Upload
ashari-rimo-mohpul
View
329
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
TES CA 19-9 DENGAN METODE ENZYME LINKED FLUORESCENT ASSAY
(ELFA)
Haerani Harun, Tenri Esa, Uleng Bahrun
Bagian Ilmu Patologi Klinik FK UNHAS RSUP DR Wahidin Sudirohusodo
I. PENDAHULUAN
Tumor Marker adalah substansi yang dihasilkan oleh sel kanker atau sel lain
dalam tubuh sebagai respon terhadap kanker atau keadaan non-kanker tertentu.
Umumnya tumor marker dihasilkan oleh sel normal seperti halnya sel kanker,
tapi kadarnya jauh lebih tinggi pada kanker. Tumor marker dapat ditemukan
pada darah, urine, feses, jaringan tumor atau jaringan lain juga pada cairan tubuh
pasien. Tumor marker lebih banyak merupakan protein, namun belakangan ini
pola ekspresi gen atau perubahan DNA juga mulai digunakan sebagai tumor
marker. Ada bermacam-macam tumor marker, beberapa tumor marker hanya
berhubungan dengan satu jenis kanker dan yang lain dapat ditemukan pada
banyak jenis kanker.1,2
Cancer antigen 19-9 (Ca 19-9) merupakan suatu antigen karbohidrat,
ditemukan sebagai suatu antibodi monoklonal IgG tikus yang muncul sebagai
reaksi terhadap sel karsinoma kolon manusia oleh Koprowsky dan kolega pada
tahun 1979. Cancer antigen 19-9 dideteksi awalnya pada jaringan kolorektal
tetapi ditemukan lebih banyak terdistribusi pada pankreas normal, lambung, dan
epitel biliar, dan juga pada serum pasien dengan karsinoma pankreas. 2-5
Antigen CA 19-9 (Sialyl Lewis a) mempunyai determinan normal yaitu
disialyl Lewis a yang dominan diekspresikan pada sel epitel normal organ
digestif sementara sialyl Lewis a diekspresikan pada sel kanker. Disialyl Lewis a
pada sel epitelial normal berperan sebagai ligand untuk reseptor immunosupresif
dan menjaga homeostasis imunologis dengan menekan aktivasi berlebihan
monosit dan makrofag pada membran mukosa organ digestif. Pada
karsinogenesis pembentukan disialyl Lewis a oleh α2,6 sialyltransferase yang
berikatan dengan dua residu asam sialyl tidak berlangsung sempurna dan hanya
membentuk membentuk monosialyl Lewis a oleh α2,3 sialyltransferase atau
Tutorial Imunologi 1
Tutorial Imunologi
sialyl Lewis a yang hanya memiliki satu ikatan residu asam sialyl sehingga
terjadi akumulasi sialyl Lewis a pada sel kanker.6
Pembentukan disialyl Lewis a dapat digambarkan sebagai berikut:
Lewis a α2,3 ST Sialyl Lewis a α2,6 ST Disialyl Lewis a
Pasien dengan Lewis negatif (Lea-b-) tidak dapat mengekspresikan antigen
CA 19-9 meskipun mengalami kanker saluran cerna karena tidak mempunyai
oligosakarida antigen Lewis yaitu asam sialyl yang diperlukan untuk membentuk
epitop CA 19-9. Kekurangan lain antigen CA 19-9 yaitu dapat meningkat pada
kelainan non-malignansi. Adanya antigen CA 19-9 dalam serum tidak spesifik
untuk kelainan malignansi dan dapat meningkat pada pasien dengan kelainan
non-malignansi. Karena itu hasil positif palsu dapat terjadi pada pasien kanker
yang disertai dengan kelainan benigna atau non-malignansi.6,7
Kondisi malignan yang dapat menyebabkan peningkatan kadar CA 19-9
antara lain Ca. Colorektal, Ca. Pankreas, Ca. Hepar, Ca. Paru dan Ca. Ovarium.
Peningkatan kadar CA 19-9 lebih dari 500 U/ml terjadi pada 50% pasien dengan
malignansi. Interval kadar CA 19-9 pada malignansi yaitu 40 – 10.000 U/ml.
Pada kaadaan benigna kadar CA 19-9 jarang meningkat lebih dari 200 U/ml.
Pada 69,7% keadaan benigna ditemukan kadar CA 19-9 meningkat kurang dari
100 U/ml. Interval kadar CA 19-9 pada keadaan benigna yaitu 40 - 331 U/ml.8
Gambar 1. Kadar CA 19-9 pada keadaan malignansi dan benigna(Sumber: http://www.searchgate.com )
Tutorial Imunologi 2
Tes CA 19-9 mempunyai sensitifitas 79 - 81 % dan spesifitas 82 - 90 % untuk
diagnosis kanker pankreas asimptomatik, tetapi tidak digunakan sebagai tes
skrining karena sensifitas dan spesifisitas tidak cukup akurat. Pengukuran kadar
CA 19-9 sebagai suatu faktor prognostik memberikan informasi berharga untuk
membantu membuat keputusan terapi terutama untuk ahli bedah. Tes CA 19-9
digunakan sebagai pemeriksaan tambahan untuk prognosis dan memonitor terapi
pada pasien yang didiagnosis dengan keganasan. Penurunan kadar CA 19-9
mengindikasikan suatu respon positif terhadap terapi dan prognosis yang baik.
Peningkatan kadar CA 19-9 yang konstan menggambarkan respon yang kurang
baik terhadap terapi. Pada evaluasi pasien dengan intervensi bedah, kadar
CA 19-9 preoperatif dan postoperatif telah digunakan untuk memperkirakan
hasil terapi pasien. 3,5,9,10
Cancer antigen 19-9 dapat ditemukan pada darah, urine, cairan peritoneal,
cairan kista, dan cairan amnion. Kadar CA 19-9 pada urine dapat diperiksa
dengan metode Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), untuk cairan
tubuh dapat diperiksa dengan metode Electrochemiluminescent immunoassay
(ECLIA). Kadar CA 19-9 pada darah dapat diperiksa dengan metode Enzyme
Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA) dan Enzyme
Linked Fluorescent Assay (ELFA). Enzyme Linked Fluorescent Assay
merupakan kombinasi metode ELISA dengan deteksi akhir fluoresen. Ada
beberapa fluorofor yang dewasa ini sering dipakai sebagai label dalam uji
imunoflouresen yaitu Fluorescein isothiocyanate, Rhodamine isothiocyanate,
Umbelliferone, Lanthanide Chelates.5,10-13 Pada tutorial ini akan dibahas
pemeriksaan CA 19-9 metode ELFA menggunakan Immunoanalyser automatik
Mini Vidas (BioMѐrieux)
II. TUJUAN
Mendeteksi kadar CA 19-9 secara kuantitatif dengan metode ELFA
Tutorial Imunologi 3
III. METODE
A. PRA ANALITIK10
1. Persiapan Pasien
Tidak ada persiapan khusus
2. Persiapan Sampel
Sampel serum atau plasma (heparin atau EDTA). Sampel dapat
disimpan pada suhu 2°C sampai 8 °C selama 48 jam, jika dibutuhkan
penyimpanan lebih lama sampel dapat dibekukan pada suhu -31°C
sampai -19°C hingga 2 bulan. Hindari penggunaan sampel hemolitik,
lipemik dan ikterik.
3. Alat dan Bahan
a. Alat Immunoanalyser Automatik Mini Vidas
b. Mikropipet dan tip
c. Vortex-type mixer
d. Kit Vidas CA 19-9
Tutorial Imunologi 4
Tabel 1. Isi kit Vidas CA 19-9
30 CA 19-9 strips STR Siap pakai
30 CA 19-9 SPRs
1x30
SPR Siap pakai
Interior SPR telah dilapisi dengan antibodi
mouse monoclonal 116-NS-19-9.
CA 19-9 Control
1x2 ml (liquid)
C1 Siap pakai
Bovine albumin + antigen reaktif 1116-
NS-19-9 (dari manusia) + 0,9 g/l sodium
azide
Confidence interval dalam U/ml terlihat
pada kartu MLE setelah muncul “Control
C1 Dose Value Range” pada layar
CA 19-9 Calibrator
1x2,5 ml (liquid)
S1 Siap pakai
Bovine albumin + antigen reaktif 1116-
NS-19-9 (dari manusia) + 0,9 g/l sodium
azide
Konsentrasi dalam U/ml terlihat pada kartu
MLE setelah disebutkan “Calibrator (S1)
Dose Value). Confidence interval pada
“Relative Fluorescence Value” terlihat
pada kartu MLE setelah muncul
“Calibrator (S1) RFV Range” pada layar
CA 19-9 Diluent
1x5 ml (liquid)
R1 Siap pakai
Serum manusia + 1 g/l sodium azide
1 kartu MLE Kartu spesifikasi yang mengandung data
kalibrasi master dari pabrik yang
dibutuhkan untuk kalibrasi
1 package insert
(Sumber : Biomerieux, packege insert Kit Vidas CA 19-9. Perancis. 2004)
1) Strip Reagen (STR)
Tutorial Imunologi 5
Gambar 2. Strip reagen dengan foil berlabel.(Sumber : Biomerieux, Prosedur manual Vidas CA 19-9. Perancis.
2008)Keterangan:
1. Barcode : Pada kondisi pengoperasian manual, pembaca
barcode internal membaca kode pada strip reagen.
2. Alfanumerik barcode : Jika sistem tidak dapat membaca
barcode, maka alfanumerik barcode digunakan untuk
memasukkan barcode.
3. Nama Pemeriksaan : Kode pemeriksaan berdasarkan karakter
atau huruf yang menggambarkan nama pemeriksaan.
4. ID : Tempat untuk menuliskan identitas sampel jika
dibutuhkan.
5. Kode Batch : Kode batch digunakan untuk mengkode tanggal
kadaluarsa lot reagen.
6. Tanggal kadaluarsa : Bila pembaca barcode membaca
tanggal ini, alat mini Vidas membandingkan dengan data
pada memori untuk memastikan lot reagen tidak melewati
tanggal kadaluarsa.
7. Nomor sequence : Pada tiap batch, tiap reagen strip memiliki
nomor yang berbeda sehubungan dengan tanggal
pembuatan.14
Setiap strip terdiri atas 10 sumur yang ditutupi foil
berlabel berisi barcode kode tes, nomor lot kit, dan tanggal
kadaluarsa. Foil pada sumur pertama dilubangi untuk
memasukkan sampel. Sumur pada bagian tengah mengandung
Tutorial Imunologi 6
berbagai reagen yang dibutuhkan untuk pemeriksaan. Sumur
yang terakhir merupakan kuvet yang memungkinkan terjadinya
pembacaan fluorometrik. Tab kecil pada bagian belakang
memastikan strip berada pada posisi yang benar.10,14
Tabel 2. Deskripsi reagen strip Ca 19-9.
Sumur Reagen
1 Sumur sampel
2-3-4 Sumur kosong
5 Konjugat : Antibodi 1116-NS-19-9 berlabel alkali fosfatase
(mouse) + 0,9 g/l sodium azide (400 µl)
6-7 Buffer pembilas : Tris (0.05 mol/l, pH 7,4) + 0,9 g/l sodium
azide (600 µl)
8 Diluent : Kalium fosfat (0,05 mol/l + horse serum (5%) + 0,9
g.l sodium azide (400 µl)
9 Buffer pembilas : Tris (0.05 mol/l, pH 7,4) + 0,9 g/l sodium
azide (600 µl)
10 Kuvet dengan substrat : 4-methyl-umbelliferyl phosphate
(0.6 mol/l) + diethanolamine (DEA) (0.62 mol/l atau
6.6%, pH 9.2) + 1 g/l sodium azide (300 µl)
(Sumber : Biomerieux, packege insert Kit Vidas CA 19-9. Perancis.
2004)
2) Solid Phase Receptacle (SPR)
Solid Phase Receptacle (SPR) berfungsi sebagai pipet pada
pemeriksaan ini. Bagian dalam SPR pada dilapisi dengan
antibodi mouse monoclonal 116-NS-19-9. Setiap SPR diberi
kode “199” dan dikeluarkan hanya sejumlah yang dibutuhkan
dari kemasan dan segera ditutup kembali dengan baik.10
Tutorial Imunologi 7
Immunoanalyser Mini Vidas Mikropipet dan tip Vortex-type Mixer
Kit Vidas Ca 19-9 Strip reagen SPR
Gambar 3. Alat dan bahan tes CA 19-9 dengan immunoanalyser Automatik Mini Vidas
(Sumber : http://www.londeran.com )
B. ANALITIK10
1. Prinsip Tes
Prinsip pemeriksaan ini merupakan kombinasi metode immunoassay
enzimatik sandwich dua langkah dengan deteksi akhir fluorosen
(ELFA) dengan langkah sebagai berikut (gambar 3):
Tutorial Imunologi 8
Gambar 4. Reaksi imunologis pada tes CA 19-9 metode ELFA(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)
a. Antibodi 1116-NS-19-9 yang terfiksasi pada dinding SPR
menangkap antigen reaktif yang terdapat pada sampel.
b. Komponen yang tidak terikat akan dikeluarkan selama fase
pembilasan.
c. Antibodi 1116-NS-19-9 berlabel alkali fosfatase (konjugat)
kemudian akan diinkubasi dalam SPR dan akan berikatan dengan
antigen reaktif 1116-NS-19-9.
d. Komponen yang tidak terikat akan dikeluarkan pada fase
pembilasan.
e. Substrat (4-methyl-umbelliferyl phosphate) dipipet keluar masuk
SPR. Enzim konjugat akan mengkatalisis proses hidrolisis substrat
ini menjadi produk fluoresen (4-methyl-umbeiliferone) dimana
fluoresen tersebut akan diukur pada panjang gelombang 450 nm.
Tutorial Imunologi 9
Intensitas fluorosen setara dengan konsentrasi antigen reaktif 1116-
NS-19-9 pada sampel
2. Cara Kerja10
a. Master lot data entry (MLE)
Master lot data entry (MLE) yang terdapat dalam tiap kit
dimasukkan sebelum reagen dengan lot baru digunakan. Master lot
data Entry (MLE) berisi spesifikasi data kurva kalibrasi. Jika
langkah ini tidak dilakukan sebelum memulai tes, maka alat tidak
dapat mencetak hasil.
Gambar 5. Master lot data entry(Sumber: http://www.biomerieux-usa.com )
b. Kalibrasi
Melakukan kalibrasi dengan kalibrator (S1) yang terdapat pada kit
harus dilakukan setiap menggunakan reagen dengan lot baru dan
setelah memasukkan master lot data. Kalibrasi seharusnya dilakukan
setiap 14 hari dan harus selalu dicek hasilnya dengan kontrol.
c. Kontrol
Kontrol kualitas harus dilakukan segera setelah kit baru dibuka untuk
meyakinkan kualitas reagen tidak berubah. Kontrol tidak dapat
divalidasi jika nilainya keluar dari nilai yang diharapkan.
d. Langkah kerja
Secara skematis tes Ca 19-9 berlangsung sebagai berikut (gambar 6):
Tutorial Imunologi 10
Gambar 6. Proses pada tes Ca 19-9 metode ELFA(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)
1) Strip reagen dan SPR yang dibutuhkan dikeluarkan dari lemari es
dan didiamkan pada suhu ruangan minimal 30 menit.
2) Satu strip dan SPR CA 19-9 digunakan untuk tiap satu sampel,
kontrol dan kalibrator dari tes yang akan diperiksa. Pastikan
kemasan kembali ditutup setelah SPR yang dibutuhkan
dikeluarkan. Memilih “199” pada alat untuk masuk pada kode tes.
Kalibrator harus ditandai sebagai “S1” dan dites dengan cara
duplikat. Jika kontrol akan dites, maka ditandai dengan “C1”
3) Sampel dapat disentrifus jika perlu
4) Kalibrator dan kontrol dihomogenkan menggunakan vortex-type
mixer.
5) Sampel, kalibrator atau kontrol dipipet sebanyak 200 µl ke sumur
sampel.
6) SPR dan strip CA 19-9 dimasukkan ke alat. Warna label dan kode
pemeriksaan strip dan SPR dipastikan sesuai.
7) Data pasien dan pemeriksaan yang akan dilakukan dimasukkan
sesuai posisi sampel pada monitor.
8) “Start” ditekan dan pemeriksaan akan dilakukan secara ototmatis
oleh alat. Pemeriksaan selesai dalam waktu kurang lebih 60 menit.
Proses kerja automatis digambarkan sebagai berikut:
Tutorial Imunologi 11
Gambar 7. Proses kerja automatis pada SPR dan strip reagen Mini Vidas(Sumber: modifikasi dari http://www.procalcitonin.com)
9) Hasil akan keluar dalam bentuk print out
10) Setelah pemeriksaan selesai, SPR dan strip dikeluarkan dari alat
dan dibuang pada tempat yang telah disediakan.
11) Sampel dengan kadar CA 19-9 lebih dari 500 U/ml harus diperiksa
kembali dan diencerkan dengan diluent (R1). Faktor pengenceran
dimasukkan pada worklist sebelum memulai tes. Jika faktor
pengenceran tidak dimasukkan pada worklist maka hasil tes
dikalikan dengan faktor pengenceran untuk memperoleh
konsentrasi CA 19-9 pada sampel.
Langkah kerja digambarkan pada gambar 8.
Tutorial Imunologi 12
1 2 3
4 5 6
7 8 9
10
Gambar 8. Langkah kerja tes CA 19-9 dengan alat Mini Vidas
C. PASCA ANALITIK
Nilai rujukan: < 37 U/ml
Interpretasi:
CA 19-9 dapat meningkat pada Ca. kolorektal, Ca. Pankreas, dan
kanker lain pada traktus digestivus seperti duktus biliaris dan lambung.
Tutorial Imunologi 13
Dapat juga meningkat pada keadaan non-malignansi seperti penyakit tiroid,
artritis reumatoid, infeksi kandung kemih dan pankreatitis.1,9
Kadar CA 19-9 pada keganasan pankreas dapat memberikan
informasi prognostik. Kadar CA 19-9 pada serum < 37 U/ml mempunyai
perpanjangan masa hidup 32 - 36 bulan dan pasien dengan kadar CA 19-9 >
37 U/ml mempunyai perpanjangan masa hidup 12-15 bulan.4
Pemeriksaan CA 19-9 digunakan sebagai pemeriksaan tambahan
untuk prognosis dan memonitor terapi pada pasien yang didiagnosis dengan
keganasan. Penurunan kadar CA 19-9 mengindikasikan suatu respon positif
terhadap terapi dan prognosis yang baik. Peningkatan kadar CA 19-9 yang
konstan menggambarkan respon yang kurang terhadap terapi. 10
D. Keterbatasan Pemeriksaan CA 19-9
Cancer antigen 19-9 tidak dianjurkan untuk skrining dan diagnosis
penyakit karena sensivitas dan spesifitas yang tidak cukup adekuat. Sekitar
5-10% populasi dengan fenotipe darah Lewis negatif tidak dapat
membentuk antigen CA 19-9 walaupun menderita Ca Pankreas sehingga
didapatkan hasil negatif palsu. Hasil positif palsu dapat ditemukan pada
pasien Ca Pankreas yang disertai kelainan non-malignansi.4,5
Keterbatasan pemeriksaan CA 19-9 dengan metode ELFA (Mini
Vidas) yaitu dapat terjadi peningkatan atau penurunan palsu kadar CA 19-9
karena adanya human anti-mouse antibodies (HAMA) saat diperiksa dengan
menggunakan kit yang mengandung mouse antibodies. Serum yang
mengandung antibodi terhadap komponen reagen juga dapat mempengaruhi
hasil pemeriksaan. Metode lain yang menggunakan antibodi selain 1116-
NS-19-9 dapat memberikan hasil yang berbeda.10
DAFTAR PUSTAKA
1. American Cancer Society. Tumor Markers. 2012. Available at
http://www.cancer.gov. Accessed on December 15th 2012.
Tutorial Imunologi 14
2. National Cancer Institute. Tumor markers. Available at
http://www.cancer.gov. Accessed on March 20th 2013
3. Rückert F, Pilarsky C, Grützmann R. Serum Tumor Markers in Pancreatic
Cancer – Recent Discoveries. 2010. Cancers 2010, 2, 1107-24
4. Ballehaninna UK, Chamberlain RS. The Clinical Utility of serum CA 19-9
gin the diagnosis, prognosis and management of Pancreatic Adenocarcinoma:
J Gastrointest Oncol 2012; 3(2):105-19.
5. Locker G Y, Hamilton S, et al. ASCO 2006 Update of recomendation for The
Usa of Tumor Markers in Gastrointestinal Cancer. JCO 2006; 24: 5313-27
6. Kannagi Reiji, Carbohydrate Antigen Sialyl Lewis a – Its Pathophysiologycal
Significance and Induction in Cancer prograssion. Chang Gung Med J 2007;
3: 189-207.
7. Tian F, Appert H E, et al. Prognostic value of serum Ca 19-9 Levels in
Pancreacitic Adenocarcinoma. Ann. Surg. 1992; 215: 350-5.
8. Pavai S, Yap SF, FRCPath. The Clinical Significance of Elevated levels of
serum CA 19-9. Med J Malaysia. 2003; 58: 667-71.
9. Hardjoeno H, dkk. Tumor Marker. Interpretasi Hasil tes Laboratorium
Diagnostik, bagian dari standar pelayanan medik. Makassar: Lephas. 2012:
422
10. Biomerieux, packege insert Kit Vidas Ca 19-9. Perancis. 2004
11. Inaudi P, Pasqui L, Torre GC, et al. CA 125 and CA 19-9 in Peritoneal, cyst
and amniotic fluids. Med Oncol Tumor Pharmacother, 1988; 5(4): 233-8.
12. Pal K, Roy S, Mondal SA. Et al. Urinary level of CA 19-9 as Tumor Marker
in Urothelial Carcinoma of the Bladder. Urology Journal. 2011; 8((3): 203-7.
13. Hardojo I. Pengantar Imunoasai Dasar. Surabaya: Pusat Penerbitan dan
Percetakan Unair (AUP). 2003: 47.
14. Biomerieux, Prosedur manual Vidas Ca 19-9. Perancis. 2008.
Tutorial Imunologi 15