido freqüentemente encontradas em K.
pneumoniae, porém, depois de uma rápida expansão pela costa da América do
Norte, diversos relatos em diferentes regiões do mundo começaram a aparecer,
sendo identificadas em diversas enterobactérias nos Estados Unidos, Escócia,
Colômbia, China e Israel e transmitidas à Ps. aeruginosa (Yigit et al., 2001,
Villegas et al., 2006, Walther-Rasmussen & Høiby 2007, Villegas et al., 2007). No
Brasil, a produção de KPC tem sido recentemente relatada na cidade do Rio de
Janeiro, Recife e São Paulo, o que confirma uma disseminação desta enzima
pelas Américas (Peirano et al., 2009, Monteiro et al., 2009, Pavez et al., 2009).
25
Estes relatos indicam que os determinantes de KPC apresentam uma
grande capacidade de disseminação, associada a sua localização plasmidial ou à
presença de elementos móveis de resistência. Um estudo realizado por Naas e
colaboradores descreveu uma associação entre KPC-2 e o transposon derivado
do Tn3, identificado como Tn4401, composto por seqüências repetitivas invertidas
imperfeitas de 39pb, um gene de transposase, um gene de resolvase e duas IS
novas denominadas ISKpn6 eISKpn7, além do gene da KPC-2. O Tn4401
apresenta duas isoformas que diferem em uma deleção de 100pb no upstream do
gene estrutural da KPC-2, porém esta deleção não tem afetado a expressão da
enzima. (Naas et al., 2008, Gootz, et al., 2009).
Finalmente, a presença de isolados bacterianos produtores de KPC pode
ser clinicamente subestimada, devido a perfis de resistência categorizados como
sensíveis na presença do gene blaKPC, o que afeta a sensibilidade de detecção
dos métodos convencionais (CLSI, 2009). Na ausência de outro mecanismo que
contribua com a resistência aos antibióticos carbapenêmicos, a concentração
inibitória mínima (CIM) dos isolados para o antibiótico imipenem apresenta apenas
uma sensibilidade diminuída e, em alguns testes fenotípicos, principalmente nos
automatizados, são erroneamente identificados como ESBL. Estas dificuldades
impedem uma boa identificação deste mecanismo, o que pode gerar resultados
equivocados com conseqüências fatais ao paciente (Walther-Rasmussen & Høiby
2007).
As últimas serino-carbapenemases de classe A relatadas são as enzimas
de tipo GES. Esta família contém nove enzimas, das quais apenas quatro GES-1,
-2, -4 e -5 têm alguma atividade mensurável para os carbapenêmicos, porém a
26
atividade carbapenemase de GES-1 é dificilmente reconhecível, sendo
frequentemente considerada como ESBL. Estas β-lactamases hidrolisadoras de
antibióticos carbapenêmicos têm sido relatadas de forma esporádica,
principalmente em P. aeruginosa, no entanto, em 2005 na Coréia foi descrito um
isolado de K. pneumoniae produtora de GES-5 (Walther- Rasmussen & Høiby
2007, Jeong et al., 2005).
1.3.2.2 Metalo-β-lactamases (MBLs)
As MBLs são β-lactamases pertencentes à classe B de Ambler ou classe 3
de Bush, hidrolisam todos os β-lactâmicos, com exceção dos monobactâmicos
(Aztreonam) e são resistentes aos inibidores de β-lactamases, mas sensíveis à
inibição por quelantes. O mecanismo de hidrólise destas enzimas é dependente
de dois íons zinco divalentes no sítio ativo da enzima, o que resulta na sua
característica inibição por EDTA ou compostos derivados do ácido tiólico que tem
a propriedade de quelar o cátion zinco divalente (Queenan & Bush 2007).
As enzimas MBLs são produzidas intrinsecamente por determinados
patógenos, tais como Stenotrophomonas maltophila, Bacillus cereus,
Chryseobacterium meningosepticum, Legionella gormaniie e Aeromonas spp.
(Queenan & Bush 2007). Em contraste a essas MBLs cromossômicas, com uma
prevalência diretamente relacionada à freqüência da espécie, a detecção e
disseminação de MBLs transferíveis ou adquiridas têm aumentado nos últimos
anos. As famílias de MBLs mais comuns relatadas em isolados clínicos incluem
as subclasses VIM, IMP, SPM, GIM e SIM e se encontram relacionadas a um
integron de classe 1, com exceção da SPM-1(Queenan & Bush. 2007, Poirel et al.
2004).
27
Desde o início da década de 90, as MBLs têm sido descritas em patógenos
clinicamente importantes, tais como Pseudomonas spp. Acinetobacter spp.e
membros da família Enterobacteriaceae (Riccio et al., 2000, Poirel et al., 2000,
Yan et al., 2001).
O primeiro relato de MBL adquirida ocorreu em 1994 no Japão, em uma
cepa clínica de S. marscescens, onde foi descrita a subclasse denominada IMP-
1(Osano et al., 1994). Desde então, novas variantes dessa subclasse foram
relatadas em diferentes microrganismos isolados em diferentes regiões
geográficas (Queenan & Bush. 2007). Atualmente, têm sido relatados mais de 20
variantes de IMP (http://www.lahey.org/studies/).No entanto, no continente
americano, a primeira variante IMP, denominada IMP-7, foi descrita por Gibb e
colaboradores em 2002, seguida de outra variante IMP-1, na América Latina,
relatada em 2003 (Gibb et al., 2002, Gales et al., 2003).
A segunda subclasse mais prevalente de MBL associada a integron é
composta pelas enzimas VIM. A enzima VIM-1 foi descrita pela primeira vez em
Verona, Itália e, atualmente, existem 22 variantes descritas dessa enzima isoladas
principalmente em P. aeruginosa (http://www.lahey.org/studies/). A subclasse VIM é
prevalente em países da comunidade européia, entretanto, também tem sido
relatada na Ásia e, mais recentemente, nos Estados Unidos, Chile e Venezuela
(Yan et al., 2001, Toleman et al., 2004, Mendes et al., 2004).
Recentemente, três novas MBLs transferíveis foram descritas. SPM-1 foi
isolada de uma amostra clínica de P. aeruginosa em São Paulo, Brasil (Toleman
et al., 2002). O gene que codifica a SPM-1 está relacionado apenas a espécie P.
aeruginosa, uma vez que essa enzima tem sido detectada apenas nesta espécie,
28
provocando alta mortalidade entre os pacientes hospitalizados no Brasil (Poirel et
al., 2004b, Zavascki, et al., 2005). Análises genéticas das regiões próximas do
gene blaSPM-1 revelaram que esta enzima não é parte de um integron, porém foi
localizada em um plasmídio, associada a regiões comuns que contém um tipo de
estrutura transponível, com uma recombinase em potencial e seqüências
promotoras (Poirel, et al., 2004b).
GIM-1 foi isolada na Alemanha no ano 2002. Esta subclasse de MBL,
localizada dentro de um integron de classe 1, foi isolada de cinco cepas de P.
aeruginosa (Castanheira et al., 2004). Finalmente, a mais nova subclasse de MBL
foi a enzima SIM-1, descrita em 2005, na Coréia em uma amostra de
Acinetobacter sp. (Lee et al., 2005).
Desde seus relatos iniciais, as enzimas MBLs SPM, GIM e SIM têm-se
mantido restritas a seus países de origem. Porém, as enzimas VIM e IMP se
encontram disseminadas geograficamente no mundo, principalmente entre as
espécies de P. aeruginosa e membros da família Enterobactériaceae (Queenan &
Bush. 2007). Na América do Sul, segundo estudos do SENTRY, os isolados
envolvendo MBL têm sido caracterizados pelo predomínio de VIM e SPM, esta
última restrita ao Brasil (Jones et al., 2005 Sader, et al., 2005).
1.3.2.3. Oxacilinases de Classe D (OXA)
As OXA são β -lactamases pertencentes à classe D de Ambler e ao grupo
2d de Bush. Similarmente às carbapenemases de tipo A, as enzimas de tipo OXA-
carbapenemases apresentam resistência às cefalosporinas, monobactâmicos,
penicilinas e carbapenêmicos, porém seu substrato preferencial é a oxacilina e
são fracamente inibidas pelo ácido clavulânico (Danel et al., 1999).
29
O primeiro relato de β-lactamase de tipo OXA ocorreu em 1993 no Reino
Unido, isolada de uma amostra de Acinetobacter baumanii produtora da enzima
ARI-1, hoje conhecida como OXA-23. Atualmente, existem 121 variantes de β-
lactamases de classe D, das quais 45 apresentam uma atividade hidrolítica frente
aos carbapenêmicos, denominadas OXA-carbapenemases (Walther & Høiby.
2006). A grande maioria das OXA hidrolisadoras de carbapenêmicos, até o
momento, foram encontradas em espécies não pertencentes à família
Enterobacteriaceae, principalmente em Acinetobacter baumanii.
No entanto, uma OXA-carbapenemase denominada OXA-48 foi identificada
em K. pneumoniae na Turquia em 2001 (Poirel et al., 2004c) com alta atividade
contra os carbapenêmicos. Essa enzima é codificada por genes inseridos em
plasmídio. Embora a disseminação desta enzima tenha sido restrita a surtos na
Turquia, recentemente, sua presença foi descrita também na Bélgica (Carrër et al.,
2008, Cuzon et al., 2008).
1.3.3. Alteração das PBPs
As PBPs são sítios alvos para atividade dos antibióticos β-lactâmicos. A
resistência a estes antimicrobianos pela alteração no sítio de ligação do antibiótico
(PBPs) é pouco pesquisada devido às dificuldades no seu estudo. Este
mecanismo já foi demonstrado em Haemophilus influenzae e em Escherichia coli,
nas quais a modificação da PBP3 foi associada à resistência à cefalexina e outras
cefalosporinas (Mendelman et al., 1990).
Resistência aos carbapenêmicos, relacionada com a alteração de PBPs,
tem sido escassamente relatada em enterobactérias, sendo descritas apenas em
30
Proteus mirabilis conferindo-lhe uma sensibilidade reduzida ao imipenem atribuída
a dois fatores: i) a diminuição na expressão da PBP-1A e ii) queda na afinidade da
PBP-2 para o antibiótico (Neuwirth et al., 1995). Porém, a presença desse
mecanismo não pode ser descartada pela possibilidade da sua contribuição na
emergência de resistência.
1.4. Contexto genético de aquisição e disseminação de determinantes
de resistência aos carbapenêmicos
A aquisição de genes necessários para a resistência aos antimicrobianos é
atribuída a uma variedade de sistemas de transferências de genes, tais como
plasmídios conjugativos, transposons e integrons (Bennett, 2008).
Os elementos genéticos móveis podem ser classificados em:
i) elementos que se movem de uma bactéria a outra, denominados plasmídios
conjugativos ou elementos de transferência horizontal e ii) elementos que se
mobilizam no genoma de uma mesma célula através de recombinação por meio
dos transposons, denominados genes cassete (Bennett, 2008).
Na ultima década, tem sido demonstrado que uma parte significativa dos
genes de resistência presentes nos plasmídios encontram-se inseridos nos
integrons (Hall & Collis 1998). Estes elementos contêm diversos genes que
conferem resistência a uma variedade de antibióticos, (e.g., aminoglicosídeos, β-
lactâmicos e sulfas) conferindo o fenótipo de multiresistência (MR) (Jacoby &
Munoz-Price, 2005).
Os integrons são elementos potencialmente móveis que contêm um sistema
de recombinação sítio específico capaz de integrar e expressar os genes contidos
31
nas estruturas do cassete. O integron é constituído por regiões conservadas (CS)
localizadas em cada uma de suas extremidades (Figura 1). A extremidade 5CS é
composta por três elementos: 1) o gene da integrase, o qual codifica uma
recombinase sítio específico, 2) um sítio de recombinação attl, reconhecido pela
integrase, que atua como receptor e integrador dos genes cassete e 3) um
promotor denominado Pant, constituído por duas seqüências de seis bases nas
posições -35 e -10 intercaladas por 17 pb. Este promotor regula a expressão dos
genes de resistência que compõem o integron (Leverstain-van Hall et al., 2002,
Partridge et al., 2002). Alguns integrons de classe 1 podem também apresentar
um segundo promotor, localizado em posição subseqüente de Pant. (Figura1)
(Leverstain-van Hall et al., 2002).
32
Figura 1. Representação esquemática de um integron de classe 1. NOTA: As setas representam os genes do integron e o sentido da transcrição dos genes.; O segmento conservado 5CS, com seus três elementos: Integrase Intl1, o sitio de recombinação attl e o promotor Pant com as seqüências localizadas nas caxas -35 e -10. No gene cassete é representado o sitio de recombinação especifico attC. O segmento conservado 3CS com os genes quacE∆1 e sul 1.
A extremidade 3CS é geralmente composta de um gene quacE∆1 que
confere resistência a compostos de amônio quaternário, seguido pelo gene sul1
que confere resistência a sulfonamidas. Ao final da extremidade 3CS, dois outros
genes podem ser designados, o orf5 e orf6. As extremidades CS flanqueiam uma
região variável que contém os genes cassete de resistência (Bennett 2008).
Os genes cassete inseridos no integron têm normalmente entre 500 a 1000
pb e apresentam características estruturais específicas, contendo um gene de
resistência e um sítio de recombinação de 59 pb reconhecido pela integrase,
denominado attc (Mazel 2006). Genes cassete podem ser encontrados como parte
do conteúdo genético de um integron ou com a sua forma circular livre, porém
33
incapazes de promover sua mobilização ou replicação. Também não possuem
promotores, portanto, sua expressão gênica e mobilização são dependentes do
integron, especificamente da integrase (Mazel 2006).
Atualmente, os genes cassete conhecidos conferem resistência aos
aminoglicosideos, penicilinas, cefalosporinas, trimetoprim, cloranfenicol,
rifampicina, eritromicina e carbapenêmicos. Este último antibiótico, devido ao fato
de os genes codificadores de MBL estarem localizados nestes elementos
(Leverstain-van Hall et al., 2002).
Existem cinco classes de integrons, sendo o integron de classe 1
freqüentemente relatado em isolados clínicos, principalmente em amostras
produtoras de MBL. A integrase do integron classe 1 é codificada pelo gene intl1 e
possui como substrato dois sítios de ação, o attl e attc. Sendo assim, esta enzima
promove o rearranjo dos genes cassete (Partridge et al., 2000).
Devido a sua incapacidade de mobilização própria, os integrons estão
associados a transposons para o seu movimento. O integron de classe 1 está
associado a transposons derivados de Tn402.
O integron de classe 2 está exclusivamente relacionado a transposons
derivados de Tn7, porém este integron tem sido associado a poucos genes
cassete, daí sua menor contribuição aos mecanismos de resistência. Esta ação
limitada pode estar vinculada ao gene da integrase intl2, o qual contém uma
mutação sem sentido no códon 179 que codifica uma proteína defeituosa (Hall &
Collis, 1998).
Recentemente, uma nova terminologia “integron classe 1 complexo” tem
sido introduzida para descrever um elemento genético que associa o integron de
34
classe 1 com outra região variável, que pode acomodar vários genes incluindo
blaCMY, blaCTX, variantes de qnrA, dfrA, seguido por uma repetição da região 3CS
(Toleman, et al., 2006). Esses elementos genéticos são denominados ISCR
(insertion sequence common region) e derivam das seqüências de inserção (IS)
IS91, IS801 e IS1294 (Bennett, 2008).
Finalmente, no Brasil, a resistência ao imipenem e aos demais antibióticos
carbapenêmicos constitui um importante desafio no tratamento de infecções
hospitalares causadas por bactérias multiresistentes, o que é considerado uma
urgência clínica e epidemiológica. Ao contrário dos dados publicados em estudos
multicêntricos realizados no Brasil, o fenótipo de resistência em isolados clínicos
de Klebsiella pneumoniae parece estar mudando, já que cepas que se
consideravam sensíveis ao imipenem, infelizmente surgiram provocando fracassos
terapêuticos com altos índices de mortalidade (Lincopan et al., 2006).
Elucidar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos incluindo sua
mobilização genética é o primeiro passo para garantir um controle epidemiológico
efetivo para este tipo de isolado, assim como sua associação com surtos fatais,
particularmente em pacientes com baixa imunidade.
35
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Caracterizar os mecanismos de resistência aos antibióticos
carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras de
enterobactérias resistentes ao imipenem isoladas em diversos hospitais.
2.2. Objetivos específicos:
2.2.1. Identificar fenotípica e genotipicamente os determinantes de resistência aos
carbapenêmicos.
2.2.2. Identificar os principais mecanismos de resistência envolvidos nas amostras
estudadas.
2.2.3. Identificar elementos de mobilização e sua associação com genes de
resistência aos antibióticos carbapenêmicos por meio da localização dos integrons
de classe 1.
2.2.4. Investigar a diversidade genética dos isolados resistentes aos antibióticos
carbapenêmicos por meio de tipagem molecular, utilizando-se as técnicas de
ERIC-PCR e PFGE.
2.2.5. Caracterizar a mobilização dos determinates de resistência para os
carbapenêmicos por técnicas de conjugação e transformação.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras bacterianas
Foram estudados 28 isolados clínicos de enterobactérias, sendo 12
Klebsiella pneumoniae, 11 Enterobacter aerogenes, 4 Escherichia coli e 1
Enterobacter gergoviae, todos previamente identificados como imipenem
resistentes (Tabela. 3), obtidos de diversos materiais clínicos e coletados em oito
centros hospitalares do Brasil no período de 2003 a 2008.
Tabela 3. Amostras bacterianas
Nº Interno
Identificação bacteriana
Centros Hospitalares
Amostra clínica
Data de isolamento
Kp-1 K. pneumoniae LAMAC Secr.abdominal Maio 2005 Eg-2 E. gergoviae HC urina Março 2005 Kp-3 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Ea-4 E. aerogenes LAMAC sangue Junho 2007 Ea-5 E. aerogenes LAMAC urina Março 2007 Kp-9 K. pneumoniae HU sangue Março 2003 Kp-11 K. pneumoniae HSPE sangue Fevereiro 2005 Kp-12 K. pneumoniae HSPE sangue Novembro 2005 Kp-13 K. pneumoniae LCE sangue Maio 2005 Kp-14 K. pneumoniae LAMAC Secr.abdominal Maio 2006 Kp-15 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Kp-16 K. pneumoniae LR sangue Junho 2005 Ea-18 E. aerogenes LAMAC urina Julho 2007 Ea-20 E. aerogenes LAMAC urina Maio 2007 Ea-21 E. aerogenes LAMAC urina Abril 2007 Kp-22 K. pneumoniae COB sangue Março 2007 Ea-23 E. aerogenes HSPE urina Maio 2007 Ea-25 E. aerogenes HSPE urina Maio 2007 Ea-34 E. aerogenes HSPE sangue Outubro 2007 Ec-1 E.coli HBP sangue Julho 2007 Ec-2 E.coli HBP sangue Julho 2007 Ec-3 E.coli HBP sangue Agosto 2007 Ec-4 E.coli HBP cateter Agosto 2007
Kp-35 K. pneumoniae LAMAC sangue Novembro 2007 Ea-36 E. aerogenes LAMAC sangue Novembro 2007 Ea-37 E. aerogenes LAMAC sangue Novembro 2007 Kp-38 K. pneumoniae HBP Liq.ascítico Janeiro 2008 Ea-39 E. aerogenes HBP urina Janeiro 2008
NOTA: Kp: Klebsiella pneumoniae , Eg: Enterobacter gergoviae, Ea:Enterobacter aerogenes, Ec: Escherichia coli, LAMAC: Laboratório Médico Análises Clínicas São Paulo SP, HC: Hospital das Clinicas FMUSP - São Paulo, COB: Centro Ontológico Infantil Boldrini, Campinas SP, HSPE: Hospital Servidor Público Estadual, São Paulo, LCE: Laboratório Clínico Endomed Ltda. São Paulo, LR: Laboratório privado Richet R.J.., HBP: Hospital Beneficência Portuguesa SP.
37
Como controles de qualidade nos testes de sensibilidade foram utilizadas
as cepas padrão Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e Escherichia coli ATCC
25922. Para o controle da produção de MBL foram utilizadas P. aeruginosa 48-
1997A produtora de SPM-1 , Enterobacter cloacae 75-10433 produtora de VIM-1,
K. pneumoniae Br-1 produtora de IMP-1, obtidas da Escola Paulista de Medicina
UNIFESP e da FCF-USP.
3.2 Condições de cultura
As amostras e cepas de referência foram semeadas em 2 mL de caldo
Müller-Hinton e incubadas a 37°C por 24 horas sob a gitação constante em shaker
rotativo à 150 rpm, sendo em seguida cultivadas em ágar Mac Conkey com disco
de imipenem de 10 µg e incubadas por 24 horas em estufa controlada a 37°C. As
culturas desta semeadura foram utilizadas para a extração de DNA e para sua
preservação a -20º C com 20% de glicerol.
Todas as culturas para a realização dos testes fenotípicos foram feitas em
estufa microbiológica controlada a 37º C, durante 18 a 22 horas.
3.3 Confirmação fenotípica da resistência
3.3.1 Teste de sensibilidade a antimicrobianos
Foram realizados os antibiogramas utilizando o método de Kirby-Bauer,
estabelecido pelo CLSI 2006, para obter o perfil de resistência aos antibióticos
gentamicina, amicacina, imipenem, ertapenem, meropenem, ceftazidima,
amoxicilina/ácido clavulânico, ceftriaxona, aztreonam, cefepime,
38
piperacilina/sulbactam, cefoxitin, ciprofloxacino e trimetoprim (OXOID, Cambridge,
UK) (CLSI 2006a). Os testes de concentração inibitória mínima (CIM) foram
realizados pela técnica de diluição em ágar, seguindo as padronizações
estabelecidas pelo CLSI para os antibióticos β-lactâmicos de interesse como
imipenem, meropenem, ertapenem, cefoxitina e ceftazidima ( CLSI 2006b).
Os agentes antimicrobianos foram testados em uma faixa de concentração
entre 0,03 – 512 µg/mL. As diluições seriadas foram realizadas a partir de uma
solução estoque em tubos contendo 19 mL de ágar Mueller-Hinton (Merck,
Darmstad- Alemanha) previamente esterilizados e estabilizados a uma
temperatura entre 45º a 50ºC. Uma vez estabilizados, 1 mL da solução do
antimicrobiano com concentração 20 vezes superior para cada diluição testada foi
adicionado aos 19 mL de ágar Mueller- Hinton. Após homogeneização, o conteúdo
foi depositado em placas de Petri estéreis de 90 x 15 mm.
Para cada amostra, 10 µL de cultura crescida overnight foram cultivados em
2 mL de caldo Mueller-Hinton (DIFCO, Lawrence, KS. USA) e incubadas a 37º C
durante duas a três horas para atingir uma turbidez equivalente a 0,5 na escala de
MacFarland na fase de crescimento exponencial da bactéria, a qual foi confirmada
no espectrofotômetro Spectronic 20 (ThermoSpectronic, Rochester, NY, USA) a
uma absorbância entre 0,8 e 1,0 em um comprimento de onda de λ 625 nm. Este
método de crescimento foi utilizado para todos os testes fenotípicos.
Para o teste de diluição em ágar, a suspensão bacteriana já atingida com
turbidez equivalente ao 0,5 da escala de Mcfarland foi diluída em caldo Mueller-
Hinton estéril na proporção 1:10, resultando em um inóculo de aproximadamente
107UFC/ml. A seguir, 300 µL dessa suspensão foram transferidos para o
39
inoculador de Steers. Desse modo, 1 a 3 µL de cada amostra foram inoculados
simultaneamente em ágar Mueller-Hinton com uma concentração bacteriana final
de 104 UFC/mL (CLSI 2006b) e as placas incubadas por 18 a 20 horas. A CIM foi
definida como a menor concentração de cada antimicrobiano capaz de inibir o
crescimento bacteriano e foram interpretadas de acordo com os critérios de
sensibilidade estabelecidos pela CLSI para a família Enterobacteriaceae (CLSI
2008).
A determinação da CIM também foi realizada com inibidores de β-
lactamases. Como inibidor de AmpC foi utilizado o ácido Fenil-Borônico (APB)
(SIGMA-Aldrich, Stenheim, Alemanha) em uma concentração fixa de 400 µg/mL
para os antibióticos cefoxitina, ceftazidima e imipenem (Coudron 2005). Para a
inibição das MBLs foi utilizado o quelante EDTA (Merck, Darmstad, Alemanha) em
uma concentração fixa de 320 µg/mL, apenas com o antibiótico imipenem
(Arakawa et al., 2000).
3.3.2 Triagem de β-lactamases
Para confirmação fenotípica, os isolados imipenem resistentes foram
submetidos ao bioensaio de acordo com o protocolo descrito por Lincopan, et al.,
2005 para demonstrar a hidrólise do imipenem. Foram preparadas quatro placas
de Petri (150 x 15 mm), sendo duas sem o antibiótico e duas com 0,06 e 0,12
µg/ml de imipenem, respectivamente. A cepa indicadora Micrococcus luteus
ATCC 9341 foi suspensa em caldo Mueller-Hinton utilizando o mesmo método de
crescimento descrito nos testes de sensibilidade. Após atingir a escala 0,5 de
Mcfarland, a cepa foi semeada nas placas com antibiótico e em outra sem para
controle de crescimento. As culturas bacterianas que atingiram a turbidez
40
correspondente à escala 0,5 de Mcfarland foram inoculadas sobre a superfície das
placas com antibiótico previamente inoculadas com cepa indicadora de M. lateus
e, na quarta placa livre de antibiótico, empregada como controle de crescimento.
As culturas foram incubadas por 18 a 20 horas a 37°C (Lincopan et al., 2005).
A triagem para a produção de MBL foi realizada mediante sinergismo com o
teste de dupla difusão com disco seguindo-se as recomendações do CLSI 2006
para os métodos de disco difusão. As amostras bacterianas suspendidas em caldo
Mueller-Hinton, ao atingir a escala 0,5 de Mcfarland, foram semeadas em ágar
Mueller-Hinton. Os discos contendo imipenem (10 µg) e ceftazidima (30 µg) foram
alinhados a uma distância de dois cm de cada disco de filtro branco contendo 5 µL
de cada um dos inibidores enzimáticos: EDTA (0.5 M), ácido 2-mercaptoacético e
acido 2-mercaptopropiônico, ambos em uma solução não diluída (Arakawa et al.,
2000, CLSI 2006a).
Para avaliar a presença de ESBL foi feita uma triagem por meio do teste de
dupla difusão com disco utilizando-se como substrato ceftazidima (30 µg),
cefotaxima (30 µg), ceftriaxona (30 µg) e aztreonam (30 µg). Os discos contendo
antibióticos foram alinhados a uma distância de dois cm de um disco único com o
inibidor ácido clavulânico em uma concentração de 4 µg/mL (Pellegrino et al.,
2006). Por último, para a triagem de AmpC, foram utilizados os métodos de dupla
difusão com disco e a técnica de disco combinado descrito por Coudron no ano
2005. Para o teste de dupla difusão com disco, os antibióticos ceftazidima (30 µg)
e cefoxitina (30 µg) foram alinhados com uma distância de 2 cm do disco de papel
filtro contendo o inibidor APB em uma concentração de 400 µg. No método de
41
disco combinado, 20 µL de uma solução de APB (20 mg/mL) foram inoculados
sobre os disco de ceftazidima (30 µg) e cefoxitina (30 µg) (Coudron, 2005).
3.4 Análises fenotípica de porinas de membrana exte rna
3.4.1 Extração de porinas da membrana externa
Células bacterianas crescidas overnight foram cultivadas em 120 ml de
caldo BHI. Após incubação de 20 horas foram concentradas por centrifugação a
2.300 g por 15 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 1,5 mL de tampão
fosfato de sódio (PBS) a 10 mM, pH 7,0, acrescido com o inibidor de protease
fluoreto fenil-metil-sulfonila (PMSF) na concentração de 1mM e as células foram
rompidas com o auxílio de um sonicador (Sonifier 450 Bronson-USA) utilizando-se
3 pulsos de 1 minuto cada, com intervalos de 1 minuto de resfriamento em banho
de gelo entre cada pulso para preservação das proteínas. Os restos celulares
foram removidos por meio de centrifugação a 1.800 g durante 15 minutos e o
resultado do sobrenadante foi submetido à ultra centrifugação a 30.000 rpm
(Sorvall®. Ultraspeed Centrifuge Pro 80. USA) durante 120 minutos a 4°C para a
coleta das frações de membrana. O sedimento resultante foi resuspendido em 150
µL de solução tampão PBS 10mM (pH 7) acrescido de PMSF 1mM; 100 µL deste
volume final foi tratado com 800 µL de solução de sarcosil a 2% por 20 minutos à
temperatura ambiente. Finalmente, a membrana externa foi obtida após a última
centrifugação com rotação de 16000 g durante 60 minutos a 4ºC. O sobrenadante
foi descartado e o pellet ressuspenso em 50 µl de solução tampão PBS 10mM (pH
7,0) acrescido de PMSF 1mM e mantido sob refrigeração (4ºC) durante 24 horas
42
para solubilização. O produto da extração foi estocado a -20º C para posterior
análise por SDS-PAGE (Achtman et al., 1983; Fumg-Tonc, 1995).
3.4.2 Análise das porinas de membrana externa
A análise das proteínas de membrana externa foi realizada por meio de
eletroforese SDS-PAGE. O material obtido da extração conforme descrito
anteriormente foi preparado segundo a metodologia de Laemmli para sua análise.
As proteínas de membrana externa foram levadas à fervura por 10 minutos com
tampão de amostra (Tris-HCl 0,5M, SDS 10%,Glicerina 20% e azul de bromofenol
0,01%) previamente acrescido de 20 µL de beta-mercapto-etanol (Laemmli, 1970).
As proteínas extraídas das amostras foram aplicadas nos géis de dodecil sulfato
de sódio contendo 12% de acrilamida no gel de separação e 5% no gel de
empilhamento em um volume de 10 µL de amostra por poço e corridas a 70V
durante 30 minutos, tempo estimado de passagem pelo gel de empilhamento,
sendo depois ajustado para 120V durante 1 h e 30 minutos. Após a eletroforese, o
gel foi corado durante duas horas com Coomassie blue (Brilliant Blue 0,1%, 25%
metanol, 5% ácido acético) e descorado com ácido acético a 10%.
Como controle foram utilizadas as cepas de Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 25922 e Escherichia coli K12, conhecidas
previamente como sensíveis ao imipenem (cepas portadoras das porinas de 35 e
36 kDa). O peso molecular das respectivas proteínas de membrana foi estimado
empregando-se padrão de massa molecular (SM#0431 Unstained Protein
Molecular Weigth marker, Fermentas®, Burlington, Canadá). Paralelamente, a
identificação do gene responsável pela expressão da proteína foi realizada por
43
PCR utilizando-se os primers OmpC Fw: 5-GTTAAAGTACTGTCCCTCCTG-3 Rw:
5-GAACTGGTAAACCAGACCCAG-3 descritos previamente (Poirel et al., 2004).
3.5. Extração de DNA bacteriano
Para a extração do DNA total foi utilizado o método da fervura descrito por
Lincopan, et al., 2005. A partir de uma cultura overnight em caldo LB, alíquotas de
1 mL foram submetidas a centrifugação durante 1 minuto a 16.000 g, o
sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 100 µL de água,
milli-Q, estéril. Posteriormente, a suspensão celular foi fervida durante 10 minutos
e mantidos num banho de gelo por outros 5 minutos. Finalmente, após 15 minutos
de centrifugação a 7500 g, 100 µL de cada sobrenadante foi transferido para um
microtubo estéril e congelado a - 20 ˚C (Lincopan et al. 2005). Foi realizada uma
reação de amplificação por PCR para o gene 16s, como controle das
amplificações do DNA.
Para extração do DNA plasmidial, foi utilizado o método de lise alcalina de
Birnboim-Dolly (1979). A partir de 3 mL de cultura overnight em caldo LB,
alíquotas de 0,5 mL foram submetidas à centrifugação de 9000 g por 15 s, o
sobrenadante foi removido cuidadosamente e o sedimento resuspenso em 100 µL
de solução I (glicose 50mM, Tris-HCl 25mM, EDTA 10Mm, Lisozima 20mg/mL).
Após incubação a 0°C por 30 min foram adicionados 2 00 µL da solução II (0.2N
NaOH, SDS 1%) e misturados cuidadosamente em vórtex, após 5 min de
incubação a 0°C, 150 µL da solução III (Acetato de sódio 3M, pH4,8) foram
adicionados e misturados por inversão para a precipitação do DNA cromossômico.
O tubo foi incubado a 0°C por 60 min. Após a centri fugação a 9000 g por 5
44
minutos, 400 µL do sobrenadante foram transferidos para um novo microtubo e
precipitados com 1 mL de etanol gelado. Após uma incubação a -20°C por 30 min,
o precipitado foi colectado por centrifugação a 9000 g por 2 min. Posteriormente, o
sedimento foi resuspenso em 100 µL de acetato de sódio 0,1M/Tris 0,05M e
novamente precipitado com 200 µL de etanol gelado e incubado a -20°C por 10
min para ser coletado por centrifugação. Esta etapa foi repetida mais uma vez
para, finalmente, o sedimento ser suspendido em 40 µL de água milli-Q (Birnboim-
Doly, 1979).
Para controlar a eficiência da extração de DNA plasmidial, foi utilizada a
cepa E. coli 39R861 com plasmideos conhecidos. A concentração do DNA
plasmidial foi quantificada utilizando-se Nanodrop (NanoDrop® Technologies INC,
Wilmington, DE, EUA).
3.6 Confirmação molecular dos determinantes de resi stência e estudo do
contexto genético
A confirmação genotípica de β-lactamases foi realizada pela técnica da
reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers específicos para
amplificar os genes de MBL: blaIMP-1, blaIMP like, blaVIM like e blaSPM,
carbapenemases: blaKPC , ESBL: blaTEM, blaSHV e blaCTX e AmpC: FOX, DHA-1,
DHA-2, DHA-2, CMY-1, CMY-2, ACT-1 e MIR/ACT. Os ensaios de PCR foram
realizados no termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Byosistems,
Foster City, EUA). As condições de corrida foram: desnaturação de 94ºC por 10
min, 30 ciclos de 94ºC por 30 s, 52ºC por 30 s. e 72ºC por 30 s. seguidos de uma
45
extensão final de 72ºC por 5 min. As seqüências dos iniciadores, tamanho dos
produtos e a temperatura de anelamento otimizadas esão descritos na tabela 4.
46
Tabela 4. Seqüência dos primers, temperatura de ane lamento e tamanho de produtos de PCR para a identificação das β-lactamases .
Primers Genes alvo Seqüências (5’-3’) Tº de
anelamento
Tamanho do
amplicon Referência
Carbapenemases IMP-1 Fw
blaIMP-1 like CTACCGCAGCAGAGTCTTTGC
50ºC 590 pb Loli, et al,.
2006 IMP-1 Rv GAACAACCAGTTTTGCCTTACC
IMP Fw blaIMP like
GGAATAGRRTGGCTTAAYT 50°C 232 pb
Balsalobre,
et al., 2009 IMP Rv GGTTTAAYAAARCAMCCACC
VIM Fw blaVIM like
GTTTGGTCGCATATCGCAAC 40ºC 590 pb
Balsalobre,
et al., 2009 VIM Rv GAGCAAKTCYAGACCGCCC
SPM-1 Fw blaSPM-1
CCTACAATCTAACGGCGACC 50ºC 648 pb
Gales, et al.,
2003 SPM-1 Rv TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
KPC Fw blaKPC like
TGTCACTGTATCGCCGTC 58ºC 1009 pb
Tenover,
et al., 2006 KPC Rv TCAGTGCTCTACAGAAAACC
ESBL SHV Fw
blaSHV like ATGCGTTATATTCGCCTGTG
52ºC 862pb Jiang,
et al., 2006 SHV Rv GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG
TEM Fw blaTEM like
ATGAGTATTCAACATTTCCGTG 52ºC 861pb
Jiang,
et al., 2006 TEM Rv TTACCAATGCTTAATCAGTGAG
CTX-M Fw blaCTX-M like
CGCTTTGCGATGTGCAG 52ºC 550 pb
Jiang,
et al., 2006 CTX-M Rv ACCGCGATATCGTTGTG
AmpC MIR/ACT Fw blaMIR like
blaACT like
TCGGTAAAGCCGATGTTGCCG 56ºC 302 pb
Pérez-Pérez &
Hanson 2002 MIR/ACT Rv CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT
DHA-1 Fw blaDHA-1
TCTGCCGCTGATAATGTCC 52ºC 262 pb
Yum, et al.,
2005 DHA-1 Rv GCCGCCGGATCATTCAGCGC
DHA-2 Fw blaDHA-2
TCTGCCGCTGATAATGTCG 52ºC 298 pb
Yum, et al.,
2005 DHA-2 Rv TCTGCCGGGTCATTCAACAT
CMY-1 Fw blaCMY-1 like
blaMOR-1
TGAGCAAGACCCTGACTGC 52ºC 654pb --a
CMY-1 Rv GGAATGTCTGCTCGGTGAC
CMY-2 Fw blaCMY-2 like
CTATGGCGTGAAATCCAGC 58ºC 366 pb --a
CMY-2 Rv TTGTTTGCCAGCATCACGATG
FOX Fw blaFOX like
AACATGGGGTATCAGGGAGATG 52ºC 190 pb
Pérez-Pérez &
Hanson 2002 FOX Rv CAAAGCGCGTAACCGGATTGG
Nota : bla: gene β-lactamase, pb: pares de base, --a: primers desenhados .
47
Os produtos de PCR foram avaliados por eletroforese em gel de
agarose ao 1,5%, utilizando tampão TBE 1x (Tris Base 90mM, ácido bórico 90mM,
EDTA 20mM pH 8,0). Como referência foi utilizado um marcador de tamanho
molecular de DNA de 100 pb (GeneRuler SM# 0321, Fermentas, Burlington,
Canada ). Após eletroforese, o gel foi corado com brometo de etidio (10 µg/mL) e
visualizado sob luz ultravioleta.
3.6.1 Caracterização de Integrons
Os DNAs das amostras foram analisados para estudar a presença de
integrons de classe 1 na bactéria empregando-se primers dos segmentos
conservados desse elemento (Tabela. 5). Para determinar os genes de
resistência para as β-lactamases que o integron carrega na região variável, foram
utilizados os primers de cada gene de β-lactamases em combinação com os do
segmento conservado (Intl1 e quacE∆1). A caracterização da região variável foi
estudada apenas para os integrons que carregam os genes de resistência para as
β-lactamases.
Tabela 5. Primers para a identificação e caracterização de integrons .
Genes Seqüência Primers (5’- 3’) Tamanho
Fragmento Referência
Int1 CCGTAGAAGAACAGC -a Sandvang, et al., 1997.
qacE∆1 GTTGCGATTACTTCG - a Sandvang, et al, 1997.
NOTA: a: Fragmento variável entre os primers Intl1 e qacE∆1
48
3.6.2 Reação de seqüenciamento
Os produtos de PCR obtidos foram excisados do gel de agarose após
eletroforese e purificados com o Kit “ GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit”
(Qiagen, Buckinghamchire,UK) conforme as instruções do fabricante. O DNA foi
quantificado por espectrofotometria a 260 nm (Sambrook &Russell. 2001) no
espectrofotômetro Nanodrop (NanoDrop® Technologies INC, Wilmington, DE,
EUA). Os produtos foram enviados para seqüenciamento para posterior análise de
sua conformação genética e comparação com as bases de dados disponíveis na
Internet (BLAST http:/www.ncbi.nlm.nhi.gov/blast/).
3.7 Tipagem molecular
3.7.1 ERIC-PCR
A análise de ERIC PCR é um método de tipagem baseado na
amplificação de segmentos conservados presentes no DNA das Enterobactérias.
As regiões conservadas do DNA das cepas em estudo foram amplificadas pela
técnica de PCR a partir de um primer único ERIC-2 5´-
AAGTAAGTGACTGGGGTGAGC-3’ (Aydin et al., 2007), específico para estes
segmentos. A reação de amplificação constou de uma etapa de desnaturação
inicial a 940C por 10min seguida da etapa de amplificação com 30 ciclos de
desnaturação a 940C por 1 min, anelamento a 520C por 1 min e etapa de extensão
a 720C por 8 min seguida de uma extensão final a 720C por 16 minutos. A
separação dos segmentos foi obtida por eletroforese em gel de agarose a 2.5% e
este corado com brometo de etídio para posterior visualização em transluminador
de luz UV.
49
3.7.2 Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Para a realização da eletroforese em campo pulsado, o DNA bacteriano foi
preparado segundo o protocolo descrito pela Centers for Disease Control and
Prevention (Gautom, 1997) com algumas modificações necessárias para a
otimização da técnica. As cepas foram semeadas inicialmente em placas de ágar
MacConkey e incubadas por 18 a 24 horas a 37ºC. Uma única colônia de cada
cepa foi semeada em 30mL de caldo LB e novamente incubada a 37ºC por 20
horas sob agitação mecânica.
As culturas foram então centrifugadas a 3000g por 15 min. a 20ºC e o
sobrenadante totalmente desprezado. As células bacterianas foram padronizadas
por peso e diluídas mantendo-se igualmente a proporção peso/volume. Para tanto,
o precipitado foi ressuspenso em 1 mL de TE estéril (10 mM Tris /1mM EDTA pH
8.0) e transferido para tubos eppendorfs pré-pesados, sendo centrifugados a
12000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi completamente desprezado e os tubos
novamente pesados.
Adicionou-se em cada tubo o volume em µL do tampão TE correspondente
ao peso obtido do sedimento. Um volume de 5 µL desta ressuspenssão foi
transferido para outro tubo eppendorf, no qual foram adicionados 300 µL de
tampão TE. A esta suspensão foi adicionada 340 µL de agarose a 2% aquecida a
55ºC e, em seguida, dispensados em moldes de acrílico (Bio-Rad Laboratories),
sendo três por amostra e incubados por 15 min. a 4ºC. Os plugs solidificados
foram então colocados em 2mL de uma solução de lise (EDTA 0,5M pH 9,3 N-
laurosylsarcosine 1%, Proteinase K 0,1 mg/mL) e incubados a 55ºC por 16 horas
50
sob agitação mecânica. Após incubação, foram realizadas duas lavagens dos
plugs com água milli-Q e 4 lavagens com tampão TE pré-aquecido a 50ºC, com
intervalos de 15 min. a 55ºC sob agitação mecânica. Os plugs foram então
estocados em 2 mL de TE a 4ºC até o momento de uso.
Para a etapa de digestão do material genético com enzima de restrição,
os plugs previamente tratados foram lavados com solução DNS (Tris0,1M, MgCl2
0,005M pH 8.0) 4 vezes com intervalos de 1 hora a temperatura ambiente sob
agitação mecânica.
A enzima de restrição utilizada foi a XbaI (#ER0681, Fermentas,
Burlington, Canada) e para cada corrida foi utilizada apenas um plug por amostra.
Cada plug foi transferido para um novo microtubo e a este foram adicionados 200
µL do tampão especifico da enzima em uma concentração 1x, segundo instruções
do fabricante. Os tubos então foram incubados durante 30 min. a 4ºC para a
otimização da enzima de restrição no interior do plug. Após este período, a
solução tampão foi removida e 200 µL do tampão, agora contendo a enzima XbaI
(40U), foram adicionados e incubados durante a noite a 37ºC (Gautom,1997,
Dropa, 2007).
Depois de submetido o DNA à ação da endonuclease, os fragmentos de
restrição obtidos no interior do plug foram submetidos à eletroforese em campo
pulsado (CHEF DRIII, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). O plug foi inserido no
gel de agarose a 1% (Invitrogen corporartion, CA, EUA), preparado com tampão
TBE 0,5x (Tris-Base 45mM, ácido bórico 45mM, EDTA 10mM pH 8,0). As
condições utilizadas na corrida foram: voltagem 6 V/cm, a 14ºC por 20 horas, com
intervalos de pulso de 3,5 a 30,8 seg. Um marcador de peso molecular (Lambda
51
Ladder PFG Marker - New England Biolabs Inc., Beverly, MA, EUA) foi corrido em
conjunto para a estimativa do tamanho dos fragmentos formados. Após a corrida,
o gel foi corado com brometo de etidio (20 µg/mL) e posteriormente visualizado
com luz UV.
3.7.3 Análises comparativas dos isolados bacteriano s
A avaliação da clonalidade foi realizada a partir do perfil de amplificação e
de restrição respectivamente para ERIC-PCR e PFGE, utilizando o coeficiente
Dice (CD), com tolerância de 2 e 3% (Darini et al.,1998).
CD:Coeficiente Dice
na=b: N° de fragmentos localizados na mesma posição em ambas as amostras.
na + nb, N° total de fragmentos apresentados por ambas as amostras.
As porcentagens de similaridade assim como os cálculos de cluster e a
subseqüente geração de dendrograma foram realizadas no software Bionumerics
(Applied Maths NV©, Sint-Martens-Latem, Belgium).
3.8 Transferência dos genes de resistência
As linhagens que apresentaram elementos de resistência sejam de
origem plasmidial ou cromossômico foram submetidas à conjugação e
transformação para o estudo de sua mobilidade. A partir de um cultivo overnight
de cada amostra e da linhagem receptora Escherichia coli K12 em ágar
McConkey, foi realizada uma subcultura com colônias puras em caldo LB (Luri
52
Bertani) e incubada a 37ºC por 3 a 4 horas para atingir uma fase de crescimento
exponencial. Posteriormente alíquotas de 0,5mL das culturas das linhagens
doadora e receptora em fase logarítmica foram misturadas e adicionadas a 4mL
de caldo LB, sendo incubadas a 37ºC por 18 horas. Os transconjugantes foram
selecionados em ágar McConkey contendo estreptomicina (300 µg/mL,
Sigma,EUA) e imipenem (2µg/mL) ou ceftazidima (1µg/ml, Sigma, EUA).
Para transformação, foi utilizada a cepa E. coli DH10B como linhagem
receptora e foram estudados representantes de cada cluster das cepas
estudadas.
A preparação das células competentes foi realizada pelo método de
CaCl2 (50mM), a partir de uma cultura de 3 mL incubada overnight, 1 mL da
suspensão de E. coli DH10B foi transferido para 100 mL de caldo LB e incubado
por 2-3 horas até alcançar uma concentração bacteriana > 109 bactérias/mL. A
suspensão de bactérias foi transferida para 2 tubos Falcon de 50mL e mantida no
gelo por 10 min. Após centrifugação a 2700g por 10 min. a 4ºC, o sobrenadante foi
descartado e o sedimento ressuspenso em 30 mL de MgCl2 80 mM / CaCl2 20mM
gelado e novamente centrifugado. Após essa etapa, as células competentes foram
ressuspensas em 2 mL de CaCl2 gelado (0,1M) e aliquotadas em 100 µL para
transformação (Sambrook &Russell 2001).
A transformação foi realizada utilizando o método do choque térmico
descrito por Mandel & Higa (1970) modificado. À suspensão de E. coli DH10B
competente (100 µL) foram adicionados 10 µL do DNA plasmidial. Após 30 min.
de incubação no gelo, a suspensão da célula receptora com o DNA foi transferido
para banho termo regulado a 42ºC por 90 seg. e levada novamente ao gelo por 2
53
minutos. Foram adicionados 1000 µL de caldo LB à suspensão transformada e
esta incubada por 90 min. a 37ºC (Mandel & Higa 1970). Dessa cultura, 300 ul
foram transferidos para 3 placas de Muller-Hinton contendo ampicilina a 64 µg/mL,
imipenem a 1,5 µg/mL e ceftazidima a 2 µg/mL, respectivamente. Para os
transformantes dos isolados produtores de AmpC, foi semeada uma quarta placa
com cefoxitina a 20µg/mL.
Para confirmar a transferência genética, os transformantes foram semeados
novamente na superfície das placas contendo ágar Mueller-Hinton com os
antibióticos previamente mencionados, logo depois foram extraídos os plasmideos
para fazer a triagem de β-lactamases.
54
4. RESULTADOS
4.1 Estudo da sensibilidade antimicrobiana
4.1.1 Antibiograma
Em geral, os isolados apresentaram um perfil de multiresistência segundo
os critérios de interpretação da CLSI, com sensibilidade apenas à gentamicina em
89% dos isolados estudados (Tabela 6). Embora apenas 32% das cepas tenham
mostrado sensibilidade à amicacina, 25% dos isolados apresentaram sensibilidade
intermediária a este antibiótico.
Quanto aos carbapenêmicos, das 28 amostras estudadas, as amostras
Kp-12, Kp-3 e Kp-15 mostraram sensibilidade a este antibiótico, sendo as duas
últimas sensíveis à maioria dos antimicrobianos testados, porém estes isolados
mostraram uma sensibilidade diminuída para alguns antibióticos β-lactâmicos
como a cefoxitina (Tabela 6).
55
Tabela 6. Sensibilidade antimicrobiana de 28 isolad os de Enterobactérias a doze antimicrobianos isolad os ou combinados.
NOTA: CN, gentamicina; IMP, imipenem; MER, meropenem; ERT, ertapenem; CIP, ciprofloxacino; AK, amicacina; CAZ, Ceftazidima; Amox/Clav, amoxicilina + Ac. Clavulânico; CRO, ceftriaxona; AZT, aztreonam; CEP, cefepime; FOX, cefoxitina; SXT, sulfa-trimetropim; Pip/Taz, piperacilina + tazobactam. R, resistente; S, sensível; I, intermédio; ND, não determinado. 13883, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; 25922, Escherichia coli ATCC 25922; %, porcentagem.
Cepas
Antibiograma
CN (R≤12,S≥15)
AK (R≤14,S≥17)
CIP (R≤15,S≥21)
SXT (R≤10,S≥16)
Amox/Clav (R≤13,S≥18)
Pip/taz (R≤17,S≥21)
CAZ (R≤14,S≥18)
CRO (R≤13,S≥21)
AZT (R≤15,S≥22)
CEP FOX (R≤14,S≥18)
IMP MER (R≤13,S≥16)
ERT (R≤15, S≥19)
Kp-1 S R R R R I R R ND R R I I I Eg-2 S R R R I I R R I R R I R R Kp-3 S R R R S S S I S ND I S S S Ea-4 S I R R R I R R R R R R R R Ea-5 S S R I R S S S S S R R R R Kp-9 S I R R R S R R R R R R R R
Kp-11 S R R R R R R R R R R R R R Kp-12 S R R R R R R R R R I S S S Kp-13 R R R R R R R R R R R R R R Kp-14 S R R R R S R R S R R I I R Kp-15 S S R R S S S S S S R S S S Kp-16 R R R R R R R R R R R R R R Ea-18 S R R R R R R R R R R R R R Ea-20 S I R R R ND R R R ND R R R R Ea-21 S R R R R R R R R R R R R R Kp-22 R R R R R I R R R R R I R R Ea-23 S I R R R I R R R R R R R R Ea-25 S I R S R R R R R R R R R R Ea-34 S I R R R I R R R R R R I R Ec-1 S S R R R I R R R R R R R R Ec-2 S S R R R I R R R R R R R R Ec-3 S S R R R I R R R R R R R R Ec-4 S S R R R I R R R R R R R R
Kp-35 S S S R R R R R R R R R R R Ea-36 S S R R R R R R R R R R R R Ea-37 S I R R R R R R R R R R R R Kp-38 S R R R R R R R R R R R R R Ea-39 S S S I R ND S S S S R R R R 13883 S S S S S S S S S S S S S S 25992 S S S S S S S S S S S S S S S% 89 32 7 4 7 19 14 11 18 11,5 - 11 11 11 I% - 25 - 7 4 38,5 - 4 4 - 7 14 11 4 R% 11 43 93 89 89 42,5 86 85 78 88,5 93 75 78 85
56
4.1.2 Concentração inibitória mínima
Em relação à cefoxitina, todas as amostras apresentaram um perfil de
resistência similar (64 - > 512 µg/mL), porém, em relação à ceftazidima, os
valores da CIM foram mais amplos variando entre 32 e > 512 µg/mL, com
exceção das amostras Ecl-39 e Ea-5 que apresentaram uma CIM de 2 µg/mL e
1 µg/ml, respectivamente (Tabela 7). Os isolados sensíveis aos
carbapenêmicos confirmaram a alta susceptibilidade quantitativa (IMP, CIM ≤
2,0 µg/mL), com exceção de Kp-12 que apresentou uma sensibilidade
diminuída, exclusivamente para o ertapenem (CIM 16 ug/mL).
Os valores da CIM dos carbapenêmicos confirmaram a resistência
destes isolados, apresentando concentrações de inibição acima de 32 µg/mL.
As cepas Kp-1, Kp-14 e Kp-16, Kp-22 e Ecl-39 foram as únicas a apresentar
valores intermediários de resistência apenas ao imipenem. Quanto aos perfis
de resistência, as CIM do imipenem e meropenem foram menores que os
descritos para o ertapenem na maioria das cepas estudadas (Tabela.7).
A adição de inibidores de β-lactamases na determinação da CIM
permitiu avaliar a presença e grau de participação destas enzimas na
resistência aos carbapenêmicos. A combinação de EDTA com o antibiótico
imipenem, nas amostras Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14, produziu uma queda
de três diluições ou mais nos valores da CIM deste antibiótico, sendo sugestivo
da produção de MBL. Por último, foi testado o inibidor APB para avaliar a
produção de AmpC nos principais substratos destas enzimas, além do
imipenem (i.e., ceftazidima e cefoxitina). Das 28 amostras, 15 apresentaram
uma diminuição dos valores da CIM em pelo menos um dos dois antibióticos
testados, porém, o melhor substrato para a deteção de AmpC foi a
57
ceftazidima. A adição de APB ao antibiótico imipenem diminuiu os valores da
CIM nas mesmas 15 amostras, além da cepa Ea-18, o que sugere a presença
de AmpC com forte indicação da participação desta enzima na resistência ao
Imipenem. Os resultados da concentração inibitória mínima para cada
antibiótico se encontram detalhados na tabela 7.
Tabela 7. Concentração Inibitória Mínima dos antibi óticos β-lactâmicos com e sem a adição dos inibidores EDTA e APB frente as 28 amost ras de Enterobactérias.
Cepas
CIM µg/Ml
IMP IMP/EDTA IMP/APB MER ERT FOX FOX/APB CAZ CAZ/APB Kp-1 8 1 4 16 8 >512 >256 512 512 Eg-2 32 0,5 16 128 256 >512 >256 256 256 Kp-3 1 2 1 0,25 0,06 8 16 0,5 0,5 Ea-4 32 16 4 64 128 >512 64 32 8
Ea-5 32 16 2 16 32 >512 64 1 0,5 Kp-9 128 1 128 256 256 >512 >256 256 256 Kp-11 64 2 32 128 512 >512 >256 256 256 Kp-12 2 2 2 4 16 32 32 32 8 Kp-13 32 32 4 256 256 256 128 128 8 Kp-14 4 0,5 4 16 8 >512 >256 512 512 Kp-15 0,125 0,5 0,25 0,25 0,125 32 32 0,5 0,5 Kp-16 8 4 4 128 512 64 32 32 8 Ea-18 32 32 4 64 128 >512 >256 32 8 Ea-20 64 16 4 64 256 >512 64 64 8
Ea-21 32 32 4 64 256 >512 128 64 8 Kp-22 16 8 4 128 256 256 128 128 16 Ea-23 32 16 4 64 256 >512 64 32 16 Ea-25 32 32 2 64 256 >512 128 64 1 Ea-34 16 8 2 32 128 >512 32 32 4 Ec-1 32 16 16 128 512 >512 >256 >512 16 Ec-2 32 8 16 128 256 >512 >256 >512 16 Ec-3 32 32 8 128 512 >512 256 256 8 Ec-4 32 8 8 128 512 >512 256 512 8
Kp-35 128 64 0,5 512 >512 256 32 64 1 Ea-36 32 32 8 128 256 >512 >256 64 16 Ea-37 32 16 8 128 256 >512 >256 64 16 Kp-38 128 32 64 128 256 64 64 128 16 Ea-39 16 8 1 32 64 >512 8 2 1 13883 2 2 4 0,25 0,06 16 16 1 1
25922 0,25 0.25 1 0,125 0,03 8 4 0,13 0,5 NOTA: CIM, concentração inibitória mínima; IMP, imipenem; MER, meropenem; ERT, ertapenem; FOX, cefoxitina; CAZ, Ceftazidima; IMP/EDTA, imipenem + EDTA; IMP/APB, imipenem + Acido fenil-Borônico; FOX/APB, cefoxitina + Acido fenil-Borônico; CAZ/APB, Ceftazidima +Acido fenil-Borônico. 13883, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; 25922, Escherichia coli ATCC 25922.
58
4.2 Triagem β-lactamases
O bioensaio confirmou a hidrólise de imipenem em 7 isolados. Os
resultados obtidos no bioensaio mostraram boa correlação, com os resultados
da CIM do IMP na presença de EDTA em cinco isolados (Tabela 7),
confirmando assim a presença de MBL. Os outros dois isolados, que também
mostraram hidrólise de imipenem, apresentaram uma queda da CIM na
presença de APB , mas não na presença de EDTA (Tabela 8).
O sinergismo para MBL é coerente com as atividades já descritas para as
amostras Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14, todas elas com um forte efeito
inibitório frente aos ácidos derivados de compostos tiólicos, porém o EDTA não
apresentou esse efeito em dois destes isolados e, fraca inibição, nas outras
três amostras. Além das cepas sugestivas de MBL, os isolados Kp-16, Kp-22 e
Ea-23 apresentaram uma pequena inibição com os ácidos acima citados
(Tabela 8).
59
Tabela 8. Bioensaio e Triagem de β-lactamases nas 28 amostras de enterobactérias.
Cepas Bioensaio
Screening MBLa
Screening ESBLa
Screening AmpC
Imipenem (µg/ml) EDTA MPP MPA Amox/clav
Sinergismo a (APB) FOX CAZ
Diâmetro >4 mm b FOX/APB CAZ/APB
Kp-1 + (0,12) - + + + - - - - Eg-2 + (0,12) - + + - - - - - Kp-3 - - - - - - - - - Ea-4 - - - - - - + + +
Ea-5 - - - - - + - + -
Kp-9 + (0,12) + + + + - - - - Kp-11 + (0,12) + + + + - - - - Kp-12 - - - - + - - - - Kp-13 + (0,12) - - - - + + - + Kp-14 + (0,12) + + + + - - - - Kp-15 - - - - - - - - - Kp-16 - + - - + + - - + Ea-18 - - - - - - + - + Ea-20 - - - - - - + - +
Ea-21 - - - - - + + + +
Kp-22 - + - - - - + + + Ea-23 - - + + - + + + + Ea-25 - - - - - - + - + Ea-34 - - - - + - - + + Ec-1 - - - - - - - - + Ec-2 - - - - - - - + + Ec-3 - - - - - - + - + Ec-4 - - - - - - + - +
Kp-35 + (0,12) - - - - - + + + Ea-36 - - - - - - - - + Ea-37 - - - - - - + + - Kp-38 - - - - - - - - - Ea-39 - - - - - - + + +
NOTA: a : teste de dupla difusão de disco; b : teste de disco combinado. MBL Metalo-β-lactamases, ESBL β-lactamases de espectro estendido, MPP Acido mercaptopropionico, MPA Acido mercaptoacetico, Amox/clav amoxicilina + ác.clavulânico, APB Acido fenil-Borónico, FOX cefoxitina, CAZ Ceftazidima. + positivo, - negativo.
Conforme esperado, a triagem de ESBL não foi muito eficiente devido à
presença de AmpC nos isolados (Tabela 9), uma vez que só 7 amostras
mostraram sinergismo sob a presença de ác. clavulânico, entre estas, as
produtoras de MBL (Tabela 8). Nossos resultados são concordantes com o
relatado na literatura, uma vez que as ESBL são prevalentes em
enterobactérias e o efeito de falsa negatividade para ESBL é produzido pela
presença das enzimas AmpC (Coudron, 2005, Brenwald et al., 2005).
60
Por último, a triagem de AmpC também foi coerente com os resultados
anteriores que apresentaram uma queda da CIM nas 16 amostras com um ou
mais dos três substratos estudados (i., IMP, CAZ, FOX), denotando um
aumento da atividade antibacteriana na presença do APB. Os isolados Ea-37,
Ea-36 e Kp-16 mostraram um resultado positivo no sinergismo para AmpC,
porém seu CIM não diminuiu para nenhum dos antibióticos testados com APB
(Tabela 7). Um resultado positivo foi considerado quando houve um aumento
do halo de inibição > 4 mm no teste de disco combinado e quando houve a
presença de zona fantasma no teste de dupla difusão. Nos dois métodos
fenotípicos o melhor substrato foi novamente a ceftazidima em comparação à
cefoxitina (Fig.2).
2.a 2.b 2.c
DC (caz + APB) DDD DC (fox + APB) Figura 2. Screening AmpC. Teste de dupla difusão e de disco combinado com APB. NOTA: 2.a : teste negativo, cepa Kp-1; 2.b: teste positivo para Ceftazidima e cefoxitina, cepa Kp-35; 2.c: Teste positivo apenas para Ceftazidima, cepa Ec-3. DC: disco combinado, DDD: dupla difusão de disco, caz: Ceftazidima, fox: cefoxitina, APB: Acido fenil- Borónico.
4.3 Análises das porinas (OMPs)
O perfil fenotípico das proteínas de membrana externa foi pesquisado
em todos os isolados. As amostras sensíveis aos carbapenêmicos
apresentaram um perfil de três porinas maiores de pesos moleculares entre 34
e 37 kDa que correspondem às porinas OmpA, OmpK35 e OmpK36 (Fig.3).
61
3.a Ec-1 Ec-2 Ec-3 CP Ec atcc PM 40 kDa OmpC 35 kDa. OmpF OmpA 25 kDa. 3.b Kp-1 Kp-11 Kp-12 Kp-9 Kp-13 Kp-35 3.c Ea-4 Ea-21 Ea-23 Ea-20 Kp atcc OmpK36 OmpK 35 Omp A
Figura 3. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS -PAGE.Perfil de Porinas de membrana externa (OMP). NOTA: 3.a Perfil OMPs Escherichia coli. CP: Escherichia coli K-12, sensível ao Imipenem, apresenta as três porinas, OmpC, OmpF e OmpA, superposta em OmpF no gel. Ec ATCC: E.coli ATCC 25922, sensível ao Imipenem. Ec-1,Ec-2 e Ec-3, resistente ao Imipenem, sem a porina OmpC. 3.b Perfil K. pneumoniae hidrolisadoras de imipenem. Kp-1 e Kp-13 resistente ao Imipenem, com porina de 36KDa, Kp-11 e Kp-12 com expressão diminuída da porina Omp36KDa e Kp-9 Kp-35, resistentes ao imipenem sem a porina Omp36KDa. 3.c Perfil E. aerogenes com triagem positiva para AmpC. Todas as amostras sugestivas de AmpC apresentaram perda da porina Omp36KDa. Kp atcc: K. pneumoniae ATCC 13883, sensível ao Imipenem. PM : Marcador De peso molecular de proteina
Nos isolados clínicos todas as amostras apresentaram as porinas
OmpA e a porina de 35 kDa, porém a porina de 36 kDa esteve presente
apenas em 7 isolados. Curiosamente, as 21 amostras que apresentaram perda
da porina OmpK36 ou ausência do seu homólogo relatam uma alta resistência
ao ertapenem (CIM ≥ 128 µg/mL), com exceção da Ea-39 e Ea-5, que tiveram,
respectivamente, CIM de 64 e 32 µg/mL (tabela.9).
62
Tabela 9. Avaliação da presença ou ausência da prot eína de membrana externa OMP de 36kDa.
NOTA: a : análises de porinas por SDS-PAGE. Omp: porina de membrana externa, +b : fragmento com tamanho > 2000pb , + : positivo, - : negativo. 13883 : Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, 25922 : Escherichia coli ATCC 25922.
No estudo de determinantes genéticos para a proteína de membrana
externa de 36 kDa, 27 amostras amplificaram o DNA. A amostra Eg-2 foi a
única que não amplificou o gene, não apresentando também expressão da
proteína, o que sugere a presença de mutações na seqüência complementar
dos iniciadores ou a deleção desse fragmento do DNA, eventos que podem
impedir a amplificão do gene (Doumith, et al., 2009). Os isolados Kp-35, Ea-37
e Kp-38 apresentaram um aumento no tamanho dos fragmentos amplificados,
sugerindo a presença de IS (Doumith, et al., 2009). As 24 amostras restantes
apresentaram fragmentos amplificados similares aos das cepas padrão.
Cepas
Porinas
OmpC/36kDa a PCR
OmpC/36KDa (1104pb)
Kp-1 Presente + Eg-2 Ausente - Kp-3 Presente + Ea-4 Ausente + Ea-5 Ausente + Kp-9 Ausente + Kp-11 Presente + Kp-12 Presente + Kp-13 Presente + Kp-14 Presente + Kp-15 Presente + Kp-16 Ausente + Ea-18 Ausente + Ea-20 Ausente + Ea-21 Ausente +
Cepas
Porinas
ompC/36kDa a PCR
OmpC/36KDa (1104pb)
Kp-22 Ausente + Ea-23 Ausente + Ea-25 Ausente + Ea-34 Ausente + Ec-1 Ausente + Ec-2 Ausente + Ec-3 Ausente + Ec-4 Ausente +
Kp-35 Ausente + b
Ea-36 Ausente + Ea-37 Ausente + b Kp-38 Ausente + b Ea-39 Ausente + 13883 Presente + 25922 Presente +
63
4.4 Confirmação molecular dos determinantes de resi stência
4.4.1. Produção de MBL e de Carbapenemases do tipo serina
Os perfis de resistência sugeridos pela identificação fenotípica para as 5
cepas produtoras de MBL (Kp-1, Eg-2, Kp-9, Kp-11 e Kp-14) foram confirmados
pela amplificação do gene blaIMP-1like. Nenhuma outra amostra apresentou um
produto de amplificação associado a outras subclasses de MBL.
Na procura de carbapenemases de tipo serina, as cepas Kp-13 e Kp-35
que também mostraram um perfil de hidrólise do imipenem foram positivas para
o gene blaKPC like. O seqüenciamento parcial deste produto de amplificação
confirmou a presença da enzima KPC-2 (Genbank FJ641197, FJ641196).
Os 7 isolados que apresentaram algum grau de hidrólise de imipenem
confirmaram a produção de carbapenemases sendo em grande medida
coerente com os resultados fenotípicos obtidos (Tabela. 10).
4.4.2 Produção de ESBL e AmpC
Uma vez que a impermeabilidade da membrana externa se encontra
relacionada à produção de β-lactamases de tipo ESBL e AmpC (Martinez-
Martinez, et al., 1999), foi feita a pesquisa para este tipo de enzima. Como
esperado, a presença das ESBL foi confirmada na maioria dos isolados (Tabela
10). Esse resultado se mostra concordante com os estudos realizados no Brasil
e América Latina sobre a alta prevalência das ESBLs nas enterobactérias
(Sader et al., 2001).
A produção de AmpC foi confirmada para 17 isolados, dos quais 11
apresentaram a amplificação positiva para os primers MIR/ACT. Em um
primeiro momento o produto da amplificação sugeriu a presença de blaMIR o
blaACT like plasmidial, mas o seqüenciamento dos fragmentos revelaram a
64
presença da AmpC cromossômica do Enterobacter aerogenes com 100% de
similaridade, obtendo assim uma amplificação cruzada com os primers da
família MIR/ACT provenientes da AmpC cromossômica de E. cloacae.
Os isolados de Escherichia coli Ec-1, Ec-2, Ec-3 e Ec-4 carregaram o
gene blaCMY-2 like, confirmado por seqüenciamento com similaridade de 99%
para CMY-2 (GenBank EU531728.1). Finalmente, as amostras Kp-3 e Kp-9,
esta última já identificada como produtora de IMP-1, apresentaram um produto
de amplificação para o gene blaDHA-1. A enzima DHA-1 na amostra Kp-3 sugere
uma participação mínima na resistência aos β-lactâmicos uma vez que este
isolado é totalmente sensível a esses antibióticos, com exceção da
sensibilidade diminuída para cefoxitina e ceftriaxona. No entanto, K.
pneumoniae Kp-9 apresenta múltiplos mecanismos que contribuem para alta
resistência aos carbapenêmicos (CIM de imipenem, 128 µg/ml). As onze
amostras restantes, foram negativas para todos os genes relacionados à
expressão de AmpC pesquisados neste estudo (Tabela 10).
65
Tabela 10. Avaliação dos genes de β-lactamases das 28 amostras: carbapenemases, ESBL e AmpC e o tamanho aproximado dos integrons ca rregados.
Cepas Produção de β-lactamases Tamanho aprox.
Integrons Carbapenemases ESBL AmpC
Kp-1 blaIMP-1 like blaSHV like blaTEM like - 1200pb, 3000pba
Eg-2 blaIMP-1 like - - -
Kp-3 - blaSHV like blaDHA-1 1500 pbb, 3000pb
Ea-4 - blaTEM like blaCTX-M like blaMIR/ACT like 700 pb, >1200pb
Ea-5 - - blaMIR/ACT like -
Kp-9 blaIMP-1 like blaSHV like blaCTX-M like blaDHA-1 1500pbb,3000pba
Kp-11 blaIMP-1 like blaSHV like blaCTX-M like - 1200pb, 3000pba
Kp-12 - blaSHV like blaTEM like
blaCTX-M like - 3000pb
Kp-13 blaKPC-2 like blaSHV like blaCTX-M like - 3000pb
Kp-14 blaIMP-1 like blaSHV like - 1200pb, 3000pba
Kp-15 - blaSHV like - -
Kp-16 - blaSHV like blaTEM like
blaCTX-M like - -
Ea-18 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Ea-20 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Ea-21 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 2500pb
Kp-22 - blaCTX-M like - -
Ea-23 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Ea-25 - - blaMIR/ACT like -
Ea-34 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Ec-1 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -
Ec-2 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -
Ec-3 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -
Ec-4 - blaTEM like blaCTX-M like blaCMY-2 like -
Kp-35 blaKPC-2 like blaSHV like - 3000pb
Ea-36 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Ea-37 - blaCTX-M like blaMIR/ACT like 3000pb
Kp-38 - blaSHV like blaTEM like
blaCTX-M like - 1000pb, 2000pb
Ea-39 - - blaMIR/ACT like -
NOTA: ESBL β-lactamases de espectro estendido. – : negativo, bla β-lactamases, pb: pares de bases, a: integron carregando blaIMP-1,
b: integron carregando blaDHA-1 .
66
4.4.3. Presença de Integrons
Com o intuito de determinar a localização dos genes de resistência, foi
estudada a presença de integrons mediante a amplificação dos fragmentos
alvo por PCR. Das 28 cepas, 17 apresentaram produtos de amplificação para a
combinação dos primers de Intl1 e qac∆E1, com tamanhos variáveis entre 600
a 3000 pb (tabela.10). As amostras Kp-1, Kp-3, Kp-9, Kp-11, Kp-14 e Kp-38
mostraram dois produtos de amplificação.
Dentre os genes codificantes para carbapenemases, o blaIMP-1 foi o único
gene que se mostrou inserido em um integron de classe 1, denominadao In86,
o qual tem sido previamente caracterizado por Penteado e colaboradores
(2008) em enterobactérias produtoras de IMP-1 disseminadas na cidade de
São Paulo. Quanto aos genes codificantes de AmpC e ESBL, apenas o blaDHA-1
encontrou-se inserido em um pequeno integron de classe 1 (Tabela 10).
4.5. Tipagem molecular
A técnica de ERIC-PCR mostrou uma diversidade genética entre as
linhagens de K. pneumoniae, um perfil clonal para a espécie Enterobacter
aerogenes, exceto a amostra Ea39, e um único perfil para Escherichia coli. O
perfil molecular da espécie de Enterobacter gergoviae não foi avaliado no
dendrograma devido à presença de um único isolado representante desta
espécie (Fig.4).
67
4.a 4.b
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 PM PM 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 PM
4.c 4.d PM 19 20 21 22 23 PM PM 24 25 26 27 28 29 PM
Figura 4. Eletroforese em gel de agarose dos perfi s de amplificação pela técnica de
ERIC-PCR.... NOTA: Fig.4a : linha 1: Kp-15, linha 2: Kp-16, linha 3: Kp-12, linha 4: Kp-1, linha 5: Kp-14, linha 6: Kp-9, linha 7: Kp-11, linha 8: Kp-38. Fig. 4b ; linha 9: Ea-20, linha 10: Ea-18, linha 11: Ea-23, linha 12: Ea-25, linha 13: Ea-5, linha 14: Ea-4, linha 15: Kp-22, linha 16: Ea-21, linha 17: Ea-36, linha 18: Ea-37. Fig. 4c ; linha 19: Ec-1, linha 20: Ec-2, linha 21: Ec-3, linha 22: Ec-4, linha 23: atcc E. Coli 25922 Fig.4d ; linha 24: Ea-39, linha 25: Ea-34, linha 26: Kp-3, linha 27: Kp-13, linha 28, Kp-35, linha 29: atcc K pneumoniae 13883.
A técnica de PFGE, método padrão em tipagem molecular, confirmou os
diferentes perfis previamente mencionados, apresentando maior poder
discriminativo (Fig. 5).
68
λ 1 2 3 4 5 λ 6 7 8 λ λ 9 10 11 12 13 λ 14 15 16 17 18 λ λ 19 20 21 22 23 λ 24 25 26 27 28 29 λ 5a 5b 5c Figura 5: Perfil de restrição XbaI de 27 dos isolados estudados, obtidos pela tecnica de PFGE. NOTA: 5a: λ: DNA lambda, linha1: Kp-16, linha 2: Ea-36, linha 3: Ea-20, linha 4: Ea-23, linha 5: Ea-37, linha 6: Ea-5, linha 7: Ea-25, linha 8: K. pneumoniae ATCC 13883 5.b: linh 9: Kp-15, linha 10: Ec-3, linha 11: E. coli ATCC 25922, linha 12: Ec-4, linha 13: Kp12, linha 14: Ec-1, linha 15: Ec-2, linha 16: Ea-39, linha 17: Ea-34, linha 18: Kp- 3. 5c: linha 19: Kp-9, linha 20: Ea-18, linha 21: Kp-14, linha 22: Kp-11, linha 23: Ea-4, linha 24: Kp-35, linha 25: Kp-13, linha 26: Kp-1, linha 27: Kp-22, linha 28: Ea-21, linha 29: Kp-38.
69
Em relação à avaliação de similaridade genética feita por análises de
cluster segundo o coeficiente DICE, entre as cepas de Klebsiella pneumoniae,
identificou-se nove perfis diferentes. As cepas produtoras de MBL Kp-1, Kp-9, Kp-
11 e Kp-14, recuperadas de três centros hospitalares entre os anos 2003 e 2006,
apresentaram o mesmo perfil genético, denominado clone A. Pela técnica de
PFGE, o cluster A não apresentou 100% de similaridade, sendo a cepa Kp9,
isolada no ano 2003, a que mostrou maior diferença no perfil de restrição com
similaridade de 94 % (Fig. 6). A cepa Kp-9 foi o primeiro isolado de MBL na
América Latina, descrito por Lincopan e colaboradores (Lincopan et al., 2005), e
foi incluída neste estudo com o intuito de caracterizar sua resistência e sua
relação genética com as amostras de Klebsiella pneumoniae pertencentes a este
estudo.
As demais 8 espécies de Klebsiella pneumoniae pesquisadas neste
estudo não apresentaram um agrupamento genético definido, sendo
consideradas de linhagens diferentes (Fig.6).
Quanto as 11 cepas de Enterobacter aerogenes produtoras de AmpC
cromossômica, isoladas durante os meses de abril a novembro do ano 2007
nos centros hospitalares do HSPE e LAMAC, observou-se a ocorrência de um
único perfil clonal, denominado clone B, com 100% de similaridade nos perfis
de amplificação do ERIC-PCR das cepas Ea-4, Ea-5, Ea-20, Ea-21, Ea-23, Ea-
25 e Ea-18, porém as cepas Ea-36 e Ea-37 pertencentes a este cluster
apresentaram uma similaridade genética de 95 % e 98% com o clone B,
respectivamente (Fig.6). Com o perfil de restrição XbaI obteve-se uma
similaridade menor entre as cepas pertencentes ao cluster B (92,48%) sendo
100% de similaridade entre as cepas Ea-4, Ea-20 e Ea-23 e entre as cepas
70
Ea-5 e Ea-25. A cepa Ea-34 teve uma similaridade em torno de 88,56% com o
cluster B, não mostrando uma origem clonal quando consideramos 90% de
similaridade como critério de clonalidade, baseado na interpretação sugerida
por Tenover e col. (Tenover, et al., 1995). Na cepa Ea39 não foi observada
relação clonal com os perfis mencionados (Fig. 6).
Em relação às cepas de Escherichia coli produtoras de CMY-2, foi
possível identificar um mesmo perfil de amplificação com uma similaridade
genética >94%, denominado perfil C. Esta diferença dada pela técnica de
ERIC-PCR não foi observada com o perfil de restrição XbaI das amostras Ec-1,
Ec-2, Ec-3, e Ec-4, tendo 100% de similaridade, denominando-se clone C (Fig.
6).
71
Ea-39 – blaMIR/ACT – perfil L
Kp-12 - (-) - perfil D
Ec-1 – blaCMY-2 – perfil C
Ec-2 – blaCMY-2 – perfil C
Ec-3 – blaCMY-2 – perfil C
Ec-4 – blaCMY-2 – perfil C
Kp-11 – blaIMP-1 – perfil A
Kp-14 – blaIMP-1 – perfil A
Kp-1 – blaIMP-1 – perfil A
Kp-9 – blaIMP-1,DHA--1 – perfil A
Kp-38 – blaCTX-M,SHV,TEM - perfil H
Kp-13 – blaKPC-2 – perfil F
Kp-16 - blaCTX-M – perfil J
Kp-35 - blaKPC-2 – perfil I
Ea-25 – blaMIR/ACT – perfil B
Ea-5 – blaMIR/ACT – perfil B
Ea-20 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-23 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-4 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-18 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-36 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-37 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-21 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil B
Ea-34 – blaMIR/ACT,CTX-M – perfil M
Kp-15 - (-) - perfil G
Kp-22 – blaCTX-M –perfil K
Kp-3 - blaDHA-1 - perfil E
Figura 6. Diversidade genética mostrada no dendrograma gerado s por ERIC-PCR (a) e PFGE (b) das cepas de K. Pneumoniae, E. aerogenes e E. coli provenientes dos diversos centros hospitalares.
NOTA: (a) O porcentagem de corte para o análises dos cluster foi de > 90%. Dice: Coeficiente DICE, Tol: Tolerância, (ano de isolamento) (b) O porcentagem de corte para o análises dos cluster foi de > 90%. Dice: Coeficiente DICE, Tol: Tolerância, - bla: β-lactamase producida-. Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, HSPE: Hospital Servidor Público, São Paulo; COB: Centro Oncológico Infantil Boldrini, Campinas-SP; LAMAC: Laboratório Médico Análises Clínicas de São Paulo SP; HU: Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, SP; HBP: Hospital da Beneficência Portuguesa, SP.; LR: Laboratório Richet, RJ. LPSP: Laboratório Clínico Endomed Ltda., São Paulo, SP.
Kp-12– HSPE (2005) – perfil D
Kp-3 – COB (2007) – perfil E
Kp-1 – LAMAC (2005) – perfil A
Kp-11 – HSPE (2005) – perfil A
Kp-14 – LAMAC (2006) – perfil A
Kp-9 – HU (2003) – perfil A
Kp-13 – LCE (2005) – perfil F
Kp-15 – COB (2007) – perfil G
Kp-38 – HBP (2008) – perfil H
Kp-35 – LAMAC (2007) – perfil I
Ea-18 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-20 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-21 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-23 – HSPE (2007) – perfil B
Ea-25 – HSPE (2007) – perfil B
Ea-4 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-5 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-37 – LAMAC (2007) – perfil B
Ea-36 – LAMAC (2007) – perfil B
Kp-16 – LR (2005) – perfil J
Kp-22 – COB (2007) – perfil K
Ec-3 – HBP (2007) – perfil C
Ec-4 – HBP (2007) – perfil C
Ec-1 – HBP (2007)- perfil C
Ec-2 – HBP (2007) – perfil C
(a) ERIC-PCR - Dice (Tol 3,0%) (b) PFGE – Dice (Tol. 2,0%)
72
4.6 Transferência dos genes de resistência
A transferência genética de resistência aos antibióticos β-lactâmicos,
principalmente carbapenêmicos, avaliada pela conjugação em E. coli K12, não foi
possível em nenhum dos isolados estudados.
A transferência realizada pela transformação da cepa de E.coli DH10B foi
realizada com sucesso em sete isolados estudados, dois pertencentes ao perfil C,
dois pertencentes ao perfil B e as amostras Kp22, Kp38 e Kp13. Os
transformantes cresceram apenas nas placas contendo o antibiótico ampicilina (64
µg/mL) e ceftazidima (2 µg/mL) (Tabela 11). A CIM de cada cepa transformante
teve um aumento ≥ 4 diluições para ceftazidima. Na presença do antibiótico
imipenem, as cepas Ec2t, Ec4t, Kp38t, Kp13t, tiveram um aumento de apenas duas
diluições, diferente do antibiótico ertapenem que promoveu um aumento da CIM
≥4 diluições para estes transformantes, levando a uma sensibilidade diminuída.
No perfil de resistência para o antibiótico cefoxitina, as cepas Ec2t e Ec4t
mostraram um aumento da CIM > 4 diluições, sendo assim, essas duas cepas
apresentaram maior mudança no perfil de resistência para os antibióticos β-
lactâmicos (Tabela11).
O determinante de resistência transferido para a linhagem receptora
correspondentes às cepas Ec2t, Ec4t foi o gene blaCMY-2, na cepa Kp13t foi
transeferido o gene blaKPC-2 e a cepa Kp22t, apresentou o gene blaCTX-M. As cepas
transformadas Ea4t e Ea34t pertencentes aos isolados Ea-4 e Ea-34 do perfil B
apresentaram o determinante de ESBL blaCTX-M. Por último, a cepa transformante
Kp38t apresentou, nos testes fenotípicos, um perfil de enzima β-lactamase da
73
classe A sendo possivelmente uma ESBL, porém não foi possível identificar o
gene mobilizado (Tabela11).
Tabela 11. Transformação por choque térmico para os representantes de cada determinate de resistência identificado.
Cepa Crescimento CIM (µg/mL)
Produto de PCR AMP
64µg/mL CAZ
2µg/mL IMP ERT FOX CAZ CTX
DH10B
(-) (-) 0,125 0,125 8 0,25 0,06 (-)
Kp1t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Eg2t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Kp9t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Kp16t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Kp22t (-) + 0,125 0,5 16 8 64 blaCTX-M
Kp38t + + 0,5 2 16 32 8 NI
Ec2t + + 0,5 4 >128 >64 64 blaCMY-2
Ec4t + + 0,5 8 >128 >64 64 blaCMY-2
Ea4t + (-) 0,25 0,125 8 4 32 blaCTX-M
Ea25t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Ea34t + (-) 0,25 0,125 8 4 32 blaCTX-M
Ea39t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Kp13t + (-) 0,5 2 16 2 0,25 blaKPC-2
Kp35t (-) (-) -- -- -- -- -- NA
Controlet + (-) -- -- -- -- -- NA
25922 NA NA 0,125 0,125 8 0,25 0,03 NA
NOTA: AMP: ampicilina, CAZ; ceftazidima, IMP: imipenem, ERT: ertapenem, FOX: cefoxitina, CTX: cefotaxima, CIM: concentração inbitorio mínima, DH10B: Cepa receptora E. coli DH10B, +: positiva, (-): negaitivo,NA: não aplica, --: não determinado, NI: não identificado.
74
G1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 G2 KPC-2
CTX-M 23,13 Kb
10Kb CMY-2
Figura 7: Extração de plasmideos dos transformantes. Nota: G1:Gene ruler 1Kb (500-10000 pb), 1:Ec2t, 2:Ec4t, 3: E. coli ATCC 25922,4: Ea34t, 5: Kp13t, 6: Kp38t, 7: Kp22t, 8: E. coli DH10B, 9: Control positivo transformação, G2: Lambda DNA/Hind III (125-23130pb).
O perfil plasmidial dos transformantes demonstrou que os genes das β-
lactamases são carregados por plasmideos ≥ 23 Kb. O gene blaCTX-M foi localizado
em plasmideos de diversos tamanhos (Figura7).
75
5. Discussão
Os resultados fenotípicos obtidos mostram um comportamento diversificado
das bactérias com relação à resistência aos carbapenêmicos. Em geral, uma das
principais características exibidas por todos os isolados foi o perfil de
multiresistência. Excepcionalmente, a resistência à gentamicina foi pouco
freqüente, sendo encontrada uma sensibilidade de 89 % a esse antibiótico, no
entanto, houve reduzida sensibilidade para a amicacina (32%). Esta diferença de
susceptibilidade para a mesma classe de antibióticos pode estar relacionada com
a presença de enzimas específicas codificadas por genes carregados
principalmente por integrons. De fato, os isolados Ea-5, Kp-15, Ec-1, Ec-2, Ec-3,
Ec-4 e Ea-39, sensíveis aos dois aminoglicosideos, não carregam este elemento.
Por outro lado, estudos de caracterização de integrons carregando múltiplos
determinantes de resistência têm mostrado esta resistência direcionada para um
tipo de aminoglicosideo específico (Mendes et al., 2004).
A resistência aos β-lactâmicos foi alta na maioria dos isolados com exceção
das cepas que mostraram um fenótipo de sensibilidade aos carbapenêmicos, Kp-
3, Kp-15 e Kp-12. É importante mencionar a diminuição de sensibilidade à
cefoxitina encontrada nestas bactérias, o que pode estar relacionado à alta
pressão seletiva existente em um ambiente hostil. Um estudo realizado por
Martinez-Martinez e colaboradores no ano 1999 demonstrou que a perda da
porina de 36 kDa contribui para a resistência aos β-lactâmicos, principalmente às
cefamicinas, porém não é determinante para a expressão de um alto nível de
resistência, conforme mostrado pela CIM desses isolados (8 e 32 µg/mL) quando
76
comparados aos produtores de enzimas hidrolisadoras deste antibiótico (CIM
>512µg/Ml) (Martinez-Martinez et al., 1999).
A impermeabilidade das porinas diminui a sensibilidade para cefalosporinas
e carbapenêmicos e outros antibióticos não relacionados, como as quinolonas.
Dentre as porinas, a OmpK36 é a principal proteína relacionada com a resistência
ao imipenem, além de contribuir para a resistência à cefoxitina, uma vez que esta
porina é a via de ingresso para essas drogas (Pages et al., 2008). Esta
impermeabilidade de membrana externa impediu a obtenção de uma boa
correlação entre os produtores de AmpC com a cefoxitina nos testes de inibição
enzimática com APB, já que 9 dos 15 isolados produtores não apresentaram uma
diminuição da CIM frente ao APB (Anexo 1). Neste trabalho, a resposta ao APB
com ceftazidima permitiu a realização de uma identificação mais definida, mesmo
assim, duas cepas ESBL positivas com impermeabilidade de membrana
apresentaram falsa positividade para AmpC. Estes resultados diferem dos
relatados por Coudron em 2005, no qual o autor cita tanto a cefoxitina e a
ceftazidima como indicadores de AmpC, porém as cepas estudadas no trabalho
de Coudron não apresentaram uma ausência de porina (Coudron, 2005, Brenwald
et al., 2005).
A triagem de ESBL foi freqüentemente mascarada pela presença de
enzimas do tipo AmpC. Todos os isolados produtores de AmpC co-produziram
algum tipo de ESBL, mas o triagem deste foi negativo para todos eles. Este relato
de falsos negativos para ESBL é devido à inibição nula do ác. clavulânico para a
enzima AmpC. Esta dificuldade é relatada em diversos estudos que procuram uma
77
identificação mais correta, principalmente na obtenção de testes mais fidedignos a
serem empregados nos laboratórios de rotina (Netzel et al., 2007, Coudron 2005).
Em relação ao tipo de gene responsável pela expressão de ESBL foi
encontrada uma alta incidência do gene blaCTX-M, carregado por um plasmídeo
transferível. A presença desse gene foi confirmada tanto em cepas de Klebsiella
como Enterobacter, o que denota a importância dos plasmideos na disseminação
desta resistência independente do gênero bacteriano e clonalidade.
Quanto ao perfil de resistência aos carbapenêmicos, os métodos
fenotípicos podem até prever os mecanismos presentes nos isolados, porém
quando há mais de um mecanismo envolvido, esses mascaram e dificultam a
interpretação fenotípica dos resultados e a sua caracterização.
A detecção de carbapenemases em enterobactérias é caracterizada por
uma CIM relativa para os carbapenêmicos, principalmente MBLs (Quennan &
Bush 2007), porém no estudo de triagem de carbapenemases de todas as cepas
que apresentaram CIM entre 8 e 128 µg/mL, apenas sete mostraram algum grau
de hidrólise do imipenem e, dessas, cinco mostraram resultados concordantes
com MBL ao apresentar sinergismos positivos com os inibidores dessas enzimas.
Os ácidos derivados de compostos tiólicos foram os melhores inibidores
para o substrato imipenem. As cepas Kp-16, Kp-22, e Kp-23 apresentaram falsa
positividade no teste de dupla difusão de disco com o inibidor EDTA e os ácidos
derivados de compostos tiólicos. A produção de falsos positivos nesta metodologia
já havia sido descrita anteriormente por Picão e colaboradores (Picão, et al.,
2008).
78
A identificação fenotípica dos isolados produtores das carbapenemases do
tipo KPC foi caracterizada pela inibição da enzima na presença do APB. Este foi
relatado pela primeira vez em 1983 como inibidor reversível de β-lactamases de
classe C (Beesley, et al., 1983). Diversos métodos para a identificação desse tipo
de enzima têm sido relatados desde então, sendo o APB considerado um inibidor
específico. Em 2008, Pasteran e colaboradores relataram a inibição da
carbapenemase KPC-2 por APB em um isolado de K pneumoniae, utilizando
como substrato o antibiótico imipenem. Este relato foi confirmado meses depois
por Tsakris e colaboradores, em um estudo feito com 57 cepas produtoras de
KPC, no qual foi descrito que a inibição do APB para o substrato imipenem era
específica para enzimas de tipo KPC (Pasteran et al., 2008, Tsakris et al., 2008).
Pasteran e colaboradores no ano 2009 pesquisaram a efetividade desse método
para a deteção de todas as carbapenemases de classe A, obtendo novas
recomendações para a triagem destas enzimas (Pasteran, et al., 2009).
Assim, no presente estudo, os dois isolados restantes que apresentaram
hidrólise do imipenem, as cepas Kp-13 e Kp-35, carregando o gene blaKPC-2,
mostraram uma diminuição significativa da CIM do antibiótico imipenem com a
presença do inibidor APB, de três ou mais diluições.
A queda da CIM do imipenem, na presença de APB, foi observada também
em todas as cepas produtoras de β-lactamases do tipo AmpC. A CIM para os
carbapenêmicos diminuiu a valores limites de sensibilidade de 2 e 4 µg/mL, com o
emprego do inibidor APB e a maioria apresentou diferença na CIM ≥3 diluições
(anexo 1). É importante citar que os resultados descritos por Pasteran et al., 2009,
que recomendam um limite de corte para carbapenemases de CIM ≥ 3 diluições,
79
não relatam a possibilidade de falso positivo decorrente da presença de AmpC.
Assim, os resultados obtidos sugerem que a hiperexpressão destas enzimas
induzíveis estariam contribuindo fortemente no desenvolvimento da resistência ao
imipenem (Poirel et al., 2008, Thomson & Bonomo 2005). Os isolados produtores
de MBL não apresentaram mudanças em suas CIM na presença deste inibidor, o
que demonstra a especificidade do APB para as enzimas AmpC e KPC.
A CIM do antibiótico imipenem não apresentou valores muito altos em
nenhum dos isolados, quando comparados aos resultados obtidos para
meropenem e ertapenem que são de 16 a 512 µg/mL e 8 a >512 µg/mL,
respectivamente. Este perfil característico de resistência, descrito entre os
antibióticos carbapenêmicos, está relacionado a mecanismos como
impermeabilidade da membrana externa por perda de porina associada à
produção de β-lactamases do tipo ESBL e AmpC (Livermore & Woodford 2006).
Todos os isolados produtores de AmpC, no presente trabalho, apresentaram este
perfil de resistência. Os isolados Eg-2, Kp-9 e Kp-11, produtores de MBL, também
apresentaram o mesmo perfil de resistência, mas, na análise de porinas, estas
cepas mostraram expressão diminuída da porina de 36 kDa, o que explica os
valores altos da CIM do ertapenem obtidos (Tabela 9).
As serino carbapenemases do tipo KPC apresentaram também um perfil
diferenciado para imipenem, ertapenem e meropenem, com valores de CIM do
imipenem entre 4 e 32 µg/mL. O antibiótico ertapenem, por sua vez, apresentou
valores mais altos de CIM, podendo estar relacionado diretamente à enzima ou à
presença de outros mecanismos que diminuem a sensibilidade a este antibiótico
de forma específica (Yigit et al., 2003, Wolter, et al., 2008, Girlich et al., 2008,
80
Woodford et al., 2007). A cepa Kp-13 teve este comportamento característico
associado à presença da enzima KPC, porém a cepa Kp-35 apresentou uma
resistência maior para o imipenem (CIM = 128 µg/mL), ertapenem e meropenem
(CIM ≥512 µg/ml). Este comportamento foi justificado pela ausência da porina
OmpK36 que contribuiu para os altos valores de resistência.
A resistência aos carbapenêmicos ainda é rara em espécies pertencentes à
família Enterobactériaceae (Livermore & Woodford 2006). Porém, o uso
indiscriminado dos carbapenêmicos tem acarretado no desenvolvimento de
resistência em bactérias Gram-negativas nos últimos anos, em decorrência de
diversos fatores, entre estes, a pressão seletiva (Nordmann & Poirel 2002). Assim,
relatos de carbapenemases em espécies da família Enterobacteriaceae ainda são
pouco frequentes, principalmente na América Latina. Deshpande e colaboradores
em 2006 concluíram, dos estudos realizados pelo programa SENTRY (2000 -
2004), que a prevalência das carbapenemases em enterobactérias, era baixa
naquele período, mas já se encontrava disseminada pelo mundo, com exceção da
América Latina (Deshpande et al., 2006).
No entanto, o primeiro relato na América Latina deste mecanismo de
resistência ocorreu em 2003, no Brasil, em uma amostra de Klebsiella
pneumoniae produtora de IMP-1. Desde então, nessa região, os membros da
família Enterobactériaceae têm sido relacionados apenas com esta MBL e à
presença da serino carbapenemase KPC-2 (Lincopan et al., 2005, Villegas et al.,
2006 e Pasteran et al. 2008, Peirano et al., 2009, Monteiro et al., 2009), dados
coerentes com o encontrado no atual estudo, uma vez que os sete isolados que
apresentaram hidrólise significativa foram confirmados para estas enzimas.
81
As MBLs têm uma alta prevalência na Europa e Oriente Médio e têm
emergido nas áreas onde P. aeruginosa produtoras destas enzimas são
endêmicas, como Turquia, Grécia e Itália (Castanheira et al., 2008), o que sugere
uma disseminação dessas enzimas a partir destas bactérias. No Brasil, o primeiro
relato de IMP-1 foi feito por Gales e colaboradores em 2003 em uma amostra de
A. baumanni isolada do complexo Hospital São Paulo/UNIFESP (Gales et al.,
2003). Depois deste estudo, diversos surtos foram relatados neste hospital, entre
eles, o primeiro de K. pneumoniae produtora de MBL, IMP-1 no Brasil (Grinbaum
et al., 2004) e, no ano 2005, o relato de uma cepa de K. pneumoniae produtora
de IMP-1 no Hospital Universitário da USP isolada em 2003. Esses dados indicam
um comportamento similar ao descrito por Castanheira em razão da presença de
MBL em enterobactérias isoladas em nosso país (Lincopan et al., 2005, Lincopan
et al., 2006).
No presente estudo, as quatro cepas de K pneumoniae produtoras de IMP-
1 foram limitadas a três centros hospitalares de São Paulo em um período de três
anos, o que sugere uma disseminação mais restrita deste determinante entre as
bactérias dessa família. Os três isolados de K. pneumoniae, Kp-1, Kp-11 e Kp-14,
pertencentes ao hospital Servidor Público Estadual e ao laboratório médico
Análises Clínicas, foram clonalmente relacionadas com o primeiro isolado de IMP-
1, descrito por Lincopan e colaboradores em 2005, denominado neste estudo
como Kp-9, o que indica uma origem comum desses isolados e das amostras
relatadas no ano seguinte por este mesmo autor. A amostra de Enterobacter
gergoviae, pertencente ao Hospital das Clínicas da USP, foi isolada no mesmo
ano que as cepas de K. pneumoniae, o que sugere uma transferência horizontal
82
desse determinante de resistência a partir dos isolados apresentados nos demais
hospitais da cidade de São Paulo (Penteado, 2007, Lincopan et al., 2006;
Grimbaum, et al., 2004 ), no entanto, não foi confirmada a localização do gene no
plasmideo, uma vez que a transformação de DH10B e o DNA plasmidial extraído
das cepas produtoras de IMP-1 não foi realizada com êxito.
A localização genética da enzima IMP-1 encontra-se associada a integrons
de classe 1, os quais carregam adicionalmente outros genes codificadores de
determinantes de resistência a outros antibióticos (Poirel & Nordmann 2002;
Penteado et a., 2009) . Em uma publicação recente, Penteado e colaboradores
descreveram o integron de classe 1 específico de 2,5 Kb denominado In86 que
carrega o gene blaIMP-1, nas cepas de K. pneumoniae provenientes do HSPE e na
primeira cepa produtora de IMP-1 no Brasil. O gene blaIMP-1 situa-se na primeira
posição com mais dois genes cassetes aacA30 e aadA1 que conferem resistência
aos aminoglicosídeos, (Penteado, et al., 2009). Este tipo de integron já havia sido
descrito anteriormente em Acinetobacter spp e Pseudomona putida isoladas de
outro hospital da cidade de São Paulo (Mendes et al., 2007), localizando-se no
cromossomo bacteriano, porém, nas amostras de Klebsiella pneumoniae, o
integron foi localizado em um plasmideo, o que sugere que o In86 foi
recentemente mobilizado por plasmidios, disseminando para espécies isoladas em
três hospitais de São Paulo (Penteado et al., 2009). Uma vez que os resultados
aqui apresentados, assim como o já publicado por Penteado e colaboradores,
demostram clonalidade entre as cepas produtoras de IMP-1, tendo em comum a
primeira cepa relatada aqui no Brasil, podemos concluir que a localização genética
83
do gene de IMP-1 na cidade de São Paulo está fortemente relacionado ao
integron de classe 1 In86 (Penteado, et al., 2009).
Diferente das MBLs, prevalentes na Europa e Ásia, as publicações do
SENTRY correspondentes aos anos 2000 e 2005 mostraram que as serino
carbapenemases são mais prevalentes na América, especificamente na América
do Norte, onde a presença da enzima KPC tem sido confirmada em bactérias
hospitalares da cidade de Nova York, constituindo um sério problema
epidemiológico (Castanheira et al., 2008). Atualmente, as serino-carbapenemases
têm sido descritas na América Latina com uma diversidade relativamente maior
que as MBLs. Dentre essas ezimas, GES-1 e GES-5 têm sido descritas na
Argentina e no Brasil; NMC-A na Argentina e KPC na Colômbia e Argentina
(Walther-Rasmussen & Høiby 2007, Villegas et al., 2006, Pasteran et al., 2008).
Recentemente, no Brasil, têm sido relatada a presença da enzima KPC-2 em
amostras de K. pneumoniae provenientes de Pernambuco, Rio de Janeiro e São
Paulo, assim como em Enterobacter cloacae no Rio grande do Sul, o que confirma
uma disseminação dessa enzima na América Latina e também no Brasil (Peirano
et al., 2009, Monteiro et al., 2009, Dinato, et al., 2008, Zavascki, et al., 2009 ;
Pavez et al., 2009).
Os resultados deste trabalho contribuem com o estudo da prevalência da
enzima KPC, já que os dois isolados produtores de KPC-2, aqui descritos, são os
primeiros casos relatados em São Paulo. Curiosamente, a cepa Kp-13,
proveniente do centro hospitalar laboratório clínico Endomed Ltda., foi isolada em
2005, um ano antes da cepa relatada em Pernambuco por Monteiro e
colaboradores, o que sugere que o surgimento dessa enzima no Brasil data do
84
ano 2005, sendo aparentemente o primeiro isolado da cidade de São Paulo
(Monteiro, et al., 2009, Pavez, et al., 2009).
A localização do gene blaKPC tem sido observada em plasmideos de
diversos tamanhos podendo apresentar mais de uma cópia do gene,
demonstrando alta capacidade de mobilização (Gootz, et al., 2009).
Recentemente, Naas e colaboradores descreveram o entorno genético do gene
blaKPC-2, o qual revelou a inserção dentro de um transposon denominado Tn4401.
Até o momento, este elemento tem sido o único relacionado ao gene blaKPC, não
sendo localizado em cromossomo ou em integron (Naas, et al., 2008). Nosso
estudo confirmou a presença de blaKPC em plasmideos maiores de 23 kb. Embora
as cepas Kp13 e Kp35 tenham apresentado plasmideos, a transferência do gene
só foi confirmada quando usamos a cepa Kp-13 como doadora do plasmídio.
Apesar das carbapenemases serem o determinante de resistência mais
prevalente e amplamente disseminado, o primeiro mecanismo de resistência ao
imipenem, descrito na espécie Klebsiella pneumoniae, foi associado com
impermeabilidade da membrana e presença da enzima AmpC (Thomson &
Bonomo 2005).
Na América Latina, a resistência aos carbapenêmicos tem sido
esporadicamente associada à perda da porina de 36 kDa (Mendes et al. 2004;
Pavez et al., 2008), sendo a presença de enzimas hidrolisadoras de imipenem o
mecanismo mais prevalente em Enterobacteriaceae (Lincopan et al., 2005,
Villegas et al., 2005, Mendes et al., 2004, Pasteran et al., 2008, Peirano et al.,
2009; Pavez et al., 2009).
85
Nosso estudo descreve uma prevalência maior de impermeabilidade da
membrana, evento pouco relatado na América Latina, sugerindo que a resistência
ao imipenem nos isolados estudados tem sido um mecanismo de adaptação da
bactéria decorrente da pressão seletiva conferida pelo amplo uso dos
carbapenêmicos.
O perfil de expressão das porinas de membrana externa mostrou uma única
ausência da porina OmpK36 ou seu homólogo OmpC na maioria dos isolados
estudados. Este determinante contribuiu para a resistência aos carbapenêmicos,
principalmente naquelas cepas com altos níveis de resistência para o antibiótico
ertapenem, o que foi característico destes isolados.
A ausência da expressão da OmpK36/OmpC deve-se a diversos
mecanismos moleculares que interferem na seqüência codificante do gene da
OMP e a outros que interferem apenas na expressão da proteína (Doumith, et al.,
2009, Pages, et al., 2008). Das 23 cepas caracterizadas pela ausência da porina,
4 apresentaram sinais compatíveis com a presença de IS. De fato, em um estudo
recente realizado por Doumith sobre os mecanismos moleculares que interferem
na expressão de proteínas, foram descritos quatro IS diferentes que
interromperam a região codificante da proteína OmpK36 (Doumith, et al., 2009).
As cepas Kp-38, Kp-35 e Ea-37 apresentaram um aumento maior que 1500pb no
tamanho esperado do produto de PCR obtido usando primers específicos para
amplificar o gene ompC/ompK36. No estudo de Doumith, também foi observada a
ausência de amplificação do gene de OmpK36 em um dos isolados estudados,
situação encontrada na cepa Eg2 de nosso estudo, indicando a deleção desse
86
fragmento de DNA ou mutações diversas que afetam a seqüência dos partidores
(Doumith, et al., 2009).
Existem diversos relatos sobre a contribuição da impermeabilidade da
membrana externa na resistência aos carbapenêmicos e há, também,
controvérsias, uma vez que a análise do mecanismo de resistência por
impermeabilidade é uma área relativamente nova de pesquisa (Poirel et al. 2004,
Kim et al. 2007, Bradford et al. 1997, Kackzmarek et al. 2006).
O mecanismo de resistência que envolve a impermeabilidade da membrana
externa está associada à perda das duas principais porinas de 36 e 35 kDa
(Pages, et al., 2008). A ausência da porina OmpK36 ou seu homólogo OmpC
confere maior resistência aos β-lactâmicos, incluindo o imipenem, sendo mais
relatada em comparação com a perda da porina OmpK35 ou seu homólogo OmpF
(Pages et al., 2008, Martinez-Martinez et al., 1999). A perda dessas duas porinas
maiores contribui para a extensão do perfil de resistência a outras classes de
antibióticos (e.g., ciprofloxacina) e para um aumento do nível de expressão da
resistência aos β-lactâmicos. A perda das duas porinas não tem sido descrita com
freqüência, pois essa ausência leva a uma menor sobrevida da bactéria
similarmente aos casos de respostas adaptativas extremas (Davin-regli et al.,
2008). Nesta situação, como alternativa, a bactéria pode compensar a restrição de
nutrientes decorrentes das perdas das porinas OmpK35/OmpK36, mediante a
produção de uma nova proteína (OmpK37), a qual permite a entrada normal de
nutrientes, mas não a entrada de β-lactâmicos, isto devido à conformação de seu
canal. Portanto, a presença desta nova proteína está relacionada com altos níveis
de resistência para estes antibióticos (Pages et al., 2008).
87
A co-produção de β-lactamases na perda da permeabilidade de membrana
externa foi a principal característica dos isolados estudados. Em um trabalho feito
no ano 1999, os autores Martinez- Martinez e colaboradores demonstraram essa
participação sinérgica entre β-lactamases (ESBL e AmpC) e ausência de porina
como mecanismo de resistência ao imipenem.
A resistência aos carbapenêmicos pela produção de enzimas do tipo
AmpC e ESBL associadas à impermeabilidade de membrana tem sido descrita em
diversos lugares do mundo, porém o entendimento desse mecanismo não está
totalmente elucidado. Alguns autores (Caio et al. 2000) confirmaram o
envolvimento dessas β-lactamases com a resistência aos carbapenêmicos,
descrito previamente por Martinez (Martinez-Martinez, et al., 1999), verificando a
necessidade da combinação da ausência da porina e produção de enzima para a
resistência aos carbapenêmicos, uma vez que uma fraca atividade de
carbapenemase é produzida pelas enzimas AmpC e algumas ESBL, contribuindo
para essa resistência (Thomson & Bonomo, 2005, Girlich et al., 2008).
Assim, a caracterização de resistência aos carbapenêmicos realizada no
presente trabalho mostrou que esse fenômeno de impermeabilidade de membrana
externa está sendo emergente nos membros da família Enterobacteriaceae
isolados nos hospitais da cidade de São Paulo, uma vez que 18 cepas
correspondentes a 64% dos isolados estudados apresentaram alguma associação
entre enzimas β-lactamases do tipo AmpC e ESBL e perda de porina, sendo 83%
produtoras de enzimas do tipo AmpC e 17% de enzimas ESBL.
A presença de AmpC nos isolados da América Latina não tem sido relatada
com freqüência. Em 2008, no Rio de Janeiro, foram identificadas fenotipicamente
88
cepas sugestivas de AmpC, mas sem uma confirmação genética. No mesmo
período, na Argentina, Rapaport e colaboradores descreveram a enzima CMY-2
em Shigellla flexneri (Da Silva et al. 2008, Rapaport et al. 2008). O primeiro relato
confirmado de AmpC no Brasil foi realizado por nosso grupo de pesquisa,
coincidindo com o primeiro relato na América Latina sobre a resistência aos
carbapenêmicos mediada por impermeabilidade de membrana descrita em uma
espécie de Escherichia coli produtora da enzima CMY-2 like. Os quatro isolados
desta espécie apresentaram alta resistência a todos os carbapenêmicos em
função da perda da porina OmpC associada à produção dessa enzima. A
presença de este isolado confirma a emergência da enzima CMY-2 like na
América Latina e sua prevalência no mundo (Pavez et al. 2008 Poirel et al. 2004,
Liu et al. 2008). A localização plasmidial da enzima CMY-2 tem contribuído com a
disseminação mundial desta β-lactamase. As cepas de E. coli confirmaram a
localização plasmidial por meio da transformação de um plasmideo > 23 Kb que
carregava o gene blaCMY-2 e este gene não foi relacionado a nenhum outro
elemento de mobilidade como o integron.
As 11 cepas positivas para a triagem de enzimas de classe C do tipo
MIR/ACT-like foram seqüenciadas e confirmadas como AmpC cromossômicas
intrínsecas de Enterobacter aerogenes com uma similaridade de 100%.
Curiosamente, dentre os isolados, a cepa Ea-39 mostrou um comportamento
diferente quanto ao perfil fenotípico de resistência, na qual a indução da enzima
AmpC pelos antibióticos ceftriaxona e aztreonam foi clara. Segundo Perez-Perez e
Hanson, a positividade cruzada do produto de PCR da AmpC cromossômica com
AmpC plasmidial da família MIR/ACT ocorre apenas com AmpC cromossômica de
89
E. cloacae, uma vez que a família MIR/ACT deriva da AmpC desta espécie, porém
em nosso estudo a enzima cromossômica de Enterobacter aerogenes levou a
uma positividade cruzada sugerida pelo gênero comum das espécies, evento não
descrito por Perez-Perez e Hanson (Perez- Perez & Hanson 2002). A super
expressão dessa AmpC cromossômica, possivelmente contribui para a
resistência ao imipenem associada a uma impermeabilidade de membrana
(Jacoby, 2009). A localização de uma AmpC do tipo plasmidial foi também
descartada pelo resultado negativo da transformação.
A enzima AmpC, DHA-1 encontrada nas cepas Kp-9 e Kp-3, teve um papel
pouco significativo no perfil de resistência aos antibióticos β-lactâmicos, uma vez
que a expressão dessa enzima está ligada ao gene AmpR , sendo então uma das
poucas enzimas AmpC plasmidiais induzíveis, frente a pressão seletiva do
antibiótico (Jacoby 2009). Além da localização plasmidial da enzima, o gene
blaDHA-1 encontra-se inserido em pequenos integrons complexos de classe 1
(Jacoby 2009). De fato, nos isolados estudados, o gene blaDHA-1 foi observado em
integrons de classe1.
Finalmente, os isolados Kp-16, Kp-22 e Kp-38 foram relacionados à
impermeabilidade associada à produção de ESBL. Os três isolados produziram
enzimas de diferentes famílias, tendo em comum apenas a família CTX-M. Um
dos indicativos para a sugestão desse mecanismo foi o comportamento fenotípico
dos isolados. Os isolados apresentaram uma sensibilidade diminuída para o IMP
de 8 µg/mL, em comparação com as produtoras de AmpC, que apresentaram uma
CIM de 32 µg/mL para imipenem, com exceção da amostra Kp-38. Os diversos
trabalhos que relatam impermeabilidade de membrana acoplada à enzima do tipo
90
ESBL confirmam um perfil de alta resistência a todas cefalosporinas e uma
sensibilidade diminuída para imipenem com CIM entre 4 e 8 µg/mL. Essa
diminuição de sensibilidade fica ainda mais acentuada para meropenem e
ertapenem em forma seqüencial, este último com alta resistência (Martinez-
Martinez et al., 1999, Kim et al., 2007, Crowley et al., 2002, Livermore &
Woodford, 2006).
Outra característica encontrada nesses isolados associados à produção de
ESBL foi o comportamento frente ao inibidor de AmpC, conjugado com o
antibiótico imipenem. As três amostras não diminuíram sua CIM de forma
significativa, demonstrando que a resistência a esse antibiótico era devido à
ausência de porina e que a contribuição das enzimas ESBL é menor para a
resistência aos carbapenêmicos do que a descrita para as enzimas do tipo AmpC.
Esse resultado da CIM é coerente, uma vez que a hidrólise de imipenem pelas
enzimas ESBL é muito fraca ou nula (Walther-Rasmussen & Hølby 2007,
Martinez-Martinez et al., 1999).
Embora a localização genética das ESBL seja muito versátil, a enzima
CTX-M tem sido freqüentemente relacionada a plasmideos e elementos de
mobilização como o integron, porém das três cepas estudadas, nas cepas Kp-16 e
Kp38 não foi possível relacionar o gene de ESBL blaCTX-M com nenhum dos dois
elementos de mobilização citados. Observou-se uma transformação positiva para
um plasmideo de 23 Kb pertencente à cepa Kp-22 que carregava a enzima CTX-
M, mas a sensibilidade aos carbapenêmicos da cepa transformada não foi
mudada. A transformação da cepa Kp-38 foi positiva, mas o gene transferido não
foi relacionado com nenhuma enzima ESBL estudada e não foi identificado
91
nenhum plasmideo na cepa transformada (Figura 7), porém esta cepa apresentou
resistência à ceftazidima, cefotaxima e sensibilidade diminuída para ertapenem,
perfil possivelmente relacionado a algumas enzimas de classe A que não foram
estudadas neste trabalho.
Curiosamente, cepas de Enterobacter aerogenes produtoras de AmpC
cromossômica co-produziram ESBL do tipo CTX-M, cujo gene blaCTX-M foi
transferido com êxito para a cepa receptora E. coli DH10B, confirmando a
mobilização plasmidial da enzima nesta espécie.
Em relação ao estudo de similaridade genética entre os isolados estudados,
as duas técnicas de tipagem molecular realizadas tiveram uma boa correlação,
demonstrando alta eficiência para o estudo epidemiológico, no entanto, a técnica
de PFGE apresentou maior poder discriminativo entre as cepas de um mesmo
perfil ou cluster, quando comparada ao ERIC-PCR, permitindo uma análise mais
acurada na definição de clones ou clusters das cepas estudadas (Figura 6).
Assim, a técnica de ERIC-PCR permitiu a realização de uma análise geral da
diversidade genética entre as cepas estudadas, servindo como um teste de
triagem pela facilidade e rapidez e a técnica de PFGE contribuiu para uma análise
mais detalhada e discriminatória dos dados previamente analisados.
A tipagem molecular realizada para o estudo de diversidade gênica sugere
que o mecanismo de disseminação dos principais determinantes de resistência
deva ter ocorrido por uma disseminação clonal dentro de cada espécie,
evidenciada, principalmente, em dois centros hospitalares da cidade de São
Paulo.
92
Assim, o determinante de resistência IMP-1 foi encontrado em um clone de
K. pneumoniae denominado clone A, sugerindo que a partir da amostra Kp-9,
cepa proveniente do HU, houve disseminação para os demais centros
hospitalares HSPE e LAMAC, uma vez que essa primeira cepa relatada no Brasil
apresentava um perfil de restrição XbaI de menor similaridade quando comparada
às demais linhagens de K. pneumoniae. Este cluster não foi relacionado com
nenhum outro tipo de mecanismo de resistência para imipenem, com exceção da
cepa original Kp-9 que produziu em conjunto uma enzima de tipo AmpC, DHA-1
com ausência da porina de 36 kDa. Assim, neste isolado, esse mecanismo de
resistência adicional resultou em um perfil de resistência diferente das demais
cepas do mesmo clone (Anexo 1).
Os únicos isolados produtores de carbapenemases que não apresentaram
relação clonal foram as K. pneumoniae produtoras de KPC-2. Essas amostras
foram recuperadas de períodos e centros hospitalares diferentes, o que sugere
distintas origens ou, o fato mais provável neste caso, a ocorrência de uma
transferência horizontal dos genes de resistência.
Por outro lado, todos os isolados de Enterobacter aerogenes foram
clonalmente relacionados, pertencentes à linhagem B, com exceção das cepas
Ea-34 e Ea-39 que apresentaram maior diversidade genética, com resultados
semelhantes tanto pelo método de ERIC-PCR como por PFGE. Porém, estas
amostras geneticamente relacionadas provenientes de dois centros distintos,
HSPE e LAMAC, coletadas durante o ano 2007 confirmaram uma disseminação
entre esses dois centros hospitalares, além de sugerir a presença de um surto do
cluster B.
93
O determinante de resistência da enzima AmpC CMY-2 foi descrito apenas
na espécie de Escherichia coli proveniente do centro hospitalar HBP, denominado
clone C, em isolados de um mesmo paciente.
Os isolados Kp-16, Kp-22 e Kp-38, associados também a uma
impermeabilidade de membrana na sua resistência aos carbapenêmicos, não
foram relacionados a nenhum perfil predominante, o que sugere que esses
isolados possuem uma resistência do tipo adaptativa regulada por mecanismos
intrínsecos da bactéria induzidos pela pressão produzida pelos antibióticos
(Chevalier et al., 2008 ).
A caracterização molecular da resistência ao imipenem relatada neste
estudo permitiu identificar e confirmar individualmente perfis e comportamentos
das bactérias para os diversos determinantes de resistência, além de apresentar
associações e vínculos entre diferentes isolados, o que permitiu entender a sua
disseminação, informação fundamental para o êxito dos tratamentos e o
entendimento de falhas terapêuticas. Estudos epidemiológicos, assim como
pesquisas aprofundadas nos mecanismos envolvidos na impermeabilidade de
membrana são fundamentais para contribuir não só para a compreensão da
emergência de novos mecanismos de resistência, mas também com o controle da
sua disseminação .
94
6. Conclusões
6.1. A presença de um perfil de multiresistência foi identificada em todas as
amostras de enterobactérias resistentes aos antibióticos carbapenêmicos
(CIM entre 8 - 128 µg/mL), apresentando, ainda, uma elevada taxa de
resistência para a cefoxitina.
6.2. Foram identificados três principais mecanismos de resistência:
produção da MBL, produção da serino carbapenemase e impermeabilidade
de membrana associada à produção de β- lactamases.
6.3 A enzima IMP-1 foi a única MBL envolvida na resistência ao imipenem
na família Enterobactériaceae e a presença de KPC-2 foi detectada em
apenas duas amostras, sendo o primeiro relato na cidade de São Paulo,
confirmando uma disseminação desta enzima pela América Latina
6.4 A impermeabilidade de membrana pela perda da porina de 36 kDa
associada a uma co-produção de β-lactamases do tipo AmpC e ESBL foi o
determinante de resistência mais freqüente nas amostras estudadas.
6.5 A produção de AmpC tanto cormossômico como plasmidial dos isolados
estudados mostrou uma contribuição importante para a resistência aos
antibióticos carbapenêmicos .
95
6.6 A presença de integron foi identificada em 17 das 28 cepas de
enterobactérias, demonstrando que esta família apresenta alta capacidade
de disseminação. Porém, a localização de determinantes de resistência ao
imipenem em integron foi identificada apenas para a MBL IMP-1.
6.7 A mobilização dos genes determinantes de resitência ao imipenem foi
confirmada apenas para CMY-2 e KPC-2, com uma localização plasmidial
destes genes.
6.8 A tipagem molecular identificou uma disseminação clonal importante
para a maioria dos determinantes detectados, demonstrando uma baixa
incidência de transferência horizontal para a resistência aos
carbapenêmicos, com exceção da KPC-2 que não apresenta relação clonal
entre os isolados produtores desta enzima.
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*Referencias segundo associação Brasileira de Normas Tecnicas (ABNT) – NBR6023
113
114
ANEXOS
115
Cepa Perfil
PFGE
Concentração inibitória mínima (CIM) µg/ml Triagem β-lactamases IMP IMP/EDTA IMP/APB MER ERT FOX FOX/APB CAZ CAZ/APB Bioensaio MBL AmpC ESBL
Ea-39 L 16 8 1 32 64 >512 8 2 1 (-) (-) + (-)
Kp-12 D 2 2 2 4 16 32 32 32 8 (-) (-) (-) +
Ec-1 C 32 16 16 128 512 >512 >256 >512 16 (-) (-) + (-)
Ec-2 C 32 8 16 128 256 >512 >256 >512 16 (-) (-) + (-)
Ec-3 C 32 32 8 128 512 >512 256 256 8 (-) (-) + (-)
Ec-4 C 32 8 8 128 512 >512 256 512 8 (-) (-) + (-)
Kp-11 A 64 2 32 128 512 >512 >256 256 256 + + (-) +
Kp-14 A 4 0,5 4 16 8 >512 >256 512 512 + + (-) +
Kp-1 A 8 1 4 16 8 >512 >256 512 512 + + (-) +
Kp-9 A 128 1 128 256 256 >512 >256 256 256 + + (-) +
Kp-38 H 128 32 64 128 256 64 64 128 16 (-) (-) (-) (-)
Kp-13 F 32 32 4 256 256 256 128 128 8 + (-) (-) (-)
Kp-16 J 8 4 4 128 512 64 32 32 8 (-) + + +
Kp-35 I 128 64 0,5 512 >512 256 32 64 1 + (-) (-) (-)
Ea-25 B 32 32 2 64 256 >512 128 64 1 (-) (-) + (-)
Ea-5 B 32 16 2 16 32 >512 64 1 0,5 (-) (-) + (-)
Ea-20 B 64 16 4 64 256 >512 64 64 8 (-) (-) + (-)
Ea-23 B 32 16 4 64 256 >512 64 32 16 (-) + + (-)
Ea-4 B 32 16 4 64 128 >512 64 32 8 (-) (-) + (-)
Ea-18 B 32 32 4 64 128 >512 >256 32 8 (-) (-) + (-)
Ea-36 B 32 32 8 128 256 >512 >256 64 16 (-) (-) + (-)
Ea-37 B 32 16 8 128 256 >512 >256 64 16 (-) (-) + (-)
Ea-21 B 32 32 4 64 256 >512 128 64 8 (-) (-) + (-)
Ea-34 M 16 16 2 32 128 >512 32 32 4 (-) (-) + +
Kp-15 G 0,125 0,5 0,125 0,25 0,125 32 32 0,5 0,5 (-) (-) (-) (-)
Kp-22 K 16 8 4 128 256 256 128 128 16 (-) + + (-)
Kp-3 F 1 2 1 0,25 0,06 8 16 0,5 0,5 (-) (-) (-) (-)
Anexo 1a.
116
D
Cepa Perfil
PFGE Amostra clinica Data de
isolamento
Centro
Hospitalar
Screening PCR β-lactamases OmpC/OmpK36
SDS-PAGE Carbapenemases AmpC ESBL
Ea-39 L Urina Janeiro-2008 HBP blaMIR/ACTlike (-)
Kp-12 D Sangue Novembro-2005 HSPE blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike +
Ec-1 C Sangue Julho-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Ec-2 C sangue Julho-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Ec-3 C Sangue Agosto-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Ec-4 C Cateter Agosto-2007 HBP blaCMY-2like blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Kp-11 A Sangue Fevereiro-2005 HSPE blaIMP-1 blaSHVlike, blaCTX-Mlike +
Kp-14 A Sec. Abdominal Maio-2006 LAMAC blaIMP-1 blaSHVlike +
Kp-1 A Sec. Abdominal Maio-2005 LAMAC blaIMP-1 blaSHVlike, blaTEMlike +
Kp-9 A Sangue Março-2003 LAMAC blaIMP-1 blaDHA-1 blaSHVlike, blaCTX-Mlike (-)
Kp-38 H Liq. Ascitico Janeiro-2008 HBP blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Kp-13 F Sangue Maio-2005 LCE blaKPC-2 blaSHVlike, blaCTX-Mlike +
Kp-16 J Sangue Julho-2005 LR blaSHVlike, blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Kp-35 I Sangue Novembro-2007 LAMAC blaKPC-2 blaSHVlike (-)
Ea-25 B Urina Maio-2007 HSPE blaMIR/ACTlike (-)
Ea-5 B Urina Março-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike (-)
Ea-20 B Urina Maio-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-23 B Urina Maio-2007 HSPE blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-4 B Sangue Junho-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaTEMlike, blaCTX-Mlike (-)
Ea-18 B Urina Julho-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-36 B Sangue Novembro-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-37 B Sangue Novembro-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-21 B Urina Abril-2007 LAMAC blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Ea-34 M Sangue Outubro-2007 HSPE blaMIR/ACTlike blaCTX-Mlike (-)
Kp-15 G Sangue Março-2007 COB blaSHVlike +
Kp-22 K Sangue Março-2007 COB blaCTX-Mlike (-)
Kp-3 F Sangue Março-2007 COB blaDHA-1 blaSHVlike +
Anexo 1b .
117
Nota anexo 1: Ea: Enterobacter aerogenes, Kp: Klebsiella pneumoniae, Ec: Escherichia coli, IMP: imipenem, IMP/EDTA: imipenem com inibidor EDTA, IMP/APB: imipenem com inibidor Acido fenil Boronico, MER: meropenem, ERT: ertapenem, FOX: cefoxitina, MBL: metalo-β-lactamase, ESBL: β-lactamase de espectro estendido, HBP: Hospital da Beneficiência Portuguesa - SP, HSPE: Hospital Servidor Público Estadual - SP, LAMAC: Laboratório Médico Analises Clínicas - SP, LCE: Laboratório Clínica Endomed Ltda. -SP, LR: Laboratório privado Richet –RJ, COB: Centro Oncológico Boldrini, Campinas –SP, bla: gene β-lactamase, +: positivo/presença, (-): negativo/ausença
118
Anexo 2
119
120
121
Anexo 3
122
Anexo 4. Curriculum Lattes Dados pessoais
Nome Mónica Alejandra Pavez Aguilar
Nome em citações bibliográficas
PAVEZ, M.
Endereço profissional
Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Av. Prof Lineu Prestes 580, Bloco 17, Laboratorio de Microbiologia Clinica Butanta 05508-900 - Sao Paulo, SP - Brasil Telefone: (11) 30913636
Formação acadêmica/Titulação
2007 Mestrado em andamento em Farmácia (Análises Clínicas) . Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Título: Caracterização molecular da resistência ao Carbapenens em Enterobactérias isoladas em hospitais brasileiros, Orientador: Elsa Masae Mamizuka. Bolsista do(a): Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico.
2001 - 2006 Graduação em Licenciatura em Tecnología Medica . Graduação em Licenciatura em Tecnología Medica. Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.
2001 - 2006 Graduação em Tecnologia Médica Menção Laboratório Clínico, Hema . Graduação em Tecnologia Médica Menção Laboratório Clínico, Hema. Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.
Formação complementar
2008 - 2008 Treinamento de PCR em tempo real. (Carga horária: 32h). Applied Biosystems do Brasil.
2005 - 2005 Sistemas de Gestión de la Calidad Aplicados al Lab. (Carga horária: 22h). Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.
2004 - 2004 Sistemas de Gestión de la Calidad Aplicados al Lab. (Carga horária: 16h). Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.
Atuação profissional
Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
Vínculo institucional
2008 - 2008 Vínculo: livre, Enquadramento Funcional: Monitoria, Carga horária: 6
02/2008 - 07/2008 Ensino, Microbiologia clínica, Nível: Graduação.
Programa de Aperfeiçõamento de Ensino (PAE) FBC0502 - Microbiologia clínica
123
Hospital Intercultural de Nueva Imperial, HI, Chile .
Vínculo institucional
2007 - 2007 Vínculo: Servidor Público, Enquadramento Funcional: Tecnologo Medico(substituiçao de cargo)., Carga horária: 44
Laboratório Clínico Antumalal, LA, Chile.
Vínculo institucional
2006 - 2007 Vínculo: Privado, Enquadramento Funcional: Tecnólogo Médico Director Técnico, Carga horária: 20
Hospital Regional de Temuco ,Hernan Henriquez Arave na, HT, Chile.
Vínculo institucional
2006 - 2006 Vínculo: Servidor Público, Enquadramento Funcional: Auxiliar paramedico (substituição de cargo), Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva.
Universidad de la Frontera, UFRO, Chile.
Vínculo institucional
2004 - 2004 Vínculo: Livre, Enquadramento Funcional: Ayudantia Parasitologia, Carga horária: 4
Atividades
10/1999 - 06/2006 Extensão universitária , Dirección de Extensión y Formación Continua de la Universidad de La Frontera
10/2004 - 12/2004 Extensão universitária , Projeto de Extensão e Comunicações de Acreditação Permanente N 041/2004, .
Atividade de extensão realizada Promoción de Salud en Escuela Básica. Satisfacción de una Necesidad y Aporte al Entorno Social . Temuco, Chile.
01/2004 - 12/2004 Pesquisa e desenvolvimento , Projeto Rüpü Grant 1014- 1000, .
04/2004 - 04/2004 Outras atividades técnico-científicas , Universidad de La Frontera e Governo do Chile - Ministério da Saúde.
Atividade realizada Coordenação e desenvolvimento das XII Jornadas Multidisciplinarias de Medicina Interna.
124
Áreas de atuação
1. Grande área: Ciências da Saúde / Área: Farmácia / Subárea: ANALISES CLINICAS.
2. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Bioquímica.
3. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Microbiologia.
4. Grande área: Ciências Biológicas / Área: Parasitologia.
5. Grande área: Ciências da Saúde / Área: Farmácia / Subárea: ANALISES CLINICAS / Especialidade: Hematologia.
Idiomas
Espanhol Compreende Bem, Fala Bem, Lê Bem, Escreve Bem.
Português Compreende Bem, Fala Razoavelmente, Lê Bem, Escreve Razoavelmente.
Inglês Compreende Razoavelmente, Fala Razoavelmente, Lê Bem, Escreve Razoavelmente.
Prêmios e títulos
2008 Menção honrosa por trabalho apresentado na XIII semana Farmaceutica de ciência e tecnologia, Faculdade de Ciência Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.
2008 Menção Honrosa por trabalho apresentado no 1º Simposio Internacional de Microbiologia clínica, Sociedade Brasileira de Microbiologia.
2006 Prêmio Colegio de Tecnólogos Médicos de Chile A.G Melhor Aluna da Menção Laboratório Clínico, Hematologia e Banco de Sangue da Carreira de Tecnología Médica, Universidad de La Frontera Promoção 2006, Colegio de Tecnologos de Chile A.G..
2006 Priemeira colocada da turma dos formandos do ano 2006 na Carreira de Tecnologia Medica, Universidad de La Frontera.
Produção em C,T & A
Produção bibliográfica
Artigos completo s publicados em periódicos
1. PAVEZ, M. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Early dissemination of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 53, p. 2702-
2702, 2009.
2. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Emergence of carbapenem-resistant Escherichia coli producing CMY-2-type AmpC beta-lactamase in Brazil. Journal of Medical Microbiology, v. 57, p.
1590-1592, 2008.
125
Resumos publicados em anais de congressos
1. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Escherichia coli produtora de beta-lactamase ampC tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbapenêmico, no Brasil. In: 1º Simposio internacional de microbiologia clínica, 2008, Gramado-RS. anais 1º Simposio internacional de microbiologia clínica. São Paulo-SP : sociedade brasileira de microbiogia, 2008.
2. NEVES, P. ; Silva, M.T. N. ; Antonio, C.S ; PAVEZ, M. ; NORONHA, M.C.A ; ATOBE, J. ; CASSETARI, V.C. ; MARTINEZ, M. B. ; LEVY, C. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Co-produção de metilases rRNA 16S e metalo-beta-lactamases em isolados clínicos multirresistentes de Pseudomonas aeruginosa disseminados em São Paulo, Brasil. In: 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007, Brasilia. XXIV Congresso Brasileiro de Microbiologia,, 2007.
Apresentações de Trabalho
1. PAVEZ, M. ; NEVES, P. ; DROPA, M. ; MATTE, M. H. ; GRINBAUM, R. ; DE ARAUJO, M. R. E. ; MAMIZUKA, E.M. ; LINCOPAN, N. . Escherichia coli produtora de beta-lactamase tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbaoenêmico, no Brasil. 2008. (Apresentação de Trabalho/Simpósio).
2. PAVEZ, M. ; Coñoman J ; Opazo M ; Salazar, L.A . Evaluación del efecto de la suplementación oral con Monohidrato de Creatina sobre marcadores biológicos de salud, en adolescentes que practican deporte de alto rendimiento. 2005. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
Produção artística/cultural
1. Pavez, M.A. ; PAVEZ, M. . Las Manos de mi Madre. 2006. (Apresentação de obra artística/Musical).
Eventos
Participação em eventos
1. 1º Simposio Internacional de Microbiologia Cínica.Escherichia coli produtora de beta-lactamse AmpC tipo CMY-2 resistente a antibiótico carbapenênmico, no Brasil. 2008. (Simpósio).
2. XIII semana Farmacêutica de Ciência e tecnologia.Emergence of CMY-2-type ampC beta-lactamase producing carbapenems resistant Escherichia coli in Brazil. 2008. (Encontro).
3. XIII semana farmauceutica de Ciência e tecnologia.Produção de Carbapenemases em Enterobactérias isoladas em hospitais de São Paulo:Emergência da variante KPC-2 no Brasil. 2008. (Encontro).
4. 2º Congreso Científico de Estudiantes de Tecnología Médica del Sur y IV Jornadas de Estudiantes de Tecnología Médica - Universidad de La Frontera.Evaluación del efecto de la suplementación oral con Monohidrato de Creatina sobre marcadores biológicos de salud, en adolescentes que practican deporte de alto rendimiento. 2005. (Congresso).
5. XII Congreso Chileno de Tecnología Médica. 2004. (Congresso).
6. XII Jornadas Multidisciplinarias de Medicina Interna. 2004. (Outra).
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Anexo 5. Ficha Aluno
Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Documento sem validade oficial
9136 - 5842691/1 - Mónica Alejandra Pavez Aguilar
Email: [email protected]
Data de Nascimento: 26/05/1983 Cédula de Identidade: RNE - V504287-L - DF Local Nascimento: Chile Nacionalidade: Chilena Graduação: Licenciado en Tecnologia Medica - Universidad de La Frontera - - Chile
– 2006
Curso: Mestrado em Farmácia Área: Análises Clínicas Data da Matrícula: 05/07/2007 Início da Contagem de Prazo: 05/07/2007 Data Limite: 05/01/2010 Orientador(es): Prof(a). Dr(a). Elsa Masae Mamizuka - 05/07/2007 a -- E.Mail:
[email protected] Proficiência em Línguas:
Exame de Qualificação: Aprovado em 05/02/2009 Data do Depósito do Trabalho:
Data máxima para aprovação da Banca: Título do Trabalho:
Data de Aprovação da Banca:
Data Máxima para Defesa:
Data da Defesa:
Resultado da Defesa:
Ocorrência: Última matrícula em 05/02/2009
Sigla Nome da Disciplina Início Término Carga Hor. Cred. Freq. Conc. Exc.
Sit. Matric.
FBC5757-1 Seminários em Análises Clínicas II 06/08/2007 18/11/2007 30 2 75.00 A N Concluída
FBC5717-4 Tópicos Avançados Sobre Imunoquímica de Antígenos
20/08/2007 10/09/2007 75 0 0.00 - N Matrícula cancelada
BMM5734-7 Genética de Microrganismos 01/10/2007 05/11/2007 150 10 100.00 A N Concluída
FBC5707-5 Infecção hospitalar: 05/11/2007 26/11/2007 75 5 100.00 A N Concluída
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recursos laboratoriais tradicionais e avançados na investigação, epidemiologia, profilaxia e controle
BMM5826-1
Análise crítica de métodos de detecção de expressão gênica em bactérias de interesse médico e odontológico
04/03/2008 08/04/2008 60 4 100.00 A N Concluída
FBC5793-8 Seminários em Análises Clínicas 11/03/2008 23/06/2008 30 2 80.00 A N Concluída
FBA5728-2 Aprimoramento Didático 06/05/2008 02/06/2008 60 4 100.00 A N Concluída
MIP5726-3
Avaliação de Sensibilidade aos Antimicrobianos e Caracterização Molecular dos Diferentes Mecanismos de Resistência
08/09/2008 28/09/2008 60 4 100.00 A N Concluída
Créditos mínimos exigidos Para Exame de Qualificação
Para Depósito de Dissertação/Tese Créditos obtidos
Disciplinas: 25 25 Disciplinas: 31 Atividades Programadas: 0 0 Atividades Programadas: 0 Seminários: 0 0 Seminários: 0 Estágios: 0 0 Estágios: 0 Total: 25 25 31
Créditos Atribuídos à Dissertação : 71
Conceito até 31/12/1996: A - Excelente, com direito a crédito; B - Bom, com direito a crédito; C - Regular, com direito a crédito; D - Insuficiente, sem direito a crédito; E - Reprovado, sem direito a crédito; I - Incompleto; J - Abandono
Justificado; T - Transferência.
Conceito a partir de 02/01/1997: A - Excelente, com direito a crédito; B - Bom, com direito a crédito; C - Regular, com direito a crédito; R -
Reprovado; T - Transferência.
Um(1) crédito equivale a (15) horas de atividade programada.
Situação em: 20/07/2009 19:41