TEMATSKI BROJ - MEDICINSKA GENETIKA MEDICINSKA GENETIKAbib.irb.hr/datoteka/318376.Medicina_-_Medicinska_genetika_4-2004.… · MEDICINSKA GENETIKA. 242 THEMATIC EDITION – MEDICAL

M. Kapovi}Uvodna rije~ 245

PREGLEDNI RADOVIJ. Vranekovi} Primjena tehnika molekularne citogenetike u detekciji kromosomskih promjena 247S. Ostoji}, B. PeterlinGeneti~ki ~imbenici u etiologiji u~estalih spontanih poba~aja 256

IZVORNI RADOVIN. Star~evi} îzmarevi}, S. Mili}, S. Risti}, D. [timac, M. Kapovi} Mutacije gena za hemokromatozu u bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljeza 265S. Risti}, N. Star~evi}-îzmarevi}, J. Sep~i}, J. Rude`, M. Crni}-Martinovi}, V. Barac-Latas, M. Kapovi}Polimorfizam 4G/5G u promotorskoj regiji gena za inhibitor aktivatora plazminogena-1 kao rizi~ni ~imbenik u multiploj sklerozi 271

STRU^NI RADOVIB. Brajenovi}-Mili}, J. Vranekovi}, O. Petrovi}, J. Masov~i}, A. Frkovi}, D. Pave{i}, H. Haller, M. Kapovi}Prenatalna dijagnostika – na{a iskustva 276A. Bureti}-Tomljanovi}, I. Vlasteli}, Lj. Randi}, M. Kapovi}, A. Radoj~i} BadovinacMikrodelecije Y-kromosoma u mu{karaca smanjene reproduktivne sposobnosti 281

PRIKAZ SLUÂJEVAJ. Vranekovi}, B. Brajenovi}-Mili}, Z. Modru{an-Mozeti~, M. Kapovi}De novo balansirana recipro~na translokacija: prikaz dva slu~aja 286V. Flego, Z. Beg-Zec, D. Matani}, D. Vukas, S. Cvitanovi}, A. Radoj~i} BadovinacIntratorakalni lipom u bolesnice s familijarnom multiplom lipomatozom 290

KLINI^KE SMJERNICEB. Brajenovi}-Mili}Invazivne i neinvazivne metode prenatalne dijagnostike 295

TEMATSKI RADOVIA. Radoj~i} BadovinacPoreme}aji plodnosti uzrokovani kromosomskim aberacijama 301N. Star~evi}-îzmarevi}, A. Bureti}-Tomljanovi}, S. Ostoji}, M. Kapovi}Citogeneti~ka analiza kromosomskih aberacija u osoba profesionalno izloènih ioniziraju}em zra~enju 305I. Medica, M. Balaban, I. Prpi}, S. Zaputovi}, S. Ostoji}, M. Kapovi}, H. Haller, B. PeterlinMutacije u genu GJB2/CONNEXIN 26 kao naj~e{}i uzrok oslabljenog sluha 310

TEMATSKI BROJ - MEDICINSKA GENETIKA

Gost urednik: Miljenko Kapovi}

MEDICINSKA GENETIKA

242

THEMATIC EDITION – MEDICAL GENETICSGuest editor: Miljenko Kapovi}

M. Kapovi}Foreword by guest editor 245

REVIEWS

J. Vranekovi}Molecular Biology Techniques in Detection of Chromosome Changes 247

S. Ostoji}, B. PeterlinGenetic Factors in Etiology of Recurrent Spontaneous Abortion 256

ORIGINAL PAPERS

N. Star~evi} îzmarevi}, S. Mili}, S. Risti}, D. [timac, M. Kapovi}Hemochromatosis Gene Mutations in Patients with Elevated Serum Iron 265

S. Risti}, N. Star~evi}-îzmarevi}, J. Sep~i}, J. Rude`, M. Crni}-Martinovi}, V. Barac-Latas, M. Kapovi}4G/5G Polymorphism in Promoter Region of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Gene as Risk Factor in Multiple Sclerosis 271

PROFESSIONAL PAPERS

B. Brajenovi}-Mili}, J. Vranekovi}, O. Petrovi}, J. Masov~i}, A. Frkovi}, D. Pave{i}, H. Haller, M. Kapovi}Prenatal Diagnostics – Our Experiences 276

A. Bureti}-Tomljanovi}, I. Vlasteli}, Lj. Randi}, M. Kapovi}, A. Radoj~i} BadovinacY Chromosome Microdeletions in Subfertile Men 281

CASE REPORTS

J. Vranekovi}, B. Brajenovi}-Mili}, Z. Modru{an-Mozeti~, M. Kapovi}De Novo Balanced Reciprocal Translocation: Two Cases 286

V. Flego, Z. Beg-Zec, D. Matani}, D. Vukas, S. Cvitanovi}, A. Radoj~i} BadovinacIntrathoracic Lipoma in Patient with Familial Multiple Lipomatosis 290

CLINICAL GUIDELINES

B. Brajenovi}-Mili}Invasive and Non-invasive Methods of Prenatal Diagnostics 295

MAIN TOPICS

A. Radoj~i} BadovinacDefective Reproductive Success Caused by Chromosome Aberrations 301

N. Star~evi}-îzmarevi}, A. Bureti}-Tomljanovi}, S. Ostoji}, M. Kapovi}Cytogenetic Analysis of Chromosomal Aberrations in People Professionally Exposed to Ionising Radiation 305

I. Medica, M. Balaban, I. Prpi}, S. Zaputovi}, S. Ostoji}, M. Kapovi}, H. Haller, B. PeterlinMutations in Gene GJB2/Connexin 26 as the Most Frequent Cause of Impaired Hearing 310

Glasilo Hrvatskoga lije~ni~kog zbora –Podru`nica Rijeka

The Journal of the Croatian MedicalAssociation – Rijeka Branch

Godina utemeljenja 1964. – Foundedin 1964

SAVJET – ADVISORY BOARD:Predsjednik – President: D. Vukas

^lanovi – Members: V. Ahel, M. Badurina, D. Barkovi}, M. Biondi}, Z. Braut, N. Brn~i},A. Depolo, A. Frkovi}, F. Gjuran, M. Gligora,F. Gruber, M. Gudelj, P. Gregorevi}-Kesovija,M. Kri`, V. Novak, \. Pahor, I. Prebili}, M. Ragus, Lj. Randi}, V. Per{i}, M. Rubini}, @. Sesar, N. [tigli}-Rogoznica, L. Tu{kan--Mohar, F. Zeidler, I. Zubovi}

UREDNI^KI ODBOR – EDITORIALBOARD:@. Jovanovi}, M. Kabalin, V. Mozeti~, D. Pe-tranovi}, I. Prebili}, D. Stojanovi}, A. [krobo-nja, P. Valkovi}

Glavni i odgovorni urednici – Editors-in-chief: I. Prpi}, V. Vlahovi}-Pal~evski

Pomo}nik urednika za internetsko izdanje –Assistant editor for internet edition: I. Prebili}

Poslovna tajnica – Secretary: Astrid Deren~i-novi}

Lektorica i korektorica za hrvatski jezik –Croatian Language Revision: G. O`bolt

Lektorica i korektorica za engleski jezik –English Language Revision: T. Dunatov

Izdava~ – Publisher: Hrvatski lije~ni~ki zbor –Podru`nica Rijeka, Kre{imirova 52a/V, HR-51001 Rijeka, p.p. 227; tel./faks: 051 334 542;e-mail: [email protected]

Organizacija – Organisation: “Grad”, Rijeka

Tisak – Printed by: Zambelli, Rijeka

Naklada – Edition: 1300 primjeraka

âsopis je indeksiran u EMBASE – TheExcerpta Medica database

^lanovima Hrvatskoga lije~ni~kog zbora –Podru`nica Rijeka ~asopis se dostavljabesplatno.

@irora~un: 2360000-1400145092

Izdavanje ~asopisa potpomogli su GradRijeka, Primorsko-goranska ùpanija iHrvatski lije~ni~ki sindikat – Podru`nicaRijeka

http://i-medicina.net

CONTENTS

Po{tovane kolegice i po{tovani kolege,

Pred vama je ~etvrti broj Medicine u 2004. godini. Iznimno nasveseli {to Medicina redovito izlazi kvartalno i tako upotpunjujehrvatsku medicinsku periodiku. Informacije koje dobivamoohrabruju nas da nastavimo s ovom ure|iva~kom politikom,objavljuju}i tematske brojeve. @elimo vam skrenuti pozornost nato da su svi brojevi Medicine u cijelosti dostupni i na na{oj web-stranici: i-medicina.net

Ovaj je broj posve}en medicinskoj genetici. U doba otkrivanjaljudskoga genoma i “kloniranja ~ovjeka”, opse`nih mogu}nostiprenatalne dijagnostike, razvoja suvremenih i sofisticiranih tehni-ka molekularne dijagnostike, vjerujemo da navedena temazavre|uje posebnu pa`nju.

S ponosom isti~emo da su objavljeni radovi rezultat istraìva-nja, znanstvenog i stru~nog, na{ih kolega – lije~nika i biologa, bezkojih se suvremena medicinska genetika ne moè zamisliti. Iakonisu u izravnom dodiru s oboljelima, njihov je rad usko povezansa svakodnevnom klini~kom medicinom, a njihov savjetbolesniku ili preporuka lije~niku uvelike pomaù u dijagnozi iprognozi odre|enih poreme}aja ili bolesti. Stoga se, ~itaju}i ovajbroj Medicine, upoznajete sa svime onime {to je dostupno napolju medicinske genetike u na{oj sredini, a bogata me|unarod-na suradnja na{ih kolega omogu}uje i mnogo vi{e.

Na kraju, uz neizostavan poziv na suradnju, svim ~itateljimaèlimo puno uspjeha, profesionalnog i osobnog, u 2005. godini.

Glavni uredniciIgor Prpi} i Vera Vlahovi}-Pal~evski

243

Vrijeme u kojem ìvimo i radimo obiluje novim znanji-ma, gomilanjem podataka te sve kvalitetnijom i bròmizmjenom informacija. Pratiti i znati sve novosti naprostonije mogu}e. Stoga se kao nikada do sada nalaè potre-ba za prisnijom suradnjom stru~njaka razli~itih specijal-nosti o istoj ili sli~noj problematici. U podru~ju biome-dicinske djelatnosti, mo`da ponajvi{e. Toliko novih pris-tupa u dijagnostici i terapiji naprosto traì zajedni~kodjelovanje znanstvenika i stru~njaka, teoreti~ara i prak-ti~ara.

Na Zavodu za biologiju i medicinsku genetiku Medi-cinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Rijeci prepoznaju setakve potrebe za suradnjom i primjenom ste~enih zna-nja. Godinama se trudimo biti na usluzi struci i pacijenti-ma modernijim dijagnosti~kim pristupima i geneti~kimsavjetovanjem. Novim pristupima dijagnostike iz podru~jacitogenetike i molekularne genetike, odnosno medi-cinske genetike u cjelini, otvorili smo suradnju s medi-cinskom strukom na svim razinama. Tradicija je Zavodaprenatalna i postnatalna citogenetska dijagnostika.Pra}enjem kromosomskih aberacija potvr|ujemouzroke neplodnosti ili pak mutagene u~inke ionizira-ju}ih zra~enja.

U nekoliko pojedinih radova, izvornih znanstvenih istru~nih radova te prikaza slu~ajeva, klini~kih smjernicai tematskih radova uputit }e se na mogu}e oblike surad-nje koji se trenuta~no izvode ili bi se mogli otvoriti.Osobno, zalaù}i se za primijenjene oblike znanja,poti~em ovakve oblike suradnje u visokostru~nom radu.Na korist je to, prije svega, kolegama na klinici u razli-~itim specijalisti~kim ambulantama pa i ordinacijamaop}e prakse. Daje im ve}u sigurnost i to~nost u diferen-cijalno-dijagnosti~kim pristupima. Prije se mogu odlu-~iti za odre|ene oblike zbrinjavanja uo~enih promjena iterapiji. Otvaraju se mogu}nosti za dodatne razgovore isavjetovanja s medicinskim geneti~arom. Tako i pacijentvi{e doznaje o svom stanju i lak{e odlu~uje o svojoj sud-bini. Kona~no, mo`da i najva`nije, mladi ljudi, na{i stu-denti, na vrijeme spoznaju za{to ne{to u~e, za{to je takonu`na suradnja izme|u stru~njaka iz razli~itih podru~jaznanja, da bi se do{lo do kvalitetnijih i preciznijihpodataka o nastalim promjenama. Podu~imo ih da jesmisao traènja novog pretakanje u primjenu, a to paknalaè jo{ prisniju suradnju znanosti i struke.

Prof. dr. sc. Miljenko Kapovi}

245

TEMATSKI BROJ

MEDICINSKA GENETIKA

Gost urednik: Miljenko Kapovi}

UVODNA RIJE^

SA@ETAK

Krajem pro{loga stolje}a humana je citogenetika uvo|enjem tehnikamolekularne biologije doìvjela velik napredak, ~ime je omogu}enrazvoj molekularne citogenetike. Metode kao {to su fluorescentna insitu hibridizacija (FISH), vi{ebojna kariotipizacija (M-FISH, SKY,RXFISH) i komparativna hibridizacija genoma (CGH) rije{ile sunedostatke klasi~nih metoda citogenetike, kojima se ~esto nije mogaoprecizno opisati kariotip. Klini~ka primjena ovih metoda va`na je udijagnostici numeri~kih i strukturnih promjena kromosoma kao {to sutrisomije, mikrodelecije, subtelomerne translokacije, te u identifikacijipodrijetla marker-kromosoma i promjena gena u tumorskim stanica-ma.

KLJU^NE RIJEÎ: FISH, M-FISH, SKY, CGH, PRINS

ABSTRACT

By the end of last century, human cytogenetics experienced a remark-able progress by applying molecular biology techniques to the con-ventional chromosome analysis, and, in that way, a new discipline wasestablished – molecular cytogenetics. The limitations of the conven-tional banding analysis in the accurate karyotyping and interpretationof certain chromosome abnormalities were largely overcome by thesenew technologies, such as, fluorescence in situ hybridisation (FISH),multicolour FISH (M-FISH, SKY, RXFISH) and comparative genomichybridisation (CGH). The clinical applications include the diagnosis ofnumerical and structural aberrations (trisomy, microdeletion, sub-telomeric translocations), as well as the identification of marker chro-mosomes and gene rearrangements in tumours.

KEY WORDS: FISH, M-FISH, SKY, CGH, PRINS

Pregledni rad Medicina 2004;42(40):247-255Review UDK: 575.113

577.212

PRIMJENA TEHNIKA MOLEKULARNE CITOGENETIKE U DETEKCIJIKROMOSOMSKIH PROMJENA

MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES IN DETECTION OF CHROMOSOME CHANGES

Jadranka Vranekovi}

Ustanova: Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci

Prispjelo: 24. 4. 2 004.Prihva}eno: 10. 5. 2004.

Adresa za dopisivanje: Mr. sc. Jadranka Vranekovi}, prof. biol/kem., Zavod zabiologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, Bra}eBranchetta 20, 51000 Rijeka.Tel. 051651131. e-mail: [email protected]

postignu}ima i standardizaciji kultiviranja tkiva ipripreme kromosomskih preparata, zapo~eo intenzivanrazvoj citogenetike. Daljnji napredak tehnologijeomogu}io je identifikaciju pojedina~nih kromosoma injihovu povezanost s odre|enim bolestima. Tako je1956. godine otkriven Downov (DS), Patauov (PS) iEdwardsov sindrom (ES).6 Otkrivene su i promjene ubroju spolnih kromosoma, koje se povezuju sa speci-fi~nom klini~kom slikom kao {to je to slu~aj kodTurnerova i Klinefelterova sindroma.3 Napredaktehnologije omogu}io je razvoj tehnika oprugavanjakromosoma, ~ime je zapo~elo novo razdoblje uhumanoj citogenetici, razdoblje oprugavanja.7 Svakikromosom ima specifi~an slijed pruga, prema kojima semogu razlikovati, a to je omogu}ilo detekciju struk-turnih promjena na kromosomima. Najra{irenija jemetoda oprugavanja kromosoma GTG-metoda (engl. –

UVOD

Prva saznanja o humanim kromosomima potje~u izdavne 1880. godine, a vezana su uz radove Fleminga iArnolda. No tek su 1956., ~ak tri godine nakon otkri}astrukture DNA-molekule, Tijo i Levan ustanovili to~anbroj humanih kromosoma, koriste}i se kulturom stanicafetalnih plu}a.1 Iste godine Ford i Hamerton izbrojili suu spermatocitama ~ovjeka 23 bivalenata. Obje grupepotvrdile su da je diploidan broj kromosoma u humanimstanicama 46.2 Tim je otkri}em, zahvaljuju}i tehni~kim

247

G-bands by trypsin using Giemsa) ili G-pruge, kod kojese kromosomski preparati tretiraju enzimom tripsinom iboje nefluorescentnom bojom – Giemsom. Poznate su idruge metode oprugavanja kromosoma kao {to su:QFQ-metoda, RHG-metoda te CBG-metoda. Tehnikeoprugavanja stalno se unapre|uju kako bi se pove}aobroj vidljivih pruga, ~ime se pove}ava i senzitivnostdetekcije kromosomskih promjena. Najmanji broj prugana metafaznom kromosomu, dobivenih GTG-metodomoprugavanja, iznosi 400. Visokorezolutnom tehnikomna metafaznom se kromosomu moè dobiti od 500 do550 pruga. Broj pruga na profaznom ili prometafaznomkromosomu doseè ~ak 850 i vi{e.2 Te metode ~estonisu dovoljno informativne pa se za potpunu i preciznuanalizu kromosoma mora primijeniti jedna ili vi{e tehni-ka molekularne citogenetike. Najmla|e je razdoblje urazvoju citogenetike molekularno razdoblje koje jezapo~elo prije dvadesetak godina zahvaljuju}i razvojutehnika molekularne biologije, koje su svoju primjenuna{le i u ovoj grani genetike. Kombinacija tehnikaklasi~ne citogenetike i molekularne genetike dovela jedo razvoja nove grane nazvane molekularna citogeneti-ka. Brojne njezine tehnike postale su neizostavni dio i upodru~ju klini~ke citogenetike i u podru~jima cito-genetike tumora, mapiranja gena te analizi evolucijekariotipa.3 Sve se vi{e postavlja pitanje jesu li tehnikemolekularne citogenetike zamjena za klasi~ne tehnikecitogenetike ili tek njihova nadopuna. Sasvim sigurno,radi se o nadopuni jer citogeneti~ka analiza u okviruprenatalne i postnatalne dijagnostike uvijek zapo~injeprimjenom jedne od klasi~nih metoda identifikacije kro-mosoma.

TEHNIKE MOLEKULARNE CITOGENETIKE

In situ hibridizacija

Metoda in situ hibridizacije (ISH, engl. – In situhybridization) kombinacija je citogeneti~kih i moleku-larnih tehnika, koja omogu}uje detekciju kromosoma ipromjena koje se na njima mogu dogoditi. ISH se temeljina interakciji obiljeène jednolan~ane DNA- ili RNA--molekule odre|enog slijeda nukleotida s komplemen-tarnim slijedom jednolan~ane ciljne DNA na metafaznimkromosomima ili u interfaznoj jezgri.2 ISH u originalurazvili su 1969. godine Pardue i Gall8 neovisno o trojicidrugih znanstvenika – Johnu, Birnstielu i Jonesu – kojisu tako|er razvijali tu metodu i iste godine objavili rad osvojim rezultatima.9 Nukleinske su se kiseline u to vri-jeme mogle obiljeìti jedino upotrebom radioaktivnihizotopa, a detekcija je bila mogu}a isklju~ivo autoradi-ografski. ISH je bio ograni~en na one sljedove baza kojisu se mogli izolirati i pro~istiti konvencionalnimbiokemijskim metodama. Molekularno kloniranje nuk-

leinskih kiselina i pobolj{anje metoda radioaktivnogobiljeàvanja omogu}ili su detekciju redoslijeda nuk-leotida veli~ine i do nekoliko stotina parova baza nametafaznim kromosomima.10-12 Unato~ visokoj senzi-tivnosti i primjenjivosti metode, ISH se nije pro{irio naklini~ke laboratorije nego se primjenjivao u istraì-va~kim laboratorijma. Glavni je razlog tome rad s radio-aktivnim materijalom te mjerama sigurnosti koje se utom slu~aju moraju primijeniti {to, nesumnjivo, poskup-ljuje i sam proces.

Fluorescentna in situ hibridizacija

In situ hibridizacija pri kojoj se upotrebljavaju nera-dioaktivne florescentne boje za obiljeàvanje slijedabaza u DNA-sondi, poznata je pod imenom fluorescent-na in situ hibridizacija (FISH).2 Osnovni princip detek-cije ciljne DNA-molekule s obiljeènom sondom, isti jekao kod izvorne metode. Razlika je u na~inu obilje-àvanja sondi. DNA-molekula koja sluì kao sonda, obil-jeàva se direktno s pomo}u fluorescentnih boja ili indi-rektno s pomo}u haptena (biotin) naj~e{}e vezanih zadeoksiuraciltrifosfate (dUTP) koji se inkorporiraju uDNA-molekulu enzimatskim reakcijama kao {to sumetoda pomicanja usjeka (engl. – nick-translation) ililan~ana reakcija polimerazom (engl. – polymerase chainreaction – PCR). Za detekciju indirektno obiljeènihsondi upotrebljavaju se fluorescentno obiljeèna antiti-jela (avidin-Cy3). Fluorescencija ima mnoge prednostinad autoradiografijom, a jedna je od njih ta {to moèistodobno detektirati nekoliko razli~itih ciljnih dijelovaDNA-molekule upotrebom razli~itih fluorescentnihboja, a sam je signal puno ve}i i bolji nego kod ISH-a.Detekcija signala mogu}a je upotrebom fluorescentnogmikroskopa s odgovaraju}im filterima, digitalnomkamerom te odgovaraju}om kompjutorskom program-skom podr{kom.13-15 Metoda fluorescentne in situ hib-ridizacije primjenjuje se na kromosomske preparatepripremljene standardnim citogeneti~kim metodamaodnosno kultivacijom razli~itih stanica kao {to su: lim-fociti periferne krvi, stanice ko{tane srì, stanice koè ilibukalne sluznice te ostalih tkiva13,14,16 (slika 1.). U pre-natalnoj dijagnostici FISH se primjenjuje na kromo-somske preparate dobivene kultivacijom stanica plodadobivenih biopsijom korionskih resica, amniocentezomili kordocentezom. Za potrebe preimplantacijske dijag-nostike koriste se polarna tjele{ca ili stanice ranogembrija (blastomere).17 Dok je za metode klasi~ne cito-genetike nu`na kultivacija stanica, FISH se moè prim-jenjivati i na nekultiviranim stanicama, odnosno nainterfaznoj jezgri. Prve ekperimente koji to dokazujunapravio je 1986. godine Pinkel sa svojim suradnicima.18

Oni su pokazali da svaki kromosom zauzima odre|enomjesto u interfaznoj jezgri te da ih je mogu}e u njoj idetektirati koriste}i se sondom za cijeli kromosom.

J. Vranekovi} PRIMJENA TEHNIKA MOLEKULARNE CITOGENETIKE U DETEKCIJI KROMOSOMSKIH PROMJENA Medicina 2004;42(40):247-255

248

Nakon njihova otkri}a zapo~ela je detekcija numeri~kihi strukturnih promjena kromosoma metodom fluores-centne in situ hibridizacije ne samo na metafaznim kro-mosomima ve} i u interfaznim jezgrama19,20 (slika 2.).Nekultivirane stanice s interfaznim jezgrama (npr.amniociti) upotrebljavaju se za potrebe brze detekcije(24 do 48 sati) naj~e{}ih aneuploidija u ljudi, a to su tri-somije 13, 18, 21 kao i X- i Y-kromosoma.21,22 Upotre-bom sondi za navedene aneuploidije, ne mogu seistodobno detektirati i ostale mogu}e numeri~ke i struk-turne promjene kromosoma. Zbog tih su razloga za pot-punu analizu kromosoma potrebne i klasi~ne metodecitogenetike. FISH se uspje{no nadopunjuje metodamaklasi~ne citogenetike pri detekciji kompleksnih struk-turnih promjena kromosoma, koje su vrlo ~este u stani-cama tumora.23 Ova metoda ima veliku va`nost i udetekciji mikrodelecija, identifikaciji marker-kromoso-ma, karakterizaciji strukturnih promjena i analizi gen-skih promjena.

DNA-sonde

Tri su glavne kategorije DNA-molekule koje se upotreb-ljavaju kao sonde u FISH-u: centromerne sonde (engl. –centromere specific probes), sonde za cijeli kromosom

ili dio kromosoma (engl. – whole/partial chromosomepaint probes-WCP/PCP) i sonde za mala specifi~napodru~ja eukromatina (engl. – single copy ili uniquesequence probes).13,14

Centromerne sonde

Centromerne sonde sadrè kratke, uzastopno ponavlja-ju}e sljedove nukleotida tvz. satelitne DNA, koje nekodiraju genske produkte. Svaka individua ima razli~itbroj kopija satelitne DNA-molekule. Alfa-satelitnu DNA~ine monomeri veli~ine oko 170 bp, koji se uzastopceponavljaju vi{e puta. Gotovo u svim humanim kromo-somima ta je vrsta ponavljaju}e DNA-sekvencije iden-ti~na, ali je oko 2%–3% specifi~na za svaki pojedini kro-mosom pa se na temelju toga mogu razlikovati. Iznimkasu kromosomi 13 i 21 te 14 i 22, koji pokazuju velikuhomologiju u gra|i α-satelitne DNA-molekule pa je tomvrstom sondi nemogu}e razlikovati te kromosome. Tavrsta sondi daje vrlo jasan i intenzivan signal i nametafaznim kromosomima i u interfaznoj jezgri. Jasansignal posljedica je same veli~ine ciljne DNA ~iji se slje-dovi ponavljaju vi{e puta14. Stoga je primjena tih sondivrlo pogodna za detekciju promjena u broju kromoso-ma.13,15


249

Slika 1. FISH na metafaznim kromosomima sa sondma zacijeli kromosom 18 (WCP 18) (zeleni signal) i za cijeli kromo-som 20 te terminalni dio dugog kraka kromosoma 17q (WCP20) (crveni signal)

Figure 1 FISH on metaphase chromosomes with the wholechromosome probes 18 (WCP 18) (green signal) and for thewhole chromosome 20 and the terminal part of the secondextension of the chromosome 17q (WCP) 20) (red signal)

Slika 2. FISH na interfaznoj jezgri sa sondama za kromosom13 (zeleni signal) i za kromosom 21 (crveni signal) Izvor: http://members.aol.com/chrominfo/intfish.htm

Figure 2 Fish on the interphase nucleus with probes for chro-mosome 13 (green signal) an for chromosome 21 (red signal)Source: http://members.aol.com/chrominfo/intfish.htm

Sonde za cijeli kromosom ili za dio kromosoma

Sonde za cijeli kromosom ili za dio kromosoma sastav-ljene su od specifi~nih i ponavljaju}ih sljedova kojipotje~u od cijelog kromosoma ili samo jednog dijelakromosoma pa je prema tome i fluorescentni signalvidljiv du` kromosoma ili samo jednoga njegova dijela.Ova vrsta sondi dobiva se mikrodisekcijom ili proto~nimfluorescentnim sortiranjem specifi~nog kromosoma izhibridnih somatskih stanica te umnaànjem izoliraneDNA-molekule specifi~nom lan~anom reakcijompolimeraze.15 Primjenjuje se samo na metafaznim kro-mosomima jer je signal, zbog kondenziranosti inter-faznog kromatina, nedovoljno jasan.13 Njezini nedostacio~ituju se u nepotpunoj hibridizaciji du` kromosoma,naj~e{}e u podru~ju telomera i centromera, pa se moèdogoditi da se njezinom upotrebom ne detektirajupromjene koje obuhva}aju te dijelove kromosoma.14

Sonde za mala podru~ja eukromatina

Sonde za mala podru~ja eukromatina hibridiziraju se naspecifi~an slijed DNA koja se ne ponavlja u genomu imoè kodirati genski produkt. Sonda moè sadràvatijedan gen ili fragment DNA poznate lokacije.14,24 U tugrupu sondi ubrajaju se i subtelomerne sonde koje hib-ridiziraju s telomernim regijama kromosoma. Intersticij-ske ili telomerne delecije vrlo je te{ko detektirati stan-dardnim tehnikama, posebno ako je odlomljeni dio kro-mosoma manji od 500 kb. Za detekciju upravo takvihpromjena upotreba tih sondi potpuno nadopunjujeklasi~ne metode oprugavanja kromosoma jer se nji-hovom primjenom detektiraju delecije veli~ine od 100do 300 kb.14,25 Danas se na trì{tu mogu kupiti gotovisetovi subtelomernih sondi za istodobnu analizu telo-mernih regija svih kromosoma izuzev{i telomer p krakakrocentri~nih kromosoma. Studije u kojima su seupotrebljavali takvi setovi sondi za analizu telomernihregija u pacijenata s mentalnom retardacijom i prividnonormalnim kariotipom, pokazuju da je u oko 23% takvihpacijenata prisutna skrivena telomerna promjena.26,27 Tirezultati upu}uju na to da su promjene telomera naj-vjerojatnije drugi uzrok mentalne retardacije nakonDownova sindroma.28

VIŠEBOJNA KARIOTIPIZACIJA

Osnovni princip fluorescentne in situ hibridizacijeuklju~en je u metode vi{ebojne kariotipizacije (engl. –multicolor karyotyping) kojom je omogu}ena analizametafaznih kromosoma na razini cijeloga genoma u jed-nom postupku. Za potrebe vi{ebojne kariotipizacijeDNA-sonde mogu se obojiti razli~itom kombinacijombroja fluorokroma (engl. – combinatorial labeling) ilifluorokromima u razli~itim udjelima (engl. – ratio labe-ling), {to rezultira bojenjem metafaznih kromosoma u 24

razli~ite boje.29 Istodobna upotreba oba na~ina obilje-àvanja sondi naziva se COBRA (engl. – combined bina-ry ratio labelling).30 Postoje dvije osnovne modifikacijete metode koje se razlikuju uglavnom u tehni~kimrje{enjima mjerenja spektra upotrijebljenih florescentnihboja, a to su: vi{ebojna fluorescentna in situ hibridizaci-ja i spektralna kariotipizacija.31

Vi{ebojna fluorescentna in situ hibridizacija

Vi{ebojna fluorescentna in situ hibridizacija (engl. –multiplex FISH ili M-FISH) zasniva se na principu stan-dardne metode fluorescentne in situ hibridizacije,uklju~uju}i kombinacijsko obiljeàvanje sondi te upotre-bu nekoliko specifi~nih filtera kojima je mogu}e raz-likovati spektre fluorescentnih boja (od 350 nm do 770nm).32 Prvi rad u kojem se opisuje upotreba pet fluo-rokroma za kombinacijsko obiljeàvanje sondi, {torezultira bojenjem kromosoma u 24 razli~ite boje,objavljen je 1996. godine.31,33 Takav na~in obiljeàvanjasondi pokazao se nedovoljno senzitivnim u detekcijimalih intrakromosomskih i interkromosomskih promje-na. Azofeifa sa suradnicima dokazala je da senzitivnost ispecifi~nost ove metode izrazito ovisi o broju i raspore-du fluorokroma uzdu` kromosoma.34 Isti su autori zapotrebe detekcije skrivenih translokacija napravili shemuobiljeàvanja sondi sa sedam fluorokroma, {to je omo-gu}ilo bolju senzitivnost u detekciji navedenih promjena.Ova se metoda naj~e{}e upotrebljava u svrhu razja-{njenja aberiranih kariotipova utvr|enih GTG-metodomoprugavanja kromosoma.29,33

Velik problem pri analizi kromosoma metodamaklasi~ne citogenetike stvara prisutnost marker-kromoso-ma koji se definira kao strukturno abnormalni kromo-som (engl. – structurally abnormal chromosome – SAC)nepoznata kromosomskog podrijetla. Takav se kromo-som pojavljuje kao prekobrojan u kariotipu pa ga ~estonazivaju i vi{kom strukturno abnormalnoga kromosom-skog materijala (engl. – extra structurally abnormal chro-mosome – ESAC).13,38 Kako se M-FISH-om svaki kromo-som boji drugom bojom, boja marker-kromosomaomogu}ava odre|ivanje njegova kromosomskog podri-jetla. Katkad su marker-kromosomi toliko sitni da nesadrè eukromatinski dio nego samo heterokromatinskimaterijal koji se ne moè detektirati M-FISH metodom.Stoga je razvijena modifikacija te metode koja se temeljina upotrebi svih centromerno specifi~nih DANN-sondi,a naziva se centromerno specifi~na vi{ebojna fluores-centna in situ hibridizacija – cenM-FISH. U toj se meto-di sonde obiljeàvaju s pet razli~itih fluorokroma i hib-ridiziraju se na metafazne kromosome u jednom koraku.Time je omogu}ena detekcija svih centromera, izuzev{icentromer kromosoma 13 i 21 zbog njihove sli~nosti.CenM-FISH se primjenjuje na preparate kromosoma s


250

urednim centromerama pa se stoga ne moè iskoristitiza detekciju kromosomskog materijala bez centromerneregije.36,37 Druga modifikacija M-FISH-a napravljena jeporadi bolje detekcije marker-kromosoma koji potje~uisklju~ivo od akrocentri~nih kromosoma, a to je AcroM-FISH. Ta metoda uklju~uje upotrebu specifi~ne kombi-nacije sondi, i to sonde za cijele akrocentri~ne kromo-some, centromerne sonde za kromosome 13/21, 14/22 i15 te sonde za ribosomsku DNA-molekulu. Svaka jesonda obiljeèna drugom kombinacijom fluorokroma.Tom metodom moè se detektirati oko 80% marker-kro-mosoma koji uglavnom potje~u od kromosoma broj 15 i22. Ostalih 20% potje~e od drugih kromosoma koji semogu detektirati nekom od metoda vi{ebojne karioti-pizacije. Ta se kombinacija sondi primjenjuje isklju~ivona metafazne kromosome.38

Spektralna kapiotipizacija

Prvi rad o spektralnoj kariotipizaciji (engl. – spectralkaryotyping – SKY) pojavio se iste godine kada i rad o M-FISH-u.39 Spektralna kariotipizacija zasniva se na kombi-nacijskom obiljeàvanju sondi koriste}i i pet razli~itihfluorokroma. Svaki je kromosom obiljeèn jedinstvenomkombinacijom fluorokroma i emitira karakteristi~nevalne duljine spektra na temelju kojih ih je mogu}eraspoznati. Interferometar i Fouirerova analiza upotreb-ljavaju se za mjerenje spaktra, a upotreba trostrukog fil-tra (engl. – Triple band-pass filter) omogu}uje ekscitaci-ju i emisiju svih fluorokroma u isto vrijeme. Digitalnakamera povezana s interferometrom precizno determi-nira kompletnu krivulju spektra za svaki pixel istodobnopa se tako moè diferencirati svaki fluorokrom, bezobzira na to {to im se spektri mogu preklapati. Kompju-torska programska podr{ka omogu}uje translaciju spek-tra u jedinstvenu boju svakog kromosoma.32,29,40 Ovametoda omogu}ava mjerenje i analizu signala slabijeginteziteta nastalog kao posljedica lo{e hibridizacije, ali jeisto tako mogu}a i detekcija signala nastalih nespeci-fi~nom hibridizacijom.41,42 Ta je ~injenica bitna kad jerije~ o slu~ajevima s minimalnom koli~inom materijalaza analizu te potrebi da se u {to kra}em vremenu dobi-je {to vi{e preciznih informacija. Ova je metoda velikuprimjenu na{la u citogenetici tumora i preimplantaci-jskoj genetici.43 Zbog dobre senzitivnosti u detekcijirazli~itih interkromosomskih promjena, aneuploidija temarker-kromosoma, spektralna kariotipizacija uvelikese upotrebljava i u klini~koj citogenetici.42,39 Principistodobne detekcije svih metafaznih kromosoma primi-jenjen je i u detekciji parcijalnog kariotipa interfazne jez-gre limfocita periferne krvi, amniocita i blastomera.Time je omogu}ena detekcija 70% numeri~kih promjenakromsoma, koje se naj~e{}e detektiraju u spontanopoba~enih plodova, a vezane su za kromsome 9, 13, 14,15, 16, 18, 21, 22, X i Y.43

Vi{ebojno oprugavanje kromosoma

Klasi~ne metode oprugavanja kromosoma kao nimetode vi{ebojne kariotipizacije nisu dovoljno senzi-tivne u detekciji malih intrakromosomskih i interkromo-somskih promjena. Detekciju takvih promjena omogu-}uje metoda vi{ebojnog oprugavanja kromosoma (engl.– high resolution multicolor-banding).43 Njezinu prvuprimjenu opisao je Chudoba sa suradnicima na primjeruprecizne detekcije to~aka loma kod delecije i inverzijekromosoma broj 5, koje nije bilo mogu}e detektiratiGTG-metodom.44 Za hibridizaciju je upotrijebio sondedobivene mikrodisekcijom kromosomskih segmenata,obiljeène s pet fluorokroma u razli~itim kombinacija-ma. Time je diferencirao specifi~ne regije kromosoma-ma na razini pruga i potpruga i to na temelju produkci-je razli~itog inteziteta fluorescencije du` kromosoma.Liehr sa suradnicima konstruirao je biblioteku speci-fi~nih sondi dobivenih mikrodisekcijom,45 koja pokriva~itav genom i rezultira vi{ebojnim oprugavanjem svihhumanih kromosoma u jednom koraku, {to odgovararezoluciji od 450 do 500 pruga dobivenih klasi~nimmetodama oprugavanja.

RxFISH

Metoda vi{ebojnog oprugavanja kromosoma kod kojese sonde dobivaju izolacijom kromosomskih fragmentagorile je metoda RxFISH (engl. – cross-species colorbanding).45 Hibridizacija takvih sondi na kromosome~ovjeka mogu}a je zbog homologije (98%) u gra|i DNA--molekule izme|u tih dviju vrsta. Naj~e{}e se upotreb-ljava u analizama kromosomskih promjena u tumorskimstanicama, zajedno sa standardnom metodom opruga-vanja kromosoma (GTG-metoda). Kombinacijom tihdviju tehnika dobiva se dovoljna rezolucija za detekcijuve}ine kromosomskih promjena koje se doga|aju u tojvrsti stanica.13,32,46

KOMPARATIVNA HIBRIDIZACIJA GENOMA

Komparativna hibridizacija genoma (engl. – compara-tive genomic hybridization – CGH) modificirana fluores-centna in situ hibridizacijska tehnika kojom je mogu}edetektirati duplikacije i delecije kromosoma na razinicijeloga genoma. Obiljeèna test-DNA, izolirana iz tkivapacijenta, mije{a se s razli~ito obiljeènom referentnomDNA-molekulom izoliranom iz tkiva normalnogmu{karca. Obje DNA-molekule u istim omjerima kohib-ridiziraju se na kromosomske preparate s normalnimhumanim metafaznim kromosomima.47 Upotrebom flu-orescentnog mikroskopa, digitalne kamere te kompju-torske programske podr{ke mjeri se udio intenziteta flu-orescencije test i referentne DNA-molekule du` svakogkromosoma. Ovom metodom uspje{no se detektirajudelecije veli~ine od 10 do 12 Mb.48-50) Kirchhoff sa


251

suradnicima uspje{no je detektirala delecije ~ak od 3 do5 Mb kod Prader-Willijeva i Angelmanova sindroma.51

Ovom metodom mogu}a je analiza aneuploidija iz samojedne stanice ili vrlo malog broja stanica, {to je odvelikog zna~enja u preimplantacijskoj i prenatalnojdijagnostici.52,53 Ozcan T. sa suradnicima potvr|ujeuspje{nost ove metode i u detekciji aneuploidija prianalizi fetoplacentarnog tkiva uklopljenog u parafinskekockice.54 Kultivacija stanica tumorskih tkiva ipoba~enih plodova ~esto rezultira slabim rastom telo{om kvalitetom kromosoma, {to oteàva analizuklasi~nim metodama oprugavanja kromosoma.55,54,57

Ovom metodom mogu se uspje{nije analizirati kromo-somske promjene upravo u takvim kulturama. Tako jeanalizom nedovoljno kvalitetnih kultura spontanopoba~enih plodova dokazana ve}a incidencija trisomije1, 7, 16, 21 i 22, kao i ve}a u~estalost svih kromosomskihpromjena (72%) nego {to je to dokazano klasi~nimmetodama analize kromosoma.58 Zahvaljuju}i razvojuove metode, mogu}e je otkriti skrivene translokacije uosoba s mentalnom retardacijom i urednim kariotipomdetektiranim GTG-metodom.49 Metodom komparativnehibridizacije genoma mogu se odrediti to~ke loma kodmalih interkromosomskih i intrakromosomskih promje-na, {to se metodama vi{ebojne kariotipizacije ne moè.Usprkos brojnim prednostima, CGH pokazuje nedo-voljnu senzitivnost u detekciji balansiranih intrakromo-somskih i interkromosomskih promjena.59 Isto tako,CGH je nedovoljno precizna za detekciju podru~ja kro-mosoma, koja uklju~uju ponavljaju}e redoslijede bazakao {to su heterokromatinske regije kromosoma 1, 9, 16i Y te centromerne regije akrocentri~nih kromosoma itelomere. Udio fluorescencije u tim regijama ~esto poka-zuje devijacije te se u interpretaciji nalaza isklju~uju. Toje najvjerojatnije povezano s nejednakom denaturacijomi hibridizacijom razli~itih regija kromosoma, {to se prijesvega odnosi na regije bogate GC-parovima baza.59 Nekiautori pokazuju da se ova metoda ipak moè uspje{noprimijeniti u detekciji skrivenih telomernih translokacijakoje se ne mogu detektirati GTG-metodom oprugavanjakromosoma, kao {to je to slu~aj u mentalno retardiranihosoba.60,61 Upotreba CGH-~ipova (engl. – array CGH)uvelike }e pove}ati osjetljivost ove metode. Ta novatehnologija omogu}it }e detekcije duplikacija i delecija iod 100-tinjak kb62.

PRINS

PRINS (engl. – primed in situ synthesis) brza je i senzi-tivna metoda za detekciju specifi~nog slijeda nukleoti-da u DNA-molekuli. Metoda se zasniva na lan~anojreakciji polimeraze koja ima samo jedan ciklus,koriste}i se specifi~nom po~etnicom i obiljeènomotopinom nukleotida.63 To je pouzdana, jednostavna i

brza metoda kojom se moè nadoknaditi nedovoljnasenzitivnost centromernih sondi u detekciji kromosoma13 i 21 jer specifi~ne po~etnice s velikom senzitivno{}urazlikuju ponavljaju}e sljedove DNA-molekule u podru-~ju centromera tih kromosoma.64-66 Veli~ina po~etnicakre}e se od 18 do 30 bp pa su vrlo pogodne za detek-ciju kromosoma u spermijima ~ovjeka. Za razliku odhibridizacije sondi u FISH-u, hibridizacija PRINS--po~etnica uspje{nija je bez obzira na kondenziranostDNA-molekule.67,68 Isto tako je senzitivna u detekcijidelecija unutar jednoga gena jer se po~etnice moguvezati za komplementarni slijed nukleotida veli~ine 18do 20 bp, kao {to je dokazano u slu~aju detekcije dele-cija u genu za distrofin.69 FISH i PRINS-metoda pokazu-ju istu senzitivnost u detekciji delecije jedne kopije gena,no prednost PRINS-metode o~ituje se u jednostavnostinjezine primjene i brzini dobivanja rezultata.70,71 Ovis-no o protokolu, rezultati FISH-a mogu se dobiti najbrèza 24 sata, a PRINS-metodom za dva do tri sata. Zbogsvih tih prednosti, PRINS-metoda se vrlo brzo ra{irila ucitogeneti~kim laboratorijima kao nadopuna klasi~nimmetodama analize kromosoma. Upotrebljava se za de-tekciju marker-kromosoma64,72, za detekciju kromosom-skih promjena u tumorskim stanicama70 i tkivima spon-tano poba~enih plodova73 te o{te}enjima kromosomanastalih kao posljedica djelovanja kemijskih i fizi~kihmutagena.74 S obzirom na pouzdanost, jednostavnost ibrzinu, ova bi metoda u budu}nosti mogla potisnutiFISH.

MIKRODISEKCIJA I REVERZNO BOJENJEKROMOSOMA

Mikrodisekcija (engl. – microdissection) metoda jekojom se izrezuje cijeli ili dio opruganog kromosoma(npr. GTG-pruge). Izrezivanje se izvodi s pomo}umikromanipulatora sa silikoniziranom staklenom iglomuz uporabu invertnog mikroskopa. Izrezani dioumnoàva se lan~anom reakcijom polimeraze koriste}idegenerirane oligonukleotidne po~etnice. Umnoènifragmenti obiljeàvaju se fluorokromom te se hib-ridiziraju na metafazne kromosome normalne diploidnestanice, {to se naziva reverznim bojenjem kromosoma(engl. – reverse chromosome painting).13,48,75 Mikrodi-sekcijom kromosomskih preparata dobivaju se sondekoje sluè za potrebe FISH-a i vi{ebojnog oprugavanjakromosoma. Uz to, ova metoda primjenjuje se i zapotrebe mapiranja i izolacije gena te za detekciju kro-mosomskih promjena. Od svih opisanih metoda,mikrodisekcija i reverzno bojenje kromosoma najboljasu kombinacija metoda za detekciju marker-kromosomajer je njihovom upotrebom mogu}e identifikaciratimarker-kromosom bilo kojega podrijetla.76,77,79


252

ZAKLJUÂK

Djelovanje citogeneti~kog laboratorija na po~etku 21.stolje}a nezamislivo je bez mogu}nosti primjene metodamolekularne citogenetike. No to ne zna~i da te metodepotpuno zamjenjuju metode klasi~ne citogenetike ve}su njihova nadopuna ili logi~an i nu`dan nastavak.Naàlost, ni molekularno citogeneti~ke metode nisu uvi-jek dovoljno senzitivne za pojedine kromosomkeaberacije pa je nu`no pravilno odabrati i kombiniratipojedine tehnike kako bi se najpreciznije i najbrè oba-vila analiza. Moderno organiziran citogeneti~ki labora-torij bi stoga, uz tehniku klasi~ne citogenetike, moraoimati i tehniku FISH-a, kao i jednu od metoda vi{ebojnekariotipizacije (M-FISH ili SKY). Uz mogu}nost primjeneCGH-a bila bi ostvarena, prema dana{njim standardima,gotovo idealna analiza kariotipova.

LITERATURA

1. Tijo JH, Levan A. The chromosome number of man. Am J

Obstet Gynecol 1956; 130:723-724.

2. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromo-

some preparation U: Verma RS, Babu A. Human chromo-

somes - manual of basic technique. Pergamon press, 1989:

6 –19.

3. Therman E, Susman M. Human chromosomes, 3rd ed. New

York: Springer-Verlag 1993.

4. Moorhead PS, Nowell PC, Mellman WJ, Battips DM,

Hungerford DA. Chromosome preparations of leukocytes

cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res 1960;

20: 613-616.

5. Hsu TC. Mammalian chromosomes in vitro I. The kary-

otype of man. J Hered 1952; 43:167-172.

6. Lejeune J, Gautier M, Turpin MR. Etude des chromosomes

somatiques de neuf enfants mongoliens. C R Acad Sci

(Paris) 1959; 248: 1721-1722.

7. Seabright M. Rapid banding technique for human chromo-

somes. Lancet II 1971; 971.

8. Parude ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive

DNA to the DNA of cytological preparation. Proc Natl Acad

Sci USA 1969; 64:600-604.

9. John H, Birnstiel M, Jones K. RNA-DNA hybrids at the cyto-

logical level. Nature 1969; 223:582-587.

10. Rabin M, Watson M, Backer PE, Ryan J, Breg WR, Ruddle

FH. NRAS transforming gene maps to region p11-p13 on

chromosome 1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell

Genet 1984; 38:70-72.

11. Jhanwag SC, Neel BG, Hayward WS, Chahanti RS. Local-

ization of the cellular oncogenes ABL, SIS and Fes on

human germ-line chromosomes. Cytogenet Cell Genet

1984; 38:73-75.

12. Schroeder WT, Lopez LC, Harper ME, Saunders GF. Local-

ization of the human glaucon gene (GCG) to chromosome

segment 2q36 -37. Cytogenet Cell Genet 1984; 38:76 – 79.

13. Blancato JK. Fluorescence in situ hybridization U: GersenSL, Keagle MB. The principles of clinical cytogenetics.Totowa New Jersey: Humana Press 1999; 443-473.

14. Carpenter NJ. Molecular cytogenetics. Seminars in pedi-atric neurology 2001; 8: 135-146.

15. Trask BJ. Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 yearsand counting. Nature rew Genetics 2002; 3: 769-778.

16. Reddy KS, Mak L. Mosaic unbalanced structural abnormal-ities confirmed using FISH on buccal mucosal cells. AnnGenet 2001; 44:37-40.

17. Miny P, Tercanli S, Holzgreve W. Developments in labora-tory techniques for prenatal diagnosis. Curr Opin ObstetGynecol 2002; 14:161-168.

18. Pinkel D, Straume T, Gray JW. Cytogenetic analysis usingquantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization.Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83:2934-2938.

19. Cremer T, Lichter P, Borden J, Ward DC, Manueldis L.Detection of chromosome aberrations in metaphase andinterphase tumor cells by in situ hybridization using chro-mosome-specific library probes. Hum Genet 1988; 80:235-246.

20. Lichter P, Cremer T, Borden J, Manueldis L, Ward DC.Delineation of individual human chromosomes inmetaphase and interphase cells by in situ suppressionhybridization using recombinant DNA libraries. HumGenet 1988; 80:224-234.

21. Estabrooks L, Lamb AN Prenatal interphase fluorescence insitu hybridization (FISH). Contemporary Ob/Gyn 2000;7:68-87.

22. Moore GE, Ruangvutliert P, Chatzimeletiou K, Bell G, ChenCK, Jonson P, Harper JC. Examination of trisomy 13,18,21fetal tissues at different gestational ages using FISH. Eur JHum Genet 2000; 8: 223-228.

23. Teixeira MR. Combined classical and molecular cytogenet-ic analysis of cancer. Eur J Cancer 2002; 38:1580-1584.

24. Minoshima S. Mapping of the gene for human xantinedehydrogenase XDH to band p23 of chromosome 2. Cyto-genet Cell Genet 1995; 68: 52-53.

25. Knight SJL, Lese CM, Precht KS. An optimized set of humantelomere clones for studying telomere integrity and archi-tecture. Am J Hum Genet 2000; 67:320-332.

26. Riegel M, Baumer A, Jamar M, Delbecque K, Herens C,Verloes A, Schinzel A. Submicroscopic terminal deletionsand duplications in retarded patients with unclassified mal-formation syndromes. Hum Genet 2001; 109: 286-294.

27. Joyce CA, Dennis NR, Cooper S, Browne CE. Subtelomericrearrangements: results from a study of selected and unse-lected probands with idiopathic mental retardation andcontrol individuals by using high-resolution G-bandingand FISH. Hum Genet 2001; 109: 440-451.

28. Knight SJL, Lese CM, Precht KS (2000) An optimized set ofhuman telomere clones for studying telomere integrity andarchitecture. Am J Hum Genet 67:320-332

29. Lichter P. Multicolor Fishing: what’s the catch? TrendsGenet 1997; 13:475-479.

30. Tanke HJ, Wiegant J, Van Gijlswijk RPM, Bezrookove V,Petteiner H, Heetebrij RJ, Talman EG, Raap AK, Vrolijk J.New strategy for multi-colour fluorescence in situ


253

hybridization: COBRA: Combined Binary Ratio labeling.Eur J Hum Genet 1999; 7: 2-11

31. Speicher M, Ward D. Karyotyping human chromosomes bycombinatorial multi-fluor FISH. Nature Genet 1996; 12:368-375.

32. Fauth C, Speicher MR. Classifying by coloros: FISH-basedgenome analysis. Cytogenet Cell Genet 2001; 93: 1-10.

33. Gorinati M, Caufin D, Minelli A, Memo L, Gaspardo G,Dodero A. Inv dup (8) (p21.1®22.1): further case reportand a new hypothesis on the origin of the chromosomeab-normality.ClinGenet1991;39:55-9

34. Azofeifa J, Fauth C, Kraus J, Maierhofer C, Langer S, BolzerA, Reichman J, Schuffenhauer S, Speicher MR. An opti-mized probe set for the detection of small interchromoso-mal aberrations by use of 24-color FISH. Am J Hum Genet2000; 66:1684-1688.

35. Bui H, Blennow E, Nordenskjold M. Prenatal diagnosis:molecular genetics and cytogenetics. Best practice &research clin obstetric gynecology 2002; 16:629-643.

36. Liehr T, Nietzl A, Strake H, Heller A, Weise A, Mrasek K,Claussen U. Characterization of small human marker chro-mosomes by centromere-specific multicolor-FISH (cen-FISH) and high resolution multicolor banding (MCB). ECAnewsletter 2002; 10:4-8.

37. Nietzel A, Rocchi M, Strake H, Heller A, Fiedler W, Wlo-darska I, Loncarevic IF, Beensen V, Claussen U, Liehr T. Anew multicolor-FISH approach for the characterization ofmarker chromosomes: centromere-specific multicolor-FISH (cenM-FISH). Hum Genet 2001; 108:199-204.

38. Langer S, Fauth C, Rocchi M, Murken J, Speicher MR.AcroM fluorescent in situ hybridization analyses of markerchromosome. Hum Genet 2001; 109:152-158.

39. Schrock E, Du Manoir S, Veldman T, Schoell B, WienbergJ, Ferguson-Smith MA, Ning Y, Ledbetter DH, Bar-Am I,Garini Y, Soenksen D, Ried T. Multicolor spectral kary-otyping of human chromosomes. Science 1996; 273: 494-49.

40. Schrock E, Veldman T, Ning Y. Spectral karyotypingrefines cytogenetic diagnostics of constitutional chromoso-mal abnormalities. Hum Genet 1997; 101:255-262.

41. Rothmann C, Bar-Am I, Malik Z. Spectral imaging for quan-titative histology and cytogenetics. Histol Histolpathol1998; 13:921-926.

42. Fung J, Weier HUG, Goldberg JD, Pedersen RA. Multilocusgenetic analysis of single interphase cells by spectral imag-ing. Hum Genet. 2000; 107:615-622.

43. Applied spectral-imaging. SKYvs.M-FISH Comparison.DGS/rev. 1998.

44. Wienberg J, Muller S. Chromosome bar codes: definingkaryotypes with molecular tags by multi color FISH. ECAnewsletter 2002; 9:3-7.

45. Wienberg J, Muller S. Chromosome bar codes: definingkaryotypes with molecular tags by multi color FISH. ECAnewsletter 2002; 9:3-7.

46. Chudoba I, Plesch A, Lemke J, Claussen U, Senger G. Highresolution multicolor-banding: a new technique for refinedFISH analysis of human chromosomes. Cytogenet CellGenet 1999; 84: 156-160.

47. Liehr T, Heller A, Starke H, Rubtsov N, Trifonov V, Mrasek

K, Weise A, Kuechler A, Claussen U. Microdissection based

high resolution multicolor banding for all 24 human chro-

mosomes. In J Mol Med 2002; 9:335-339.

48. Xu J, Chen Z. Advances in molecular cytogenetics for the

evaluation of mental retardation. Am J Med Genet 2003;

117C: 15-24.

49. Du Manoir S, Speicher MR, Joos S, Schrock E, Popp S,

Dohner H, Kovacs G, Nicoud MR, Lichter P, Cremer T.

Detection of complete and partial chromosome gains and

losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum

Genet 1993; 90: 590-610.

50. Fauth C, Speicher MR. classifying by coloros: FISH-based

genome analysis. Cytogenet Cell Genet 2001; 93: 1-10.

51. Kirchhoff M, Rose H, Maahr J, Gerdes T, Bugge M, Tom-

merup N, Tumer Z, Lespinasse J, Jensen PKA, Wirth J,

Lundsteen C. High resolution comparative genomic

hybridization analysis reveal imbalances in dyschromoso-

mal patients with normal or apparently balanced conven-

tional karyotypes. Eur J Hum Genet 2000; 8: 661-668.

52. Kirchhoff M, Rose H, Gerdes T, Lundsteen C (2001) Screen-

ing for submicroscopic chromosomal imbalances by com-

parative genomic hybridization. ECA newsletter 8:3-7

53. Tonnies H, Stumm M, Wegner RD, Chudoba I, Kalscheuer

V, Neitzel H. Comparative genomic hybridization based

strategy for the analysis of different chromosome imbal-

ance detected in conventional cytogenetic diagnostic.

Cytogenet Cell Genet 2001; 93:188-194.

54. Ozcan T, Burki N, Parkash V, Huang X, Pejovic T, Ward

DC. Cytogenetical diagnosis in paraffin-embedded fetopla-

cental tissue using comparative genomic hybridization.

Prenat Diagn 2000; 20:41-44.

55. Voullaire L, Slater H, Williamson R, Wilton L. Chromosome

analysis of blastomeres from human embryos by using

comparative genomic hybridization. Hum Genet 2000; 106:

210-217.

56. Voullaire L, Slater H, Wilton L, Williamson R. Detection of

aneuploidy in single cells using comparative genomic

hybridization. Prenat Diagn 1999; 19: 846-851.

57. Lomax B, Tang S, Separovic E, Phillips D, Hillard E, Thom-

son T, Kalousek D.K. Comparative genomic hybridization

in combination with flow cytometry improves results of

cytogenetic analysis of spontaneous abortions. Am J Hum

Gent 2000; 66: 1516-1521.

58. Fritz B, Hellermann C, Oltert J, Fuchs B, Bruns M, Aslan M,

Schmidt S, Coerdt W, Muntefering H, Rehder H. Cytoge-

netic analyses of culture failures by comparative genomic

hybridization – Re-evaluation of chromosome aberration

rates in early spontaneous abortions. Eur J Hum Genet

2001; 9:539-547.

59. Ozaki T. Chromosomal alternations in osteosarcoma cell

lines revealed by CGH and multicolor karyotyping. Cancer

Genet Cytogenet 2003; 140: 145-152.

60. Wang N. Methodolologies in cancer cytogenetics and mol-

ecular cytogenetics. Am J Med Genet (Semin Med Genet)

2002; 115:118-124.


254

61. Tachdjian G, Aboura A, Lapierre JM, Viguie F. Cytogeneticanalysis from DNA by comparative genomics hybridiza-tion. Ann Genet 2000; 43: 147-154.

62. Joly G, Lapierre JM, Ozilou C, Gosset P, Aurias A, de BloisMC, Prieur M, Raoul O, Colleaux L, Munnich A, RomanaSP, Vekemans M, Turleau C. Comparative genomichybridization in mentally retarded patients with dysmor-phic features and normal karyotype. Clin Genet 2002;60:212-219.

63. Yaron Y, Carmon E, Golstein M, Voskobolnik N, OchshornY, Gelman-Kohan Z, Orr-Urtreger A. The clinical applica-tion of spectral karyotyping (SKY) in the analysis ofparentally diagnosed extra structurally abnormal chromo-somes (ESACs). Prenat Diagn 2003; 23:74-79.

64. Veltman JA, Schoenmakers EFPM, Eussen HB, Janssen I,Merkx G, van Cleef B, van Ravenswaaij M, Brunner HG,Smeets D, van Kessel AG. High-throughput analysis of sub-telomeric chromosome rearrangements by use of arraybased comparative genomic hybridization. Am J HumGenet 2002; 70:1269-1276.

65. Gosden J, Lawson D. Instant PRINS: a rapid method forchromosome identification by detecting repeatedsequences in situ. Cytogenet Cell Genet 1995; 68:57-60.

66. Hindkjaer J, Koch JK, lvaraa S, Bolund L. Primed in situlabeling (PRINS) as a rational procedure for identificationof marker chromosomes using a panel of primers differen-tially tagging the human chromosomes. Clin Genet 1996;50.437-441.

67. Pellestor F, Girardet A, Lefort G, Andreo B, Charlieu JP. Useof the primed in situ labeling (PRINS) technique for rapiddetection of chromosomes 13,16,18,21,X and Y. HumGenet 1995; 95:12-17.

68. Pellestor F, Quenesson I, Coignet L, Girardet A, Andreo B,Lefort G, Charlieu JP. FISH and PRINS, a strategy for rapidchromosome screening: application to the assessment ofaneuploidy in human sperm. Cytogenet Cell Genet 1996;72:34-36.

69. Pellestor F, Coignet L, Girardet A, Andreo B, Lefort G,Charlieu JP. Assessment of aneuploidy for chromosomes8,9,13,16, and 21 in human sperm by using primed in situlabeling technique. Am J Hum Genet 1996; 58: 797-802.

70. Pellestor F, Imbert I, Andreo B. Rapid chromosome detec-tion by PRINS in human sperm. Am J Med Genet 2002;107:109-114.

71. Chudoba I, Plesch A, Lemke J, Claussen U, Senger G. Highresolution multicolor-banding: a new technique for refinedFISH analysis of human chromosomes. Cytogenet CellGenet 1999; 84: 156-160.

72. Tharapel SA, Kadandele JS. Primed in situ labeling for eval-uation of gene deletions in cancer. Am J Med Genet 2000;107:123-126.

73. Tharapel AT, Kadandele JS, Martens PR, Wachtel SS,Wilroy Jr SR. Prader Willi/Angelman and DiGeorge/Velo-cardiofacial Syndrome deletions: Diagnosis by primed insitu labeling (PRINS). Am J Med Genet 2000; 107:119-122.

74. Velagaleti GVN, Tharapel AT, Kadandele JS, Martens PR,Tharapel SA. Rapid identification of marker chromosomesusing PRINS. Am J Med Genet 1997; 71:130-133.

75. Rabin M, Watson M, Backer PE, Ryan J, Breg WR, RuddleFH. NRAS transforming gene maps to region p11-p13 onchromosome 1 by in situ hybridization. Cytogenet CellGenet 1984; 38:70-72.

76. Russo A. Prins tandem labeling of satellite DNA in thestudy of chromosome damage. Am J Med Genet 2002;107:99-104.

77. Senger G, Ludecke HJ, Horsthemake B, Claussen U.Microdissection of banded human chromosomes. HumGenet 1990; 84:507-511.

78. Frederich U. Microdissection - a precise method to disclosethe parental origin of supernumerary marker chromo-somes. Ann Genet 2000; 43: 109-110.

79. Rothlisberger B, Shinzel A, Kotzot D. A new molecularapproach to investigate origin and formation of structuralchromosome aberrations. Chrom Res 2000; 8:451-453.


255

SA@ETAK

Brojna istraìvanja mehanizama trudno}e nisu dala jasne smjernicekoje bi pomogle prakti~arima kao dijagnosti~ko ili terapijsko sredstvou rje{avanju problema u~estalih spontanih poba~aja nepoznate eti-ologije. U~estali spontani poba~aji tri su ili vi{e uzastopnih spontanihprekida trudno}e s istim partnerom prije 23. tjedna gestacije. Zna~ajansu klini~ki problem budu}i da se javljaju u 0,5–3% èna i da je njihovuzrok nepoznat u oko 40–50% slu~ajeva. Poznati uzroci u~estalihspontanih poba~aja raznorodni su i uklju~uju negeneti~ke i geneti~ke~imbenike. Iako je njihov ve}i dio uzrokovan geneti~ki, genskim ilikromosomskim abnormalnostima, poku{aj lije~enja zasad je mogu}jedino u skupini negeneti~kih uzroka. Cilj je ovog rada prikazatisada{nje spoznaje o geneti~kim razlozima u~estalih spontanihpoba~aja, o ~emu se vrlo malo zna. Upozorit }emo na HLA-podu-darnost u roditelja, monogenske nasljedne bolesti i na gensku varija-bilnost u obliku genskih polimorfizama, kao na mogu}e ~imbenikepredispozicije za u~estale spontane poba~aje. Opisat }emo ~imbenikekoji su u{li u klini~ku praksu, kao i nove ~imbenike, dobivene asoci-jacijskim studijama poput gena povezanih s imunosnim sustavom,koagulacijom i vaskularizacijom. Naposljetku, na{ doprinos sustav-nom istraìvanju uloge genskih ~imbenika u etiologiji u~estalih spon-tanih poba~aja razvijat }emo kroz projekt HuMGeN (Human Miscar-riage Genetic Network) koji smo pokrenuli na me|unarodnoj razini.

KLJU^NE RIJEÎ: u~estali spontani poba~aji, imunogenetika, kromo-somske abnormalnosti, HLA-podudarnost, monogenske bolesti,polimorfizmi gena

ABSTRACT

Despite much research into the mechanism of pregnancy and preg-nancy loss, few diagnostic or therapeutic procedures for the evaluationof recurrent spontaneous abortion (RSA) can be offered. RSA isgenerally defined as three or more consecutive spontaneous termina-tions of pregnancy (with the same biological partner) occurring prior tothe 23rd gestational week. RSA presents an important clinical challengeas it occurs in 0.5% to 3% of all pregnancies, and in 40% to 50% of thesecases, without any known cause. The known causes of spontaneouspregnancy loss vary, including those of both non-genetic and geneticetiology. The goal of this work is to discuss the current knowledge ofgenetic causes of RSA, which is a rapidly developing field. The mecha-nism of HLA incompatibility, monogenetic disease, as well as geneticvariance in genetic polymorphisms, as possible factors in causing a pre-disposition to RSA will be presented. The contributing factors to RSAthat are already known in the present clinical practice as well as themore recent suspected factors which have been demonstrated in asso-ciated studies, such as genetic variation in genes associated with theimmune system, coagulation and vascularization, will also be dis-cussed. In conclusion, our contribution to the systematic research ofgenetic factors contributing to RSA through the international “HuMGeN” (Human Miscarriage Genetic Network) project will be pre-sented.

KEY WORDS: recurrent spontaneous abortion, immunogenetics, chro-mosomal aberrations, HLA-sharing, monogenic disorders, gene poly-morphism

Pregledni rad Medicina 2004;42(40):256-264Review UDK: 618.39-021.3:575.113.1

GENETI^KI ÎMBENICI U ETIOLOGIJI UÊSTALIH SPONTANIH POBAÂJA

GENETIC FACTORS IN ETIOLOGY OF RECURRENT SPONTANEOUS ABORTION

Sa{a Ostoji}1, Borut Peterlin2

Ustanova: 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci,2Slu`ba za medicinsku genetiku, Klinika za ginekologiju, Klini~ki centar Ljub-ljana, Ljubljana, Slovenija

Prispjelo: 15. 3. 2004.Prihva}eno: 31. 3. 2004.

Adresa za dopisivanje: Dr. sc. Sa{a Ostoji}, dr. med., Medicinski fakultet u Rije-ci, Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Bra}e Branchetta 22, 51000 Rijeka.e-mail:[email protected]

256

To~an broj abnormalnih zigota u ~ovjeka nije poznat jerone propadaju rano u trudno}i, prije no {to se ustanovi

da je èna trudna. Ipak, smatra se da se od ukupnogbroja oplo|enih jajnih stanica ra|a samo 10–25% djece,{to navodi na zaklju~ak da je fenomen trudno}e u~ovjeka neuspje{niji nego {to se uobi~ajeno misli.Mogu}e je da su spontani poba~aji, pojedina~ni iliu~estali, evolucijsko sredstvo uklanjanja nenormalnihembrija, ~ime se smanjuje u~estalost ra|anja djece spriro|enim malformacijama.

U~estali spontani poba~aji, tri ili vi{e uzastopnihspontanih prekida trudno}e s istim partnerom prije 23.tjedna gestacije, javljaju se u 0,5–3% èna.1,2 Ta se

klini~ka slika dalje klasificira kao primarna, ako uop}enema ìvoro|ene djece, ili kao sekundarna, ako uz tri ilivi{e spontanih poba~aja postoje i uspje{ne trudno}e.3

Prema razdoblju prekida trudno}e, prenatalna sesmrt ploda dijeli na pretklini~ku (do 6. tjedna gestacije),gubitak embrija (od 6. do 10. tjedna gestacije) i gubitakfetusa (od 10. do 20. tjedna gestacije).1 Neèljeni seprekidi trudno}e mogu podijeliti na one kod kojih jerazlog rana smrt ploda zbog patolo{kog razvoja i onekod kojih je do{lo do anembrijske trudno}e (od engl.anembryonic pregnancies), kada se razvijaju samoembrionalne ovojnice bez ploda.

Iako su, s obzirom na incidenciju, u~estali spontanipoba~aji zna~ajan klini~ki problem, danas se moguprona}i uzroci u 50–60% slu~ajeva. Njihov ve}i diouzrokovan je geneti~ki, genskim ili kromosomskimabnormalnostima,4 no poku{aj lije~enja zasad je mogu}jedino u skupini negeneti~ke etiologije, uklju~uju}iispravljanje anatomskih nepravilnosti reproduktivnogsustava, lije~enje op}ih bolesti, suzbijanje infekcija, re-guliranje hormonskih poreme}aja i imunosnu terapiju.

Cilj je ovoga preglednog rada prikaz sada{njih spoz-naja geneti~kih razloga u~estalih spontanih poba~aja.

ETIOLOGIJA UÊSTALIH SPONTANIH POBAÂJA

Uzroci u~estalih spontanih poba~aja raznorodni su ibrojni, uklju~uju}i negeneti~ke i geneti~ke ~imbenike.1,5

Negeneti~ki uzroci obuhva}aju op}e bolesti, infekci-je,6 anatomske anomalije reproduktivnog sustava, sla-bosti vrata maternice, imunosne poreme}aje (uklju~uju}ipovi{enu CD56+16+ aktivnost stanica NK u krvi iendometriju, antifosfolipidna protutijela te autoimunebolesti),7,8 endokrine poreme}aje (uklju~uju}i polici-sti~ne jajnike, disfunkciju ùtog tijela, hiperprolaktinemi-ju, dijabetes, bolesti {titnja~e itd.),9-11 hemostatske i meta-boli~ke abnormalnosti (uklju~uju}i deficijenciju proteinaS, hiperhomocisteinemiju i antikardiolipinska protuti-jela),12,13 hemodinamske poreme}aje, tumore,1 utjecajokoli{nih ~imbenika, neke lijekove te psihi~ki stres.

Dob majke je, isto tako, zna~ajan ~imbenik rizika zaspontane poba~aje. Tako u èna u dobi od 22 do 24godine iznosi 8,9%, u èna od 42 godine vi{e od 50%, au èna starijih od 45 godina ~ak 74,7%.14 S godinamamajke, raste i rizik za sustavne bolesti, uklju~uju}iendokrine bolesti i poreme}aje metabolizma, {to moèutjecati na spontani prekid trudno}e, iako se smatra daje u èna starije reproduktivne dobi jedan od vode}ihuzroka u~estalih poba~aja geneti~ke prirode.

Od geneti~kih uzroka u~estalih spontanih poba~aja,najza~ajnije su kromosomske abnormalnosti.15 Uz struk-turne i broj~ane abnormalnosti ~ija je povezanost su~estalim spontanim poba~ajima poznata, malo se zna ovarijabilnosti i mutacijama gena uklju~enih u fiziolo{ke

procese tijekom gametogeneze i trudno}e, kao i ulozimultifaktorijalnih ~imbenika. Spontani poba~aj ~e{}i je uèna koje su ve} imale spontani poba~aj, a u~estalostraste s njihovim brojem,16 {to je u skladu s genskimmehanizmom kao obja{njenjem.

U radu }emo opisati poznate geneti~ke ~imbenike,kako kromosomske tako i genske, koji pridonose eti-ologiji u~estalih spontanih poba~aja. Prije osvrta nageneti~ku uzro~nost, uputit }emo na dio spoznaja u jed-nom od najistraìvanijih podru~ja genetike trudno}e –imunogenetici.

IMUNOGENETIKA TRUDNO]E

Tijekom normalne trudno}e embrij, koji je antigenobarem djelomi~no nepoznat majci, preìvi, raste i razvi-ja se, iako se tkivno nepodudarni transplantirani aloanti-geni uobi~ajeno odbacuju imunosnim odgovoromdoma}ina. Djelomi~no je ta proturje~nost rezultatodnosa na fetoplacentnoj povr{ini, gdje imunokompe-tentne stanice maj~ine decidue dolaze u neposredandodir s HLA (od engl. Human Leukocyte Antigen) – anti-genima o~eva podrijetla izraènim na stanicama tro-foblasta, fetalnom dijelu fetoplacentne povr{ine. Nave-deno rezultira stvaranjem hormona, citokina i drugih~imbenika koji, pojedina~no ili me|udjelovanjem, regu-liraju funkciju stanica na mjestu su~eljavanja majke iploda. Posebice je to va`no tijekom implantacije, kad jekontrola vaskularizacije jedan od klju~nih mehanizamaodrànja trudno}e.17

HLA-antigeni i u~estali spontani poba~aj

Geni HLA-regije kontroliraju strukturu mnogih va`nihpovr{inskih stani~nih antigena, utje~u na rast i razvoj tena raznolikost va`nih biolo{kih funkcija uklju~enih uimunosne odgovore, a povezani su s vi{e od 40 bolestiu ~ovjeka, uklju~uju}i tumore.18-19

Stanice trofoblasta jedina su vrsta stanica podrijetlomod embrija izloènih decidui i krvi majke, te stoga ~ineza{titnu barijeru od maj~inih izvr{nih stanica. Glavniza{titni mehanizmi uklju~uju regulaciju ekspresijeneklasi~nih HLA-molekula razreda I na stanicama tro-foblasta i nespecifi~no prepoznavanje putem gama-delta limfocita T. U ~ovjeka stanice ekstraviloznogcitotrofoblasta, koje vr{e invaziju na maj~inu deciduu ispiralne arterije tijekom trudno}e, ne izraàvaju“klasi~ne” HLA-A i HLA-B antigene klase I i “klasi~ne”HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR antigene klase II, kao niorgan specifi~ne i embrionalne (onkofetalne) antigene,ve} jedinstveno izraàvaju neklasi~ne HLA-antigeneklase I - HLA-G, HLA-E, kao i “klasi~ne” HLA-C antigeneograni~ene polimorfije.20-24 Ovaj obrazac ekspresijejedinstven je me|u HLA-genima i upu}uje na mogu-}nost da je HLA-G upleten u klju~ne interakcije za

S. Ostoji}, B. Peterlin GENETI^KI ÎMBENICI U ETIOLOGIJI UÊSTALIH SPONTANIH POBAÂJA Medicina 2004;42(40):256-264

257

uspostavljanje i/ili odràvanje trudno}e. Stoga su va`nai istraìvanja varijacija HLA-G gena, {to je opisano upoglavlju o polimorfizmima gena kao ~imbenicima pre-dispozicije za u~estale spontane poba~aje.

Poznata je i povezanost podudarnih HLA-antigena (odengl. HLA-sharing) u partnera i raznih poreme}aja repro-dukcije, uklju~uju}i u~estale spontane poba~aje.25-26 Upribli`no 50% istraìvanja u kojima je prona|ena pove-zanost, upozoreno je na razli~ite podudarne HLA-gen-ske lokuse u roditelja s u~estalim spontanim poba~a-jima.

Podudarnost HLA-antigena nije sama po sebi uzrokspontanih poba~aja, ve} su podudarni HLA-antigeni bi-ljezi za odre|ene HLA-vezane recesivne gene ili genskedefekte, blisko povezane s HLA-B,-DP,-DR i -DQ anti-genima4,27-36 koji su u roditelja u heterozigotnom obliku,dok u homozigotnom obliku u ploda mogu uzrokovatismrt.18,37 Christiansen i sur. postavljaju hipotezu poli-genskog obrasca naslje|ivanja, gdje HLA-vezani genidjeluju s drugim genima izraènim na fetusu ili na tro-foblastu.38

Uz razvojne defekte uzrokovane izravno HLA-veza-nim genima, fetalna smrt moè biti uzrokovana i epis-tatskim me|udjelovanjem izme|u HLA-vezanih semile-talnih recesivnih gena i heterozigotnih letalnih gena nadrugim kromosomima. HLA-podudarnost i prisutnost C3alela za transferin povezana je s u~estalim spontanimpoba~ajima, a ako su prisutna oba biljega zajedno,u~estalost je poba~aja jo{ izraènija.19,39 Osim me|udje-lovanja recesivnih semiletalnih gena, upozoreno je namogu}nost delecije u HLA-regiji, koja uzrokuje gubitakvezanih gena klju~nih za normalnu reprodukciju, kon-trolu rasta i razvoja te imunosne funkcije.18

Brojne su i studije koje, nasuprotno iznesenom,upu}uju na to da razina podudarnih HLA-antigena nijezna~ajno vi{a u parova u kojih se javljaju u~estali spon-tani poba~aji.32,40-43 Iako negativni, ovi rezultati neopovrgavaju ulogu koju HLA ima u reprodukciji jer jemogu}e postojanje neotkrivenih gena povezanih s HLA--regijom. Opre~ne rezultate i neslaganja te{ko je uskla-diti zbog metodolo{kih razlika istraìvanja i potencijalneheterogenosti izme|u subjekata.30 Uz to, vrlo je vjerojat-no da vi{e od jedne HLA-regije utje~e na reproduktivniishod i da geni koji utje~u na fertilnost nisu isklju~ivoHLA-geni ve} nepoznati geni u neravnoteì vezanosti(od engl. linkage disequilibrium) s HLA-B i HLA-DRgenima.44 Stoga fenomen neravnoteè vezanosti ucijeloj HLA-regiji dodatno oteàva zaklju~nu inter-pretaciju uloge roditeljske HLA-podudarnosti kao vjero-dostojnog ~imbenika genske predispozicije u~estalimspontanim poba~ajima.

Uloga citokina u trudno}i

Imunologija trudno}e u zadnjih je desetak godina sna`noobiljeèna Th-1/Th-2 obrascem citokina, koje stvarajudvije razli~ite vrste zrelih izvr{nih CD4+ limfocita T.Promjene u trudno}i uklju~uju posebno imunoregu-lacijsko okruènje u decidui u kojem citokini, ~imbenicirasta, steroidni hormoni te prostaglandini, potiskuju pro-liferaciju limfocita T, stvaranje Th-1 obrasca citokina iizraàj T stani~nog receptora, istodobno poti~u}i za{titniTh-2 citokinski odgovor.45 No koncept normalne trud-no}e kao Th-2 fenomen mora se razmatrati kao djelo-mi~no zastarjeo i zasigurno prekomjerno pojednostav-njen,46 s obzirom na nu`nost ekspresije Th-1 citokinaIFN-gama i IL-1 na implantacijskome mjestu tijekom nor-malne trudno}e.17,47 Stoga je potrebna revizija klasi~nihpostavki uloge Th-1/Th-2 citokinskih obrazaca tijekomrazli~itih razdoblja trudno}e u ~ovjeka i mi{a.46-48

Sloènost definiranja citokinske mreè u cijelostiuklju~uje spoznaju da pojedini citokini mogu stvaratisuprotne u~inke, {to ovisi o dozi i tempiranju njihovasudjelovanja u imunosnom odgovoru na fetoplacentnojpovr{ini. Navedeno moè biti posljedica genske varija-bilnosti, opisane u poglavlju o polimorfizmima gena kao~imbenicima predispozicije za u~estale spontane poba-~aje. Pokazano je da bi se individualne varijacijevisokog, srednjeg i niskog citokinskog odgovora moglepredvidjeti prema genotipu citokina.49 Kako su genskipolimorfizmi u promotorskim regijama odre|enih cito-kina povezani s njihovim izraàjem, jasno je da i lu~enjecitokina moè biti odre|eno na transkripcijskoj razini.50

GENETI^KE ABNORMALNOSTI KAO UZROKUÊSTALIH SPONTANIH POBAÂJA

Kromosomske abnormalnosti

Kod pojedina~nih spontanih poba~aja, unutar prvih 28dana trudno}e, kromosomske abnormalnosti javljaju se

u visokom postotku (25–62%).16,51,52 Naju~estaliji kro-mosomski uzroci spontanih poba~aja su trisomije kro-mosoma 13, 14, 15, 16, 18, 21 i 22, slijede poliploidije imonosomija X, dok je za razliku od u~estalih spontanihpoba~aja udio strukturnih kromosomskih abnormalnos-

ti najmanji. 51,53-56

I u 4% parova s u~estalim spontanim poba~ajima,nasuprost 0,2% u normalnoj populaciji, kromosomskeabnormalnosti roditelja glavni su geneti~ki uzrok.1,15,57

Treba upozoriti da postoji znatna razlika u vrsti kromo-somskih abnormalnosti kao uzroku u~estalih spontanihpoba~aja u odnosu na spontane poba~aje koji se neponavljaju.

Balansirane strukturne aberacije roditeljskih kromo-soma, uklju~uju}i translokacije i inverzije, glavni su kro-mosomski razlog u~estalih spontanih poba~aja. One


258

mogu uzrokovati nebalasirane strukturne promjene kro-mosoma u ploda te stoga postoji medicinska indikacijaza citogeneti~ku analizu partnera s u~estalim spontanimpoba~ajima (3 i vi{e uzastopnih prekida trudno}e, sistim partnerom, prije 23. tjedna gestacije).

Iako se smatra da broj~ane kromosomske abnormal-nosti ne pridonose zna~ajno geneti~koj etiologiji u~esta-lih spontanih poba~aja, treba upozoriti na mogu}uulogu gonadnog mozaicizma u roditelja kao uzro~nog~imbenika. Prisutnost broj~anih kromosomskih abnor-malnosti u stanicama spolnih `lijezda roditelja utje~e nastvaranje nebalansiranih kariotipova u ploda. Takavmozaicizam ne nalazimo rutinski budu}i da rutinskakariotipizacija uklju~uje stanice mezodermnog podrijet-la (limfociti periferne krvi).

Genske abnormalnosti

Iako su provedena brojna istraìvanja kako bi se identi-ficirali ~imbenici koji bi mogli uzrokovati u~estale spon-tane poba~aje, vrlo se malo zna o genskim mehanizmi-ma.58

Kod potencijalnih gena koji utje~u na fiziolo{ki tijektrudno}e, mogu}e su dvije vrste promjena koje mogupotaknuti poba~aj, uklju~uju}i monogenske nasljednebolesti – mutacije gena koje “sve ili ni{ta”-u~inkom kva-litativno mijenjaju fiziolo{ke mehanizme, kao i genskuvarijabilnost u obliku genskih polimorfizama, koji naiste mehanizme utje~e kvantitativno.

Monogenske nasljedne bolesti

Nekolicina je monogenskih nasljednih bolesti i klini~kiprepoznatljivih sindroma uz koje se javljaju u~estalispontani poba~aji. Mutacije gena odgovorne za spome-nute sindrome, odgovorne su i za u~estale neuspje{netrudno}e. Zna se za ~etiri sindroma koji se naslje|ujudominantno, vezano uz X-kromosom i kod kojihtijekom trudno}e dolazi do smrti mu{kih plodova:inkontinencija pigmenti (mutacija na lokusu Xq28),59

OFD (orofacijalnodigitalni) sindrom 1 (mutacija nalokusu Xp22.3-p22.2),60 fokalna dermalna hipoplazija(mutacija na lokusu Xp22.31) i Aicardijev sindrom(ageneza korpus kalozuma s korioretinalnom abnormal-no{}u; mutacija na lokusu Xp22).59 Franchi i sur.pokazali su da su u nasljednoj trombofiliji (mutacija nalokusu 20p11.2), mutacije gena THBD i EPCR bile ~e{}eu èna s neobja{njenim prekidima trudno}e nakon 20.tjedna gestacije.61

Uz to, postoje ohrabruju}i rezultati koji upu}uju namogu}e gene ~ije bi varijacije u obliku polimorfizamamogle biti ~imbenicima predispozicije u~estalih spon-tanih poba~aja, uklju~uju}i gene povezane s imunosnimsustavom, vaskularizacijom, apoptozom i dr.

Polimorfizam gena kao ~imbenik predispozicije zau~estale spontane poba~aje

Budu}i da genski polimorfizmi mogu rezultirati prom-jenom strukture i funkcije proteinskog proizvoda,zna~ajan dio istraìvanja etiologije neobja{njenihu~estalih spontanih poba~aja su studije genske varijabil-nosti klju~nih molekula u trudno}i, kao mogu}ih~imbenika predispozije.

Geni povezani s imunosnim sustavom

Imunosni sustav jedan je od klju~nih modulatora trud-no}e. Treba upozoriti na mogu}u va`nost genske varija-bilnosti brojnih molekula uklju~enih u taj sustav, kao~imbenika podlo`nosti u~estalim spontanim poba~a-jima. Genske varijacije u regulaciji ekspresije citokinamogli bi pridonijeti njihovu statusu, kao i posljedi~nomemoduliranju maj~ina imunosnog odgovora tijekom trud-no}e, posreduju}i normalnu trudno}u, ali, jednako tako,i njezin prekid. Tako su u èna s neobja{njenim u~esta-lim prekidima trudno}e prona|eni genski polimorfizmiTh1/Th2 citokina TNF-alfa, IFN-gama, TGF-beta, LIF, IL-1,IL-6 i IL-10.50,62-64

U posljednje vrijeme posebnu pa`nju izazivaproupalni citokin IL-18, snaàn induktor IFN-gama ~ija jeprisutnost tijekom trudno}e na mjestu implantacije pri-jeko potrebna.65 îni se da je za implantaciju, odràvanjedecidue, modifikaciju krvnih ìla uterusa i njihovu vazo-dilataciju te preìvljavanje fetoplacentne jedinice, oso-bito va`na regulacija aktivnosti uterinih stanica NK (odengl. Natural Killer), posebice putem IFN-gama, {to bimogao biti glavni posrednik njihove funkcije.17

Budu}i da smo se tijekom proteklih godina inten-zivno bavili lokalizacijom i razinom izraàvanja IL-18 nafetoplacentnoj povr{ini u mi{a,65-66 nastavili smoistraìvanje polimorfizama gena za IL-12/IL-18 u èna snormalnim trudno}ama, u odnosu na ène s u~estalimspontanim poba~ajima. Kako IL-12 poti~e ekspresijureceptora za IL-18 na limfocitima T i B, kao i makrofazi-ma koji sna`no produciraju IFN-gama kao odgovor naIL-18,67 razina ekspresije i mogu}i polimorfizam gena zaIL-12/IL-18 tijekom trudno}e mogu pridonijeti razumije-vanju odnosa na fetoplacentnoj jedinici, posebicetijekom implantacije.

Citokinsko okru`je koje omogu}ava preìvljavanjeploda, posredno je odre|eno jedinstvenom ekspresijomneklasi~nih HLA-antigena klase I na stanicama tro-foblasta.21,22 Iako paradoksalno, maj~ino prepoznavanjefetalnih aloantigena podrijetlom od oca dovodi dopreusmjerenja neprikladna imunosnog odgovorastani~nog tipa na prikladan humoralnog tipa, na ~emuse i temelji hipoteza imunotrofizma.68

S obzirom na iznimnu va`nost HLA-G gena u nor-malnoj trudno}i, u zadnje su vrijeme provedena brojna


259

istraìvanja veze HLA-G alelnih varijacija i u~estalihspontanih poba~aja.28 Aldrich i sur. upozorili su napove}anu u~estalost HLA-G*0104 ili HLA-G*0105N alela,istraùju}i HLA-G polimorfizme u 113 parova s neob-ja{njenim u~estalim spontanim poba~ajima,69 dok suPfeiffer i sur. pokazali zna~ajno pove}anje u~estalostiHLA-G alela *01013 ili *0105N u èna s u~estalim spon-tanim poba~ajima u usporedbi s kontrolnom sku-pinom.70

Geni povezani s koagulacijom i vaskularizacijiom

Uspje{na implantacija posljedica je me|udjelovanjareceptivnog endometrija, s jedne, i invazivnog trofoblas-ta, s druge strane. Vrlo rano tijekom trudno}e staniceendovaskularnog citotrofoblasta ranog zametka napada-ju maj~ine spiralne arterije i zamjenjuju endogeni endo-tel krvnih ìla, sve do razine njihova spoja s velikimkrvnim ìlama uterusa. Endovaskularni citotrofoblasttako|er napada sloj glatkih mi{i}a krvnih ìla, zamjenju-ju}i dijelom kontraktilno glatko mi{i}no tkivo. Poraditoga majka ne moè smanjiti sadràj hranjivih tvari ukrvi, koji dospijeva u placentu bez smanjivanja opskrbeza vlastita tkiva.

Stoga je istraìvanje polimorfizama gena, uklju~enihu modulaciju invazivnosti, vaskularizacije i koagulacijena fetoplacentnoj jedinici, iznimno vaàn prilog genskojetiologiji neobja{njenih u~estalih spontanih poba~aja.Nekoliko je studija u zadnje vrijeme uputilo na takvupovezanost, uklju~uju}i polimorfizme gena za koagu-lacijski ~ibenik V (Leiden),71-73 inhibitor aktivatoraplazminogena 1 (PAI1),74 protrombin,71,73,75 koagulacijs-ki ~imbenik XIII74 te apolipoprotein E.76

Kako venska tromboza na fetoplacentnoj jedinicimoè biti etiolo{ki ~imbenik poba~aja,77 posebice jezanimljivo istraìvanje mutacija koagulacijskog ~imbeni-ka V. To~kasta mutacija G1691A gena za ~imbenik Vnaziva se Leiden-mutacija, prema gradu u kojem jeotkrivena. Zna se da heterozigoti za Leiden-mutacijuimaju 5 do 10 puta ve}i rizik, a homozigoti ~ak do 95puta ve}i rizik za duboke venske tromboze.

Rey i sur. upozorili su na povezanost polimorfizamaodre|enih gena u nasljedne trombofilije, hiperkoagula-cijskog poreme}aja koji poti~e trombozu i u~estalihspontanih poba~aja.12 To uklju~uje mutacije gena zakoagulacijski ~imbenik V, metilentetrahidrofolat reduk-tazu (MTHFR) i protrombin G20210A (PTm), kao i defi-cijenciju proteina C, proteina S i antitrombina.

Gubitak fetusa u èna s trombofilijom mogao bi seobjasniti sna`nom trombozom u krvnim ìlama pla-cente, placentnim infarktom i sekundarnom uteropla-centnom insuficijencijom.78 I trombofilija u ploda moglabi biti upletena u mehanizam prekida trudno}e, poti~u}istvaranje ugru{ka na fetalnoj strani placente. Tako suDizon-Townson i sur., upozorili na pove}an postotak

spontanih poba~aja kada je plod bio nositelj Leiden--mutacije.79

Ostali geni

Osim gena povezanih s imunosnim sustavom, vaskula-rizacijom i koagulacijom, ~iji su polimorfizmi bili najvi{eistraìvani, u zadnje se vrijeme istraùju polimorfizmigena i drugih molekula u trudno}i zbog mogu}nosti dapredstavljaju ~imbenike predispozicije za u~estale spon-tane poba~aje neobja{njenog uzroka.

Progesteron je hormon koji je najizravnije odgovoranza odrànje trudno}e. Uz sustavnu funkciju, progesteronima i va`nu lokalnu ulogu. Limfociti koji izraàvajureceptor za progesteron, pod djelovanjem progesteronastvaraju PIBF (od engl. Progesterone induced blockingfactor), ~ijim posredstvom progesteron djeluje kaolokalni imunopotiskiva~ki ~imbenik na fetoplacentnojpovr{ini, koji smanjuje stanicama posredovan imunosniodgovor i citotoksi~nost stanica NK periferne krvi premaembrionalnim fibroblastima.80 Schweikert i sur. upu}ujuna povezanost polimorfizma gena za progesteronskireceptor i u~estalih spontanih poba~aja.81 Prona|ene sui pozitivne asocijacije u~estalih spontanih poba~aja ipolimorfizama gena va`nih u biotransformaciji moleku-la,82 metaboli~kim putevima76,83 te biosintezi moleku-la.84

BUDU]E SMJERNICE

Normalna trudno}a zahtijeva seriju imunosnih,endokrinih, metaboli~kih i krvoìlnih reguliraju}ihprocesa. Me|utim, zna~enje pojedinih gena uklju~enihu te procese nije dovoljno odre|eno. Do sada je upo-zoreno na vi{e od 40 gena ~ija je razina ekspresije u ènas u~estalim spontanim poba~ajima razli~ita u odnosuprema ènama s normalnim trudno}ama. Ipak, prijepostavljanja hipoteza o genskoj podlo`nosti u~estalihspontanih poba~aja, potrebno je precizno razlu~ivanjeuzroka u odnosu na posljedice.58

Zna~ajan uvid u kompleksnost genske kontroleranoga embrionalnog razvoja daju ìvotinjski modeli.Recesivni geni koji reguliraju rast, razvoj i reprodukciju,a vezani su uz glavni kompleks tkivne podudarnosti(MHC, od engl. Major Histocompatibility Complex),prona|eni su u mi{a, {takora i ~ovjeka.85 Mogu}e je daMHC/HLA-vezani geni ili genske abnormalnosti, koji suu heterozigotnom obliku u roditelja, mogu postatihomozigotni kod fetusa i uzrokovati njegov gubitak.Kod mi{a je najvi{e istraìvan T/t kompleks koji sadrìseriju lokusa, od kojih svaki ima multiple alele ~vrstovezane uz MHC. U~inci tih gena seù od smrti embrijado razmjerno manjih anomalija kostura, uklju~uju}iabnormalnosti reproduktivnog sustava.86 Knock outeksperimenti kod mi{a upozorili su na vi{e od 20 gena


260

~ija delecija ima za posljedicu rani prekid trudno}e. Tigeni mogu imati utjecaj i na postnatalni razvoj.

No osim gena koji su uklju~eni u procese prena-talnog i postnatalnog rasta i razvoja, a ~ije bi promjene ukvalitativnom i/ili kvantitativnom smislu mogle pri-donijeti u~estalim spontanim poba~ajima, potrebno jeupozoriti i na gene koji mogu potaknuti kromosomskenepravilnosti u roditelja, {to }e, isto tako, rezultiratineuspje{nom reprodukcijom. Mogu}e je postojanjenepoznatih genskih mutacija koje izazivaju nepravilnukonjugaciju, rekombinaciju i/ili nerazdvajanje homolog-nih kromosoma tijekom prve mejoti~ke diobe ili ne-razdvajanje sestrinskih kromatida tijekom druge, pose-bice u majke, te na taj na~in uzrokuju broj~ane abnor-malnosti kromosoma.87 Ako postoje geni koji modulira-ju razinu mejoti~ke rekombinacije kromosoma, mogu}eje i da njihove mutacije dovode do smanjene ili pove}a-ne razine rekombinacije i utje~u na preuranjeno razdva-janje homolognih kromosoma te posljedi~nu aneu-ploidiju.

Treba upozoriti i na mogu}u ulogu genomskog upisa(od engl. genomic imprinting), iznimke Mendelovazakona o jednakoj vrijednosti o~evih i maj~inih gena.Kako ekspresija nekih gena ovisi o roditeljskom podri-jetlu, za normalan razvoj ~ovjeka apsolutno je nu`naprisutnost genoma oba roditelja u zigoti. Stoga bi gre{kau genomskom upisu pojedinih molekula va`nih u trud-no}i, poput HLA-G, H19 i IGF-II, mogla pridonijeti gen-skoj etiologiji spontanih poba~aja.

Brojna istraìvanja mehanizama trudno}e nisu dalajasne smjernice koje bi pomogle prakti~arima kao dijag-nosti~ko ili terapijsko sredstvo u rje{avanju problemau~estalih spontanih poba~aja nepoznate etiologije. Na{doprinos sustavnom istraìvanju uloge genskih ~imbeni-ka u etiologiji u~estalih spontanih poba~aja, razvijat}emo kroz projekt HuMGeN (Human MiscarriageGenetic Network) koji smo pokrenuli na me|unarodnojrazini. Cilj je tog projekta skupljanje relevantnogaklini~kog materijala i testiranje gena kandidata asocija-cijskim studijama. Sva budu}a istraìvanja provodit}emo na istim uzorcima, a rezultate pojednih studijauklopiti u zajedni~ki mozaik koji nam moè pomo}i urazumijevanju u~estalih spontanih poba~aja nepoznateetiologije u ~ovjeka.

LITERATURA

1. Li TC, Makris M, Tomsu M, Tuckerman E, Laird S. Recurrentmiscarriage: aetiology, managment and prognosis. HumanReproduction Update 2002; 8:463-81.

2. Clifford K, Rai R, Regan L. Future pregnancy outcome inunexplained recurrent first trimester miscarriage. HumReprod 1997; 12:387–9.

3. McIntyre JA, McConnachie PR, Taylor CG, Faulk WP. Clini-cal, immunologic and genetic definitions of primary andsecondary recurrent spontaneous abortions. Fertil Steril1984; 42:849-55.

4. Gill TJ 3rd. Genetic factors in fetal losses. Am J ReprodImmunol Microbiol 1987; 15:133-7.

5. Bricker L, Farquharson RG. Types of pregnancy loss inrecurrent miscarriage: implications for research and clinicalpractice. Human Reproduction 2002; 17:1345-50.

6. Giles RW. Recurrent abortion caused by Haemophilusinfluenzae with subsequent successful pregnancy. J ObstetGynecol 2003; 23:87.

7. Hill JA. Immunological mechanisms of pregnancy mainte-nance and failure: A critique of theories and therapy. AJRI1990; 22:33-41.

8. Kutteh WH, Rote NS, Silver R. Antiphospholipid antibodiesand reproduction: The anti phospholipid antibody syn-drome. AJRI 1999; 41:133-52.

9. Roberts CP, Murphy AA. Endocrinopathies associated withrecurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med 2000; 18:357-62.

10. Rai R, Backos M, Rushworth F, Regan L. Polycystic ovariesand recurrent miscarriage-a reappraisal. Hum Reprod 2000;15:612-15.

11. Bussen S, Sutterlin M, Steck T. Endocrine abnormalities dur-ing the follicular phase in women with recurrent sponta-neous abortion. Hum Reprod 1999; 14:18-20.

12. Rey E, Kahn SR, David M, Shrier I. Thrombophilic disordersand fetal loss: a meta-analysis. Lancet 2003; 361:901-8.

13. Coumans ABC, Huijgens PC, Jakobs C, Schats R, de VriesJIP, van Pampus MG i sur. Haemostatic and metabolicabnormalities in women with unexplained recurrent abor-tion. Hum Reprod 1999; 14:211-14.

14. Nybo Andersen AM, Wohlfahrt J, Christens P, Olsen J, Mel-bye M. Maternal age and fetal loss: population based regis-ter linkage study. BMJ 2000; 320:1708-12.

15. Gill TJ III. Reproductive immunology; a personal view. AJRI1992; 27:87-8.

16. Smith A, Bannatyne P, Russel P, Elwood D, Den Dulk G.Cytogenetic studies in perinatal death. Aus N Zealand JObstet Gynaecol 1990; 30:206-10.

17. Ashkar AA, Di Santo JP, Croy BA. Interferon gamma con-tributes to initiation of uterine vascular modification, decid-ual integrity, and uterine natural killer cell maturation dur-ing normal murine pregnancy. J Exp Med 2000; 192:259–70.

18. Gill TJ 3rd. Role of the major histocompatibility complexregion in reproduction, cancer, and autoimmunity. Am JReprod Immunol 1996; 35:211-5.

19. Ho HN, Gill TJ III, Hsieh CY, Yang YS, Lee TY. The preva-lence of recurrent spontaneous abortions, cancer, and con-genital anomalies in the families of couples with recurrentspontaneous abortions or gestational trophoblastic tumors.Am J Obstet Gynecol 1991; 165:461-6.

20. Fernandez N, Cooper J, Sprinks M, AbdElrahman M, FiszerD, Kurpisz M i sur. A critical review of the role of the majorhistocompatibility complex in fertilization, preimplantationdevelopment and feto-maternal interactions. Hum ReprodUpdate 1999; 5:234-48.


261

21. Hutter H, Hammer A, Dohr G, Hunt JS. HLA expression atthe maternal-fetal interface. Dev Immunol 1998; 6:197-204.

22. Le Bouteiller P. The role of HLA-G expression in theembryo during implantation. J Gynecol Obstet Biol Reprod2004; 33:S9-12.

23. Le Bouteiller P, Sargent IL. HLA class I molecules in the pla-centa: which ones, where and what for? A workshop report.Placenta 2000; 21:93-6.

24. Hammer A, Hutter H, Dohr G. HLA Class I Expression onthe Materno-fetal interface. AJRI 1997; 38:150-8.

25. Ober C, Hyslop T, Elias S, Weitkamp LR, Hauck WW.Human leukocyte antigen matching and fetal loss: results ofa 10-year prospective study. Hum Reprod 1998; 13:33-8.

26. Thomas MJ, Harger JH, Wagener DK, Rabin BS, Gill III TJ.HLA-sharing and spontaneous abortion in humans. Am JObstet Gynecol 1985; 151:1053-8.

27. Kruse C, Steffensen R, Varming K, Christiansen OB. A studyof HLA-DR and -DQ alleles in 588 patients and 562 controlsconfirms that HLA-DRB1*03 is associated with recurrentmiscarriage. Hum Reprod 2004; 19:1215-21.

28. Ober C, Aldrich CL, Chervoneva I, Billstrand C, Rahimov F,Gray HL i sur. Variation in the HLA-G promoter regioninfluences miscarriage rates. Am J Hum Genet 2003;72:1425-35.

29. Takakuwa K, Adachi H, Hataya I, Ishii K, Tamura M, Tana-ka K. Molecular genetic studies of HLA-DRB1 alleles inpatients with unexplained recurrent abortion in the Japan-ese population. Hum Reprod 2003; 18:728-33.

30. Christiansen OB, Ring M, Rosgaard A, Grunnet N, Gluud C.Association between HLA-DR1 and -DR3 antigens andunexplained repeated miscarriage. Hum Reprod Update1999; 5:249-55.

31. Takakuwa K, Hataya I, Arakawa M, Kikuchi A, HigashinoM, Yasuda M i sur. Possible susceptibility of the HLA-DPB1*0402 and HLA-DPB1*04 alleles to unexplained recur-rent abortion: analysis by means of polymerase chain reac-tion-restricted fragment length polymorphism method. AmJ Reprod Immunol 1999; 42:233-9.

32. Sbracia M, Mastrone M, Scarpellini F, Grasso JA. Influenceof histocompatibility antigens in recurrent spontaneousabortion couples and on their reproductive performances.Am J Reprod Immunol 1996; 35:85-92.

33. Jin K, Ho HN, Speed TP, Gill TJ III. Reproductive failure andthe major histocompatibility complex. Am J Hum Genet1995; 56:1456-67.

34. Ober C, Steck T, van der Ven K, Billstrand C, Messer L,Kwak J i sur. MHC class II compatibility in aborted fetusesand term infants of couples with recurrent spontaneousabortion. J Reprod Immunol 1993; 25:195-207.

35. Gill TJ III. Invited Editorial: Influence of MHC and MHC-linked genes in reproduction. Am J Hum Genet 1992; 50:1-5.

36. Ho HN, Gill TJ 3rd, Nsieh RP, Hsieh HJ, Lee TY. Sharing ofhuman leukocyte antigens in primary and secondary recur-rent spontaneous abortions. Am J Obstet Gynecol 1990;163:178-88.

37. Gill TJ 3rd.Genetic factors in reproduction and their evolu-tionary significance. Am J Reprod Immunol 1997; 37:7-16.

38. Christiansen OB, Pedersen B, Mathiesen O, Husth M, Grun-net N. Maternal HLA class II alleles predispose to pregnan-cy losses in Danish women with recurrent spontaneousabortions and their female relatives. Am J Reprod Immunol1996; 35:239-44.

39. Gill TJ 3rd. Mechanisms of action of major-histocompatibil-ity-complex-linked genes affecting reproduction. Am JReprod Immunol 1999; 41:23-33.

40. Souza SS, Ferriani RA, Santos CM, Voltarelli JC. Immuno-logical evaluation of patients with recurrent abortion. JReprod Immunol 2002; 56:111-21.

41. Wagenknecht DR, Green KM, McIntyre JA. Analyses ofHLA-DQ alleles in recurrent spontaneous abortion (RSA)couples. Am J Reprod Immunol 1997; 37:1-6.

42. Dizon-Townson D, Nelson L, Scott JR, Branch DW, Ward K.Human leukocyte antigen DQ alpha sharing is notincreased in couples with recurrent miscarriage. Am JReprod Immunol 1995; 34:209-12.

43. Eroglu G, Betz G, Torregano C. Impact of histocompatibili-ty antigens on pregnancy outcome. Am J Obstet Gynecol1992; 166:1364-9.

44. Ober C. Current topic: HLA and reproduction: lessons fromstudies in the Hutterites. Placenta 1995; 16:569-77.

45. Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. Bidirection-al cytokine interactions in the maternal-fetal relationship: issuccessful pregnancy a Th2 phenomenon? ImmunologyToday 1993; 14:353-6.

46. Chaouat G, Ledee-Bataille N, Dubanchet S, Zourbas S, San-dra O, Martal J. Reproductive immunology 2003: reassess-ing the Th1/Th2 paradigm? Immunology Letters 2004;92:207-14.

47. Croy BA, Chantakru S, Esadeg S, Ashkar AA, Wei Q. Decid-ual natural killer cells: key regulators of placental develop-ment. J Reprod Immunol 2002; 57:151-68.

48. Chaouat G, Ledee-Bataille N, Dubanchet S, Zourbas S, San-dra O, Martal J. TH1 /TH2 paradigm in pregnancy: para-digm lost? Cytokines in pregnancy/early abortion: reexam-ining the TH1/TH2 paradigm. Int Arch Allergy Immunol2004; 134:93-119.

49. Hutchinson IV, Pravica V, Hajeer A, Sinnott PJ. Identifica-tion of high and low responders to allografts. Rev Immuno-genetics 1999; 1:323-33.

50. Reid JG, Simpson NAB, Walker RG, Economidou O, Shilli-to J, Goii HC i sur. The carriage of the pro-inflammatorycytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy loss.AJRI 2001; 45:35-40.

51. Rushdia ZY, Naeem R. Cytogenetic abnormalities in prod-ucts of conception: a relationship revisited. Am J ReprodImmunol 2004; 52:88-96.

52. Eiben B, Bartels I, Bahr-Porsh S, Borgmann S, Gatz G,Gellert G i sur. Cytogenesis analysis of 750 spontaneousabortions with the direct-preparation method of chorionicvilli and its implications for studying genetic causes of preg-nancy wastage. Am J Hum Genet 1990; 47:656-63.

53. Duzcan F, Atmaca M, Cetin GO, Bagci H. Cytogenetic stud-ies in patients with reproductive failure. Acta ObstetGynecol Scand 2003; 82:53–6.


262

54. Stephenson MD, Awartani KA, Robinson WP. Cytogeneticanalysis of miscarriages from couples with recurrent mis-carriage: a case - control study. Hum Reprod 2002; 17:446-51.

55. Badovinac AR, Bureti}-Tomljanovi} A, Star~evi} N, Kapovi}M, Vlasteli} I, Randi} L. Chromosome studies in patientswith defective reproductive success. Am J Reprod Immunol2000; 44:279–83.

56. Brajenovi}-Mili} B, Petrovi} O, Kra{evi} M, Risti} S, Kapovi}M. Chromosomal anomalies in abnormal human pregnan-cies. Fetal Diagn Ther 1998; 13:187-91.

57. Rubio C, Simon C, Vidal F, Rodrigo L, Pehlivan T, Remohi Ji sur. Chromosomal abnormalities and embryo develop-ment in recurrent miscarriage couples. Human Reproduc-tion 2003; 18:182-8.

58. Baek KH. Aberrant gene expression associated with recur-rent pregnancy loss. Mol Hum Reprod. 2004; 10:291-7.

59. Wettke-Schafer R, Kantner G. X-linked dominant inheriteddiseases with lethality in hemizygous males. Hum Genet1983; 64:1-23.

60. Ferrante MI, Giorgio G, Feather SA, Bulfone A, Wright V,Ghiani M i sur. Identification of the gene for oral-facial-dig-ital type I syndrome. Am J Hum Genet 2001; 68:569-76.

61. Franchi F, Biguzzi E, Cetin I, Facchetti F, Radaelli T, BozzoM i sur. Mutations in the thrombomodulin and endothelialprotein C receptor genes in women with late fetal loss. Br JHaematol 2001; 114:641-6.

62. Prigoshin N, Tambutti M, Larriba J, Gogorza S, Testa R.Cytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy lossof unknown cause. AJRI 2004; 52:36-41.

63. Daher S, Shulzhenko N, Morgun A, Mattar R, Rampim GF,Camano L i sur. Associations between cytokine gene poly-morphisms and recurrent pregnancy loss. J ReprodImmunol 2003; 58:69-77.

64. Babbage SJ, Arkwright PD, Vince GS, Perrey C, Pravica V,Quenby S i sur. Cytokine promoter gene polymorphismsand idiopathic recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol2001; 51:21-7.

65. Ostoji} S, Dubanchet S, Chaouat G, Abdelkarim M, TruyensC, Capron F. Demonstration of the presence of IL-16, IL-17and IL-18 at the murine fetomaternal interface duringmurine pregnancy. Am J Reprod Immunol 2003; 49:101-12.

66. Chaouat G, Zourbas S, Ostoji} S, Lappree-Delage G,Dubanchet S, Ledee N i sur. A brief review of recent data onsome cytokine expressions at the materno-foetal interfacewhich might callenge the classical Th1/Th2 dichotomy.Journal of Reproductive Immunology 2002; 53:241-56.

67. Ahn HJ, Maruo S, Tomura M, Mu J, Hamaoka T, NakanishiK i sur. A mechanism underlying synergy between IL-12and IFN-gamma-inducing factor in enhanced production ofIFN-gamma. J Immunol 1997; 159:2125-31.

68. Wegmann TG. Fetal protection against abortion: is itimmunosuppression or immunostimulation ? Ann Immunol1984; 135:309-12.

69. Aldrich CL, Stephenson MD, Karrison T, Odem RR, BranchDW, Scott JR i sur. HLA-G genotypes and pregnancy out-come in couples with unexplained recurrent miscarriage.Mol Hum Reprod 2001; 7:1167-72.

70. Pfeiffer KA, Fimmers R, Engels G, van der Ven H, van derVen K. The HLA-G genotype is potentially associated withidiopathic recurrent spontaneous abortion. Mol HumReprod 2001; 7:373-8.

71. Finan RR, Tamim H, Ameen G, Sharida HE, Rashid M,Almawi, WY. Prevalence of factor V G1691A (factor V-Lei-den) and prothrombin G20210A gene mutations in a recur-rent miscarriage population. Am J Hematol 2002; 71:300-5.

72. Wramsby ML, Sten-Linder M, Bremme K. Primary habitualabortions are associated with high frequency of factor VLeiden mutation. Fertil Steril 2000; 74:987-91.

73. Foka ZJ, Lambropoulos AF, Saravelos H, Karas GB, Karavi-da A, Agorastos T i sur. Factor V leiden and prothrombinG20210A mutations, but not methylenetetrahydrofolatereductase C677T, are associated with recurrent miscar-riages. Hum Reprod 2000; 15:458-62.

74. Dossenbach-Glaninger A, van Trotsenburg M, DossenbachM, Oberkanins C, Moritz A, Krugluger W i sur. Plasminogenactivator inhibitor 1 4G/5G polymorphism and coagulationfactor XIII Val34Leu polymorphism: impaired fibrinolysisand early pregnancy loss. Clin Chem 2003; 49:1081-6.

75. Pihusch R, Buchholz T, Lohse P, Rubsamen H, RogenhoferN, Hasbargen U i sur. Thrombophilic gene mutations andrecurrent spontaneous abortion: prothrombin mutationincreases the risk in the first trimester. Am J ReprodImmunol 2001;46:124-31.

76. Zetterberg H, Palmer M, Ricksten A, Poirier J, Palmqvist L,Rymo L i sur. Influence of the apolipoprotein E epsilon4allele on human embryonic development. Neurosci Lett2002; 324:189-92.

77. Kupferminc MJ, Eldor A, Steinman N, Many A, Bar-Am A,Jaffa A i sur. Increased frequency of genetic thrombophiliain women with complications of pregnancy. N Engl J Med1999; 340:9-13.

78. Arias F, Romero R, Joist H, Kraus FT. Thrombophilia: amechanism of disease in women with adverse pregnancyoutcome and thrombotic lesions in the placenta. J MaternFetal Med 1998; 7:277-86.

79. Dizon-Townson DS, Meline L, Nelson LM, Varner M, WardK. Fetal carriers of the factor V Leiden mutation are proneto miscarriage and placental infarction. Am J ObstetGynecol 1997; 177:402-05.

80. Szekeres-Bartho J, Varga P, Kinsky R, Chaouat G. Proges-terone-mediated immunosuppresion and the maintenanceof pregnancy. Res Immunol 1990; 141:175-81.

81. Schweikert A, Rau T, Berkholz A, Allera A, Daufeldt S, WildtL. Association of progesterone receptor polymorphism withrecurrent abortions. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004;113:67-72.

82. Sata F, Yamada H, Kondo T, Gong Y, Tozaki S, Kobashi Gi sur. Glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphismsand the risk of recurrent pregnancy loss. Mol Hum Reprod2003; 9:165-9.

83. Zetterberg H, Regland B, Palmer M, Rymo L, ZafiropoulosA, Arvanitis DA i sur. The transcobalamin codon 259 poly-morphism influences the risk of human spontaneous abor-tion. Hum Reprod 2002; 17:3033-6.


263

84. Sata F, Yamada H, Yamada A, Kato EH, Kataoka S, Saijo Yi sur. A polymorphism in the CYP17 gene relates to the riskof recurrent pregnancy loss. Mol Hum Reprod. 2003; 9:725-8.

85. Lokki ML, Laitinen T. Role of major histocompatibility com-plex class III genes in recurrent spontaneous abortions.Front Biosci 2001; 6:23-9.

86. Gill TJ 3rd, Siew S, Kunz HW. Major histocompatibility com-plex (MHC)-linked genes affecting development. J ExpZool 1983; 228:325-45.

87. Hixon M, Millie E, Judis LA, Sherman S, Allran K, Taft L i sur.FISH studies of the sperm of fathers of paternally derivedcases of trisomy 21: no evidence for an increase in aneu-ploidy. Hum Genet 1998; 103:654-7.


264

SA@ETAK

Cilj na{eg istraìvanja bio je ustanoviti u~estalost C282Y i H63Dmutacija u bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljezarazli~ite etiologije. U istraìvanje je bilo uklju~eno 105 bolesnika (84mu{karca i 21 èna) koji su podijeljeni u dvije skupine. U prvoj jeskupini bilo 55 bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza, koji su prekomjerno konzumirali alkohol, a u drugoj 50bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljeza nepoznate eti-ologije. Prisutnost mutacija u HFE genu ustanovili smo metodomlan~ane reakcije polimeraze (PCR) nakon koje je slijedila restrikcija sodgovaraju}im restrikcijskim endonukleazama.Prema dobivenim rezultatima, frekvencije C282Y i H63D alela u skupinibolesnika koji su konzumirali alkohol, iznose 4,5% i 20,1%, a u bolesnikas povi{enim vrijednostima serumskog èljeza nepoznate etiologije 18,0%i 19,0%. Usporedbom u~estalosti HFE alela i genotipova izme|u nave-denih skupina bolesnika utvrdili smo statisti~ki zna~ajnu razliku (p<0,05)u frekvenciji C282Y alela kao i u frekvenciji C282Y homozigota.Na{i rezultati upu}uju na to da je analiza mutacija HFE gena korisna ubolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljeza, pogotovo kadnije jasno ima li bolesnik jetrenu bolest s povi{enim vrijednostimaserumskog èljeza ili ima nasljednu hemokromatozu uz povi{enenalaze jetrenih enzima.

KLJU^NE RIJEÎ: nasljedna hemokromatoza, mutacije HFE-gena,C282Y, H63D, konzumacija alkohola, èljezo

ABSTRACT

To study the role of hemochromatosis gene mutations in patients withelevated serum iron, we have analysed C282Y and H63D mutations ofthe HFE gene. The investigation included 105 patients (84 males and21 females) divided in two groups: 55 active alcoholic individuals (49males and 6 females) and 50 individuals (35 males and 15 females)with elevated serum iron of unknown etiology. The analysis of HFEgene mutations was performed using the PCR-RFLP method.According to our results C282Y and H63D allele frequencies were4.54% and 20.09% in active alcoholics and 18.00% and 19.00% in thesecond group of patients without the history of alcohol consumption,respectively. Comparing the HFE allele and genotype frequenciesbetween investigated groups statistically significant differences (p0.05) were observed in the frequency of C282Y allele and the fre-quency of C282Y homozygotes.Our results suggest that the analysis of HFE mutations can be useful inpatients with the elevated serum iron, especially in patients withunclear hereditary hemochromatosis or another liver disease, such asalcoholic liver disease.

KEY WORDS: hereditary hemochromatosis; HFE gene mutations,C282Y, H63D, alcohol consumption, iron

Izvorni rad Medicina 2004;42(40):265-270Original paper UDK: 612.392.4:575.113.1

MUTACIJE GENA ZA HEMOKROMATOZU U BOLESNIKA S POVIŠENIMVRIJEDNOSTIMA SERUMSKOG @ELJEZA

HEMOCHROMATOSIS GENE MUTATIONS IN PATIENTS WITH ELEVATED SERUM IRON

Nada Star~evi} îzmarevi}1, Sandra Mili}2, Smiljana Risti}1, Davor Štimac2, Miljenko Kapovi}1

Ustanova: 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci, 2Katedra za internu medicinu, Medicinski fakultet Sveu~ili{tau Rijeci


Adresa za dopisivanje: Mr. sc. Nada Star~evi} îzmarevi}, dipl. ing., Zavod zabiologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, Bra}eBranchetta 20, 51000 Rijeka. Tel. 051-651-129. e-mail: [email protected]

nima s o{te}enjem tkiva i posljedi~nom funkcijskominsuficijencijom, posebno jetre, gu{tera~e, srca, koè ihipofize. S obzirom na na~in nastajanja, postoji nasljed-na ili hereditarna hemokromatoza (NH) za koju se znada je uzrokovana mutacijama gena za hemokromatozu(HFE), i ste~ena hemokromatoza koja je nastala talo-ènjem èljeza i o{te}enjem tkiva zbog drugih bolesti.1

Ste~eni poreme}aji taloènja èljeza, kao {to je npr. ualkoholnoj cirozi jetre, u parenhimnim organima mogudovesti do iste klini~ke slike i patolo{kih promjena kaoi NH.

UVOD

Hemokromatoza je poreme}aj u metabolizmu èljeza ukojemu pove}ana crijevna apsorpcija èljeza dovodi donjegova prekomjernog odlaganja u parenhimnim orga-

265

Nekad se vjerovalo da je bolest koju danas poznaje-mo kao hemokromatozu, samo jedan oblik alkoholneciroze. Bliska povezanost pretjerane konzumacije alko-hola i klini~ke ekspresije hemokromatoze predmet jezanimanja ve} vi{e godina budu}i da ciroza jetre obi-ljeàva teì stadij bolesti i u hemokromatozi i u alkohol-noj bolesti jetre.2 U obje su bolesti poreme}eni para-metri èljeza. @eljezo inducira oksidativni stres koji imaklju~nu ulogu u patogenezi alkoholne bolesti jetre i uhemokromatozi.

Nasljedna hemokromatoza jedna je od naj~e{}ihautosomnih recesivnih bolesti u europskoj populaciji.HFE gen lokaliziran je na kra}em kraku kromosoma 6(6p21.3), ~ime je postalo mogu}e genetsko testiranje zadvije mutacije (C282Y i H63D) koje se naj~e{}e povezu-ju s bolesti.3

Dijagnosti~ki algoritam (slika 1.) za NH promijenio seotkako je dostupna analiza mutacija HFE gena, ~ime jeporaslo zanimanje za probir populacije, a time i ranu dija-gnozu bolesti i odgovaraju}u terapiju.4 I danas je pri sum-nji na hemokromatozu, potrebno najprije odrediti kon-centraciju serumskog èljeza, ukupan kapacitet vezanjaèljeza (TIBC), zasi}enje transferina (èljezo/TIBCx100%)i feritin, a tek onda provesti gensku analizu.5

Naime, bolesnici s NH-om u 60-100% slu~ajeva suhomozigoti za mutaciju C282Y ili sloèni heterozigoti zaC282Y mutaciju na jednom alelu i H63D mutaciju nadrugom alelu te u 1% homozigoti za mutaciju H63D.3,6

Ostale mutacije povezane s NH-om jo{ se istraùju.Namjera je na{eg istraìvanja bila ustanoviti

u~estalost C282Y i H63D mutacija u bolesnika s povi{e-nim vrijednostima serumskog èljeza razli~ite etiologije.

BOLESNICI

U istraìvanje je bilo uklju~eno ukupno 105 bolesnika(84 mu{karca i 21 èna) koji su u razdoblju od 1. lipnja2002. do 1. lipnja 2003. obra|ivani na Gastroentero-lo{kom odjelu ili poliklini~koj slu`bi Klinike za internumedicinu Klini~koga bolni~kog centra Rijeka, a usta-novljene su im povi{ene vrijednosti serumskog èljeza.Bolesnici su bili upoznati s istraìvanjem te su dali pisanipristanak, a istraìvanje je odobrilo Eti~ko povjerenstvoMedicinskog fakulteta u Rijeci. U svih je bolesnika uzetadetaljna anamneza i odre|eni odgovaraju}i biokemijskipokazatelji serumskog èljeza. Na osnovi anamnesti~kihpodataka osnovane su dvije skupine bolesnika. U prvojje skupini bilo 55 bolesnika (49 mu{karaca i 6 èna) s

N. Star~evi} îzmarevi}, S. Mili}, S. Risti} i dr. MUTACIJE GENA ZA HEMOKROMATOZU... Medicina 2004;42(40):265-270

266

Slika 1. Dijagnosti~ki algoritam (preuzeto iz Pietrangelo A. Haemochromatosis. Gut 2003; 52(Suppl III); ii23-iii30)

Figure 1 Diagnostic algorithm (taken from Pietrangelo A. Haemochromatoasis. Gut 2003; 52(Suppl III); ii23-iii30)

1 wt/wt- wild type – normalan genotip2 C282Y/C282Y3 C282Y/H63D

povi{enim vrijednostima serumskog èljeza, koji sukonzumirali alkohol u koli~inama ve}im od 80 g/dantijekom 5 i vi{e godina, a u drugoj 50 bolesnika spovi{enim vrijednostima serumskog èljeza nepoznateetiologije.

Iz istraìvanja su isklju~eni i bolesnici s prije dijagnos-ticiranim bolestima: talasemijom major, sideroblastienomanemijom, hemoliti~kom anemijom, s prekomjernim uzi-manjem èljeza (prehrana, transfuzije), s akutnim (virusnii toksi~ni hepatitis) i kroni~nim jetrenim bolestima i jasnodefiniranom dijagnozom (kroni~ni virusni hepatitis B i C,porphyria cutanea tarda, portokavalni spoj i dr.) tebolesnici na dugotrajnoj hemodijalizi.

METODE

Iz seruma bolesnika odre|ivala se vrijednost èljeza2,4,6-tri (2 pyridyl) -5-triazinom, a UIBC kolorimetrij-skom metodom. Povi{ena vrijednost serumskog èljezabila je iznad 26,9 mol/l.

Bolesnicima je izva|eno i 6 ml periferne krvi, koja jedo DNA-izolacije zamrznuta u epruvetama s antikoagu-lansom na -20oC. Za molekularno-genetieku analizuizolirali smo DNA prema standardnom protokolu teutvr|ivali prisutnost svake od mutacija u HFE-genu spomo}u lan~ane reakcije polimeraze (PCR) nakon koje

je slijedila restrikcija s odgovaraju}im restrikcijskim enzi-mima (Rsa I za C282Y mutaciju i Mbo I za H63D mutaci-ju). Uvjete i po~etnice za lan~anu reakciju polimerazeopisali su Feder i suradnici.3 Restrikcijske fragmenterazdvojene elektroforezom analizirali smo pod UV-lam-pom i ovisno o migraciji restrikcijskih fragmenata nagelu razlikovali smo homozigote normalnog genotipa,heterozigote i homozigote za svaku navedenu mutaciju(slika 2.).

Usporedba u~estalosti C282Y i H63D alela i genoti-pova izme|u skupina bolesnika provedena je χ2-testomi Fisherovim egzaktnim testom, a statisti~ka zna~ajnostrazlika izraèna je na razini 0,05.

REZULTATI

Distribucija HFE genotipova u obje skupine bolesnika spovi{enim vrijednostima serumskog èljeza prikazana jeu tablici 1.

U skupini od 55 bolesnika koji uz povi{ene vrijed-nosti serumskog èljeza prekomjerno konzumiraju alko-hol, njih 28 (50,9%) imalo je uredan genotip, a 27(48,1%) bolesnika imalo je neku od ispitivanih HFE mutacija. U ovoj skupini samo je jedna osoba (0,9%) bilahomozigot, i to za H63D mutaciju. Niti jedna osoba nijebila sloèni heterozigot za navedene mutacije. Hete-


267

Slika 2. Veli~ina PCR-produkta i restrikcijskih fragmenata zapojedini genotip pri analizi C282Y-lokusa

Figure 2 Size of PCR product and restrictive fragments for par-ticular genotype in analysing C282Y locus

1 - PCR-produkt2 - normalan homozigot3 - homozigotna mutacija4 - heterozigot

Slika 3. Veli~ina PCR-produkta i restrikcijskih fragmenata zapojedini genotip pri analizi H63D-lokusa

Figure 3 Size of PCR product and restrictive fragments for par-ticular genotype in analysing H63D locus

1 - PCR-produkt2 - normalan homozigot3 - homozigotna mutacija4 - heterozigot

rozigota za C282Y mutaciju bilo je 5 (9,1%), a hetero-zigota za H63D mutaciju 21 (38,2%).

U drugoj skupini od 50 bolesnika s povi{enim vrijed-nostima serumskog èljeza, 21 (42,0%) bolesnik imao jeuredan genotip, a 29 (58,0%) bolesnika imalo je neku odispitivanih HFE mutacija. Prona{li smo pet C282Y homo-zigota (10,0%), dok su tri osobe (6,0%) bile sloèni hete-rozigoti s C282Y mutacijom na jednom kromosomu iH63D mutacijom na drugome homolognom kromoso-mu. U ovoj skupini bolesnika heterozigota za C282Ymutaciju bilo je 5 (10,0%), a heterozigota za H63D mu-taciju 16 (32,0%).

Usporedbom pojedinih HFE genotipova izme|udviju skupina bolesnika, ustanovljena je statisti~ki

zna~ajna razlika (p 0.05) u u~estalosti C282Y homozigo-ta u bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza nepoznate etiologije.

Da bismo ustanovili frekvencije C282Y i H63D alelau bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza analizirali smo ukupno 210 kromosoma na tedvije mutacije. Dobiveni rezultati u skupini bolesnika spovi{enim vrijednostima serumskog èljeza i pove-}anom konzumacijom alkohola pokazuju da je ukupnafrekvencija C282Y alela iznosila 4,5%, a frekvencijaH63D alela 20,1% (tablica 2.). Frekvencija C282Y alela uskupini bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza nepoznate etiologije iznosila je 18,0%, te 19,0%za H63D alel (tablica 2.).


268

Tablica 1. Distribucija u~estalosti HFE-genotipova u bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljeza

Table 1 Distribution of HFE genotype incidence in patients with elevated serum iron

C282Y H63D I. skupina1 II. skupina2 pN (%) N (%)

-/- -/- 28 (50,9) 21 (42,0) NS3

-/- +/- 21 (38,2) 16 (32,0) NS3

-/+ -/- 5 (9,1) 5 (10,0) NS3

-/- +/+ 1 (1,8) 0 NS3

+/+ -/- 0 5 (10,0) <0,05

+/- +/- 0 3 (6,0) NS3

Ukupno 55 50

1 bolesnici s povi{enim serumskim èljezom koji su preko-mjerno konzumirali alkohol

2 bolesnici s povi{enim serumskim èljezom nepoznate etio-logije

3 NS - nema statisti~ke zna~ajnosti

Tablica 2. Mutacije HFE-gena: frekvencija alela (%) u bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskog èljeza

Table 2 HFE gene mutations: allele frequency (%) in patients with elevated serum iron

Mutacije HFE-gena I. skupina1 II. skupina2 p(N=55) (N=50)

C282Y 4,5 18,0 <0,05

H63D 20,1 19,0 NS3

1 bolesnici s povi{enim serumskim èljezom koji su preko-mjerno konzumirali alkohol

2 bolesnici s povi{enim serumskim èljezom nepoznate etio-logije

3 NS - nema statisti~ke zna~ajnosti

Frekvencija C282Y alela bila je statisti~ki zna~ajnove}a (p<0,05) u skupini bolesnika s povi{enim serum-skim èljezom nepoznate etiologije.

RASPRAVA

Istraìvanjem smo obuhvatili bolesnike s povi{enim vri-jednostima serumskog èljeza, podijeljene u dvijeskupine, u kojih smo ustanovili u~estalost HFE alela igenotipova odgovornih za razvoj manifestne hemokro-matoze. Razlikovanjem skupina bolesnika koji konzu-miraju alkohol u prekomjernim koli~inama i bolesnika spovi{enim serumskim èljezom nepoznate etiologijenastojali smo pokazati nu`nost molekularno-geneti~keanalize u diferencijaciji nasljedne i ste~ene hemokroma-toze.

Za razliku od niza studija o zna~enju HFE mutacija udijagnostici hemokromatoze, do sada je u literaturiobjavljeno svega nekoliko studija o ulozi mutacija HFEgena u bolesnika s alkoholnom bolesti jetre.7-10 Što seti~e C282Y mutacije, frekvencija ovog alela u na{ihbolesnika iznosila je 4,5%, {to je statisti~ki zna~ajnomanje nego u ostalih bolesnika s povi{enim vrijednosti-ma serumskog èljeza nepoznate etiologije (tablica 2.), ane odstupa od vrijednosti objavljenih za op}u hrvatskupopulaciju (3,3%).11 Takav rezultat odgovara ve}spomenutim studijama iz ovog podru~ja i ne upu}uje napovezanost ove mutacije s razvojem alkoholne bolestijetre.

U bolesnika koji prekomjerno konzumiraju alkohol,jedna je osoba bila homozigot za H63D mutaciju (tabli-ca 1.), a u~estalost H63D alela (20,1%) (tablica 2.), kojije ina~e podjednako i s ve}om u~estalo{}u zastupljen uraznim europskim populacijama, nije se statisti~kizna~ajno razlikovala od frekvencije u hrvatskoj popu-laciji (14,5%).11 Rezultati objavljeni u dvije studije9,10 oulozi ove mutacije u alkoholnoj bolesti jetre opre~ni su,i iako na{i rezultati nisu ustanovili izravnu uklju~enostH63D mutacije u razvoj alkoholne bolesti jetre, nemoèmo negirati svaku vezu budu}i da je hetereozigotaza tu mutaciju (38,2%) vi{e u bolesnika nego u op}ojpopulaciji (23%).

U bolesnika s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza nepoznate etiologije, ustanovili smo 5 homozi-gota (10%) za C282Y mutaciju, a frekvencija C282Y alelaje 18%. Dosada{nje brojne studije pokazuju ulogumutacija HFE gena u dijagnostici NH. Pojavnost homo-zigota za C282Y mutaciju u oboljelih je razli~ita urazli~itim studijama: Austrija 78%, Francuska 91%, Italija69%, Velika Britanija 92%, Sjedinjene Ameri~ke Dràve82%, Kanada 95%.6 Jazwinska i sur.12 su pak u studiji uAustraliji ustanovili da su svi oboljeli (100%) bili homo-zigoti za C282Y mutaciju. U studijama Pietrangela,13 Ca-relle,14 Olynyka,15 Mure16 i Beutlera17 o~ekivano je zna-

~ajno vi{a frekvencija C282Y alela u bolesnika s NH-omi vrijednosti iznose od 43% do 86%.

Mogu}i razlog {to je u na{ih bolesnika na|en manjibroj homozigota za C282Y mutaciju u odnosu premaprije navedenim studijama jest postojanje razlika u kri-terijima za uklju~ivanje jer su u navedenim studijama, uzpovi{enu vrijednost serumskog èljeza, uzete u obzir ipovi{ene vrijednosti zasi}enja transferinom i/ilipovi{ene vrijednosti feritina. Na prije navedene kriterijeu na{em istraìvanju, iz kojih bi se mogli izdvojiti nosio-ci mutacija HFE gena kao i oni s genotipovima odgo-vornim za NH, odlu~ili smo se zbog relativne jednos-tavnosti i dostupnosti. Razlike u u~estalosti C282Ymutacije bi se mogle objasniti i etni~kim razlikamaodnosno zemljopisnim smje{tajem ispitivanih populaci-ja. Stoga je na{a pretpostavka da u populacijama sniòm frekvencijom C282Y alela nego u zemljama sje-verne i zapadne Europe, ostale mutacije HFE gena teodre|eni okoli{ni ~imbenici mogu biti jedan od kofak-tora za razvoj klini~ki manifestnog NH-a.

Što se ti~e H63D mutacije, razina u~estalosti homo-zigota za H63D mutaciju kre}e se me|u bolesnicima, uobjavljenim studijama, oko 1%.6 U na{ih bolesnika spovi{enim serumskim èljezom nismo ustanovili nitijednog homozigota, a frekvencija H63D alela iznosi19%. Frekvencija H63D alela u studijama Deugniera18 iSteinberga19 iznosi 18,4%, odnosno 21,1% i odgovarana{im rezultatima.

Studije u europskim populacijama pokazuju da jefrekvencija sloènih heterozigota C282Y/H63D u bole-snika 4-6%.6 Na{i se rezultati uklapaju u navedene su~estalo{}u sloènih heterozigota od 6%.

Serumsko èljezo, TS i feritin uobi~ajeni su biokemij-ski testovi koji se upotrebljavaju u dijagnostici hemo-kromatoze. Povi{enje razine èljeza moè biti post-prandijalno, ali postoje i diurnalne promjene koncen-tracije èljeza te je senzitivnost ove pretrage 56%, a akoje udruèna s povi{enjem TS i feritina, senzitivnostpostaje ve}a (86%).20 Isto tako, èljezo i feritin mogu bitinormalni u mladih bolesnika ili pak povi{eni zbogmnogih razloga (kroni~ni virusni hepatitis, alkoholnabolest jetre, nealkoholni steatohepatitis, u nekim malig-nim bolestima i u drugim upalnim stanjima).

@eljezo i alkohol nezavisni su hepatotoksini sasli~nim patogenim mehanizmom. Konzumacija alkoho-la poti~e prekomjerno nakupljanje èljeza i zna~ajnopove}ava rizik od ciroze jetre u bolesnika s NH-om.21

Razlog zbog kojega prekomjerna konzumacija alkoholanagla{ava klini~ku ekspresiju hemokromatoze, nejasanje. Najvjerojatnije bi obja{njenje bilo da su èljezo i alko-hol dodatni kofaktori, a svaki od njih izaziva oksidativnistres i fibrogenezu jetre.

êsta dijagnosti~ka nedoumica nastupa kad nijejasno ima li bolesnik jetrenu bolest (npr. alkoholnu


269

cirozu jetre) s povi{enim vrijednostima serumskogèljeza ili bolesnik ima NH uz povi{ene nalaze jetrenihenzima.

Upravo u takvim je okolnostima analiza mutacija HFEgena iznimno korisna, {to je dokazalo i na{e istraìvanje.Ako je bolesnik homozigot za C282Y ili sloèni hete-rozigot C282Y/H63D, optere}enje èljezom najvjerojat-nije je uzrokovano genetskim poreme}ajem. S drugestrane, ako bolesnik ima neku drugu jetrenu bolest (npr.alkoholnu bolest jetre) i heterozigot je za C282Y, hete-rozigot za H63D ili nema niti jednu od tih mutacija, pre-optere}enje èljezom vjerojatno je uzrokovano osnov-nom jetrenom bole{}u, a mo`da manjim dijelom HFE genotipom.

LITERATURA1. Powell LW, Isselbacher KJ. Hemokromatoza. U: Harrison

(ed.) Principi interne medicine. Prvo hrvatsko izdanje,

Split, Placebo, 1997:1814-6.

2. Fletcher LM, Powell LW. Hemochromatosis and alcoholic

liver disease. Alcohol 2003; 30:131-6.

3. Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA,

Basava A et al. A novel MHC class I-like is mutated in

patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet

1996; 13:399-408.

4. Bulaj ZJ, Griffen LM, Jorde LB, Edwards CQ, Kushner JP.

Clinical and biochemical abnormalities in people het-

erozygous for hemochromatosis. N Engl J Med 1996;

335:1799-1805.

5. Powell LW, George K, McDonnell SM, Kowdley KV. Diag-

nosis of hemochromatosis. Ann Intern Med 1998; 129:925-

31.

6. Brissot P, Moirand R, Jouanolle AM, Guyader D, Le Gall JY,

Deugnier Y, David V. A genotypic study of 217 unrelated

probands diagnosed as “genetic hemochromatosis” on

“classical” phenotypic criteria. J Hepatol 1999; 30: 588-93.

7. Brandhagen DJ, Fairbanks VF, Baldus WP, Smith CI,

Kruckeberg KE, Schaid DJ, Thibodeau SN. Prevalence and

clinical significance of HFE gene mutations in patients with

iron overload. Am J Gastroenterol 2000; 95:2910-4.

8. Frenzer A, Rudzki Z, Norton I, Butler WJ. Heterozygosity of

the haemochromatosis mutation, C282Y, does not influ-

ence susceptibility to alcoholic cirrhosis. Scand J Gastroen-terol 1998; 33:1324

9. Grove J, Daly AK. Heterozygotes for HFE mutations haveno increased risk of advanced alcoholic liver disease. Gut1998; 43:262-6.

10. Ropero GP, Villegas MA, Fernandez AM, Garcia-AgundezJA, Gonzalez FFA, Benitez RJ et al. C282Y and H63D muta-tions of HFE gene in patients with advanced alcoholic liverdisease. Rev Esp Enferm Dig 2001; 93:156-63.

11. Ristic S, Makuc J, Starcevic N, Logar N, Brajenovic-Milic B,Stepec S et al. Hemochromatosis gene mutations in theCroatian and Slovenian populations. Clin Genet 2003;64:444-6.

12. Jazwinska EC, Cullen LM, Busfield F, Pyper WR, Webb SI,Powell LW et al. Haemochromatosis and HLA-H. NatGenet 1996; 14:249-51.

13. Pietrangelo A, Montosi G, Totaro A, Garuto C, Conte D,Cassanelli S et al. Hereditary hemochromatosis in adultswithout pathogenic mutations in the hemochromatosisgene. N Engl J Med 1999; 341:725-32.

14. Carella M, DeAmbrosio L, Totaro A, Grifa A, Valentino MA,Piperno A et al. Mutation analysis of the HLA-H gene inItalian haemochromatosis patients. AM J Hum Genet 1997;60:828-32.

15. Olynyk JK, Cullen DJ, Aquilia S, Rossi E, Summerville L,Powell LW. A population-based study of the clinicalexpression of the hemochromatosis gene. N Engl J Med1999; 341:718-24.

16. Mura C, Nousbaum JB, Verger P, Moalic MT, Raguenes O,Mercier AY, Ferec C. Phenotype-genotype correlation inhaemochromatosis subjects. Hum Genet. 1997; 101:271-6.

17. Beutler E, Felitti VJ, Koziol JA, Ho NJ, Gelbart T. Pene-trance of 845G A (C282Y) HFE hereditary haemochro-matosis mutation in the USA. Lancet 2002; 359:211-8.

18. Deugnier YM, Turlin B, Loreal O. Iron and neoplasia JHepatol 1998; 28:21-5.

19. Steinberg KK, Cogswell ME, Chang JC, Caudill SP, McQuil-lan GM, Bowman BA et al. Prevalence of C282Y and H63Dmutations in the hemochromatosis (HFE) gene in the Unit-ed States. JAMA. 2001; 285:2216-22.

20. Tavill AS. Diagnosis and management of hemochromato-sis. Hepatology 2001; 33:1321-8.

21. Fletcher LM, Dixon JL, Purdie DM, Powell LW, CrawfordDH. Excess alcohol greatly increases the prevalence of cir-rhosis in hereditary hemochromatosis. Gastroenterology2002; 122: 281-9.


270

SA@ETAK

Da bi se ispitalo mogu}e zna~enje proteoliti~kih mehanizama narazvoj upalnih lezija u MS-u, u radu je analiziran utjecaj polimorfizma4G/5G u promotorskoj regiji gena za inhibitor aktivatora plazmino-gena-1 (PAI-1) na podlo`nost za MS i klini~ku ekspresiju bolesti. Ispi-tanici su bili bolesnici iz Gorkog kotara s klini~ki sigurnim i labora-torijski potvr|enim sigurnim MS-om (N=46), a u kontrolnoj su skupinibili dobrovoljni davatelji krvi, autohtoni stanovnici iz istog podru~ja(N=101). Rezultati su pokazali da se distribucija PAI-1 genotipova ialela u MS-bolesnika nije statisti~ki razlikovala od u~estalosti u zdravihispitanika, a razlike nije bilo niti kada su uspore|eni pojedini subtipovibolesti (PP, SP i RR) me|usobno kao i sa zdravim ispitanicima. Nijebilo ni statisti~ki zna~ajne razlike u dobi nastupa i progresiji bolestiizme|u pojedinih PAI-1 genotipova. Stoga moèmo zaklju~iti dapolimorfizam 4G/5G PAI-1 gena nema utjecaja na podlo`nost kao nina ekspresiju bolesti u MS-bolesnika iz Gorskog kotara.

KLJU^NE RIJEÎ: multipla skleroza, inhibitor aktivatora plazminogena-1,

rizi~ni ~imbenik

ABSTRACT

In view of the potential importance of the proteolytic mechanisms in thedevelopment of MS lesions, the authors studied whether the 4G/5G pro-moter polymorphism of the plasminogen activator inhibitor 1 (PAI 1)gene may play a role in the clinical characteristics of Gorski kotar MSpatients and their potential genetic susceptibility to MS. A total of 46patients with clinically definite and laboratory supported MS wererecruited from Gorski kotar region, while the control group consisted of101 unrelated ethnically matched healthy blood donors. The distribu-tion of PAI-1 genotypes and alleles in MS patients was similar to the dis-tribution pattern in healthy donors. Furthermore, no association wasobserved between the PAI-1 promoter polymorphism and clinical char-acteristics, such as clinical course, age of disease onset and disease pro-gression. Therefore, we can conclude that the 4G/5G promoter poly-morphism of the PAI-1 gene does not influence the susceptibility to MSor the clinical characteristics of MS in Gorski kotar patients.

KEY WORDS: multiple sclerosis, plasminogen activator inhibitor 1, riskfactor

Izvorni rad Medicina 2004;42(41):271-275Original paper UDK: 616.832-004.2:575.113.1

POLIMORFIZAM 4G/5G U PROMOTORSKOJ REGIJI GENA ZA INHIBITORAKTIVATORA PLAZMINOGENA–1 KAO RIZI^NI ÎMBENIK U MULTIPLOJ

SKLEROZI

4G/5G POLYMORPHISM IN PROMOTER REGION OF PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR-1GENE AS RISK FACTOR IN MULTIPLE SCLEROSIS

Smiljana Risti}1, Nada Star~evi}-îzmarevi}1, Juraj Sep~i}2, Josip Rude`3, Marija Crni}-Martinovi}4,

Vesna Barac-Latas5, Miljenko Kapovi}1

Ustanova: 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci, 2Poslijediplomski studij, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta uRijeci, 3Klinika za neurologiju, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, 4Zavod zatransfuziologiju, KBC Rijeka, 5Zavod za fiziologiju i imunologiju, Medicinskifakultet Sveu~ili{ta u Rijeci


Adresa za dopisivanje: Prof. dr. sc. Smiljana Risti}, Zavod za biologiju i medicin-sku genetiku, Medicinski fakultet Rijeka, Bra}e Branchetta 20, 51000 Rijeka. Tel.051/651181. e-mail: [email protected]

podupiru saznanja o pove}anom relativnom rizikubra}e i sestara oboljelih (20–40 puta) u usporedbi sop}om populacijom, kao i pove}ana konkordantnastopa u monozigotnih (25%–30%) u usporedbi s dizigot-nim blizancima (5%).1 Geneti~ke studije velikog brojaobitelji s obiteljskom i/ili blizana~kom MS-om, sugerira-ju da je MS poligenska bolest u kojoj je podlo`nost zabolest odre|ena ve}im brojem gena koji djeluju neovis-no ili epistatski.2 Identifikacija gena s pomo}u pozicij-skog kloniranja, uklju~enih u patogenezu MS-a, slijediuglavnom dva pravca. Prvi je pravac istraìvanja poli-morfnih gena ~iji su produkti uklju~eni u imunolo{kiodgovor – glavni kompleks histokompatibilnosti

UVOD

Multipla skleroza (MS) sloèna je bolest multifaktorijalneuzro~nosti, za ~iju su patogenezu potrebni geneti~ki iokoli{ni ~imbenici. Ulogu geneti~kih ~imbenika u MS-u

271

(MHC), T-stani~ni receptorni geni, geni za tumorski fak-tor nekroze (TNF) i imunoglobulinski geni, koji redompokazuju odre|eni geneti~ki utjecaj na podlo`nost zaMS. Drugi pravac su istraìvanja genomskog probira,koja identificiraju vi{e od 19 lokusa podlo`nosti za MS,uklju~uju}i 5p14, 5q13, 6p21, 7q21, 17q22 i 19q13.2 Unedavnim studijama pokazan je i utjecaj specifi~nih gen-skih polimorfizama na podlo`nost i/ili ekspresiju MS-a.3-7

Rezultati tih istraìvanja, s iznimkom MHC-gena,pokazali su se te{ko ponovljivim u ostalim populacija-ma. Razli~iti rezultati u navedenim studijama, koji seodnose na utjecaj razli~itih gena i lokusa, mogu se objas-niti geneti~kom i etiolo{kom heterogenosti u MS-u. Ta~injenica upu}uje na to da odre|ene populacije, pogla-vito one koje se odlikuju visokom incidencijom i preva-lencijom za MS, predstavljaju izazovne modele zaistraìvanje te bolesti. U svijetu su takve istraène popu-lacije rijetke: Orkney otoci u sjevernoj Škotskoj(250/105), Shetland otoci u sjeveroisto~noj Škotskoj(100/105) te Sardinija (102/105).8 Razlike u geneti~kojstrukturi tih populacija, utvr|enih HLA-studijama, govo-re o zna~enju geneti~ke podloge za MS-podlo`nost te opotrebi nastavka takvih studija za procjenu geneti~kih~imbenika u MS-u.

Cilj je ovog rada istraìvanje specifi~nog polimorfiz-ma gena za inhibitor aktivatora plazminogena -1 (PAI-1)u MS-bolesnika Gorskog kotara (Hrvatska), jo{ jednojzoni visokog rizika za MS u Europi (prevalencija143,5/105)9 i njegova utjecaja na podlo`nost za MS iekspresiju bolesti.

ISPITANICI I METODE

Ispitanici

Analizirali smo 46 bolesnika – 24 ène i 22 mu{karca(spolni indeks: 1,09) iz Gorskog kotara, slu~ajevi kli-ni~ki sigurne i laboratorijski potkrijepljene sigurne mul-tiple skleroze (kriteriji prema Ch. M. Poseru).10 Bolesni-ci su bili obra|eni prema protokolu European Databasefor Multiple Sclerosis (EDMUS).11

U kontrolnoj skupini bili su zdravi dobrovoljnidavatelji krvi (N=101), autohtoni stanovnici togapodru~ja, nesrodni me|usobno i s MS-bolesnicima.

Svi su ispitanici bili anketirani i nakon njihova pris-tanka uzeta im je periferna krv iz v. cubitalis.

Genotipizacija

DNA iz periferne krvi ispitanika bila je izolirana premastandardnom protokolu. Polimorfizam 4G/5G u promo-torskoj regiji PAI-1 gena ustanovljen je s pomo}umetode lan~ane reakcije polimeraze (PCR) premauputama M. Luomala i suradnika.14 Slijedila je restrikcijaPCR-produkata s Bsl-restrikcijskom endonukleazom.

Restrikcijska smjesa inkubirana je tijekom 2,5 sata uvodenoj kupelji pri temperaturi od 55°C. Restrikcijskifragmenti provjeravani su elektroforezom na 4% aga-roznom gelu, pri ~emu su se jasno razlikovali 4G4G,4G5G i 5G5G genotipovi (slika 1.).

Statisti~ka obrada

Uporabom ra~unalnih programa Statistica 6,0 i Epi 6,uspore|ena je u~estalost alela i genotipova izme|uskupina MS-bolesnika i kontrole χ2 i Fisherovim egzakt-nim testom. Po~etno doba i trajanje bolesti te stupnjeviinvalidnosti u pro{irenoj ljestvici prema J. F. Kurtzkeu(EDSS)12 i indeks progresije MS-a u bolesnika s razli~itimPAI-1 genotipovima, ispitani su ANOVA-one waytestom. Statisti~ka zna~ajnost razlika izraèna je na razi-ni 0,05.

REZULTATI

Osnovne klini~ke karakteristike MS-bolesnika prikazanesu u tablici 1.

Trajanje bolesti odre|eno je razdobljem od po~etnogdoba bolesti do zadnjega klini~kog pregleda, a indeksprogresije kao odnos EDSS-a i trajanja bolesti.

Spol i dob izme|u skupina MS-bolesnika i kontrolenisu bili statisti~ki zna~ajno razli~iti.

S. Risti}, N. Star~evi}-îzmarevi}, J. Sep~i} i dr. POLIMORFIZAM 4G/5G U PROMOTORSKOJ REGIJI GENA... Medicina 2004;42(40):271-275

272

Slika 1. Analiza PAI-1 genotipova. Linija 1: 50 bp DNA marker;linije 2,4: 5G5G genotip (77bp i 22 bp); linije 3,6: 4G5Ggenotip (98bp, 77bp i 22bp); linija 5: 4G4G genotip (98bp).Restrikcijski fragment od 22 bp ne vidi se na prikazanomegelu.

Figure 1 PAI-1 genotype analysis. Line 1: 50 bp DNA marker;lines 2,4: 5G5G genotype (77bp and 22 bp); lines 3,6: 4G5Ggenotype (98bp, 77bp and 22bp); line 5: 4G4G genotype (98bp). Restrictive fragment of 22 bp cannot be seen on the pre-sented gel.

Tablica 1. Klini~ke karakteristike MS-bolesnika iz Gorskogkotara, Hrvatska (N=46)

Table 1 Clinical characteristics of MS patients from Gorskikotar region, Croatia (N=46)

Distribucija PAI-1 genotipova i alela u MS-bolesnikau kontrolnih ispitanika prikazana je u tablici 2. Distribu-cija genotipova i alela nije se statisti~ki razlikovalaizme|u skupina MS- bolesnika i kontrolnih ispitanika, arazlika nije bilo ni u usporedbi pojedinih evolucijskihoblika bolesti me|usobno kao niti s kontrolom.

Ovisnost klini~ke ekspresije bolesti od razli~itih PAI-1 genotipova prikazana je u tablici 3. Nije bilo sta-tisti~ki zna~ajne razlike u dobi nastupa, trajanju, stupnjuinvalidnosti i indeksu progresije izme|u pojedinihgenotipova.

RASPRAVA

Patologija MS-a izraàva se razasutim upalnim i dege-nerativnim o{te}enjima mijelina ìv~ane osi. Razvoj tiho{te}enja dijelom je posljedica proteoliti~kih u~inakaaktivatora plazminogena (PA) i metaloproteaza matricerazli~ita djelovanja: pospje{uju migraciju imunosnih


273

Spolni indeks 1,09

Dob nastupa bolesti a (godine) 27,6 (9,0)

Trajanje bolestia (godine) 21,6 (11,1)

Primarno progresivni MS (PP) n (%) 5 (10,9)

Sekundarni MS (SP) n (%) 21 (45,6)

Relapsno-remitiraju}i MS (RR) n (%) 20 (43,5)

Stupnjevi invalidnosti (EDSS)b 6.0 (3,2)

Indeks progresije (PI)c 0.36 (0,25)

a, b, c. vrijednosti izraène su kao prosjek (standardna

devijacija, SD)

Tablica 2. Distribucija PAI-1 genotipova i alela u MS-bolesnika iz Gorskog kotara, Hrvatska, i kontrolnih ispitanika

Table 2 Distribution of PAI-1 genotypes and alleles in MS patients from Gorski kotar region, Croatia, and in control group

Genotipovi MS bolesnici Kontrola P(N=46) (N=101)

PP (N=5) SP (N=21) RR (N=20) ukupno n (%) n (%) n (%) n (%) n (%)

4G4G 1 (20,0) 5 (23,8) 2 (10,0) 8 (17,4) 31 (30,7) ns

4G5G 4 (80,0) 10 (47,6) 16 (80,8) 30 (65,2) 50 (49,5) ns

5G5G 0 6 (28,6) 2 (10,0) 8 (17,4) 20 (19,8) ns

Aleli % % % % %

4G 60,0 47,6 50,0 50,0 55,4 ns

5G 40,0 52,4 50,0 50,0 44,6 ns

Tablica 3. Odnos PAI-1 genotipova i klini~kih karakteristika u MS-bolesnika iz Gorskog kotara, Hrvatska

Table 3 Relation between PAI-1 genotypes and clinical characteristics in MS patients from Gorski kotar region, Croatia

Karakteristike PAI-1 genotipovi P

4G4G 4G5G 5G5G

Dob nastupa bolesti (godine) 28,4 (9,5) 27,4 (9,6) 27,6 (7,2) ns

Trajanje bolesti (godine) 15,5 (8,4) 22,2 (11,4) 25.4 (10,9) ns

Stupnjevi invalidnosti (EDSS) 6,6 (2,9) 5,4 (3,2) 7,6 (3,2) ns

Indeks progresije 0,52 (0,30) 0,32 (0,22) 0,34 (0,24) ns

a, b, c. vrijednosti izraène su kao prosjek (standardna devijacija, SD)

stanica kroz krvno-mo`danu membranu nakon {to su jeo{tetili, te degradiraju mijelin.13,14,16

Aktivatori plazminogena glavni su pokreta~i kaskad-ne aktivnosti nekoliko metaloproteaza. Aktivnost samo-ga PA moè biti zako~ena posredstvom PAI-1. U àri-{tima (plakovima) MS-a prisutni su i PA i PAI-1.16 U ani-malnom modelu, PAI-1 obustavlja razvoj alergijskogencefalomijelitisa vjerojatnom inhibicijom proteoliti~kihmehanizama prisutnih u procesu demijelinizacije.14 Sin-teza, proizvodnja i aktivnost PAI-1 regulirane su sna`nimgenetskim mehanizmima. Polimorfizam 4G/5G u pro-motorskoj regiji PAI-1 gena daje kao rezultat tri mogu}agenotipa: 4G4G, 4G5G, i 5G5G. Genotip 5G5G, in vivo iin vitro, uvjetuje niù koncentraciju PAI-1 te je sasvimmogu}e da taj genotip utje~e na patogenezu MS-a.17

Na{e je istraìvanje usmjereno na utjecaj PAI-1 genana podlo`nost i klini~ku ekspresiju MS-a, bolesti jo{danas neidentificirane (etio)patogeneze. Op}e je prih-va}eno da je MS poligenska bolest u kojoj svaki pojedi-na~ni lokus umjereno pridonosi njezinoj predispoziciji.2

Ne iznena|uje, dakle, dana{nji procvat istraìvanja ozdruènosti specifi~nih genskih polimorfizama i MS.3-7

Razli~itost rezultata tih istraìvanja name}e potrebuusmjerenja novih geneti~kih studija MS-a u stanovni{tvudonedavnih zemljopisnih izolata, primjenom sve pre-ciznijih dijagnosti~kih algoritama i kriterija. Stoga je una{em radu ispitan polimorfizam 4G/5G u promotorskojregiji PAI-1 gena u MS-bolesnika iz Gorskoga kotara,podru~ja visokog rizika za tu bolest. Dijagnoza jepostavljena na osnovi Poserovih kriterija koji su sepokazali najprikladnijim u epidemiolo{kim i klini~kimistraìvanjima MS-a.

Nedavno utvr|ena zdruènost 5G5G genotipa u MS--bolesnica u Finskoj (OR=2,3, 95% CI: 1,04-5,23) kojapretpostavlja da smanjena proizvodnja proteaznihinhibitora utje~e na patogenezu MS-a u èna, te dokazlokacije PAI-1 gena na 7q21.3-22, koja se poklapa slokusom podlo`nosti za MS – izazovi su za poduzeto iprovedeno istraìvanje.17,18

Temeljni su rezultati tog istraìvanja sljede}i: dis-tribucija PAI-1 genotipova i alela u MS-bolesnika izGorskoga kotara statisti~ki se ne razlikuje od one uzdravom autohtonom stanovni{tvu; me|u razli~itimevolucijskim oblicima bolesti uspore|uju}i ih me|usob-no i s kontrolom te, kona~no, izme|u spolova (S. Risti},neobjavljeno priop}enje 2004.). Ispitivani polimorfizam4G/5G u promotorskoj regiji PAI-1 gena, dakle, nemautjecaja ni na podlo`nost ni na tijek bolesti u MS-bo-lesnika iz Gorskoga kotara.

Niska genetska heterogenost autohtonog stanovni{-tva Gorskoga kotara eliminirala je ~est problem kojioptere}uje sli~ne populacijsko-asocijacijske studije ukojima je ispitivanje mogu}ih geneti~kih ~imbenika napredispoziciju za bolest problemati~no zbog geneti~kih

razlika izme|u ispitanika razli~itog etni~kog podrijetla. Sdruge strane, mogu}nost detekcije malog utjecaja ispiti-vanog ~imbenika ograni~ena je malim uzorkom bolesni-ka te ~injenicom da “odgovorni genotip” tako|er moèbiti u~estao u stanovni{tvu.

Zato je u novije vrijeme veliko zanimanje pokazanoza studije koje se bave identificiranjem gena koji mije-njaju “pona{anje” same bolesti jer bi to dovelo i dorazvoja novih terapijskih postupaka i pristupa MS-u. Tasu istraìvanja pokazala da problem etni~kih razlika uodre|enom stanovni{tvu nije odlu~uju}i za procjenuutjecaja specifi~noga genetskog ~imbenika na klini~kuekspresiju bolesti. U na{em ispitivanju po~etno doba,trajanje, stupnjevi invalidnosti i indeks progresije bolestinisu bili statisti~ki zna~ajno razli~iti izme|u osoba kojesu imale 4G4G, 4G5G ili 5G5G genotipove.

Zaklju~ujemo, dakle, da polimorfizam 4G/5G PAI-1gena nema utjecaja na podlo`nost kao ni na ekspresijuMS-a u autohtonom stanovni{tvu Gorskog kotara.

LITERATURA

1. Ebers GC, Koopman WJ, Hader W, Sadovnick AD, Kre-menchutzky M, Mandalfino P, et al. The natural history ofmultiple sclerosis: a geographically based study: 8: familialmultiple sclerosis. Brain. 2000; 123 ( 3):641-649.

2. Compston A. Genetic susceptibility to multiple sclerosis.In: Compston A, Ebers GC, Lassmann H, McDonald I,Matthews B and Wekerle H, eds. McAlpine’s Multiple Scle-rosis. 3rd ed, London Livingstone, 2000,pp.101-142.

3. Tienari PJ, Wikström J, Sajantila A, Palo J, Peltonen L.Genetic susceptibility to multiple sclerosis linked to myelinbasic protein gene. Lancet 1992; 340: 987–991

4. Nejentsev S, Laaksonen M, Tienari PJ, Fernandez O,Cordell H, Ruutiainen J, et al. Intercellular adhesion mole-cule-1 K469E polymorphism: study of association withmultiple sclerosis. Hum Immunol 2003; 64(3): 345-9.

5. Niino M, Fukazawa T, Yabe I, Kikuchi S, Sasaki H, TashiroK. Vitamin D receptor gene polymorphism in multiple scle-rosis and association with HLA class II alleles. J Neurol Sci2000; 177: 65-71.

6. Niino M, Kikuchi S, Fukazawa T, Yabe I, Tashiro K. Estro-gen receptor polymorphism in Japanese patients with mul-tiple sclerosis. J Neurol Sci 2000; 179: 70-5.

7. Niino M, Kikuchi S, Fukazawa T, Yabe I, Tashiro K. Genet-ic polymorphisms of osteopontin in association with mul-tiple sclerosis in Japanese patients. J Neuroimmunol 2003;136/1-2: 125-9.

8. Kurtzke JF. Multiple sclerosis in time and space - geo-graphic clues to cause. J Neurovirol 2000; 6(Suppl 2): S134-S140.

9. Sep~i} J, Antonelli L, Materljan E, Šepi}-Grahovac D. Mul-tiple sclerosis cluster in Gorski kotar, Croatia. In: BattagliaMA, ed. Multiple Sclerosis Research. Amsterdam: ElsevierScience Publishers B V, 1989,pp.165-169.


274

10. Confavreux C, Compston DAS, Hommes OR, McDonaldWI, Thompson AJ. EDMUS, a European database for mul-tiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiat 1992; 55:671-676.

11. Poser CM, Paty DW, Scheinberg L, et al. New diagnosticcriteria for multiple sclerosis: Guidelines for research pro-tocols. Ann Neurol 1983; 13:227-231.

12. Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple scle-rosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurolo-gy 1983; 33:1444-1452.

13. Leppert D, Waubant E, Burk M, Oksenberg J, Hauser S.Interferon beta-1b inhibits gelatinase secretion and in vitromigration of human T cells: a possible mechanism for treat-ment efficacy in multiple sclerosis. Ann Neurol 1996;40:846–852.

14. Gijbels K, Galardy R, Steinman L. Reversal of experimentalautoimmune encephalomyelitis with a hydroxamate

inhibitor of matrix metalloproteases. J Clin Invest1994;94:2177–2182.

15. Proost P, Van Damme J, Opdenakker G. Leukocyte gelati-nase B cleavage releases encephalitogens from humanmyelin basic protein. Biochem Biophys Res Commun1993; 192:1175–1181.

16. Cuzner M, Gveric D, Strand C, et al. The expression of tis-sue-type plasminogen activator, matrix metalloproteasesand endogenous inhibitors in the central nervous system inmultiple sclerosis: comparison of stages in lesion evolu-tion. J Neuropathol ExpNeurol1996; 55:1194–1204.

17. Luomala M, Elovaara I, Ukkonen M, Koivula T, LehtimäkiT. Plasminogen activator inhibitor 1 gene and risk of MS inwomen. Neurology 2000; 54/9:1864-4.

18. Haines JL, Ter-Minassian M, Bazyk A, et al. A completegenomic screen for multiple sclerosis underscores a rolefor the major histocompatibility complex. Nat Genet 1996;13:469–471.


275

ZAHVALA

Rad je izra|en u okviru projekta broj 0062016, koji je odobrilo Ministarstvo za obrazovanje, znanost i {port Republike Hrvatske.

Zahvaljujemo svim ispitanicima koji su dobrovoljno sudjelovali u istraìvanju. Posebnu zahvalnost dugujemo prof. dr. sc. Boru-

tu Peterlinu, predstojniku Zavoda za medicinsku genetiku Univerziteta u Ljubljani, s kojim sura|ujemo u istraìvanjima

geneti~kih ~imbenika u multiploj sklerozi.

SA@ETAK

Cilj je ovoga rada prikazati organizaciju prenatalne skrbi na podru~jurije~ke regije te iznijeti rezultate dobivene primjenom neinvazivnih(biokemijski test probira za Downov sindrom – DS) i invazivnih meto-da (rana amniocenteza – RAC) detekcije kromosomopatija u plodatijekom drugog tromjese~ja trudno}e. Od svibnja 1986. do kolovoza 2004. izvedeno je 1856 RAC-a, a od1996. godine biokemijskoj analizi seruma u svrhu procjene rizika zaDS primjenom dvostrukog (MS-AFP i slobodni β-hCG) ili trostrukogtesta (MS-AFP, slobodni β-hCG i nE) pristupilo je 10.057 trudnica.Aberirani kariotip ustanovljen je u 2,6% provedenih RAC-a, odnosnoanaliza stanica plodove vode. U 73% detektiranih aberacija radilo se onumeri~koj promjeni kromosoma, a naj~e{}a je to bila trisomija 21(69%). Preostalih 27% aberacija odnosi se na strukturne promjene kro-mosoma, od kojih je 54% nastalo kao posljedica svjeè mutacije (denovo), dok su ostale bile obiteljskog podrijetla. U 23% strukturnihaberacija radilo se o nebalansiranoj promjeni.Stopa detekcije DS-a primjenom biokemijskog testa probira za DS u~itavom uzorku iznosila je 64% (14/22), a od 2000. godine, otkako serabi trostruki test, iznosi 70% (7/10), uz 6,9% pozitivnih nalaza. Respektabilan broj utvr|enih abnormalnih kariotipova u drugomtromjese~ju trudno}e jasno upu}uje na va`nost primjene i invazivnih ineinvazivnih metoda prenatalne dijagnostike.

KLJU^NE RIJEÎ: rana amniocenteza, prenatalni test probira za DS

ABSTRACT

The purpose of this paper was to present the organization of prenatalcare in the city of Rijeka and to present the results obtained by non-invasive (biochemical screening for Down syndrome-DS) and invasivemethods (amniocentesis-AC) for chromosomal aberration detectionduring the second trimester of pregnancies.A total of 1856 AC were performed from May 1986 until August 2004and 10,057 pregnant women underwent prenatal biochemical screen-ing for DS using double (MS-AFP and free β-hCG) or triple tests (MS-AFP, free β-hCG and nE).The frequency of abnormal karyotypes in the pregnancies that under-went AC was 2,6%. The most common aberration was numerical (73%)with trisomy 21 in great numbers (69%). Structural anomaly was foundin 27% of all obtained aberrations and 54% of them were de novomutation. Unbalanced structural abnormalities were present in 23% ofall of them.The detection rate for DS using non-invasive test was 64% (14/22), butfrom the year 2000 until now the detection rose to 70% (7/10), with the6.9% screen positive rate.The respectable number of abnormal karyotypes identified in ourwork clearly demonstrated that non-invasive as well as invasive meth-ods should be used in prenatal diagnostics during the secondtrimester.

KEY WORDS: amniocentesis, prenatal screening for DS

Stru~ni rad Medicina 2004;42(41):276-280Professional paper UDK: 618.2-082:575.113.1

PRENATALNA DIJAGNOSTIKA – NAŠA ISKUSTVA

PRENATAL DIAGNOSTICS – OUR EXPERIENCES

Bojana Brajenovi}-Mili}1, Jadranka Vranekovi}1, Oleg Petrovi}2, Jakov Masov~i}2/2*,

Aleksandra Frkovi}2/2*, Danilo Pave{i}2, Herman Haller2, Miljenko Kapovi}1

Ustanova: 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet, Sveu~ili{teu Rijeci, 2Klinika za ginekologiju i porodni{tvo KBC-a Rijeka/2*privatna praksa


Adresa za dopisivanje: Prof. dr. sc.Bojana Brajenovi}-Mili}, Zavod za biologiju imedicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, Bra}e Branchetta22, 5100 Rijeka. Tel. 051 651128. e-mail:[email protected]

Jo{ 1986. godine, suradnjom Zavoda za biologijuMedicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Rijeci i Klinike zaginekologiju i porodni{tvo KBC-a Rijeka, zapo~ela jeprimjena rane amniocenteze i, u jednom kra}em raz-doblju, biopsije resica korion frondozuma u svrhudetekcije kromosomskih aberacija u ploda.1,2 Do 1996.godine probir kromosomopatija provodio se na osnovigodina starosti ili osobnog/obiteljskoga geneti~kogoptere}enja, a po~etkom 1996. uvodi se i neinvazivan,biokemijski probir za trisomiju 21 (Downov sindrom –DS) kao naj~e{}u aberaciju i uzrok mentalne retardacije

UVOD

Cilj je ovog rada prikazati organizaciju prenatalne skrbina podru~ju rije~ke regije te iznijeti rezultate dobiveneprimjenom neinvazivnih i invazivnih metoda detekcijekromosomopatija.

276

277

u ljudi.3,4 Iako su u proteklom razdoblju primjene pre-natalne dijagnostike postojali ne{to druk~iji kriterijiodabira trudno}a za pojedinu metodu, danas moèmore}i da postoje jasne odrednice (slika 1.). U mla|ih trud-nica (<35 godina) geneti~ki neoptere}ene osobne iliobiteljske anamneze, preporu~uje se neinvazivno testi-ranje, odnosno biokemijski i ultrazvu~ni probir za DS.Starijim (>35 godina) trudnicama ili pak trudnicama sgeneti~kim optere}enjem predlaè se invazivna dijag-nostika, npr. rana amniocenteza, i to stoga {to je rizik dastvarno dobiju aficirano dijete ve}i od rizika koji nosisam zahvat.

ISPITANICI I METODE

U razdoblju od 22. svibnja 1986. do 31. kolovoza 2004.godine na Klinici za ginekologiju i porodni{tvo KBC-aRijeka izvedeno je 1856 ranih amniocenteza. RAC seuglavnom izvodio pod kontrolom ultrazvuka (UZV)(97%), free hand tehnikom, uz upotrebu igala od 18 do20 G, izme|u 16. i 20. tjedna trudno}e. Tjedan trudno}eodre|ivao se na temelju datuma zadnje menstruacije, uzpotvrdu ultrazvu~nim pregledom.

Indikacije za RAC bile su: dob trudnice (≥35 godi-na), DS u prethodnoj trudno}i, druge kromosomopatijeu prethodnih trudno}a, DS u obitelji, numeri~ke ilistrukturne aberacije u roditelja, pozitivan nalaz bio-kemijskog testa probira za DS, patolo{ki UZV-nalaz iostalo (zra~enje, psiholo{ki razlozi i sl.).

Indikaciju je postavio geneti~ar ili ginekolog. Sve sutrudnice bile upoznate s na~inom izvo|enja zahvata i omogu}im komplikacijama. Kona~nu odluku donosili susupru`nici uz pismeni pristanak trudnice.

Kultivacija i citogeneti~ka analiza stanica plodovevode dobivenoga RAC-a izvodila se na Zavodu zabiologiju Medicinskog fakulteta Sveu~ili{ta u Rijeci. Zaidentifikaciju kromosoma rabila se GTG-metoda opru-gavanja.

U razdoblju od 1. sije~nja 1996. do 31. svibnja 2004.godine prenatalnom testu probira za Downov sindrom,koji se izvodi na Zavodu za biologiju Medicinskog fakul-teta Sveu~ili{ta u Rijeci, pristupilo je 10.057 trudnica.Trudnice su na testiranje upu}ivali ginekolozi Domazdravlja Rijeka, Pula, Pazin, Rovinj, Pore~, Umag, Labin,Buzet, Op}e bolnice Pula, Klinike za ginekologiju iporodni{tvo KBC-a Rijeka te ginekolozi privatnihginekolo{kih ambulanti koje rade u tim podru~jima.Informaciju o svrsi, mogu}nostima i na~inu interpretaci-je rezultata ovog testa trudnice su dobile od svojihginekologa i educiranog osoblja Zavoda za biologiju.Nakon obavljenog razgovora, trudnice su svojim potpi-som dale pristanak za testiranje.

Biokemijska analiza seruma obavljena je izme|u 15.i 18. tjedna trudno}e. Gestacijska dob je utvr|ivana,

naj~e{}e, na osnovi ultrazvu~nog nalaza fetalne bio-metrije (96%), ali i na osnovi podatka o prvom danuzadnjega menstruacijskog ciklusa (4%).

Do kraja 1999. godine ispitivana su dva serumska bi-ljega, MS-AFP i slobodni b-hCG (dvostruki test), i toimunoenzimatskom tehnikom (AFP EIACTTM; Fb-hCGEIACTTM; -CIS BIO international B.P.-91192 GIF-SURYVETTE CEDEX, Francuska). Od po~etka 2000. godinemjere se tri biljega – MS-AFP, slobodni b-hCG i nE (T21Screening ELISA; GAMMA, Belgija). Izra~unavanje indi-vidualnog rizika za Downov sindrom izvedeno je prim-jenom predvi|ene programske podr{ke (Free betascreen (CIS BIO international B.P.-91192 GIF-SURYVETTE CEDEX, Francuska i GAMMA T21 SOFT;GAMMA, Belgija). Prora~un rizika temelji se na podatkuo ìvotnoj dobi trudnice na termin poro|aja i izmjerenojrazini serumskih biljega transformiranih u odgovaraju}eMoM-vrijednosti.

Kao pozitivan nalaz testa smatrao se rizik za Downovsindrom jednak ili vi{i od 1:250 (DS rizik ≥1:250). Trud-nicama s povi{enim rizikom za Downov sindrom, bila jepreporu~ena amniocenteza. Osim procjene rizika za DS,provodila se i procjena rizika za o{te}enje neuralne cije-vi te, primjenom trostrukog testa za Edwardsov sindrom(ES). U slu~ajevima povi{enog rizika za o{te}enje neu-ralne cijevi kao i ES-a, trudnice su najprije upu}ivane nadetaljan ultrazvu~ni pregled, a nakon toga, prema potre-bi, i na RAC.

REZULTATI

Prosje~na ìvotna dob trudnica koje su pristupile RAC-ubila je 33,7±5,6, a srednja vrijednost gestacijske dobi kadje zahvat u~injen, iznosila je 17,0±1,3. U uzorku od 1856kariotipiziranih kultura stanica plodove vode, utvr|enoje 48 aberiranih kariotipova (2,6%). Broj amniocenteza,vrsta i u~estalost aberacija u odnosu na pojedinu indi-kaciju, prikazan je u tablici 1. Va`no je istaknuti da suvrlo ~esto istodobno bile prisutne dvije indikacije zaRAC (npr., dob i pozitivan nalaz probira za DS ili dob ipatolo{ki UZV-nalaz i sl.). U takvim smo se slu~ajevima,za potrebe prikaza rezultata, odlu~ivali samo za jednuindikaciju, i to onu koja je bila vode}a. Tako, npr., uslu~ajevima kada se radilo o indikaciji dob i pozitivannalaz probira za DS, svrstavali smo ih pod indikacijudob trudnice.

U 73% (n=35) utvr|enih aberacija radilo se onumeri~koj promjeni kromosoma, a naj~e{}a je bila tri-somija 21 (69%). U preostalih 27% (n=13) aberacija radi-lo se o strukturnoj promjeni kromosoma, a ~ak 54%nastalo je kao posljedica svjeè mutacije (de novo), doksu ostale bile obiteljskog podrijetla. U 23% strukturnihaberacija radilo se o nebalansiranoj promjeni. Utvr|enoje 6 slu~ajeva Robertsonovih translokacija, 3 balansirane

B. Brajenovi}-Mili}, J. Vranekovi}, O. Petrovi} i dr. PRENATALNA DIJAGNOSTIKA – NAŠA ISKUSTVA Medicina 2004;42(40):276-280

recipro~ne translokacije, 2 marker-kromosoma te jednaadicija (12 p) i jedna inverzija (1 p). Iz rada su isklju~enisvi slu~ajevi pericentri~ne inverzije kromosoma broj 9.Najve}i broj aberacija (81%) ustanovljen je kod trudno}atestiranih zbog poodmakle dobi trudnice (≥35 godina).Naj~e{}a numeri~ka aberacija bila je trisomija 21 (54%),a od 10 strukturnih aberacija, 6 ih je nastalo kao poslje-dica svjeè mutacije, de novo (3 balansirane i 3 nebalan-sirane), a u preostala 4 slu~aja radilo se o naslije|enojpromjeni. Ostale su strukturne aberacije (n=3), utvr|enevezano uz druge indikacije, bile balansirane, a jedna odnjih nastala je de novo.

U 94% trudno}a s ustanovljenom numeri~komaberacijom ploda obavljen je prekid trudno}e na zahtjevroditelja, a u slu~ajevima strukturnih aberacija u 15%trudno}a.

Od ukupno 10.057 trudnica koje su pristupilebiokemijskom testu probira za DS, u 5165 slu~aja mjere-na su dva serumska biljega (MS-AFP i slobodni β-hCG;dvostruki test), a tri biljega (MS-AFP, slobodni β-hCG inE; trostruki test) u preostale 4892 trudno}e. Prosje~naìvotna dob trudnica bila je 29,6±4,9. Srednja vrijednost

gestacijske dobi u vrijeme testiranja iznosila je 16,1±1,5.Stopa detekcije DS-a uz grani~ni rizik ≥1:250 iznosila je64% (14/22).

Uz primjenu trostrukog testa koji se rabi od po~etka2000. godine, stopa detekcije DS-a iznosi 70% (7/10), uz6,9% pozitivnih nalaza. Stopa detekcije trisomije 21 utrudnica mla|ih od 35 godina bila je 40%, uz 2,7% pozi-tivnih nalaza, a u starijih trudnica (≥35 godina) 100%, uz32% pozitivnih nalaza.

RASPRAVA

Na podru~ju rije~ke regije prenatalna dijagnostika kro-mosomopatija sustavno se primjenjuje od 1986. godine.Uz invazivnu dijagnostiku kao {to je rana amniocenteza,trudnice imaju mogu}nost odabira i neinvazivnih testo-va probira za Downov sindrom, {to je od posebnogzna~enja za ène mla|e dobi.

U proteklom razdoblju u na{em je centru izvedeno1856 ranih amniocenteza u svrhu detekcije kromosom-skih promjena kod ploda. U~estalost aberacija iznosi26/1000 u~injenih zahvata (2,6%), {to zna~i da se aberi-


278

Tablica 1. Vrsta i u~estalost kromosomskih aberacija u odnosu na indikaciju za RAC

Table 1 Type and incidence of chromosomal aberrations regarding the indication for RAC

INDIKACIJE ZA RANU AMNIOCENTEZU

VRSTE ABERACIJA Dob trudnice Pozitivan nalaz DS u obitelji DS i druge Numeri~ke i UZV KROMOSOMA testa probira numeri~ke aberacije strukturne indikacija

za DS u prethodnoj aberacije trudno}i u roditelja

n(%) n=1445 n=244 n=63 n=46 n=10 n=18

trisomija 21 18 3 2* 1**18 213 1XXX 1XXY 3

monosomijaX0 1

mozaicizam gonosoma 3

strukturne aberacije 10 1 1 1

UKUPNO 39(2,7) 4(1,6) 1(1,6) 2(4,3) 1(10) 1(5,6)

- pericentri~na inverzija (9) isklju~ena* u oba slu~aja indikacija za RAC je bila: DS (regularni tip) u prethodnoj trudno}i** pove}an nuhalni nabor; trudnica 23 godine starosti

279


Slika 1. Prenatalna dijagnostika i probir kromosomopatija

Figure 1 Prenatal diagnostics and screening of cromosomopathy

* Dodatne pretrage:

1. KARIOTIPIZACIJA LIMFOCITA PERIFERNE KRVI RODITELJA- U slu~ajevima utvr|enih STRUKTURNIH ABERACIJA

(balansirane i nebalansirane aberacije, delecije, adicije,marker kromosom i sl.)

- Pretraga je gotova za 10-ak dana

2. KULTURA STANICA PLODOVE VODE (ponavljanje amnio-centeze)- pseudo- ili la`ni MOZAICIZAM- STRUKTURNE ABERACIJE- Pretraga je gotova za 2 tjedna

TRUDNICE <35 GODINA TRUDNICE ≥35 GODINA

UZV – PREGLED

8. – 10. tj.

GENETI^KO SAVJETOVANJE

negativno osobno/obiteljskogeneti~ko optere}enje

UZV PREGLED11. – 14. tj.

to~na procjena gestacijeUZV biljezi kromosomopatija

BIOKEMIJSKI TESTPROBIRA ZA DS, ES i NTD

(15. – 17. tj.)

negativniUZV biljezi

pozitivniUZV biljezi

NEGATIVAN POZITIVAN

UZV PREGLEDdetaljan

NEMA DALJNJIHDIJAGNOSTI^KIH

PRETRAGA

DS i ES NTD



pozitivno osobno/obiteljskogeneti~ko optere}enje, npr.: - nositelji kromosomskih promjena- kromosomske aberacije u

prethodnim trudno}ama- DS u obitelji

16. – 18. tj. 15. – 17. tj. 15. – 16. tj. 15. – 16. tj.

A M N I O C E N T E Z A *

rani kariotip utvr|uje na svakih 38 analiza stanicaplodove vode. U~estalost numeri~kih aberacija iznosi19/1000 (1,9%), a strukturnih 7/1000 (0,7%) analiza. Uovom radu nisu izneseni podaci o u~estalosti pericen-tri~ne inverzije kromosoma broj 9 [per inv9] jer se radi obalansiranoj strukturnoj aberaciji prisutnoj u 0,85% –1,65% ljudi i ne povezuje se s odre|enom promjenomfenotipa te se stoga smatra varijantom kromosoma, a neabnormalnim kariotipom.5,6

Naj~e{}a, ujedno i najsenzitivnija u smislu probira jeindikacija dob trudnice. Najve}i broj kromosomopatija,posebice trisomija, utvr|en je upravo u toj grupi ispiti-vanih trudno}a. Takav je rezultat o~ekivan jer je u eti-ologiji tih poreme}aja odavno poznat i dobro dokazanutjecaj godina majke/trudnice.7,8,9 Isto tako, ~ak 77%svih ustanovljenih strukturnih aberacija, kao i onihnastalih de novo (86%), otkriveno je u starijih trudnica.

Indikacija kao {to je DS u prethodnoj trudno}i iz-nimno je zna~ajna u probiru kromosomskih poreme-}aja, {to dokazuju i na{a dva slu~aja uzastopnih trud-no}a s istim poreme}ajem, odnosno trisomijom 21 regu-larnog tipa u ina~e zdravih roditelja urednog kariotipa.U detekciji kromosomopatija nesumnjivo je zna~enjeUZV-probira koji }e, iako u na{em radu jo{ uvijek nijedovoljno zastupljen, s vremenom zasigurno postatijedan od vode}ih neinvazivnih testova.

Od ostalih prikazanih indikacija za RAC, najmanjustopu detekcije ima indikacija DS u obitelji. Da bi oprav-danost primjene te indikacije bila ve}a, valjalo birazlu~iti o kakvom se tipu trisomije 21 radi. U slu~ajevi-ma regularnog tipa DS u obitelji, mogla bi se trudnicamanajprije ponuditi neinvazivna dijagnostika, a tek uslu~aju pove}anog rizika i invazivna dijagnostika.

Uvo|enjem biokemijskog testa probira za DS,zna~ajno je unaprije|ena prenatalna skrb na rije~kompodru~ju. Stopa detekcije Downova sindroma iznosi64%, {to je u skladu s rezultatima ostalih centara.10-12

Primjenom trostrukog testa (MS-AFP, slobodni β-hCG inE), stopa detekcije doseè 70% te omogu}ava procjenurizika i za Edwardsov sindrom. Iako se mo`da stopadetekcije DS-a u mladih trudnica (40%) ~ini malom, ipakje to znatno vi{e od 0% bez biokemijskog testa probira.Znatno bolja detekcija moè se posti}i samo kombinaci-jom UZV i biokemijske analize seruma, i to u prvomtromjese~ju trudno}e.

Kako su neinvazivne i invazivne metode prenatalnedijagnostike usko povezane i primjenjuju se jedna zadrugom, va`no je {to prije (do 12.–13. tjedna trudno}e)provesti geneti~ko savjetovanje. O pravodobnoj obavi-je{tenosti i odabiru pretrage zna~ajno ovisi i vrijemedobivanja kona~nog nalaza, a to bitno utje~e i na stu-panj anksioznosti trudnice.13 Uz to {to valja razmi{ljati opsihi~kom stanju trudnice, treba voditi brigu i o vre-menu potrebnom za dodatne pretrage, dakako, u

slu~ajevima patolo{kih nalaza. Naj~e{}e je prijekopotrebno obaviti kariotipizaciju roditelja, a katkad iponoviti RAC poradi precizne dijagnostike i boljegageneti~kog informiranja. Za dopunske pretrage potreb-no je 7 do 14 dana. Stoga je jedino dobrom suradnjomjedinica Primarne zdravstvene za{tite èna, Klinike zaginekologiju i Laboratorija za citogenetiku mogu}adobra i kvalitetna organizacija prenatalne skrbi.

LITERATURA

1. Brajenovi} B, Stamatovi} M, Obersnel V. Chorionic villibiopsy as a method in prenatal diagnosis. Medicina 1987;23:115-118

2. Brajenovi}-Mili} B, Stamatovi} M, Masov~i} J, Obersnel V.Prenatal chromosome studies in pregnancies at risk. ActaFac med Flum 1991; 16 (3-4):173-176

3. Prodan M, Šojat S, Sandalj R, Manestar, Ra~ki G, Frkovi} A.Kratak osvrt na prenatalni probir i dijagnostiku Downovasindroma u rije~koj regiji. Medicina 2000; 37:69-74

4. Brajenovi}-Mili} B, Ti{lari} D, Ba~i} J, Paravi} J, Slivar A,Kapovi} M i sur. Screening for Down’s Syndrome andNeural Tube Defect in Croatia: A Regional ProspectiveStudy. Fetal Diagn Ther 1998; 13:367-371

5. Serra A, Brahe C, Millington-Ward A, Neri G, Tedeschi B,Tassone F i sur. Pericentric inversion of chromosome 9:prevalence in 300 Down syndrome families and molecularstudies of nondisjunction. Am J Med Genet 1990; 7:162-168

6. Yamada K. Population studies of inv(9) chromosomes in4300 Japanese: incidence, sex difference and clinical sig-nificance. Jpn J Hum Genet 1992; 37:293-301

7. Penrose LS. The relative effects of paternal and maternalage in mongolism. J Genet 1933; 27:219-24

8. Cuckle HS. Effect of maternal age curve of predicted detec-tion rate in maternal serum screening for Down syndromePrenat Diagn 1998:18:1127-30

9. Brajenovi}-Mili} B, Risti} S, Kapovi} M, Mojsovi} A, MedicaI, Modru{an-Mozeti} Z. Incidence of Down’s Syndrome inthe Municipality of Rijeka and Istrian Region. Coll Antropol1996; 20 (Suppl): 1-5

10. Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW i sur. Maternal serumscreening for Down’s syndrome in early pregnancy. BMJ1988; 297:883-7

11. Palomaki GE, Knight GJ, McCarthy J, Haddow JE, Don-howe JM. Maternal serum screening for Down syndrome inthe United States: a 1995 survey. Am J Obstet Gynecol1997; 176:1046-51

12. Spencer K. Second trimester prenatal screening for Down’ssyndrome using alpha-fetoprotein and free beta hCG: Aseven year review. Br J Obste Gynaecol 1999; 106:1287-93

13. Paravi} J, Brajenovi}-Mili} B, Ti{lari} D, Kapovi} M, BoticaA, Milotti S. Maternal Serum Screening for Down Syn-drome: A Survey of Pregnant Women’s Views. CommunityGenet 1999; 82:109-112


280

281

SA@ETAK

Mikrodelecije AZF-podru~ja Y-kromosoma mogu} su geneti~ki ~imbe-nik neplodnosti u mu{karaca. Javljaju se u pribli`no 7% mu{karaca sidiopatskom neplodno{}u. Molekularna analiza mikrodelecija op}epri-hva}ena je metoda koja dobiva sve ve}e zna~enje s obzirom nausavr{avanje metoda potpomognute reprodukcije i prijenos mikro-delecija s o~eva na sve sinove. Pacijenti s najve}im rizikom za mikrode-lecije Y-kromosoma su oni s azoospermijom ili te{kim oblikom oligo-zoospermije. Studije mikrodelecija Y-kromosoma va`ne su i za izborodgovaraju}eg na~ina geneti~kog informiranja neplodnih parova.U radu je analizirano 75 ispitanika.

KLJU^NE RIJEÎ: neplodnost mu{karaca, mikrodelecije humanog Y-kromosoma

ABSTRACT

Microdeletions of the Y chromosome in the AZF region are a possiblegenetic factor of male infertility. They are found in about 7% of infertilemen. The molecular detection of microdeletions is widely accepted ininfertility treatments as there is an advance in methods of assistedreproduction and because microdeletions are transmitted to 100% ofmale offspring. Patients with the highest risk of microdeletion arethose with azoospermia or severe oligozoospermia. The study ofmicrodeletions is very useful in adopting an appropriate strategy inproviding genetic counselling to the affected couples.We preliminary analysed 75 patients in the study.

KEY WORDS: male infertility, microdeletions of human Y chromosome

Stru~ni rad Medicina 2004;42(41):281-285Professional paper UDK: 616.697:575.113.1

MIKRODELECIJE Y-KROMOSOMA U MUŠKARACA SMANJENE REPRODUKTIVNESPOSOBNOSTI

Y CHROMOSOME MICRODELETIONS IN SUBFERTILE MEN

Alena Bureti}-Tomljanovi}1, Ivan Vlasteli}2, Ljiljana Randi}2, Miljenko Kapovi}1,

An|elka Radoj~i} Badovinac1,2

Ustanova: : 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci, 2Odjel za planiranje obitelji, Klinika za ginekologiju i porod-ni{tvo, Klini~ki bolni~ki centar Rijeka


Adresa za dopisivanje: Doc. dr. sc. Alena Bureti}-Tomljanovi}, dipl. ing., Medi-cinski fakultet u Rijeci, Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Bra}eBranchetta 22, 51 000 Rijeka. e-mail: [email protected]

astenozoospermija (slaba pokretljivost spermija) ili tera-tozoospermija (abnormalna veli~ina ili oblik spermija).Geneti~ki uzroci mu{kog infertiliteta mogu se razmatratina razini kromosoma ili gena. Poznato je da se u mu{ka-raca smanjene reproduktivne sposobnosti na|u kromo-somske aberacije ~e{}e negoli u op}oj populaciji. U~e-stalost kromosomskih aberacija najvi{a je u mu{karaca sazoospermijom (do 14%), ne{to je nià u onih s oligo-zoospermijom (5%–11%), dok se u op}oj populacijikre}e oko 1%.4 Naj~e{}e kromosomske aberacijepovezane sa smanjenom reproduktivnom sposobno{}umu{karaca jesu numeri~ke i uklju~uju spolne kromo-some. Radi se o trisomiji XXY ili Klinefelterovu sindro-mu kod kojega se u klini~koj slici javlja odsutnost sper-matogeneze, hipogonadizam i ginekomastija, ili orazli~itim oblicima mozaicizma (npr. 45,X/46,XY;47,XXY/46,XY i drugi) koji u odre|enim slu~ajevimamogu biti posljedica nestabilnosti dicentri~nog Y-kro-mosoma i udruèni s razli~itim stupnjem poreme}aja

UVOD

Smanjena sposobnost reprodukcije javlja se u pribli`no15% bra~nih parova.1-3 Smatra se da je za polovicu tihslu~ajeva odgovoran neki ~imbenik gametogeneze umu{karaca. Iako su poznati brojni uzroci smanjenereproduktivne sposobnosti mu{karaca, kao npr. vari-kokela, opstrukcija sjemenovoda, aglutinacija spermija,hormonska neravnoteà ili geneti~ki uzroci, oko 30%infertilnih mu{karaca pati od idiopatskog infertiliteta.1

Smanjena reproduktivna sposobnost mu{karaca moèse okarakterizirati kao azoospermija (potpun nedostatakspermija), oligozoospermija (smanjen broj spermija),

spermatogeneze. Strukturne aberacije koje uzrokujusmanjenu plodnost mu{karaca, zahva}aju uglavnom Y-kromosom, a to su delecije del (Yq), prstenasti kromo-som r(Y) ili izokromosom i(Yq). Reproduktivnu sposob-nost mu{karaca mogu umanjiti i Y-autosomsketranslokacije, druge recipro~ne translokacije, Robert-sonove translokacije ili inverzije. Procjenjuje se da su zapribli`no 10% mu{kog infertiliteta odgovorne mutacijegena uklju~enih u odvijanje spermatogeneze. Zasad jepoznat odre|en broj gena na humanom Y-kromosomu,koji su uklju~eni u odre|ivanje mu{kog spola iodràvanje spermatogeneze. Na kratkom kraku mapiranje ~imbenik determinacije testisa (SRY), dok je nadugom kraku odre|en ~itav niz gena uklju~enih usloèn proces spermatogeneze. Svi su ti geni mapirani upodru~ju Yq11 (OMIM). Dio njih naveden je u tablici 1.Mnogi od tih gena nalaze se u Yq11 podru~ju u multi-plim kopijama, od kojih nisu sve funkcionalne. Podru~jeYq11 nazvano je i ~imbenikom azoospermije (engl. –azoospermia factor, AZF) i podijeljeno je na 4 podru~ja:AZFa, AZFb, AZFc i AZFd, od kojih se prva tri smatrajunajva`nijima za odvijanje procesa spermatogeneze.AZFc podru~je nalazi se najvi{e distalno u eukromatin-skom dijelu q kraka na granici prema heterokromatin-skom bloku Y-kromosoma. Glavni geni kandidati zaodvijanje spermatogeneze jesu geni DFFRY/USP9Y(AZFa), RBMY (AZFb) i DAZ (AZFc).1

MIKRODELECIJE Y-KROMOSOMA

Rezultati brojnih radova upu}uju na povezanost mikro-delecija unutar AZF-podru~ja sa smanjenom reproduk-tivnom sposobno{}u mu{karaca.5 Geni u AZF-podru~juY-kromosoma vrlo su vjerojatno esencijalni za odvijanjespermatogeneze. Karakterizira ih specifi~na aktivnost utestisima, iako neki imaju i svoje gene homologe naautosomima. Osnovne funkcije AZF-gena nisu poznate,ali je ~injenica da mikrodelecije Y-kromosoma nisuutvr|ene u plodnih mu{karaca, {to potvr|uje njihovuva`nost za spermatogenezu. Za detekciju mikrodelecijaispituju se brojni STS-markeri (engl. – sequence-taggedsites) koji su mapirani unutar gena AZF-podru~ja i izvannjih. U~estalost mikrodelecija u razli~itim radovima znat-no varira – od 1% do ~ak 55,5%. S obzirom na velike raz-like u u~estalosti mikrodelecija u studijama, vrlo je vjero-jatno da na u~estalost mikrodelecija utje~u i nekiokoli{ni ~imbenici te da postoje me|upopulacijske raz-like. Mikrodelecije su u infertilnih mu{karaca naju~estal-ije unutar AZFc-podru~ja. Proksimalne mikrodelecije(AZFa i AZFb) obi~no prate teì defekti spermatogenezekao npr. Sindrom samo Sertolijevih stanica (engl. – Ser-toly-cell-only syndrome – SCOS) gdje u zavijenim kana-li}ima nema stanica zametnog epitela. Distalne mikro-delecije (AZFc) mogu biti udruène s oligozoospermi-

jom koja s vremenom moè prije}i i u azoospermiju.Korelacija opsega mikrodelecija i fenotipa nije potpunojasna. S pojavom SCOS-a mogu se povezati mikrodeleci-je gena USP9Y/DFFRY i DBY, dok se mikrodelecijeAZFb-podru~ja na|u i u slu~ajevima azoospermije,oligozoospermije i normozoospermije.1 Analizom brojamikrodelecija prema klini~kim dijagnozama ispitanikautvr|eno je da se ~ak 66% mikrodelecija pojavljuje umu{karaca s azoospermijom, 28% u mu{karaca s te{komoligozoospermijom te sporadi~no u mu{karaca s kon-centracijom spermija >5x106/ml (6%). Prema tim jepodacima o~ekivana u~estalost mikrodelecija u selekti-ranoj grupi mu{karaca smanjene fertilnosti oko 7%.5

U nastojanju da se mikrodelecije u infertilnihmu{karaca otkriju te da se utvrdi njihov opseg, razli~itisu autori istraìvali i do 60 STS-biljega unutar AZF-po-dru~ja. Skupljanjem rezultata prof. Manuela Simoni isur.5 objavili su vodi~ za otkrivanje mikrodelecija Y-kro-mosoma. Autori su predloìli rutinsko testiranje {estnaj~e{}e deletiranih STS-biljega (po dva u AZFa, AZFb iAZFc-podru~ju) ~ime se, prema njihovim saznanjima,moè otkriti vi{e od 90% mikrodelecija. Predloènagrupa STS-biljega jesu jedinstveni i nepolimorfni slje-dovi nukleotida na DNA-molekuli. Tek u slu~ajupronalaska mikrodelecije, analiza se pro{iruje na ve}ibroj STS-biljega kako bi se pobliè odredile granicemikrodelecije. Ista grupa upu}uje i na to koje STS-bi-ljege treba izbjegavati pri analizi mikrodelecija budu}ida su repetitivni i/ili raspr{eni po ~itavom Y-kromosomute stoga nepouzdani za analizu. Potrebno je upozoriti dadijagnoza mikrodelecije Y-kromosoma u pacijenata nijedokaz da je smanjena reproduktivna sposobnost uzro-kovana upravo mikrodelecijom, me|utim, ta je uzro~no-posljedi~na veza vrlo vjerojatna. STS-biljezi koji se rabeza rutinsku analizu mikrodelecija Y-kromosoma, nave-deni su u tablici 2. Uz STS-biljege za analizu AZF-po-dru~ja, analiziraju se kontrolni biljeg sY14 (SRY) te genZFX/ZFY koji se nalazi u pseudoautosomskom podru~juX i Y-kromosoma. Tim su prijedlogom Simoni i sur.5

nastojali standardizirati analizu mikrodelecija Y-kromo-soma, ~ime bi bila olak{ana usporedba i interpretacijarezultata razli~itih laboratorija.

MEHANIZAM NASTANKA MIKRODELECIJA

Boljim upoznavanjem organizacije AZF-podru~ja moèse razumjeti za{to je to podru~je podlo`no nastankumikrodelecija de novo. AZF-podru~je bogato je ponav-ljanim sljedovima nukleotida organiziranih u palin-drome, iako sadrì i jedinstvene sljedove. S obzirom naprimjere mikrodelecija sli~nog opsega u razli~itih indi-vidua, pretpostavljen je zajedni~ki mehanizam njihovanastanka. U AZFa i AZFc-podru~ju utvr|en je meha-nizam homologne rekombinacije izme|u velikih po-

A. Bureti}-Tomljanovi}, I. Vlasteli}, Lj. Randi} i dr. MIKRODELECIJE Y-KROMOSOMA U MUŠKARACA... Medicina 2004;42(40):281-285

282

283

navljanih sljedova nukleotida jednake orijentacije, ~imese uklanja (deletira) DNA-fragment izme|u njih.6 Isti semehanizam pretpostavlja i u AZFb-podru~ju. U AZFb iAZFc utvr|eni su identi~ni ponavljani sljedovi nukleoti-da me|u kojima je mogu}a homologna rekombinacija,~ime nastaju mikrodelecije koje se proteù kroz obapodru~ja. Najvi{a je u~estalost de novo mikrodelecija uAZFc-podru~ju (3x10-4)7, {to obja{njava ~injenica da jetaj dio dugog kraka gra|en gotovo potpuno od duga-~kih direktnih i invertiranih ponavljanih sljedova nuk-leotida, koje nazivamo amplikonima. ^lanovi razli~itihobitelji amplikona jednaki su i do 99,8%. AZFc-podru~jeveli~ine je 4,5 Mb, sadrì tri palindroma sastavljena od{est obitelji amplikona. AZFc ujedno sadrì 11 genskihobitelji s 27 potencijalno funkcionalnih gena. Vrlo jevjerojatno da fenotipski u~inak mikrodelecije, barem {tose ti~e potpodru~ja AZFc, odre|uje ~injenica koji suamplikoni zahva}eni mehanizmom homologne rekom-binacije, koliko su ti amplikoni me|usobno udaljeni,kao i koji su geni tako uklonjeni.7

INDIKACIJE ZA ANALIZU MIKRODELECIJA Y-KROMOSOMA

Iako nema apsolutnih kriterija za odre|ivanje pacijenatakandidata, na analizu mikrodelecija Y-kromosomaupu}uju se pacijenti predvi|eni za ICSI (engl. – intracy-toplasmic sperm injection) budu}i da se mikrodelecijeY-kromosoma prenose na sve mu{ko potomstvo. Stogaje, u slu~aju otkrivanja mikrodelecije, prijeko potrebnogeneti~ko informiranje o rizicima pojave smanjenereproduktivne sposobnosti u mu{kog potomstva. Anal-iza mikrodelecija Y-kromosoma jo{ je eksperimentalnopodru~je reproduktivne medicine i genetike, pa je predklini~arima zasad slobodna odluka koje }e pacijentetestirati. Prema dosada{njim rezultatima, molekularnaanaliza mikrodelecija Y-kromosoma trebala bi obuhvati-ti sve mu{karce s brojem spermija manjim od 5x106/ml,uklju~uju}i one s varikokelom i/ili kriptorhizmom.8-10

ISPITANICI I METODE

Analiza mikrodelecija Y-kromosoma preliminarno seizvodi u Zavodu za biologiju i medicinsku genetikuMedicinskog fakulteta u Rijeci s ciljem da postane rutin-ska pretraga povezana s izvo|enjem metoda potpo-mognute reprodukcije. Do sada je analizirano 75 pacije-nata Odjela za planiranje obitelji, Klinike za ginekologi-ju i porodni{tvo, Klini~koga bolni~kog centra u Rijeci.Klini~ke dijagnoze ispitanika uklju~enih u studiju suazoospermija (18) (~etvorica ispitanika su operiralavarikokelu), opstruktivna azoospermija (2), oligo-zoospermija (27), te{ka oligozoospermija (9) i normo-zoospermija (19). Ispitanici su prije uzimanja uzorka

krvi upoznati sa svrhom studije. Uzorak DNA pripravljenje iz pune krvi standardnim postupcima. MikrodelecijeY-kromosoma ispitivane su dvjema multiplim lan~animreakcijama polimeraze (PCR) pri ~emu su rabljene odgo-varaju}e DNA-po~etnice (engl. – primer). Multipla reak-cija 1 uklju~ila je DNA-po~etnice za STS-biljege sY84,sY127, sY254, sY14 i gen ZFX/ZFY. Multipla reakcija 2uklju~ila je DNA-po~etnice za STS-biljege sY86, sY134,sY255, sY14 i, tako|er, gen ZFX/ZFY. Reakcije su izve-dene u ukupnom volumenu od 10 µl. Reakcijska smjesauklju~ila je 50 ng svakog DNA-uzorka, 1x pufer zalan~anu reakciju polimeraze, 1,5 mM MgCl2, 200 µmol/ldeoksinukleotidtrifosfata (dNTP), 0,5 µmol/l svakogpara po~etnica i 5U/µl Taq DNA-polimeraze. Reakcija jeizvedena u ure|aju za lan~anu reakciju polimeraze(Eppendorf Mastercycler personal) prema programu:po~etna denaturacija na 94°C 5 minuta, 30 ciklusa od94°C 60 s, 56–62°C 60 s, 72°C 60 s. Zavr{no produljiva-nje izvedeno je na 72°C 10 minuta. Produkti reakcijaanalizirani su elektroforezom na 80V i 2%-tnom aga-roznom gelu uz dodatak etidij bromida (0,1 mg/ml).

U svakoj analizi mikrodelecija lan~ana reakcijapolimeraze ra|ena je na DNA-uzorku ènske osobe(pozitivna kontrola ZFX lokusa), DNA-uzorku fertilnemu{ke osobe (pozitivna kontrola svih lokusa) te s reak-cijskom smjesom bez DNA-uzorka (negativna kontrola).

REZULTATI I RASPRAVA

Analiza mikrodelecija Y-kromosoma {iroko je prihva-}ena metoda ~ije zna~enje postaje sve ve}e s obzirom nausavr{avanje metoda potpomognute reprodukcije~ovjeka. Metoda ICSI omogu}uje dobivanje potomstvamu{karcima izrazito smanjene reproduktivne sposob-nosti, ~ime se potencijalni ~imbenici neplodnostiprenose na sljede}u generaciju. Mikrodelecije Y-kromo-soma, prema literaturi, ~ine mogu}i uzrok neplodnostimu{karaca u prosje~no 7% slu~ajeva idiopatske neplod-nosti. Skupina ispitanika s najve}im rizikom za pojavumikrodelecija (mu{karci s azoospermijom) u na{em jeuzorku razmjerno mala (18 ispitanika), kao i skupinaonih s te{kim oblikom oligozoospermije (9 ispitanika),{to zna~i da zasad o~ekujemo pronalazak mikrodelecijeu jednog do dva ispitanika. Treba istaknuti da analizaobuhva}a {est STS-biljega u AZF-podru~ju Y-kromoso-ma, koji bi, prema Simoni i sur.5 trebali pokrivati vi{e od90% mikrodelecija. Analizom rezultata drugih autoramoè se uo~iti da su mikrodelecije kontinuirane te daobi~no zahva}aju niz susjednih lokusa unutar pojedinogAZF-podru~ja, ili se kontinuirano proteù preko dva ilivi{e podru~ja (od AZFa do AZFc).2,6,11 Thangaraj i sur.1

objavili su nekoliko slu~ajeva u kojima su mikrodelecijeisprekidane, odnosno, uz ve}u mikrodeleciju u AZFc--podru~ju deletirani su i pojedina~ni lokusi u AZFa.


Uporaba velikog broja STS-biljega za detekciju mikrod-elecija nije se pokazala suvi{e u~inkovitom budu}i da bibarem neke od tih delecija mogle biti polimorfne vari-jante. Prijedlog Simoni i sur.5, koji se temelji na ve}inidosad objavljenih rezultata, zapravo je poku{aj da sedobiju odgovori na pitanja koja je stvarna u~estalostmikrodelecija u mu{karaca smanjene reproduktivnesposobnosti, koje su mikrodelecije klini~ki zna~ajne, ukojih je pacijenata indicirana molekularna analizamikrodelecija i koje bi STS-biljege trebalo analizirati. Tasu pitanja va`na ne samo za dijagnozu mikrodelecija ve}i za geneti~ko informiranje u potpomognutoj reproduk-ciji. Mikrodelecije Y-kromosoma mogu se prenijeti s ocana sinove, a zabiljeèno je i pove}anje opsega mikro-delecije pri prijenosu iz jedne generacije u drugu.12,13

Što se ti~e prognosti~ke vrijednosti dijagnoze mikrode-lecija, pokazalo se da one vi{e distalno (AZFc) mogu bitikompatibilne s odre|enim stupnjem spermatogeneze te

se u azoospermi~nih mu{karaca ili u mu{karaca ste{kom oligozoospermijom s AZFc-mikrodelecijamana|u zreli spermiji u ejakulatu ili se mogu ekstrahiratimetodom TESE (engl. – testicular sperm extraction), dokto nije slu~aj u onih s proksimalnim mikrodelecijama(AZFa i AZFb).14

Mikrodelecije Y-kromosoma mogu biti uzrokomnestabilnosti toga kromosoma i uzrokovati njegov gu-bitak u dijelu stanica. Stoga, nalaz stani~ne linije 45,Xpored normalne 46,XY moè upu}ivati na prisutnostmikrodelecija. Neki autori preporu~uju vi{ebojnu FISH--analizu na somatskim, a po mogu}nosti i germinativnimstanicama u svrhu detekcije gonadnog mozaicizma upacijenata s mikrodelecijama koji se èle podvrgnutimetodi potpomognute reprodukcije ICSI-ja15. Povezanos izvo|enjem ICSI-ja, predlaè se i preimplantacijskageneti~ka dijagnoza za otkrivanje aberacija Y-kromoso-ma.16


284

Tablica 1. Geni uklju~eni u odvijanje spermatogeneze i njihov poloàj na humanom Y-kromosomu

Table 1 Genes involved in spermatogenesis and their position in human Y- chromosome

Oznaka gena Ime gena (engl.) AZF podru~je

USP9Y (DFFRY) ubiquitin-specific protease 9, Y chromosome (Drosophila fat facets related, Y linked)

UTY ubiquitously transcribed TPR gene on Y chromosome AZFa

DBY

VCY1 (BPY1) variably charged 1, Y chromosome (basic protein on Y chromosome 1)

RBM1 RNA-binding motif 1

RBM2 RNA-binding motif 2 AZFb

CDY1 chromodomain protein on Y chromosome 1

CDY2 chromodomain protein on Y chromosome 2

DAZ deleted in azoospermia

VCY2 (BPY2) variably charged 2, Y chromosome (basic protein on Y chromosome 2) AZFc

BPY2 basic protein on Y chromosome 2

Tablica 2. STS-biljezi za rutinsku analizu mikrodelecija Y-kromosoma

Table 2 STS-markers for routine analysis of Y-chromosome microdeletions

AZFa AZFb AZFc kontrolni biljezi**

STS-biljeg pb STS-biljeg pb pb

SY84 326 sY127 274 sY254* 350-400 sY14 (SRY) 472

SY86 326 sY134 301 sY255* 126 ZFX/ZFY 495

* nalazi se u genu DAZ

** ZFX/ZFY-gen je unutarnja kontrola koja hibridizira s DNA i mu{karaca i èna

285

Broj na{ih dosada{njih ispitanika razmjerno je malen,posebice grupa s najve}im rizikom za mikrodelecije, {toje vjerojatno razlog za{to ih jo{ nismo otkrili. Potrebno jepro{iriti analizu na znatno ve}i broj ispitanika te utvrditiu~estalost mikrodelecija Y-kromosoma u na{oj popula-ciji. Budu}i da za ve}inu gena otkrivenih u AZF-podru-~ju Y-kromosoma ne znamo vi{e od toga da su izraèniisklju~ivo ili ve}im dijelom u testisu, u budu}im }eistraìvanjima u sredi{tu pozornosti biti i sami AZF-geni i njihovi mogu}i funkcionalni polimorfizmi.

LITERATURA

1. Thangaraj K, Gupta NJ, Pavani K, Reddy AG, SubramainanS, Selvi Rani D, Ghosh B, Chakravarti B, Singh L. Y Chro-mosome deletions in Azoospermic men in India. J Androl2003; 24:588-597

2. Peterlin B, Kunej T, Sinkovec J, Gligorievska N, Zorn B.Screening for Y chromosome microdeletions in 226Slovenian subfertile men. Hum Reprod 2002; 17:17-24

3. Bor P, Hindkjaer J, Ingerslev HJ, Kolvraa S. Multiplex PCRfor Screening of Microdeletions on the Y Chromosome. JAssist Reprod Genet 2001; 18:291-298

4. Radoj~i} Badovinac A, Bureti}-Tomljanovi} A, Star~evi} N,Kapovi} M, Vlasteli} M, Randi} Lj. Chromosome Studies inPatients with Defective Reproductive Success. AJRI 2000;44:279-283

5. Simoni M, Bakker E, Eurlings MCM, Matthijs G, Moro E,Müller CR, Vogt PH. Laboratory guidelines for the molecu-lar diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. EuropeanMolecular Genetics Quality Network (EMQN) 2001; 1-7

6. Ferlin A, Moro E, Rossi A, Dallapicola B, Foresta C. Thehuman Y chromosome’s azoospermia factor b (AZFbregion): sequence, structure, and deletion analysis in infer-tile men. J Med Genet 2003; 40:18-24

7. Yen P. The fragility of fertility. Nature Genet 2001; 29:243-244

8. Simoni M, Kamischke A, Nieschlag E. Current status of themolecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions inthe work-up of male infertility. Hum Reprod 1998; 13:1764-1768

9. Krausz C, Rajpert-De Meyts E, Frydelund-Larsen L, Quin-tana-Murci L, McElreavey K, Skakkebaek NE. Double-BlindY Chromosome Microdeletion Analysis in Men withKnown Sperm Parameters and Reproductive Hormoneprofiles: Microdeletions Are Specific for SpermatogenicFailure. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86:2638-2642

10. Kunej T, Zorn B, Peterlin B. Y chromosome microdeletionsin men with cryptorchidism. Fertil Steril 2003; 79:1559-1565

11. Vogt PH, Edelman A, Kirsch S, Henegariu O, HirschmannP, Kiesewetter F, Köhn FM, Schill WB, Farah S, Ramos C,Hartman M, Hartchuh W, Meschede D, Behre HM, CastelA, Nieschlag E, Weidner W, Gröne H-J, Jung A, Engel W,Haidl G. Human Y chromosome azoospermia factors(AZF) mapped to different subregions in Yq11. Hum MolGenet 1996; 7:933-943

12. Rolf C, Gromoll J, Simoni M, Nieschlag E. Natural transmis-sion of a partial AZFb deletion of the Y chromosome overthree generations: Case report. Hum Reprod 2002; 17:2267-2271

13. Oates RD, Silber S, Brown LG, Page DC. Clinical character-ization of 42 oligozoospermic or azoospermic men withmicrodeletion of the AZFc region of the Y chromosome,and of 18 children conceived via ICSI. Hum Reprod 2002;17:2813-2824

14. Kleiman S, Bar-Shira Maymon B, Yogev L, Paz G, Yavetz H.Prognostic value of Y deletion analysis. The prognosticrole of the extent of Y microdeletion on spermatogenesisand maturity of Sertoli cells. Hum Reprod 2001; 16:399-402

15. Siffroi JP, Le Bourhis C, Krausz C, Barbaux S, Quintana-Murci L, Kanafani S, Rouba H, Bujan L, Bourrouillou G,Seifer I, Boucher D, Fellous M, McElreavey K, Dadoune JP.Sex chromosome mosaicism in males carrying Y chromo-some long arm deletions. Hum Reprod 2000; 15:2559-2562

16. Mansour R. Preimplantation genetic diagnosis for Y-linkeddiseases: why not? RBM Online 2004; 8:144-145


/

SA@ETAK

U radu su prikazana dva slu~aja s de novo balansiranom recipro~nomtranslokacijom, koja su detektirana u sklopu prenatalne dijagnostike.U takvim slu~ajevima nemogu}e je sa sigurno{}u prognozirati fenotipploda/djeteta zbog saznanja o mogu}nostima njegove promjene u 6%slu~ajeva. Kariotip je odre|en GTG-metodom oprugavanja kromoso-ma te fluorescentnom in situ hibridizacijom sa sondama YAC 758H11(20q12),PCP 433 (4q11->21) i YAC 758h10 (1p31.1), PCP 122 (2pter->2q21). U oba slu~aja trudno}a i poro|aj protekli su bez komplikacijai ro|ena su zdrava djeca. Kontrolnim pedijatarskim pregledom godinudana nakon poro|aja utvr|en je uredan psihomotorni razvoj djece.

KLJU^NE RIJEÎ: de novo balansirane recipro~ne translokacije, FISH,GTG

ABSTRACT

In this study we describe two cases with de novo balanced reciprocaltranslocation detected by prenatal diagnosis. Genetic counselling canbe problematic in such cases because the risk of phenotypicabnormality was 6%. Karyotyping was performed using the GTG-banding method and fluorescence in situ hybridisation withprobes YAC 758H11 (20q12), PCP 433 (4q11->21) and YAC 758h10(1p31.1), PCP 122 (2pter->2q21). In both cases, the pregnancies aswell as the deliveries were carried out with no complication and bothbabies were born healthy. After a year they showed normal physicaland mental development.

KEY WORDS: de novo balanced reciprocal translocation, FISH, GTG

Prikaz slu~aja Medicina 2004;42(41): 286-289Case report UDK:618.2-082:575.113.1

DE NOVO BALANSIRANA RECIPRO^NA TRANSLOKACIJA: PRIKAZ DVA SLUÂJA

DE NOVO BALANCED RECIPROCAL TRANSLOCATION: TWO CASES

Jadranka Vranekovi}1, Bojana Brajenovi}-Mili}1, Zlata Modru{an-Mozeti~2, Miljenko Kapovi}1

Ustanova: 1Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultetSveu~ili{ta u Rijeci, 2Odsjek za djecu s neurorazvojnim smetnjama, Klinika zapedijatriju, KBC Rijeka


Adresa za dopisivanje: Mr. sc. Jadranka Vranekovi}, prof. biol/kem., Zavod zabiologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, Bra}eBranchetta 20, 51000 Rijeka. Tel. 051651131. e-mail: [email protected]

problemi se javljaju vezano uz njihovu reprodukciju jerse tijekom gametogeneze mogu, uz balansirane, stvaratii nebalansirane gemete, {to moè dovesti do promjenefenotipa u njihovih potomaka. U ve}ini slu~ajeva reci-pro~ne se translokacije naslje|uju od jednog roditelja(obiteljski tip), ali mogu nastati i kao posljedica svjeèmutacije odnosno de novo. De novo recipro~netranslokacije nastaju zbog gre{ke tijekom mejoze uroditelja (8, 140), a incidencija u novoro|en~adi je1/2000 (Wassman, 1989.). Brojne studije upu}uju namogu}nost promjene fenotipa u takvim slu~ajevima(Warburton, 1991.). Upravo to ~ini geneti~ko savjeto-vanje u okviru prenatalne dijagnostike mnogo teìmnego u slu~ajevima kada se radi o naslije|enoj promjeni.Stoga je iznimno va`no pratiti psihofizi~ki razvoj takvihosoba, i to ~ak i duè od dvije godine. U ovom radu bit}e prikazana dva slu~aja s de novo recipro~nomtranslokacijom, koja su prenatalno detektirana, a post-natalno pra}ena i duè od dvije godine starosti djeteta.

UVOD

Recipro~ne translokacije su strukturne interkromo-somske promjene koje nastaju kao posljedica preba~ajakromosomskih segmenata izme|u heterolognih kromo-soma. Ako nema promjene u ukupnoj koli~ininasljednog materijala unato~ prespajanju dijelova kro-mosoma, promjena se smatra balansiranom, a osobekoje nose takvu promjenu zovemo mirnim nosiocima.U~estalost mirnih nosioca u op}oj populaciji iznosi1:600.(8) Iako se radi o osobama urednog fenotipa,

286

287

PRIKAZ SLUÂJEVA

Slu~aj 1.

Trudnica, 28 godina, upu}ena je u 17. tjednu trudno}ena amniocentezu zbog pozitivnog nalaza testa probiraza Downov sindrom (DS rizik 1/87). Analizom stanicaplodove vode GTG-metodom oprugavanja kromosoma,ustanovljena je recipro~na translokacija izme|u 4. i 20.kromosoma (4q;20p) pa je kariotip ploda opisan kao:46,XX,t(4;20)(q21;p11) (slika 1.). Kariotipizacijom lim-focita periferne krvi utvr|en je uredan kariotip obaroditelja, {to je upu}ivalo na to da se radilo o de novopromjeni u ploda. Ultrazvu~nom dijagnostikom nisuutvr|ene nikakve anomalije ploda pa je nakongeneti~kog informiranja trudno}a nastavljena. Sam jeporo|aj protekao bez komplikacija na termin. Ro|eno jezdravo ènsko dijete (poro|ajna teìna i duìna 3740 g/49 cm, opseg glave 33,5 cm i APGAR 9/10). Dvadana nakon poro|aja napravljena je kariotipizacija lim-focita periferne krvi djeteta. Uz klasi~nu citogenetiku,u~injena je i molekularno citogeneti~ka analiza kromo-soma metodom fluorescentne in situ hibridizacije sasondama PCP 433 (4 q11->21) i YAC 758H11 (20 p11.2).Time je potvr|en nalaz, a to~ke loma preciznije suodre|ene (slika 2.).

Godinu dana poslije, kontrolnim pedijatarskim pre-gledom ponovno je utvr|en uredan psihofizi~ki rast irazvoj djevoj~ice. U petoj godini djevoj~ica je upu}enana razgovor k specijalisti klini~ke psihologije zbog“ìvahna” pona{anja. Nalaz specijaliste pokazuje da seradi o djetetu s mentalnom sposobno{}u na razini boljegprosjeka s urednim psihomotornim razvojem.

Slu~aj 2.

Trudnica u 18. tjednu trudno}e upu}ena je na amnio-centezu zbog godina starosti (40 godina). Analizomstanica plodove vode GTG-metodom oprugavanja kro-mosoma utvr|ena je recipro~na translokacija kromoso-ma (1p; 2q) pa je kariotip ploda opisan kao:46,XY,t(1;2)(p31;q21) (slika 3.). Kariotipizacijom lim-focita periferne krvi roditelja utvr|en je uredan kariotip,{to je upu}ivalo na pojavu svjeè mutacije u njihovadjeteta. I u ovom slu~aju ultrazvu~nom dijagnostikomnisu utvr|ene anomalije ploda pa je trudno}a nastavlje-na. Poro|aj je protekao bez komplikacija. Ro|eno jezdravo mu{ko dijete (poro|ajna teìna i duìna 3080 g/49 cm, opseg glave 32,5 cm i APGAR 8/10). U~etvrtom mjesecu dje~aku je napravljena kariotipizacijalimfocita periferne krvi, kojom je potvr|en prenatalnodijagnosticirani kariotip. Isto tako, napravljena je imolekularno citogeneti~ka analiza kromosomametodom fluorescentne in situ hibridizacije sondamaPCP 122 (2pter->2q21) i YAC 758H10 (1p31.1) (slika 4.).

J. Vranekovi}, B. Brajenovi}-Mili}, Z. Modru{an-Mozeti~, M. Kapovi} DE NOVO BALANSIRANA RECIPRO^NA TRANSLOKACIJA Medicina 2004;42(40):286-289

Slika 1. Metafazni kromosomi (GTG-pruge). Plavim strelicamaozna~eni su normalni kromosomi 4 i 20, a crvenima deriviranikromosomi 4 i 20.

Figure 1 Metaphase chromosomes (GTG-banding). Normalchromosomes 4 and 20 are indicated with blue arrows, whilederived chromosomes 4 and 20 with red ones.

Slika 2. FISH na metafaznim kromosomimaKariotip: 46,XX.isht(4;20)(4pter->4q21.2::20p11.2;20qter>20p11.2: :4q21.24->4qter)de novo(A) sonda YAC 758H11 (20q12), (B) sonda PCP 433 (4q11->21) (C) Idiogram normalnih i deriviranih kromosoma 4 i 20 (GTG-pruge).

Figure 2 FISH on metaphase chromosomesKaryotype: 46,XX.isht(4;20)(4pter->4q21.2::20p11.2;20qter->20p11.2::4q21.24->4qter)de novo(A) probe YAC 758H11 (20q12), (B) probe PCP 433 (4q11->21)(C) Idiogram of normal and derived chromosomes 4 and 20(GTG-banding).

Kontrolnim pedijatarskim pregledom, godinu danaposlije, potvr|en je normalan psihofizi~ki rast i razvojdjeteta.

RASPRAVA

U radu smo obradili dva slu~aja kod kojih je analizomstanica plodove vode utvr|ena de novo balansirana reci-pro~na translokacija. U takvim je slu~ajevima vrlo te{koprognozirati daljnji psihofizi~ki razvoj ploda/djeteta jerprema studiji koju je 1991. godine provela Dorothy War-burton, de novo balansirane recipro~ne translokacijemogu biti povezane s fenotipskim promjenama u oko6% slu~ajeva.4 Da se balansirane recipro~ne translokaci-je mogu povezati s mentalnom retardacijom i kogenital-nim anomalijama, zna se od 1972. godine.5 Otada dodanas opisani su brojni slu~ajevi koji se danas opisujukao prividno balansirane recipro~ne translokacije.Promjena fenotipa u osoba s prividno balansiranomrecipro~nom translokacijom obja{njava se o{te}enjemgena do kojega dolazi zbog izmjene kromosomskogmaterijala, {to dovodi do gubitka njegove funkcije.6 Pre-cizno utvr|ivanje to~aka lomova moè uvelike pomo}iu identifikaciji lokusa gena. Izolacijom DNA-molekule upodru~ju to~aka loma, mogu se detektirati eventualnemutacije toga gena i povezati s odre|enim fenotipomkarakteristi~nim za neku ve} poznatu ili novootkrivenubolest. Uz to, postoje i neka druga obja{njenja kojima senastoji razjasniti promjena fenotipa u nosioca prividnobalansiranih recipro~nih translokacija. Jedno od tihobja{njenja kaè da je strukturna promjena u stvarnostinebalansirana zbog mogu}nosti male delecije ili dup-likacije kromosomskog materijala oko samog mjestaloma, a koja je ispod razine citogeneti~ke detekcijeklasi~nim metodama oprugavanja kromosoma.7,8

Sljede}e obja{njenje govori o tome da je genski materi-jal balansiran, ali promjena njegove pozicije i novo kro-mosomsko okru`je moè biti uzrokom abnormalnefunkcije gena, {to je ~est slu~aj u tumorskim stanicama.9

Isto tako, abnormalan fenotip u nosioca prividno balan-sirane recipro~ne translokacije, moè se povezati s uni-parentnom disomijom (UPD)7. Pojam uniparentna dis-omija opisuje prisutnost homolognog para kromosomaili samo jednog njegova dijela, koji su istoga roditeljskogpodrijetla u ina~e euploidnoj stanici.10,11 Dokazano je daUPD razli~itih kromosoma ima i razli~it utjecaj na feno-tip, {to ovisi o roditeljskom podrijetlu kromosoma.Fenomen koji opisuje razli~itu ekspresiju gena, odnosnokromosoma s obzirom na njegovo roditeljsko podrijetlo,naziva se genomic imprinting.11

Razvojem molekularne citogenetike i op}enito tehni-ka molekularne biologije, analiza to~aka loma u svimstrukturnim promjenama, pa tako i u ovima, postala jeneizostavan dio pretrage, ~ime se omogu}uje mapiranje


288

Slika 3. Metafazni kromosomi (GTG-pruge). Plavim strelica-ma ozna~eni su normalni kromosomi 1 i 2, a crvenim derivi-rani kromosomi 1 i 2.

Figure 3 Metaphase chromosomes (GTG-banding). Normalchromosomes 1 and 2 are indicated with blue arrows, whilederived chromosomes 1 and 2 with red ones.

Slika 4. FISH na metafaznim kromosomima.Kariotip: 46,XY.isht(1;2)(1qter->1p31.1::2q21.2->2qter;2pter->2q21.1::1p31.2->1pter)de novo(A) sonda PCP 122 (2pter->2q21), B) sonda YAC 758h10 (1p31.1) (C) Idiogram normalnih i deriviranih kromosoma 1 i 2 (GTG--pruge).

Figure 4 FISH on metaphase chromosomesKaryotype: 4 6 , X Y . i s h t ( 1 ; 2 ) ( 1 q t e r - > 1 p 3 1 . 1 : : 2 q 2 1 . 2 ->2qter;2pter->2q21.1::1p31.2->1pter)de novo(A) probe PCP 122 (2pter->2q21), B) probe YAC 758h10 (1p31.1)C) Idiogram of normal and derived chromosomes 1 and 2(GTG-banding).

289

gena te utvr|ivanje povezanosti kariotipa/genotipa ifenotipa. Za tu se svrhu naj~e{}e upotrebljava fluores-centna in situ hibridizacija. Sonde za hibridizacijuodabiru se na temelju kariotipa utvr|enog nekom odklasi~nih metoda oprugavanja kromosoma. I u na{em jeradu upotrijebljena fluorescentna in situ hibridizacija zaprecizno utvr|ivanje to~aka loma na deriviranim kro-mosomima koji su posljedica recipro~ne translokacije.Temeljem dobivenih rezultata hibridizacije, a premaOMIM (engl. – Online Mendelian Inheritance in Man)12

bazi podataka, ustanovili smo da utvr|ene to~ke lomanisu povezane s lokusima funkcionalnih gena, ~ime semoè objasniti uredan fenotip ispitanika.

U slu~ajevima prenatalno utvr|enih kromosomskihpromjena nastalim kao posljedica svjeè mutacije, zarazja{njenje odnosa genotip – fenotip veliko zna~enjeima i ultrazvu~na dijagnostika.13 Park sa suradnicimaupu}uje na potrebu detaljnijega ultrazvu~nog pregledafetusa, koji bi uklju~ivao ekokardiografiju radi {to boljeprognoze fenotipa ploda/djeteta. Studije pokazuju da suosobe s de novo balansiranom recipro~nom translokaci-jom, u kojih nije bilo ultrazvu~no utvr|enih anomalija,ro|ene bez zdravstvenih problema.13-15 Ni u na{ih ispi-tanika prenatalnom ultrazvu~nom dijagnostikom nisuustanovljene nikakve anomalije. Oba pacijenta ro|enasu bez zdravstvenih smetnji, {to je i potvr|eno daljnjimpedijatarskim pregledima.

Kao {to smo spomenuli u uvodu, mirni nosioci reci-pro~ne translokacije mogu imati razli~ite probleme ureprodukciji, a jedan od takvih problema mogu biti ispontani poba~aji. Do spontanih poba~aja dolazi zbogstvaranja nebalansiranih gameta tijekom gametogeneze.Upravo zbog tih problema mnogi od njih se u novije vri-jeme odlu~uju na preimplantacijsku geneti~ku dijagnos-tiku (engl. – preimplantation genetic diagnosis) meto-dom fluorescentne in situ hibridizacije koja im pruàve}u sigurnost da }e njihovo dijete biti zdravo.16

ZAKLJUÂK

U slu~ajevima de novo balansiranih recipro~nih trans-lokacija nemogu}e je sa sigurno{}u odrediti da }efenotip djeteta biti uredan. Taj problem stoga predstav-lja podru~je intenzivnog istraìvanja, ponajprije u smisluodre|ivanja odnosa genotip-fenotip, {to }e u budu}-nosti znatno olak{ati geneti~ko savjetovanje, posebno uokviru prenatalne dijagnostike.

LITERATURA

1. Zergorllern LJ. Strukturne kromosomske promjene U: Sam-bolek-Hrbi} E. Medicinska genetika 1. Školska knjiga,Zagreb 1991; 34 – 37.

2. Bonthron D, Fitz Patric D, Porteous M, Trainer A. Chromo-some abnormalities. U: Clinical genetics a case-basedapproach. W.B. Saunders company 1998; 28-29.

3. Wassman ER, Cheyovich DL, Nakahara Y. Possibly denovo translocations: prenatal risk counselling. Am J ObstetGynecol 1989; 161: 698-702.

4. Warburton D. De Novo Balanced Chromosome Rearrange-ments and Extra Marker Chromosomes Identified at Prena-tal Diagnosis: Clinical Significance and Distribution ofBreakpoints. Am J Hum Genet 1991; 49:995-1013.

5. Breg W.R, Miller DA, Allderdice PW. Identification oftranslocation chromosomes by qunacrine fluorescence.Am J Dis Child 1972; 123:561-564.

6. Nishikawa M, Ichiyama T, Hayashi T, Furukawa S. Mobius-like syndrome associated with a 1; 2 chromosome translo-cation. Clin Genet 1997; 51:122-123.

7. Kumar A, Becker LA, Depinet TW, Haren JM, Kurtz CL,Robin NH, Cassidy SB Wolff DJ, Schwartz S. Molecularcharacterization and delineation of subtle deletions in thenovo «balanced» chromosomal rearrangements. HumGenet 1998; 103: 173-178.

8. Wienberg J, Muller S. Chromosome bar codes: definingkaryotypes with molecular tags by multi color FISH. ECAnewsletter 2002; 9: 3-7.

9. Teixeira MR. Combined classical and molecular cytogenet-ic analysis of cancer. Eur J Cancer 2002; 38:1580-1584.

10. Ledbetter DH, Engel E. Uniparental disomy in humans:development of an imprinting map and its implications forprenatal diagnosis. Hum Molecular Genet 1995; 4:1757-1764.

11. Wang JCC. Genomic imprinting and uniparental disomy.U: Gersen SL, Keagle MB: The principles of clinical cyto-genetics. Humana Press Totowa New Jersey 1999, 473-499.

12. OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man, center forMedical Genetics, John Hopkins University(Baltimore,MD) and National Centre for BiotechnologyInformation, national Library of medicine, Bethesda,MD

13. Park SY, Kim JW, Kim YM, Kim JM, Lee MH, Lee BY, HanJY, Kim MY, Yang JH, Ryu HM. Frequencies of fetal chro-mosomal abnormalities at prenatal diagnosis: 10 yearsexperiences in a single institution. J Korean Med Sci. 2001;16(3): 290-3.

14. Abrams L, Cotter PD. Prenatal diagnosis of de novo X;autosome translocations. Clin Genet. 2004; 65: 423-8.

15. Warburton D. Outcome of cases of de novo structuralrearrangements diagnosed at amniocentesis. OrenatDiagn. 1984; 4:69-80

16. Weier HU, Munne S, Fung J. Patient-specific probes forpreimplatation genetic diagnosis of structural and numeri-cal aberrations in interphase cells. J Assist Reprod Genet.1999; 16: 182-191.


SA@ETAK

Prikazan je slu~aj bolesnice koja je kirur{ki lije~ena zbog ve}eg intra-torakalnog lipoma, a otprije je bolovala od familijarne multiple lipo-matoze. Pojavljivanje tih dviju bolesti u jednog bolesnika do sada nijeobjavljeno. Navedeni su i literaturni podaci o vi{e klini~kih sindromalipomatoza, a posebno su razmatrani familijarna multipla lipomatoza imultipla simetri~na lipomatoza. Uzrok ovih bolesti nije poznat. Lipomisu naj~e{}i benigni tumori u ljudi, dok su intratorakalni lipomi vrlorijetki. Dijagnoza se postavlja naj~e{}e kompjutoriziranom tomografi-jom (CT) i biopsijom, a terapija je kirur{ka. Kirur{kom zahvatu pristu-pa se kada lipom uzrokuje kompresiju na okolne strukture ili je razlogkozmeti~ke prirode.

KLJU^NE RIJEÎ: intratorakalni tumor, lipom, familijarna multipla lipo-matoza

ABSTRACT

This paper presents the case of a patient who underwent surgery dueto a large intrathoracic lipoma and had previously been diagnosedfamilial multiple lipomatosis. The occurrence of both diseases in onepatient has not been reported yet. The data of several clinical syn-dromes of lipomatosis are reviewed, with special attention paid tofamilial multiple lipomatosis and multiple symmetric lipomatosis. Thecause of these diseases is unknown. Lipoma is the most commonbenign human tumour, while intrathoracic lipoma occurs rarely. Thediagnosis is usually established by CT and both the biopsy and thetreatment are surgical. Surgery is performed when lipoma causes com-pression on surrounding structures or the reason is of cosmetic nature.

KEY WORDS: intrathoracic tumor, lipoma, familial multiple lipomato-sis

Prikaz slu~aja Medicina 2004;42(41):290-294Case report UDK: 617.5.94-006.44

INTRATORAKALNI LIPOM U BOLESNICE S FAMILIJARNOM MULTIPLOMLIPOMATOZOM

INTRATHORACIC LIPOMA IN PATIENT WITH FAMILIAL MULTIPLE LIPOMATOSIS

Veljko Flego1, Zlata Beg-Zec1, Dubravka Matani}1, Duje Vukas2, Slavica Cvitanovi}3,

An|elka Radoj~i} Badovinac4

Ustanova: 1Odjel za pulmologiju, Klinika za interne bolesti, Klini~ki bolni~kicentar Rijeka, 2Odjel za torakalnu i vaskularnu kirurgiju, Klinika za kirurgiju,Klini~ki bolni~ki centar Rijeka, 3Odjel za plu}ne bolesti, Klini~ka bolnica Split,4Zavod za biologiju, Medicinski fakultet u Rijeci


Adresa za dopisivanje: Veljko Flego, Odjel za pulmologiju, Klinika za internebolesti, Klini~ki bolni~ki centar Rijeka, T. Striì}a 3, 51 000 Rijeka. Tel. 051407104

mogu zahvatiti manje ili ve}e dijelove tijela.3 Multiplilipomi ili lipomatoza nalazi se u sklopu vi{e klini~kihsindroma. Multipla lipomatoza moè biti simetri~na iasimetri~na, a i jedna i druga se mogu javljati sporadi~noili familijarno.4 Naj~e{}i oblici bolesti su familijarna mul-tipla lipomatoza i multipla simetri~na lipomatoza (MSL).

Familijarna multipla (asimetri~na) lipomatoza karak-terizirana je prisutno{}u neinkapsuliranih lipoma narazli~itim dijelovima tijela.5,6 Mu{karci obolijevaju dvaputa ~e{}e nego ène.5,7 Lipomi mogu biti i u inkapsuli-ranom obliku, a tada su prisutni obi~no u ve}em broju(nekoliko stotina), oblikuju}i jedinstvenu veliku tumoro-znu tvorbu.8 To je benigni nasljedni poreme}aj masnogtkiva, koji je rijetko udruèn s poreme}ajem metabolizmalipida.9,10 Bolest je vrlo rijetka, javlja se rano, obi~no utre}oj ili ~etvrtoj dekadi ìvota.11 Spontana regresijatumora, kao i maligna alteracija su rijetke.7 Naj~e{}e senaslje|uje autosomno dominantno, iako su objavljeni islu~ajevi s recesivnim naslje|ivanjem.12,13 Dijagnoza se

UVOD

Namjera je ovoga rada prikazati slu~aj intratorakalnoglipoma u bolesnice koja boluje od familijarne multiplelipomatoze, {to do sada nije objavljeno.1

Lipomi su ~esti benigni tumori gra|eni od zrelih mas-nih stanica i vezivne kolagene strome s krvnim ìlama.2

Inkapsulirani su uglavnom, mogu se na}i u bilo kojemdijelu tijela, ali su naj~e{}i u potko`nomu masnom tkivu.Lipomatoza ozna~ava difuzno smje{tene lipome, naj-~e{}e u potko`nom tkivu, obi~no bez kapsule, koji

290

291

potvr|uje biopsijom tumora, kada postoji sumnja uto~nu klini~ku dijagnozu, kada su tumori bolni ili kadadolazi do funkcionalnog poreme}aja zahva}enog dijelatijela.14 Ako su lipomi brojni, veliki, difuzni, mogu zahti-jevati kirur{ki tretman.15 Rezultati kirur{kog lije~enja suvrlo dobri, s minimalnim postoperativnim oìljcima.16

Multipla simetri~na lipomatoza (Launois-Ben-saudeov sindrom) rijetka je bolest, javlja se uglavnom umu{karaca srednje ìvotne dobi, a karakterizirana jeneinkapsuliranim i neseptiranim, histolo{ki normalnimmasnim tkivom, na razli~itim podru~jima tijela.17 Posto-je dva tipa bolesti. Prvi je Madelungova bolest (benignasimetri~na lipomatoza) koja je karakterizirana sime-tri~nim depozitima masnog tkiva na potiljku vrata, naramenima, u supraklavikularnoj regiji i proksimalnimdijelovima ruku, a u tih su bolesnika ~e{}i i malignitumori gornjeg di{nog sustava te glave i vrata, kao ialkoholizam.18 Lipomatoza moè zahvatiti i medi-jastinum, {to dovodi do pritiska na du{nik ili gornju{uplju venu. Masno tkivo na preostalim dijelovima tijelaizgleda normalno. U drugom tipu lipomi se proteù niztijelo pa odaju izgled obi~ne debljine, osobito u èna. Zaispravno postavljanje dijagnoze treba razaznati da sunakupine masti simetri~ne te da su ruke i noge u distal-nim dijelovima po{te|ene od nakupljanja masnogtkiva.19

Multipla simetri~na lipomatoza ~esto se nalazi ualkoholi~ara i bolesnika koji boluju od dijabetes meli-tusa i arterijske hipertenzije.20 Od metaboli~kihporeme}aja na|ene su hiperuricemija i hiperlipidemi-ja.19 Bolest ima familijarnu predispoziciju, naj~e{}e senaslje|uje autosomno dominantno, ali na|eni su islu~ajevi sporadi~nog MSL-a.3,9 êsto se u tih bolesnikanalazi periferna neuropatija, a elektrofiziolo{kim mjere-njima na|ene su i promjene sredi{njega ìv~anog susta-va, u ve}ine bolesnika.21,22 Uzrok se multiple simetri~nelipomatoze ne zna, ali je bolest ~esto povezana s mito-hondrijskim funkcionalnim promjenama u stanici. Dis-funkcija mitohondrija ~esta je u multiploj simetri~nojlipomatozi. U nekim slu~ajevima MSL-a pokazane suto~kaste mutacije tRNA Lys gena mitohondrijske DNA, ito osobito u lipomatozi s proksimalnom miopatijom,kao jedinom manifestacijom mitohondrijske bolesti.23

Jo{ nije poznato podrijetlo masnih stanica u toj bolesti.Mogu}e obja{njenje proliferacije masnog tkiva i miopati-je je poreme}aj metabolizma lipida zbog deficijencijemitohondrijske funkcije koja moè biti povezana s defi-cijencijom karnitina.24 Mogu}e je da su i sme|e masnestanice izvor lipoma u bolesnika koji imaju tRNA Lysmutacije u mitohondrijskoj DNA.23

U djece je MSL vrlo rijedak i u takvim su slu~ajevimana|ene mutacije mtDNA.25 Opisani slu~ajevi u djeceimali su polineuropatiju, atrofiju cerebeluma i mitohon-drijske citopatije. Poznate su i neke citogenetske prom-

jene u sindromu multiple simetri~ne lipomatoze, i totranslokacije na kromosomima 2 i 19, ~ija daljnja istra-ìvanja mogu dati bolji uvid u patogenezu sindroma.26

Terapija MSL-a je kirur{ka, iako ~esto dolazi do re-lapsa lipoma nakon kirur{kog odstranjenja.19 Prognozaje izvrsna.

U kutanim lipomima op}enito utvr|en je high mobilitygroup protein isoform I C (HMGIC) gen, koji se nalazi nakromosomu 12q15.2,26,27 Smatra se da su lipomi posljed-ica translokacije HMGIC-gena na kromosomu 12 i lipo-ma preferred partner (LLP) gena na kromosomu 3.2,7

Osim translokacija, na|ene su delecije, inverzije i inser-cije. Preraspodjela kromosomskih regija kromosoma 6,13, 11, 12 ili ostalih na|ena je u jednoj tre}inipovr{inskih lipoma s abnormalnim kariotipom.2 U ma-njem broju lipoma nalaze se normalni kariotipovi.28

Premda su lipomi naj~e{}i benigni tumori u ~ovje-ka, intratorakalni lipomi su iznimno rijetki.26,29 Moguzapo~eti rast iz torakalne stijenke, medijastinuma, peri-karda, pleure, dijafragme i plu}nog parenhima.30,31

Dijagnostika standardnom rtg snimkom grudnih organanije dovoljna, ve} je za sigurniju dijagnozu potrebnakompjutorizirana tomografija (CT) i nuklearna magnets-ka rezonancija (NMR).32,33 CT i NMR daju dobre podatkeo ra{irenosti tumora, ali ne mogu diferencijalno dijag-nosti~ki razlikovati liposarkom od lipoma.34,35 Intra-torakalni lipomi rijetko se nalaze i u djece. Otkrivaju ses visokom to~no{}u CT-om, a mogu erodirati rebro skojim dolaze u kontakt.36 U djece su opisani i medijasti-nalni lipoblastomi.37

Za dijagnostiku intratorakalnog lipoma upotrebljavase aspiraciona iglena biopsija.30 To~nija dijagnostika i te-rapija tih tumora je kirur{ka (torakotomija ili videoasisti-rani torakoskopski zahvat-VATS),38,39 a jedino patohisto-lo{ki nalaz to~no razlikuje lipom od liposarkoma.40,41

PRIKAZ SLUÂJA

Pedesetogodi{nja bolesnica se hospitalizira zbog disp-neje u naporu, koja traje zadnjih 5 mjeseci. Prije 15 godi-na operirala je ù~ne kamence, a prije 6 godina operi-rani su potko`ni lipomi na desnoj ruci. Zadnjih 8 godinalije~i se zbog inzulin-neovisne {e}erne bolesti. Rutinskilaboratorijski nalazi bili su u granicama normale, osimvrijednosti kolesterola 6,2 mmol/l (do 5,2) i glukoze ukrvi 16,l mmol/l (3,9-6,1). U familijarnoj anamnezi saz-najemo da je majka bolovala od {e}erne bolesti, brat imave}i broj potko`nih ~vorova na rukama i trupu, kao i k}ibolesnice. Prvi potko`ni ~vorovi pojavili su se ubolesnice u dobi od 32 godine ìvota na rukama, a posli-je i po cijelom trupu i nogama, u asimetri~noj formi.

Fizikalnim pregledom ustanovili su se difuznipotko`ni ~vorovi po ekstremitetima i trupu, tvrde kon-

V. Flego, Z. Beg-Zec, D. Matani} i dr. INTRATORAKALNI LIPOM U BOLESNICE S FAMILIJARNOM MULTIPLOM LIPOMATOZOM Medicina 2004;42(40):290-294

zistencije, bezbolni na palpaciju, pomi~ni, veli~ine od1–4 cm.

Standardna rtg snimka torakalnih organa pokazala jeinhomogeno zasjenjenje, o{tro ograni~eno od okoline,smje{teno bazalno i straga u desnom hemitoraksu. Nalazkompjutorizirane tomografije toraksa pokazao jeekspanzivnu tvorbu desno dorzobazalno veli~ine 82 x120 x 128 mm, apsorpcijskih vrijednosti masti, kao i obil-nije masno tkivo u podru~ju oba kardiofreni~na kuta(slika 1.). Sonografski se prikazala okrugla formacijadesno supradijafragmalno s hiperehogenom kapsulom iheterogenim internim odjecima. U~inila se transto-rakalna punkcija, pod kontrolom ultrazvuka. Citolo{kinalaz pokazao je masne stanice.

U~inila se desnostrana torakotomija i ekstirpiratumor u cijelosti. Tumor je zapo~eo rast iz subpleu-ralnog masnog tkiva torakalne stijenke u 7. interkostal-nom prostoru. Baza tumora iznosila je 2 cm, dimenzijesu mu bile 60 x 110 x 140 mm, a teìna je bila 650 grama(slika 2.). Tumor je bio inkapsuliran, mekane konzisten-cije, ùte boje, na prerezu se nalaze krvarenja. Histolo{kise radilo o tumoru gra|enom od zrelog masnog tkiva(lipoma). Tijekom operacije na|ena je manja koli~inaserozne teku}ine u pleuralnom prostoru. Postoperativnitok bio je uredan. Bolesnica ~etiri godine nakonoperacije dolazi na redovite kontrolne preglede, imaurednu rtg snimku torakalnih organa, kao i spirometrij-sko ispitivanje.

RASPRAVA

Prikazani slu~aj je familijarna multipla asimetri~na lipo-matoza, zbog familijarnog javljanja bolesti i nesimetri~nedistribucije lipoma po ekstremitetima i trupu. Radi senaj~e{}e o autosomno dominantnoj bolesti, {topotvr|uje geneolo{ko ispitivanje i ovog slu~aja. Bolestse pojavljuje u tri generacije. Intratorakalni lipom rijetkaje lokalizacija lipoma koji moè biti lokaliziran natorakalnoj stijenci, kao u prikazanom slu~aju, ili na sti-jenci traheje i/ili bronha.1 U literaturi postoji prili~novelika konfuzija u razlikovanju sindroma multiple lipo-matoze.5,12

U multiploj simetri~noj lipomatozi, koja se ~e{}e jav-lja u mu{karaca, ~esto je prisutan alkoholizam, dok je ufamilijarnoj multiploj lipomatozi rijedak.42,43 ê{}e jav-ljanje lipoma u alkoholi~ara tuma~i se promjenama ubroju i funkciji beta-adrenergi~nih receptora te lipoge-nim i antilipoliti~kim djelovanjem etilnog alkohola.42

Druga je hipoteza da defekt lipolize nastaje zbog prom-jene u mitohondrijima sme|ega masnog tkiva, ~iji je ras-pored sli~an tipi~noj distribuciji lipoma u multiplojsimetri~noj lipomatozi.42 Na{a bolesnica nije bila alko-holi~ar. Od metaboli~kih poreme}aja, bolesnica je imalahiperkolesterolinemiju i dijabetes melitus tipa II.


292

Slika 1. Prikaz intratorakalnog lipoma kompjutoriziranom

tomografijom (CT) toraksa

Figure 1 Intrathoracic lipoma shown by the computerised

tomography (CT) of the thorax

Slika 2. Kirur{ki odstranjen intratorakalni lipom

Figure 2 Surgically removed intrathoracic lipoma

Iz kromosomskih promjena, navedenih u literaturi,moè se pretpostaviti da su multipla simetri~na lipoma-toza i pojedina~ni lipomi dva odvojena entiteta. MSLima familijarnu osnovu (autosomno dominantnonaslje|ivanje), ali na|eni su i slu~ajevi sporadi~ne mul-tiple lipomatoze.3,9 Razli~ite translokacije kromosoma 2,12 i 19 na|ene su u vi{e lipoma istog bolesnika, {topotvr|uje hipotezu da se multipli lipomi razvijaju iz

293

razli~itih mati~nih stanica.2,26,44 Naàlost, jo{ nismodobili pristanak pacijentice za citogenetsku analizuobitelji i tumorskih stanica. Utvr|ene su i citogeneti~kepromjene koje su razli~ite u lipomima i liposarkomi-ma.28 U lipomima promjene se nalaze na kromosomu12q15, tj. distalnije od promjena u liposarkomima(12q13.3). Takav citogeneti~ki nalaz na|en u lipomima,jednak je nalazima u lejomiomima uterusa i pleo-morfnom adenomu `lijezde slinovnice.28 S druge stranemoè se uzeti u obzir da se radi o istoj bolesti, tj. da pos-toji predispozicija za bolest, a da dodatni riziko-faktori(npr. alkoholizam) pridonose nastanku bolesti.

MSL moè biti udruèna s multiplom endokrinomneoplazijom tipa I (MEN 1), gdje se povremeno nalazepromjene u lipomima na kromosomu 11.45 U ovom jeslu~aju u~injena torakotomija i ekstirpacija tumora zbogveli~ine samog tumora. Patohistolo{ki nalaz opera-tivnog materijala potvrdio je nalaz lipoma koji je i prijeutvr|en aspiracijskom iglenom biopsijom. êtiri godinenakon kirur{ke resekcije nema recidiva tumora.

Uzrok sindroma multiple asimetri~ne lipomatoze nijepoznat. Ispitivanja samih tumorskih stanica pokazala suda se u lipoma i lipomatozi radi o hiperplaziji masnihstanica (adipocita), koje imaju jednaku histogenezu.Pretpostavlja se da je lipoliza smanjena na razini hormonreceptor/adenil ciklaza.46

Terapija u svim slu~ajevima lipomatoze jest kirur{kouklanjanje lipoma, osobito onih ve}ih dimenzija kojiuzrokuju kompresiju na okolne organe, ili je razlogkozmeti~ke prirode, a nerijetko u diferencijalno dijag-nosti~ke svrhe.15 Od kirur{kih tehnika upotrebljava seobi~na ekscizija, endoskopski zahvat ili liposukcija.16

Komplikacija intratorakalnog lipoma moè bitikrvarenje koje se osobito javlja u tumorima na peteljci.35

Do sada nije objavljen nalaz intratorakalnog lipoma iko`nih lipoma u jednog bolesnika. Smatramo da }e ovajrad pridonijeti boljem razumijevanju i klasifikaciji poje-dinih sindroma lipomatoze.

LITERATURA

1. Morton SE, Byrd RP, Fields CL, Roy TM. Tracheal Lipoma.A Rare Intrathoracic Neoplasm. South Med J 2000; 93: 360-3.

2. Pedeutour F, Foa C. From cytogenetics to cytogenomics ofadipose tissue tumors: 1. Benign adipose tissue tumors.Bulletin du Cancer 2002; 89: 689-95.

3. Wilson D, Boland J. Sporadic multiple lipomatosis: a casereport and review of the literature. W V Med J 1994; 90:145-6.

4. Salam GA. Lipoma excision. Am Fam Physician 2002; 65:901-4.

5. Leffell DJ, Braverman IM. Familial multiple lipomatosis.Report of a case and a review of the literature. J Am AcadDermatol 1986; 15: 275-9.

6. Mohar N. Familial multiple lipomatosis. Acta Derm Venere-ol 1980; 60: 509-13.

7. Toy BR. Familial multiple lipomatosis. Dermatol Online J2003; 9: 9.

8. Ersek RA, Lele E, Surak GS, Denton DR, McCue K. Heredi-tary progressive nodular lipomatosis: a report and selectivereview of a new syndrome. Ann Plast Surg 1989; 23: 450-5.

9. Wilson D, Boland J. Sporadic multiple lipomatosis: a casereport and review of the literature. W V Med J 1994, 90:145-6.

10. Rubinstein A, Goor Y, Gazit E, Cabili S. Non-symmetricsubcutaneous lipomatosis associated with familial com-bined hyperlipidaemia. Br J Dermatol 1989; 120: 689-94.

11. Rabbiosi G, Borroni G, Scuderi N. Familial multiple lipo-matosis. Acta Derm Venereol 1977; 57: 265-7.

12. Stoll C, Alembik Y, Truttmann M. Multiple familial lipo-matosis with polyneuropathy, an inherited dominant con-dition. Ann Genet 1996; 39: 193-6.

13. Keskin D, Ezirmik N, Celik H. Familial multiple lipomato-sis. Isr Med Assoc J 2002; 4: 1121-3.

14. Dolph JL, Demuth RJ, Miller SH. Familial multiple lipo-matosis. Plast Reconstr Surg 1980; 66: 620-2.

15. Al-basti HA, El-Khatib HA. The use of suction-assisted sur-gical extraction of moderate a large lipomas: long-term fol-low-up. Aesthetic Plast Surg 2002; 26: 114-7.

16. Ronan SJ, Broderick T. Minimally invasive approach tofamilial multiple lipomatosis. Plast Reconstr Surg 2000; 106:878-80.

17. Stavropoulos PG, Zouboulis CC, Trautmann C, Orfanos CE.Symmetric lipomatoses in female patients. Dermatology1997; 194: 26-31.

18. Smith PD, Stadelmann WK, Wassermann RJ, Kearney RE.Benign symmetric lipomatosis (Madelung´s disease). AnnPlast Surg 1998; 41: 671-3.

19. Harsch, Michaeli P, Hahn EG, Ficker JH, Konturek PC.Launois-Bensaude syndrome in a female with type 2 dia-betes. Med Sci Monit 2003; 9: CS5-8.

20. Morelli F, De Benedetto A, Toto P, Tulli A, Feliciani C.Alcoholism as a trigger of multiple symmetric lipomatosis?J Eur Acad dermatol Venereol 2003; 17: 367-9.

21. Lee HW, Kim TH, Cho JW, Ryu BY, Kim HK, Choi CS. Mul-tiple symmetric lipomatosis: Korean experience. DermatolSurg 2003; 29: 235-40.

22. Klopstock T, Naumann M, Seibel P, Shalke B, Reiners K,Reichmann H. Mitochondrial DNA mutations in multiplesymmetric lipomatosis. Mol Cell Biochem 1997;174: 271-5.

23. Vila MR, Gamez J, Solano A, Playan A, Schwartz S, San-torelli FM i sur. Uncoupling protein-1 mRNA expression inlipomas from patients bearing pathogenic mitochondrialDNA mutations. Biochem Biophys Res Commun 2000; 278:800-2.

24. Munoz-Malaga A, Bautista J, Salazar JA, Aguilera I, GarciaR, Chinchon i sur. Lipomatosis, proximal myopathy, andthe mitochondrial 8344 mutation. A lipid storage myopa-thy? Muscle Nerve 2000; 23: 538-42.


25. Gastro Gago M, Alonso A, Pintos Martinez E, NovoRodriguez MI, Blanco Barca M, Campos Y i sur. Multiplesymmetric lipomatosis associated to polyneuropathology,atrophy of the cerebellum and mitochondrial cytopathy.Rev Neurol 2003; 36: 1026-9.

26. Vaughan CJ, Weremowicz S, Goldstein MM, Casey M, HartM, Hahn RT i sur.. A t(2;19)(p13;p13.2) in giant invasivecardiac lipoma from a patient with multiple lipomatosis.Genes Chromosomes Cancer 2000; 28: 133-7.

27. Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Vanden Berghe H, Van de Ven WJ. Recurrent rearrangementsin the high mobility group proteine gene, HMGI-C, inbenign mesenchymal tumours. Nat Genet 1995; 10: 436-44.

28. Mrozek K, Karakousis CP, Bloomfield CD. Chromosome12breakpoints are cytogenetically different in benign andmalignant lipogenic tumors: localisation of breakpoints inlipoma to 12q15 and in myxoid liposarcoma to 12q13.3.Cancer Res 1993; 53: 1670-5.

29. Rosenberg RF, Rubinstein BM, Messinger NH. IntrathoracicLipomas. Chest 1971; 60: 507-9.

30. Baris YI, Kalyoncu AF, Aydiner A, Gulekon N, Eryilmaz M,Selcuk ZT i sur. Intrathoracic lipomas demonstrated bycomputed tomography. Respiration 1990; 57: 77-80.

31. Vagner EV, Bruns VA, Kubarikov AP. Difficulties and errorsin diagnosis of intrathoracic adipose tumors. Khirurgiia1993; 10: 88-91.

32. Kondoh K, Kobayashi T, Urakami T, Kasugai T. A case ofpedunculated intrathoracis chest wall type lipoma. KyobuGeka 1997; 50: 1065-8.

33. Tokitsu K, Tachibana S, Kawakami M, Nakao K, Morita T,Hashimoto T i sur. Two surgical cases of intrathoracic lipo-ma. Kyobu Geka 1999; 52: 251-3.

34. Naruse H, Katayama Y, Inada K, Ikeda T. An adult case ofintrathoracic chest wall type lipoma by VATS resection.Kyobu Geka 1998; 51: 517-20.

35. Geis JR, Russ PD, Adcock KA. Computed tomography of asymptomatic infarcted thoracic lipoma. J Comput Tomogr1988; 12: 54-6.

36. Dubus JC, Guys JM, Louis C, Panuel M, Garnier JM, MilletV i sur. Unusual intrathoracic tumor in children: lipoma.Arch Fr Pediatr 1993; 50: 123-5.

37. Whyte AM, Powell N. Mediastinal lipoblastoma of infancy.Clin Radiol 1990; 42: 205-6.

38. Umemori Y, Makihara S, Fukuhara T, Nakashima K, MaedaT, Sakae K. A case of intrathoracic lipoma arising from thechest wall resected by video-assisted thoracoscopicsurgery. Kyobu Geka 1998; 51: 1144-7.

39. Kusaka T, Okubo T, Hasegawa N, Okayasu K, Tanabe T. Acase of intrathoracic chest wall type lipoma. NipponKyobu Geka Gakkai Zasshi 1992; 40: 316-9.

40. Yanagi M, Shimotakahara T, Kubo M, Matsumoto H, Nishi-jima H, Simazu H. An adult of intrathoracic lipoma arisingfrom the chest wall. Kyobu Geka 1994; 47: 249-51.

41. Takayama T, Hirai S, Ishihara T, Kumazaki S, Sano K,Mishima H i sur. Pleural lipoma: report of a case. SurgToday 1994; 24: 173-5.

42. Lomartire N, Ciocca F, di Stanislao C, Bologna G, Giuliani M.Multiple symmetrical lipomatosis (MSL): a clinical case anda review of the literature. Ann Ital Chir 1999; 70: 259-62.

43. Novak N, Petrow W, Bieber T. Benign symmetricalLaunois–Bensaude type II lipomatosis with maarket sys-temic involvement and psoriasis. Hautarzt 2000; 51: 427-30.

44. Dal Cin P, Turc-Carel C, Sandberg AA. Consistent involve-ment of band 12q14 in two different translocations threelipomas from the same patient. Cancer Genet Cytogenet1988; 31: 237-40.

45. Morelli A, Falchetti A, Weinstein L, Fabiani S, Tomassetti P,Enzi G i sur. RFLP analysis of human chromosome 11region q13 in multiple symmetric lipomatosis and multipleendocrine neoplasia type 1- associated lipomas. BiochemBiphys Res Commun 1995; 207. 363-8.

46. Enzi G, Busetto L, Ceschin E, Coin A, Digito M, Pigozzo S.Multiple symmetric lipomatosis: clinical aspects and out-com a long-term longitudinal study. Int J Obes Relat MetabDisord 2002; 26: 253-61.


294

SA@ETAK

Brojne invazivne i neinvazivne metode danas su sastavni dio svake mo-derno organizirane prenatalne skrbi. Invazivni, dijagnosti~ki testovi kao{to su biopsija korion frondozuma i amniocenteza, primjenjuju se uvisokorizi~nih trudno}a, a neinvazivni, biokemijski i/ili ultrazvu~ni,testovi probira predvi|eni su za sve trudnice, bez obzira na dob i bezosobnog ili obiteljskoga geneti~kog optere}enja. Svrha je probirautvr|ivanje trudnica s pove}anim rizikom za odre|eni poreme}aj, {toindicira daljnju dijagnostiku. Danas je u {irokoj primjeni biokemijski testprobira za trisomiju 21 (Downov sindrom), naj~e{}u autosomnu aberaci-ju u ljudi. Probir se naj~e{}e izvodi izme|u 15. i 18. tjedna trudno}e, aprocjena rizika temelji se na riziku za trisomiju 21 ovisnom o godinamatrudnice i riziku vezanom uz razinu serumskih biljega kao {to su alfa-fetoprotein, humani korionski gonadotropin ili njegova slobodna β-pod-jedinica i nekonjugirani estriol. Stopa detekcije Downova sindroma udrugom tromjese~ju trudno}e kre}e se od 60% do 75%, uz 5% la`nopo-zitivnih nalaza. Test probira moè se izvoditi i u prvom tromjese~ju ikombinacija je ultrazvu~nog mjerenja nuhalnog nabora i mjerenja razineslobodnog β-hCG-a i uz trudno}u vezanog plazma proteina-A (PAPP-A)u serumu trudnice. Stopa detekcije je vi{a nego u drugom tromjese~ju iiznosi 75%–90%, uza stopu od 5% la`nopozitivnih nalaza. Uz Downovsindrom, biokemijskim testovima probira mogu se detektirati i neki drugiporeme}aji kao {to su o{te}enja neuralne cijevi i prednje trbu{ne stijenke(drugo tromjese~je), trisomija 18 (Edwardsov sindrom), Turnerov sin-drom, Smith-Lemli-Opitzov sindrom i deficijencija steroidne sulfataze.

KLJU^NE RIJEÎ: Downov sindrom; prenatalni test probira

ABSTRACT

A variety of invasive and non-invasive tests have been included in themodern prenatal care. Invasive and diagnostic tests (chorionic villussampling and amniocentesis) are performed in “high risk” pregnancies,while non-invasive, biochemical or/and ultrasonographical screeningtests are available to all pregnant women regardless of their age, inparticular to those women who do not have any personal or familyhistory of genetic disorder. The purpose of a prenatal screening test is toidentify individuals at a sufficient risk of a specific disorder to benefitfrom a further diagnostic investigation. Nowadays, the second trimesterserum screening for one of the most common autosomal aberrations,trisomy 21 (Down syndrome), has been gaining a wide acceptance.Generally, it is carried out between 15 to 18 weeks of gestational age andthe risk evaluation is based on the combination of the maternal age-specific risk for an affected pregnancy together with the risk associatedwith the concentrations of maternal serum alpha-fetoprotein, humanchorionic gonadotropin or its free β-subunit and unconjugated estriol.The second trimester detection rate for Down syndrome is 60-75% at a5% false positive rate. The first trimester screening for trisomy 21 can beperformed using combined measuring of the fetal nuchal translucencythickness and the maternal serum free β-hCG as well as the pregnancyassociated plasma protein-A. In this case, a detection rate of 75-90% at a5% false positive rate can be achieved. In addition to Down syndrome,serum-screening tests are also effective in the detection of neural tubedefects, abdominal wall defects, trisomy 18 (Edward’s syndrome), Turnersyndrome, Smith-Lemli-Opitz syndrome and steroid sulfatase deficiency.

KEY WORDS: Down syndrome, prenatal screening test

Klini~ke smjernice Medicina 2004;42(41):295-300Clinical guidelines UDK: 618.2-082-072.5

616.899.6:618.33

INVAZIVNE I NEINVAZIVNE METODE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE

INVASIVE AND NON-INVASIVE METHODS OF PRENATAL DIAGNOSTICS

Bojana Brajenovi}-Mili}



Adresa za dopisivanje: Prof. dr. sc. Bojana Brajenovi}-Mili}, Zavod za biologiju imedicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, Bra}e Branchetta22, 51000 Rijeka. Tel. 051 651-128. e-mail: [email protected]

295

UVOD

Kongenitalne anomalije uzrok su perinatalne smrti u20–25% slu~ajeva, a ~ak 3% djece rodi se s ve}om ili ma-

njom malformacijom. Mnoge od njih mogu biti detekti-rane ve} prije ro|enja primjenom razli~itih metoda pre-natalne dijagnostike. Dana{nja, moderno koncipiranaprenatalna skrb nudi brojne invazivne i neinvazivnetestove. Invazivni testovi kao {to su amniocenteza i biop-sija korion frondozuma, dijagnosti~ki su i primjenjuju seu slu~ajevima visokorizi~nih trudno}a. Razlozi njihoveprimjene su brojni, a naj~e{}e se radi o slu~ajevimaosobnog ili obiteljskoga geneti~kog optere}enja, o ve}ro|enome bolesnom djetetu, poznoj dobi trudnice te

pove}anom riziku utvr|enim biokemijskim ili ultra-zvu~nim testom probira. No prije bilo kakve intervencijeili primjene invazivnih metoda, valja uvaàvati pravilosine qua non prenatalne dijagnostike, {to u prvom redupodrazumijeva mogu}nost utvr|ivanja ili isklju~ivanjabolesti analizom fetalnog tkiva. U slu~ajevima utvr|enogporeme}aja u fetusa, prenatalna dijagnoza omogu}ujeroditeljima da u razgovoru sa svojim lije~nikom donesuodluku o daljnjem tijeku trudno}e.

Za razliku od invazivnih metoda, neinvazivni testoviprobira, biokemijski i ultrazvu~ni, predvi|eni su za svetrudnice bez obzira na dob, odnosno one koje nemajuniti jedan od prije navedenih problema. Op}enito,pojam probira podrazumijeva sistemsku primjenu testaporadi otkrivanja osoba s pove}anim rizikom zaodre|en poreme}aj.1 Odre|en program probira morazadovoljiti ove kriterije: medicinski dobro opisanporeme}aj s poznatom prevalencijom, financijski oprav-dan, siguran i pristupa~an test s dobro definiranimmogu}nostima.2 Valjanost testa probira procjenjuje se naosnovi njegove stope detekcije (senzitivnost), la`nopo-zitivne stope (specifi~nost) i o mogu}nosti da se stvarnoradi o bolesti u slu~aju pozitivnog rezultata.

Prenatalni biokemijski test probira poradi identi-fikacije trudnica s pove}anim rizikom za Downov sin-drom (DS), u skladu je s navedenim kriterijima i pot-puno opravdava svoju primjenu.

Klini~ki aspekt Downova sindroma

Downov sindrom naj~e{}i je uzrok mentalne retardacijeu ~ovjeka i uz karakteristi~nu kraniofacijalnu dismorfiju,~esto se javljaju te{ke abnormalnosti srca, bubrega i cri-jeva, {to nerijetko zahtijeva kirur{ku intervenciju u prvihnekoliko godina ìvota. êsto boluju i od akutneleukemije, a ako doìve dob od 40–50 godina, ve}ina ihpati od presenilne demencije tipa Alzheimer.3

Incidencija Downova sindroma iznosi 1 na 650 do1000 ìvoro|ene djece4. U Hrvatskoj je u~estalostDownova sindroma 13.0 na 10.000 ìvoro|enihgodi{nje.5,6

Downov sindrom je posljedica trisomije 21. kromo-soma7. U gotovo 95% slu~ajeva radi se o slobodnoj tri-somiji (regularni tip) koja je naj~e{}e posljedica neraz-dvajanja kromosoma tijekom oogeneze8. U 4% slu~ajevaradi se o translokacijskom tipu trisomije 21 koja nastajekao posljedica Robertsonove translokacije, a u svega 1%slu~ajeva Downov sindrom moè biti posljedica prisut-nosti dviju stani~nih linija, od koje je jedna trisomi~na za21. kromosom (mozaicizam).9

Jo{ je davne 1933. godine Penrose uo~io vezuizme|u prevalencije Downova sindroma i godinamajke.10 Tako, npr., vjerojatnost da }e èna s 30 godinaroditi dijete s Downovim sindromom je 1:910, s 35 godi-na 1:350, a u dobi od 40 godina ta je vjerojatnost

zna~ajno ve}a i iznosi 1:10011. Va`no je istaknuti da u10–24% trudno}a s trisomijom 21 dolazi do spontanogpoba~aja tijekom drugog tromjese~ja pa je stvarna inci-dencija DS-a vi{a i rizik u drugom tromjese~ju za tride-setpetogodi{nju trudnicu iznosi 1:270.12

Prije uvo|enja biokemijskog testa probira za DS,provodio se probir na osnovi godina majke, uvaàvaju}i35 godina kao grani~nu vrijednost. To, drugim rije~ima,zna~i da je u trudnica starih 35 i vi{e godina bila indici-rana neka od invazivnih metoda prenatalne dijagnozeporadi utvr|ivanja kariotipa ploda. Ovakvim se pro-birom moè, teoretski, ustanoviti 30% slu~ajeva DS-a, au stvarnosti taj je postotak iznosio najvi{e do 20%.12 Nije~udno stoga {to je u proteklih petnaestak godina u~injenvelik napor kako bi se uveli novi testovi probira koji sumorali biti, u prvom redu, bezopasni za trudnicu i plod,a u~inkovitiji od postoje}ih.

BIOKEMIJSKI TEST PROBIRA ZA DOWNOV SINDROM

Jo{ su davne 1984. godine Merkatz, Macri i suradniciustanovili smanjenu razinu alfa-fetoproteina u serumutrudnice (MSAFP) koja nosi plod s trisomijom 21.13

Godine 1988. Canick i suradnici upozoravaju na sniènurazinu nekonjugiranog estriola (nE),14 a 1987. Bogart isuradnici iznose podatak o povi{enoj razini humanogkorionskoga gonadotropina (hCG) kod trudno}a s tri-somijom 21.15 Kasne 1990. i rane 1991. godine Macri sasuradnicima i Spencer, neovisno jedan o drugome,objavljuju radove koji govore o povi{enoj razini slo-bodne β-podjedinice hCG.16,17 Tim ranim radovima za-po~inje era uvo|enja i primjene biokemijskih testovaprobira za Downov sindrom.

Biokemijski test probira za Downov sindrom u drugomutromjese~ju

Wald i suradnici su 1988. godine preporu~ili mjerenje triserumska biljega (MSAFP, hGC i nE) poradi detekcijeDownova sindroma.18 Taj je test vrlo brzo prihva}en kaorutinski dio prenatalne skrbi pa je provedenim ispitivan-jem 1995. godine ustanovljeno da ~ak 63% trudnica uSjedinjenim Ameri~kim Dràvama pristaje biti testira-no.19 Uz navedene kombinacije serumskih biljega,danas su u uporabi i druge kombinacije kao {to su, npr.,MSAFP i slobodna β-podjedinica hCG;20,21 MSAFP, slo-bodna β-podjedinica hCG i nE 22 te MSAFP, hCG, nE iInhibin-A.23 Procjena rizika temelji se na riziku za tri-somiju 21 ovisnom o godinama trudnice i rizikuvezanom uz razinu serumskih biljega, a upotrebljava sematemati~ki model za multivarijantnu analizu normalnodistribuiranih varijabli (Gauss).24 Izmjerene koncen-tracije biljega izraène su kao koli~nici njihovih medi-jana razine (MoM, od engl. Multiple of the Median) u

B. Brajenovi}-Mili} INVAZIVNE I NEINVAZIVNE METODE PRENATALNE DIJAGNOSTIKE Medicina 2004;42(40):295-300

296

neugroènim trudno}ama u odre|enom tjednu gestacijei korigirane prema teìni trudnice.

Bez obzira na kombinaciju serumskih biljega, bio-kemijski test probira za DS drugog tromjese~ja izvodi seizme|u 15. i 18. tjedna trudno}e prema protokoluprikazanom na slici 1. Kao grani~na vrijednost naj~e{}e sesmatra rizik od 1:250, {to zna~i da }e svaki rizik ve}i odgrani~nog biti pozitivan nalaz. Na uspje{nost probira bitnoutje~e odre|ivanje tjedna gestacije te se stoga preporu~ujeultrazvu~no odre|ivanje prema mjerama trtica-tjeme ilibiparijentalnog promjera glavice fetusa. U tablici 1.prikazana je va`nost to~nog odre|ivanja gestacije. O pro-cijenjenom riziku ovisi daljnje vo|enje i pra}enje trudno}ete sam ishod trudno}e. Razina serumskih biljega ovisi otjelesnoj teìni trudnice, rasi i inzulin-ovisnoj {e}ernojbolesti pa programi za prora~un individualnog rizikaimaju mogu}nost korekcije u odnosu na spomenute para-metre.25-27 Postoje i drugi ~imbenici koji utje~u na razinubiljega, a to su cigaretni dim (pu{enje), paritet, graviditet,in vitro fertilizacija te spol fetusa.28-30 Iako se ~ini da nekiod navedenih ~imbenika imaju dokazan zna~ajan utjecaj,kao {to je to primjer s uìvanjem cigaretnog dima, korek-cija za njih nije u {iroj i obveznoj primjeni.

Stopa detekcije Downova sindroma primjenombiokemijskog testa probira u drugom tromjese~ju kre}ese od 60 do 75%, uz 5% la`nopozitivnih rezulta-ta.18,19,23,31 Me|utim, uspje{nost detekcije ovisi, u manjojmjeri, o kombinaciji serumskih biljega, a vi{e o grani~nojvrijednosti rizika te o starosti testiranih trudnica. Što seti~e dobi testiranih trudnica, bolja detekcija je svakako ugrupi èna starijih od 35 godina (90%), a manja u mla|ihtrudnica (40%). Kao posljedica toga, broj la`nopozi-tivnih nalaza ve}i je u grupi starijih èna, a manji u grupimla|ih trudnica. Isto tako, uz manji grani~ni rizik (npr.1:350), o~ekuje se i ve}a stopa detekcije, ali i ve}i brojla`nopozitivnih nalaza.39,40

Mogu}nost detekcije ostalih poreme}aja

Biokemijskim testovima probira mogu se, osim Downo-va sindroma, detektirati i neke druge kromosomopatije iporeme}aji. To se, u prvom redu, odnosi na o{te}enjaneuralne cijevi i prednje trbu{ne stijenke. Odavno jepoznata veza izme|u visoke razine AFP-a, kako uplodovoj vodi tako i u serumu majke, i spomenutihporeme}aja.32 Iako osjetljivost MSAFP-a kao pojedi-na~nog biljega u probiru trisomije 21 nije vi{a od 30-akposto, njegova uloga kao visokoosjetljivog pokazateljao{te}enja neuralne cijevi i prednje trbu{ne stijenke ~iniga neizostavnim dijelom svakoga biokemijskog probiradrugog tromjese~ja. Osim trisomije 21, biokemijski testprobira primjenjuje se i za probir trisomije 18(Edwardsov sindrom). Takve trudno}e karakteriziranesu niskom razinom MSAFP-a, nE, hCG/slobodnim β-hCG i Inhibin-A glikoproteinom.33 Mogu}nost detek-cije trisomije 13, Patau sindrom, mala je, osim u slu~aje-vima kada je prisutno o{te}enje neuralne cijeviotvorenog tipa, vezano uz pove}anu razinu MSAFP-a.34

Monosomiju X-kromosoma, Turnerov sindrom, udru-ènom s fetalnim hidropsom ~esto odlikuje niska razinaMSAFP-a i nE i visoka razina HCG-a i Inhibina-A.35 Uslu~ajevima bez hidropsa, razina je sva ~etiri markeraniska. Geneti~ki poreme}aji vezani uz nepravilnu sin-tezu nE, kao {to su deficijencija steroidne sulfataze iSmith-Lemli-Opitzov sindrom, mogu tako|er biti detek-tirani u okviru biokemijskog testa probira.36,37

Veza izme|u visoke razine MS-AFP-a i intrauterinogzastoja rasta, prijevremenog poro|aja i smrti fetu-sa/novoro|en~eta poznata je jo{ od ranih sedamdesetihgodina pro{loga stolje}a. Iskustva ste~ena {irokomprimjenom biokemijskog testa probira za trisomiju 21pokazuju da, osim visoke razine MS-AFP-a, i visoka raz-ina hCG-a, bilo totalnog ili slobodnog β-hCG-a, moèbiti pokazatelj ugroènosti ploda i lo{eg ishoda sametrudno}e.38 îni se stoga razumnim da se trudno}e sla`nopozitivnim nalazom za DS pomnije prate u tomsmislu.

KOMBINIRANI, ULTRAZVU^NI I BIOKEMIJSKI, TESTPROBIRA ZA DOWNOV SINDORM U DRUGOMTROMJESE^JU

Ultrazvu~ni pregled trudnice obvezno je uklju~en u pro-tokol biokemijskog testa probira za DS jer se njime, uprvom redu, utvr|uje tjedan gestacije. Me|utim, ultra-zvukom se mogu tijekom drugog tromjese~ja trudno}eustanoviti specifi~ne anatomske anomalije fetusa i/ilibiljezi karakteristi~ni za DS. To se, u prvom redu, odnosina pove}an nuhalni nabor (engl. – nuchal fold), kratkifemur i humerus, pijelektaziju, hiperehogeno crijevo iciste koroidnog pleksusa.39 U slu~aju pozitivnog nalazabiokemijskog testa probira, utvr|en jedan ili vi{e ultra-


297

Tablica 1. Primjer va`nosti to~nog odre|ivanja tjedna gestaci-je na procjenu rizika za Downov sindrom u trudnice stare 26,4godina

Table 1 Precise determination of gestation weeks important inthe risk evaluation of Down syndrome – a case of a 26,4 year-old pregnant woman

Gestacija Koncentracija DS rizikserumskih biljega

tjedan dan MS-AFP slobodni MoM β-hCG MoM 1:n

15 1 1,19 3,49 309

15 5 1,05 4,10 159

16 1 0,96 4,58 101


298

Slika 1. Protokol biokemijskog testa probira za Downov sindrom u drugom tromjese~ju trudno}e

Figure 1 Protocol of the biochemical screening test for Down syndrome in the second trimester of pregnancy

zvu~nih biljega, pove}ava rizik za DS. No valja imati naumu da se, u slu~aju kada se ultrazvu~ni biljezi neutvrde, rizik utvr|en biokemijskom analizom neisklju~uje, iako je reduciran za oko 50%.40

Budu}i da su mjere nuhalnog nabora i humerusakontinuirane varijable, mogu se kombinirati s vrijednos-tima razina serumskih biljega koje su uklju~ene uosnovni multivarijantni Gausssov model. Prema podaci-ma iz literature, stopa detekcije DS-a iznosi ~ak 90% uz5% la`nopozitivnih nalaza.41 U ovom trenutku, primje-na ultrazvuka u svrhu matemati~ke korekcije rizikautvr|enog na osnovi biokemijske analize, nije u {irojprimjeni i jo{ je predmet rasprava.

PRENATALNI TEST PROBIRA ZA DOWNOVSINDROM U PRVOM TROMJESE^JU

Brojni radovi potvrdili su vezu izme|u niske razine uztrudno}u vezanog plazma proteina-A (engl. – pregnan-cy-associated plasma protein-A; PAPP-A) i trisomije 21tijekom prvog tromjese~ja.42 Kod urednih trudno}a, raz-ina PAPP-A naglo raste i od 15. tjedna dalje njegova vri-jednost kao biljega za DS prestaje. Mjerenjem ovog pro-

teina i uz uvaàvanje godina trudnice, moè se detekti-rati 52% slu~ajeva DS-a, uz 5% la`nopozitivnih rezulta-ta.42 U trudno}a s trisomijom 21, razina slobodnog β-hCG-a stalno je povi{ena izme|u 8. i 14. tjednagestacije. Na osnovi slobodnog β-hCG-a i godina, stopadetekcije DS-a iznosi 42%, uz 5% la`nopozitivnihnalaza.43 Jo{ je 1990. godine prepoznata va`nost mjere-nja nuhalnog nabora u probiru DS-a tijekom prvog tro-mjese~ja. Uz grani~nu vrijednost od 3 mm debljinenuhalnog nabora, stopa detekcije DS-a iznosi 64%.44

Kombiniranjem vrijednosti PAPP-A i slobodnog β-hCG-a u serumu te nuhalnog nabora, mogu}nostdetekcije DS penje se do zavidnih 90%, uz 5% la`nopo-zitivnih nalaza.45 Testiranje se provodi izme|u 10. i 14.tjedna gestacije. U slu~aju pozitivnog nalaza, trudnicamoè pristupiti biopsiji korion frondozuma (10.–12.tjedan) ili amniocentezi (15.–18. tjedan), ovisno o tomekada je zavr{eno testiranje.

Kao {to je ve} re~eno, stopa detekcije Downova sin-droma u drugom tromjese~ju trudno}e umnogome serazlikuje, ovisno o dobi trudnica. Taj je efekt, me|utim,bitno manje izraèn pri testiranju u prvom tromjese~jupa je stopa detekcije za starost od 15 godina 77%

(1,9% la`nopozitivnih), u 30-godi{njakinja 84% (4% la`no-pozitivnih), a s 49 godina 100%, uz 67% la`nopozitivnihnalaza.45

INFORMIRANJE TRUDNICA

U svakom programu probira, pa tako i u ovom, iz-nimno je va`no pravilno informiranje trudnica o svrsitesta, njegovim mogu}nostima, odnosno prednostima inedostacima. Brojni radovi posve}eni ovom problemu,govore o nedovoljnom i neprimjerenom informiranjutrudnica, {to je nerijetko izazivalo ili izaziva strepnju inemir.46 Poseban je problem interpretacija nalazaodnosno rezultata testa pa je, prema na{im podacimaobjavljenim 1999. godine, ~ak 32% testiranih trudnicaodgovorilo da ne zna {to zna~i pojam “visoki rizik”.47 Uto su doba informiranje provodili jedino ginekolozi.Ovaj nas je podatak naveo na ciljanu edukaciju labora-torijsko-zdravstvenog osoblja Zavoda (Zavod za biologi-ju, Medicinski fakultet, Sveu~ili{te u Rijeci) poradiosposobljavanja za ispravno i detaljno informiranje trud-nica. Od po~etka 2000. godine sa svakom se trudnicomvodi razgovor nakon kojega se, davanjem tzv. informi-ranog pristanka (engl. – informed consent), trudnicepodvrgavaju testiranju. Uz to, u svim ginekolo{kimambulantama trudnicama su dostupni i leci u kojima jeopisana svrha testa. Leci su tiskani u sklopu projektaRijeka zdrav grad. Taj je tekst dostupan je i na web-stranicama rije~koga Zavoda za biologiju(www.medri.hr/katedre/biologija).

Ponovnim anketiranjem trudnica, provedenim 2003.godine, ustanovljeno je da svega 11% èna ni nakondetaljnog informiranja ne razumije svrhu testa (Braje-novi}-Mili} B. i sur. in press). Zanimljiv je i podatak ospremnosti èna za daljnju dijagnostiku u slu~aju pozi-tivnog nalaza. Naime, dok je u prvom ispitivanju svega46% trudnica bilo spremno pristupiti amniocentezi, udrugom ispitivanju ~ak 91% èna smatra amniocentezulogi~nim slijedom pretraga u slu~ajevima utvr|enogpove}anog rizika za Downov sindrom. Ti podaci jasnoupu}uju na va`nost i obvezu zdravstvenog osoblja dana|e dovoljno vremena i, jezikom razumljivim svakojtrudnici, objasni svrhu i mogu}nosti testa probira.

LITERATURA

1. Wald NJ.Guidance on terminology. J Med Screen 1994;1:76

2. Cuckle HS, Wald Nj. Principles of screening. U: Wald NJ,ur. Antenatal and neonatal screening. Oxford: Oxford Uni-versity Press. 1984; 1-22

3. Tofts Cp, Christianson RE. Anomalies in Down syndromeindividuals in a large populations-based registry. Am J MedGenet 1998; 77:431-8

4. Hook EB, Cross PK, Schreinemachers DM. Chromosomalabnormality rates at amniocentesis and in live-born infants.JAMA 1983; 249:2034-8

5. Eurocat Working Group: EUROCAT Report 6. Surveillanceof congenital anomalies in Europe 1980-1992. Brussels,Institute of Hygiene and Epidemiology, 1995.

6. Brajenovi}-Mili} B, Risti} S, Kapovi} M, Mojsovi} A, MedicaI, Modru{an-Mozeti} Z. Incidence of Down’s syndrome inthe municipality of Rijeka and Istrian region. Coll Antropol1996; 20 suppl:1-5

7. Lejeune J, Gautier M, Turpin R. Etude des chromosomessomatiques de neuf enfants mongoliens. c R Acad Sci 1959;248:602-3

8. Antonarakis SE, Lewis JG, Adelsberger PA. Parental originof the extra chromosome in trisomy 21 using DNA poly-morphism analysis. New Eng J Med 1991; 324:872-6

9. Nevin NC. Trends in the prevalence of congenital abnor-malities. U: Drife JO, Donnai D, ur. Antenatal Diagnosis ofFetal Anormalities. London: Springer-Verlag; 1991:8

10. Penrose LS. The relative effects of paternal and maternalage in mongolism. J Genet 1933; 27:219-24

11. Cuckle HS. Effect of maternal age curve of predicted detec-tion rate in maternal serum screening for Down syndromePrenat Diagn 1998:18:1127-30

12. Cuckle HS. Down syndrome fetal loss rate in early preg-nancy. Prenat Diagn 1999:19:1177-9

13. Merkatz IR, Nitowsky HM, Macri JN, Johnson WE. An asso-ciation between low maternal serum alpha-fetoprotein andfetal chromosomal abnormalities. Am J Obstet Gynecol1984; 148:886-94

14. Canick JA, Knight GJ, Palomaki GE, Haddow JE, CuckleHS, Wald NJ. Low second unconjugated oestriol in preg-nancies with Down syndrome. Br J Obstet Gynaecol 1988;95:330-3

15. Bogart MH, Pandian MR, Jones OW. Abnormal maternalserum chorionic gonadotropin levels in pregnancies withfetal chromosome abnormalities. Prenat Diagn 1987:7:623-30

16. Macri JN, Krantz DA, Kasturi RV i sur. Maternal serumDown syndrome screening: Free-β protein is a more effec-tive marker than human chorionic gonadotropin. Am JObstet Gynecol 1990; 163:1248

17. Spencer K. Evaluation of an assay of free beta subunit ofchoriogonadotropin and its potential value in screening forDown syndrome. Clin Chem 1991:37:809

18. Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW i sur. Maternal serumscreening for Down’s syndrome in early pregnancy. BMJ1988 297:883-7

19. Palomaki GE, Knight GJ, McCarthy J, Haddow JE, Don-howe JM. Maternal serum screening for Down syndrome inthe United States: a 1995 survey. Am J Obstet Gynecol1997; 176:1046-51

20. Spencer K. Second trimester prenatal screening for Down’ssyndrome using alpha-fetoprotein and free beta hCG: Aseven year review. Br J Obste Gynaecol 1999; 106:1287-93

21. Brajenovi}-Mili} B, Ti{lari} D, Ba~i} J. i sur. Screening forDown’s syndrome and neural tube defect in Croatia: A


299

regional prospective study. Fetal Diagn Ther 1998; 13:367-71

22. Verloes A, Gillerot Y, Van Maldergem L i sur. Majordecrease in the incidence of trisomy 21 at birth in southBelgium: mass impact of triple test? Eur J Hum Genet.2001;9:1-4.

23. Wald NJ, Densem JW, George L, Muttukrishna S, KnightPG. Prenatal screening for Down’s syndrome using inhib-in-A as a serum marker. Prenat Diagn 1996:16:143-52

24. Reynolds TM, Penny MD. The mathematical basis of multi-variate risk screening: with special reference to screeningfor Down syndrome associated pregnancy. Ann ClinBiochem 1989; 27:452-8

25. Neveux LM, Palomaki GE, Larrivee DA, Knight GJ, Had-dow JE. Refinements in managing maternal weight adjust-ment for interpreting prenatal screening results. PrenatDiagn 1996; 16:1115-9

26. Benn PA, Clive JM, Collins R. Medians for second trimestermaternal serum alpha-fetoprotein, human chorionicgonadotropin, and unconjugated estriol; differencesbetween races or ethnic groups. Clin Chem 1997; 43:333-7

27. Kramer RL, Yaron Y, OBrein JE i sur. Effect of adjustmentof maternal serum alpha-fetoprotein levels in insulin-dependent diabetes mellitus. J Med Genet 1998; 75:176-8

28. Bernstein L, Pike MC, Lobo RA, Depue RH, Ross RK, Hen-derson BE. Cigarette smoking in pregnancy results inmarked decrease in maternal hCG and oestradiol levels. BrJ Obstet Gynaecol 1989; 96:92-6

29. Ti{lari} D, Brajenovi}-Mili} B, Risti} S i sur. The influenceof smoking and parity on serum markers for Down’s syn-drome screening. Fetal Diagn Ther 2002; 17:21

30. Wald NJ, White N, Morris JK, Huttly WJ, Canick JA. Serummarkers for Down’s syndrome in women who have had invitro fertilisation: implications for antenatal screening. Br JObstet Gynaecol 1999; 106:1304-6

31. Huderer-\uri} K, Škrablin S, Kuva~i} I, Rubala D,Suchanek E. The triple marker test in predicting fetal ane-uploidy: A compromise between sensitivity and specificity.Eur J Obstet Gynaecol Biol 2000:88:49-55

32. Ferguson-Smith MA. The reduction of anencephalic andspina bifida births by serum alpha-fetoprotein screening.Br Med Bull 1983:39:365

33. Canick JA, Palomaki GE, Osthanondh R. Prenatal screen-ing for trisomy 18 in the second trimester. Prenat Diagn1990; 10:546-8

34. Saller Jr DN, Canick JA, Blitzer MG i sur. Second-trimestermaternal serum analyte levels associated with fetal trisomy13. Prenat Diagn 1999; 19:813-6

35. Saller Jr DN, Canick JA, Schwartz S, Blitzner MG. Multiple-marker screening in pregnancies with hydropic and non-hydropic Turner syndrome. Am J Obstet Gynecol 1992;67:1021-4

36. Bradley LA, Palomaki GE, Knight GJ i sur. Levels of uncon-jugated estriol and other maternal serum markers in preg-nancies with Smith-Lemli-Opitz (RSH) syndrome fetus. AmJ Med Genet 1999:82:355-8

37. Bradley LA, Canick JA, Palomaki GE, Haddow JE. Unde-tectable maternal serum unconjugated estriol levels in thesecond trimester: risk of perinatal complications associatedwith placental sulfatase deficiency. Am J Obstet Gynecol1997; 176:531-5

38. Pergament E, Stein AK, Fiddler M, Cho NH, KupfermineMJ. Adverse pregnancy outcome after a false positivescreen for Down syndrome using multiple markers. ObstetGynecol 1995; 86:255-8

39. Smith-Bindman R, Hosmer W, Feldstein VA, Deeks JJ,Goldberg JD. Second- trimester ultrasound to detect fetuswith Down syndrome: a meta-analysis. JAMA 2001;285:1044-55

40. Nyberg Da, Souter VL, El-Bastawissi A, Young S, LuthardtF, Luthy DA. Isolated sonographic markers for detectionfetal Down syndrome in the second trimester of pregnan-cy. J Ultrasound Med 2001; 20:1053-63

41. Kaminsky L, Egan J, Ying J, Borgida A, DeRoche M, BennP.Combined second trimester biochemical and ultrasoundscreening for Down syndrome is highly effective. Am JObstet Gynecol 2001; 185:78

42. Wald Nj, Kennard A, Hacckshaw A, McGuire A. Antenatalscreening for Down’s syndrome. J Med Screen 1997; 4:181-246

43. Hallahan T, Krantz D, Orlandi F i sur. First trimester bio-chemical screening for Down syndrome: free beta hCGversus intact hCG. Prenatal Diagn 2000;20:785-9

44. Szabo J, Gellen J. Nuchal fluid accumulation in trisomy-21detected by vaginosonography in first trimester. Lancet1990; 1:336

45. Spencer K. Age related detection and false positive rateswhen screening for Down’s syndrome in the first trimesterusing fetal nuchal translucency and maternal serum β-hCGand PAPP-A. Br J Obstet Gynaecol 2001;108:1043-46

46. Gekas J, Gondry J, Mazur S, Cesbron P, Thepot F. Informedconsent to serum screening for Down syndrome: Are womengiven adequate information? Prenat Diagn 1999; 19:1-7

47. Paravi} J, Brajenovi}-Mili} B, Ti{lari} D i sur. Maternalserum screening for Down syndrome: A survey of preg-nant women’s views. Community Genetics 1999; 2:109-12


300

^lanak je preuzet uz dopu{tenje iz Paediatr Croat 2004; Supl 19: 175-179.

SA@ETAK

U~estalost major-kromosomskih aberacija u osoba s poreme}ajimaplodnosti iznosi 13%, {to upu}uje na to da su promjene fertiliteta isterilitet glavni rizici za kromosomsku aberaciju. U~estalost aberacija uop}oj populaciji iznosi 1%. Kromosomopatija je uzrokom i u~estalihspontanih poba~aja i/ili ra|anja malformiranog potomka i neplodnos-ti u 18% analiziranih parova. Za parove koji su uklju~eni u lije~enjeneplodnosti metodama potpomognute reprodukcije, taj se postotakpenje i na 22,2%. Sa stajali{ta genetike, smanjenje plodnosti ili neplod-nost najve}i je rizik za kromosomsku aberaciju. U~estalost aberacijapove}ana je i u grupi mu{karaca s poreme}ajima fertiliteta (17,7%) i uanaliziranoj grupi èna (26,4%). U kromosomske aberacije naj~e{}e suuklju~eni spolni kromosomi. Moè se zaklju~iti da se major-kromo-somske aberacije ~e{}e na|u kao uzroci poreme}aja plodnosti ineplodnosti nego {to se to o~ekivalo. îni se i da u~estalost aberacijas vremenom raste. Detaljna citogenetska analiza i mu{karaca i ènapromijenjene reproduktivne sposobnosti osnova je za planiranje iodre|ivanje uspjeha reprodukcije.

KLJU^NE RIJEÎ: kromosomske aberacije, fertilitet, metode potpo-mognute reprodukcije, sterilitet

ABSTRACT

Overall frequency of major chromosomal aberration in patients withdefective reproductive success is 13.1%, which suggests that fertility orsterility problems are one of the most certain symptoms for the chro-mosomal aberration. The reported frequency of chromosomal aberra-tion in general population was less than 1%. A cause for the repeatedspontaneous abortion and/or malformed child and sterility problemsin 18.0% of couples is also chromosome abnormality. Chromosomaldisorder in couples seeking IVF and ICSI is considerable (22.2%).From the genetic point of view, infertility patients seeking assistedreproduction have to be classified as a high-risk group. The incidenceof chromosome abnormalities in the group of infertile men is alsoincreased -17.7%, and within the subfertile female group it is 26.4%.The most commonly involved chromosomal aberrations in subfertileand sterile males and females are sex chromosomes. We conclude thatmajor chromosomal disorders are the underlying basis of infertilityand sterility in a higher proportion of cases than had previously beenexpected. It seems that the prevalence of aberrations is slightlyincreasing with time. A detailed cytogenetic analysis of both males andfemales with the decreased reproductive fitness is essential for pre-dicting the success of reproduction.

KEY WORDS: chromosomal aberrations, fertility, assisted reproductiontechniques, sterility

Tematski rad Medicina 2004;42(41):301-304Main topic UDK: 616.697:575.113.1

618.177:575.113.1

POREME]AJI PLODNOSTI UZROKOVANI KROMOSOMSKIM ABERACIJAMA

DEFECTIVE REPRODUCTIVE SUCCESS CAUSED BY CHROMOSOME ABERRATIONS

An|elka Radoj~i} Badovinac



Adresa za dopisivanje: An|elka Radoj~i} Badovinac, Zavod za biologiju i medi-cinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci

prema nekim autorima, predstavljaju glavninu uzroka

neplodnosti. Otkriveno je da vi{e od 150 gena mi{a

utje~e na plodnost,1 a za dobar dio njih ve} se zna da

postoje i u ~ovjeka. S druge strane, major-kromosomal-

ne aberacije mogu remetiti formiranje i sazrijevanje

gameta i normalan embrionalni razvitak. Osim aneu-

ploidnih gameta uzrokovanih roditeljskim aberacijama

kromosoma, i postzigotni ~imbenici koji utje~u na seg-

regaciju kromosoma, mogu djelovati na razvoj mozai-

cizma i uzrokovati spontane poba~aje ili ra|anje mal-

formiranog ploda. Sa stajali{ta genetike, smanjenje plod-

UVOD

U suvremenome svijetu sve je vi{e neplodnih brakova.Razlozi su tomu mnogobrojni – od socijalnih i ekonom-skih, do odluka èna da u kasnijoj dobi planiraju obitelji potomstvo. Va`ni su u tome i genetski ~imbenici koji,

301

nosti ili neplodnost najve}i je rizik za kromosomskuaberaciju. Vi{e od 13% pacijenata ima promjene kromo-soma2, za razliku od op}e populacije gdje je u~estalostaberacija manja od 1%.3 Uz razvoj metoda potpo-mognute reprodukcije, koju upravo koriste pacijentismanjene plodnosti ili neplodni, reskiramo poreme}ajprenijeti na potomstvo ili pak neuspje{no ponavljamoskup i zahtjevan postupak.4 Stoga bi citogeneti~ka anali-za bra~nih parova koji su upu}eni na kori{tenje metodapotpomognute reprodukcije trebala biti obvezna, jed-nako kao i genetsko savjetovanje i informiranje.

Zahvaljuju}i naizgled jednostavnoj tehnici analizekariotipa limfocita periferne krvi nakon kratkotrajne kul-ture i GTG-bojenja,5 dobiva se jasna podjela kromosomana pruge. Zahvaljuju}i specifi~nim prugama, kromoso-mi su svrstani u parove, a mogu}e je ustanoviti ne samobroj~anu promjenu ve} i premje{taje ili translokacije,gubitak, pa i vi{ak pojedinog dijela kromosoma. Oba sesupru`nika analiziraju u slu~ajevima spontanih poba~ajai neobja{njenog steriliteta, a pojedina~no mu{karci, uslu~aju oligospermije (smanjenje broja spolnih stanicaispod 10 mil u ml), azoospermije, asthenozoospermije,kombinacije tih poreme}aja, hipogonadizma teamenoreje ili oligomenoreje u èna.

Spolni kromosomi naj~e{}e su uklju~eni u humanekromosomske aberacije.3 Manje ili vi{e, njihove struk-turne promjene ili promjene u broju, uvijek uzrokujuporeme}aje u reproduktivnoj sposobnosti. U~estalostbroj~anih kromosomakih aberacija u op}oj populaciji je0,85%, a strukturnih 0,1%.3

Strukturne kromosomske promjene autosoma,posebno recipro~ne translokacije, kao {to je Robert-sonova translokacija ili centri~na fuzija akrocentri~nihkromosoma, gdje se dva kromosoma slijepe u jedan,mogu u spermatogenezi poremetiti broj i pokretljivostspermija. Zbog nepravilne segregacije kromosomastvaranjem trivalenata umjesto bivalenata, mogu rezulti-rati poba~ajem, mrtvoro|enim ili malformiranim potom-stvom.

Posebnu grupu citogeneti~ki analiziranih osoba ~ineosobe koje se doslovno ne mogu svrstati ni u grupustrukturnih niti u grupu onih s broj~anim aberacijama.Njihov citogeneti~ki spol ne odgovara fenotipu. To sumu{karci s kariotipom 46,XX i ène kariotipa 46,XY. Ugrupi 782 analizirane osobe s poreme}ajima plodnosti,prona|eno je {est pacijenata tako aberantnog kariotipa.2

Iako ti pacijenti ~ine grupu manju od 1%, ne smiju sezanemariti jer aberacija iziskuje operativnu ginekolo{kuterapiju i odstranjenje gonada u èna kariotipa 46,XY(4/782) zbog velikog rizika razvoja malignoma.

Poseban su problem varijante kromosoma 1, 9, 16 iY. Duplikacije blokova heterokromatina oduvijek izazi-vaju pozornost, ali ostaje upitno djeluju li na fenotip iklini~ku manifestaciju. Mjeranja pokazuju da se sta-

tisti~ki zna~ajno pove}ana koli~ina heterokromatinakromosoma 16 na|e u bra~nih parova s mrtvoro|enim imrtvoro|enim malformiranim potomstvom.6

UDIO KROMOSOMSKIH ABERACIJA U BRA^NIHPAROVA S POREME]AJEM PLODNOSTI

Uspje{nost reprodukcije u ~ovjeka te{ko je mjerljiva ka-tegorija, osobito ako je treba izraziti u postocima. Posto-ji heterogenost u dijagnozama neplodnosti i grupiranjuparova poslanih na citogeneti~ku analizu. Dijelom zbograzli~ite selekcije, u~estalost kromosomopatije je2,4–18%2, 7-11 i ~ini se da je u porastu. S obzirom naklini~ke uputne dijagnoze i o~ekivan geneti~ki rizik,naj~e{}e se dijele u grupe onih s normalnim i malformi-ranim potomstvom, s dva ili manje spontanih poba~aja,s tri i vi{e spontanih i u neplodne. Tako najve}i rizik zaaberaciju ima grupa s tri i vi{e spontanih poba~aja, iglavnina geneti~ara smatra da parovi s ponovljenimspontanim poba~ajem moraju biti citogenetio~ki anal-izirani. S druge strane, normalno potomstvo u repro-dukcijskoj anamnezi osiguravaju}i je ~imbenik.

U~estalost aberacija kromosoma u parova koji suupu}eni na metode potpomognute oplodnje u svim jeradovima ve}a nego u bilo kojoj istraìvanoj grupi, iiznosi 18–22,2%.2,12 Mozai~ni kariotip na|e se u 25–40%aberacija.2,11 Dok }e udio niskog postotka mozaicizmaovisiti o broju analiziranih mitoza po osobi u laboratori-ju, op}e pove}anje broja aberacija zadnjih petnaestakgodina ne moè se potpuno obrazloìti razlikom utehnici. Pove}anje u~estalosti aberacija implicira da pos-toje postzigotni ~imbenici koji dovode do mozaicizma uranom embrionalnom razvoju i uzrokuju aberacije.

Udio strukturnih aberacija u analiziranih bra~nihparova je 3,5%.2 Naj~e{}a je strukturna aberacija inver-zija kromosoma 9. Taj kromosom katkad sadrì velikukoli~inu heterokromatina smje{tenu pericentri~no, ~ijarazlika u koli~ini predstavlja varijantu normalnogahumanog kariotipa. Duplikacije izazivaju nestabilnost~itave kromosomske regije pa ako do|e do inverzije iokolnog eukromatina, a ne samo heterokromatinskogdijela, posljedice za reprodukciju mogu biti velike.Inverzija kromosoma 9 ~e{}e je prona|ena u bra~nihparava s u~estalim spontanim poba~ajima. Naj~e{}e seradi o familijarnoj kromosomopatiji, a u ve}ini slu~ajevanosilac je otac. Ako uzmemo u obzir tip inverzije,veli~inu kromosoma i mogu}nost krossing-overa, slijedida se zbog jedne ili nijedne sinapse, u otprilike 50%gameta o~ekuje nebalansirani genetski sadràj s dup-likacijom i delecijom dijela kromosoma 9, a preostali diogameta ima {ansu za normalan sadràj genetskog mate-rijala kromosoma 9. Uz to, ako daje nebalansiranugametu, genetski defekt je velik i gotovo nije spojiv saìvotom. Drugim rije~ima, gamete imaju podjednaku

A. Radoj~i} Badovinac POREME]AJI PLODNOSTI UZROKOVANI KROMOSOMSKIM ABERACIJAMA Medicina 2004;42(40):301-304

302

{ansu da budu genetski normalne ili s inverzijom ili pakda budu nebalansirane, {to u ovom slu~aju uzrokujespontani poba~aj. Zbog nemogu}nosti uporabe zakonavelikih brojeva u slu~aju malobrojnog potomstva ~ovje-ka, nemogu}e je odrediti koliko bi zigota imalo nor-malan genetski sadràj, a koliko ne.

KROMOSOMSKE ABERACIJE U @ENSKIH OSOBA SPOREME]ENOM PLODNOŠ]U

U~estalost kromosomskih aberacija u ènskih osoba sporeme}ajima fertiliteta je 21,5%,11 26,4%13 ili 28,3%.2 Uanaliziranih osoba s amenorejom ~ak 63%.14 Takvau~estalost pokazuje jasnu statisti~ki zna~ajnu razliku od0,4% u op}oj populaciji èna.3 Amenoreja i hipogo-nadizam uputne su dijagnoze s vrlo velikim rizikom zaaberaciju u koju je uklju~en X-kromosom, dokoligomenoreja, kao uputna dijagnoza, nema posebanrizik.2 Sa stajali{ta citogeneti~ara, va`na je uputna dijag-noza i nizak rast,13 kao jedan od simptoma Turnerovasindroma u mla|ih osoba. U takve dijagnoze, aberacijaje prona|ena u 26,4% analiziranih pacijentica.2 Naj~e{}eaberacije su 45,X i 47,XXX, te ove aberacije u mozaiku.

CITOGENETI^KI I GENETSKI ÎMBENICI SMANJENJAMUŠKE PLODNOSTI

Glavnina spoznaja o mu{koj neplodnosti temelji se naprou~avanju spermatogeneze mi{a i transgenih ìvoti-nja, npr. Dazl1 knockout (Dazl -/ -) mi{u i transgenommi{u s DAZ humanim genom. Vrlo va`ne spoznajedobivene su u prou~avanju regulacije apoptoze u sper-matogenezi i vezi izme|u Bcl-2 gena i plodnosti.15

Uzrokom mu{ke neplodnosti mogu biti i genetskiporeme}aji gonadotropinske aktivnosti, a neosporno jedokazana i genetska povezanost cisti~ne fibroze (CF),kongenitalne bilateralne odsutnosti vas deferens(CBAVD) i mikrodelecija Y-kromosoma AZFa, AZFb iAZFc-regije.16,17 Najsloèniji humani genski sustavnalazi se na Y-kromosomu. Od 59 milijuna parova bazaglavnina su uzastopna ponavljanja, duplikacije, ampli-koni orijentirani u palindrome s izokrenutim i duplicira-nim sekvencijama. Sva genetska i evolucijska doga-|anja, mogu se vidjeti na ovom kromosomu. Uz to,polovica gena izraènih u ranim stadijima spermatoge-neze mi{a i gen-receptora za androgene, nalaze se na X- kromosomu, pa se ~ini da je izu~avanje fertilitetanerje{iva zavrzlama.18

Zbog mehanizma apoptoze, u spermatogenezi }eglavnina manje vrijednih gameta biti isklju~ena iz dalj-njeg razvoja, ali to jo{ uvijek ne zna~i da spermiji ne}eimati aberantan broj kromosoma. Zna se da glavninaaberacija vi{ka ili manjka spolnih kromosoma potje~e

od oca, tj. da je nastala nerazdvajanjem ili nepravilnimrazdvajanjem X- i Y-kromosoma u spermatogenezi.

U izdvojenim grupama mu{karaca s poreme}ajimaplodnosti, objavljeno je 12,6–17,7%3,19 onih s major-kro-mosomskom aberacijom. U istraìvanja su uklju~enipacijenti s uputnim klini~kim dijagnozama neobja{njeneneplodnosti, ginekomastije i kriptorhizma, ali ako seizdvoje samo oni s azoospermijom, oligozoospermijom(broj spermija manji od 10 mil/mL ejakulata) i oligoas-thenozoospermijom, udio aberacija penje se na 26,9%.20

U istraìvanju 78 mu{karaca s tim uputnim dijagnozama,u~estalost je Robertsonovih translokacija 2,5%, inverzija2,5%, drugih strukturnih aberacija 6,5%, 10,2%numeri~kih aberacija spolnih kromosoma i 3,8% mozai-cizma spolnih kromosoma.20 Naj~e{}a je aberacija Kline-felterov sindrom (47,XXY). Sve te aberacije remete sper-matogenezu i zbog apoptoze rezultiraju smanjenim bro-jem spermija u ejakulatu. Citogenetska analiza, uz ana-lizu mikrodelecija Y-kromosoma, svakako je opravdanaza pacijente uklju~ene u metode potpomognute repro-dukcije. Izbor lije~enja uklju~uje preimplantacijskugeneti~ku dijagnostiku ili donaciju sjemena, ovisno otipu kromosomske promjene.

LITERATURA

1. Brugh VM 3rd, Maduro MR, Lamb DJ. Genetic disordersand infertility. Urol Clin North Am 2003. 30:143-152-

2. A. Radoj~i} Badovinac, A Bureti}-Tomljanovi}, N.Star~evi}, M. Kapovi}, I. Vlasteli}, LJ. Randi}: Chromosomestudies in patients with defective reproductive success.AJRI 2000; 44:279-283.

3. Nielsen J, Wohlert M. Chromosome abnormalities among34910 newborn children: results from 13-year incidencestudy in Arhus, Denmark. Hum. Genet. 1991; 87: 81-83.

4. Causio F, Fischetto R, Sarcina E, Geusa S, Tartagni M. Chro-mosome analysis of spontaneous abortions after in vitrofertilization (IVF) and intracytoplasmic sperm injection(ICSI). Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2002. 105: 44-48.

5. Moorhead PS, Nowell PC, Mellman WJ, Battips DM, Huger-ford DA. Chromosome preparation of leukocytes culturedfrom human peripheral blood. Exper Res 1960;20:613-616.

6. Bureti}-Tomljanovi} A, Radoj~i} Badovinac A, Vlasteli} I,Randi} LJ. Quantitative analysis of constitutive heterochro-matin in couples with fetal wastage. Am J Reprod Immunol1997; 38:201-204.

7. Makino T, Tabuchi T, Nakada K, Iwasaki K, Tamura S, Iizu-ka R. Chromosomal analysis in Japanese couples withrepeated spontaneous abortions. Int J Fertil 1990; 35:266-270.

8. Castle D, Bernstein R. Cytogenetic analysis of 688 couplesexperiencing multiple spontaneous abortions. Am J MedGenet 1988; 29:549-556.

9. Maione S, Lamberti L, Alovisi C, Armellino F. Retrospectivestudy of couples with a history of recurrent spontaneousabortion. Acta Eur Fertil 1995; 26:95-100.


303

10. Coulam CB. Epidemiology of recurrent spontaneous abor-tion. Am J Reprod Immunol 1991; 26:23-27.

11. Duzcan F, Atmaca M, Cetin GO, Bagci H. Cytogenetic stud-ies in patients with reproductive failure. Acta ObstetGynecol Scand. 2003.82: 53-56.

12. Mau UA, Backert IT, Kaiser P, Kiesel L. Chromosomal find-ings in 150 couples referred for genetic counselling prior tointracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1997;12:930-937.

13. Temtamy SA, Ghali I, Salam MA, Hussein FH, Ezz EH,Salah N. Karyotype/phenotype correlation in females withshort stature. Clin Genet 1992; 41:147-151.

14. Roy AK, Banerjee D. Cytogenetic study of primary amen-orrhoea. J Indian Med Assoc 1995; 93:291-292.

15. T. Huynh, R. Mollard, A. Trounson. Selected genetic factorsassociated with male infertility. Human ReproductionUpdate 2002; 8:183-198.

16. B. Peterlin, T. Kunej, J. Sinkovec, N. Gligorijevska, B. Zorn.Screening for Y chromosome microdeletions in 226Slovenian subfertile men. Human reproduction 2002; 17:17-24.

17. M. Simoni, E. Bakker, M.C.M. Eurlings, J. Matthijs, E. Moro,C.R. Muller, P.H. Vogt. Laboratory guidelines for the mole-cular diagnosis of Y chromosomal microdeletions. Interna-tional Journal of Andrology 1999; 22: 292-299.

18. Lahn B.T.,Page D.C. A human sex-chromosomal gene fam-ily expressed in male germ cell and encoding variablycharged proteins. Hum Mol Genet 2000; 9:311-319.

19. Nakamura Y, Kitamura M, Nishimura KI, Koga M, KondohN, Takeyama M, Mats K, Okuyama A. Chromosomal vari-ants among 1790 infertile men. Int J Urol.2001; 8:49-52.

20. Radoj~i} Badovinac A, Bureti}-Tomljanovi} A, Kapovi} M,Vlasteli} I, Randi} LJ. Kromosomske aberacije u mu{kihpartnera uklju~enih u IVF-ICSI program. Gynaecol Perina-tol 2004.Suppl. 123:188


304

SA@ETAK

S obzirom na sve ve}u izloènost humane populacije razli~itimizvorima radijacije, potrebno je, posebice u osoba profesionalnoizloènih zra~enju, pratiti njezine u~inke na organizam. U ovom smoradu prikazali va`nost primjene analize strukturnih kromosomskihaberacija, koja je najpouzdaniji biolo{ki pokazatelj izloènosti ion-iziraju}em zra~enju.

KLJU^NE RIJEÎ: ioniziraju}e zra~enje, strukturne aberacije kromoso-ma, citogeneti~ka analiza

ABSTRACT

The people who are professionally exposed to radiation need to bemonitored for its somatic and genetic effects. In this paper we pre-sented the method of the structural chromosomal analysis that is thebest biological indicator of the exposure to radiation.

KEY WORDS: ionising radiation, structural chromosomal aberrations,cytogenetic analysis

Tematski rad Medicina 2004;42(41): 305-309Main topic UDK: 612.014.48

CITOGENETI^KA ANALIZA KROMOSOMSKIH ABERACIJA U OSOBAPROFESIONALNO IZLO@ENIH IONIZIRAJU]EM ZRAÊNJU

CYTOGENETIC ANALYSIS OF CHROMOSOMAL ABERRATIONS IN PEOPLE PROFESSIONALLYEXPOSED TO IONISING RADIATION

Nada Star~evi} îzmarevi}, Alena Bureti}-Tomljanovi}, Sa{a Ostoji}, Miljenko Kapovi}



Adresa za dopisivanje: Mr.sc. Nada Star~evi} îzmarevi}, dipl. ing., Zavod zabiologiju i medicinsku genetiku, Medicinski fakultet Sveu~ili{te u Rijeci, Bra}eBranchetta 20, 51000 Rijeka. Tel.: 051-651-129, e-mail: [email protected]

DJELOVANJE IONIZIRAJU]EG ZRAÊNJA

Zra~enje koje ima dovoljno energije da razbije neutralnemolekule u elektri~ki nabijene ~estice, odnosno da iza-zove ionizaciju kroz neku materijalnu sredinu, naziva seioniziraju}e zra~enje. Djelovanjem toga zra~enja na ìvabi}a, nastaju razli~ita o{te}enja koja mogu biti geneti~kai somatska. Geneti~ka o{te}enja nastaju zbog djelovanjazra~enja na spolne stanice i u~inci su vidljivi u nasljed-nika, dok se somatska o{te}enja javljaju na tijeluozra~ene osobe. Neposredni somatski u~inci akutnogzra~enja organizma zapaèni su u individua koje su sezatekle u blizini sredi{ta atomske eksplozije u Japanu1945. godine. Somatski u~inci visoke doze zra~enja naodre|enom tkivu uo~avaju se u pacijenata koji se lije~eod malignih bolesti i u osoba stradalih u nesre}ama priradu, uzrokovanim radioaktivnim materijalom. Geneti~kiu~inak zra~enja o~ituje se na razini kromosoma i gena,mijenjaju}i naj~e{}e strukturu kromosoma ili u~estalostgenskih mutacija.

Budu}i da stanice i tkiva sadrè oko 85% vode, veli-ka je vjerojatnost interakcije zra~enja s molekulamavode (indirektno djelovanje). Jedan manji dio unijeteenergije djelovat }e i na organske makromolekule koje

UVOD

Razli~iti vanjski {tetni ~imbenici (zra~enja, virusi,kemikalije itd.) uzrokuju o{te}enja deoksiribonuk-leinske kiseline (DNK), molekule koja sadrì ukupnugeneti~ku informaciju svakog organizma. Danas seprimjenjuju razli~ite vrste testova kojima se odre|uje jeli, i koliko, neka osoba izloèna djelovanju mutagenihtvari. Citogeneti~ka analiza kromosomskih aberacijapouzdan je test procjene o{te}enosti DNK kaoposljedice izloènosti ioniziraju}em zra~enju i pojedi-nim kemijskim mutagenima, dok su test izmjene sestrin-skih kromatida i mikronukleus-test dobri pokazateljiizloènosti kemijskim mutagenima.1,2

305

imaju ulogu u regulaciji sloènih biokemijskih reakcija(direktno djelovanje).3 Promjene na molekulama vode iorganskim molekulama temeljni su uzroci o{te}enjastanice zra~enjem.

Od svih o{te}enja organskih makromolekula izaz-vanih zra~enjem, najzna~ajnija su o{te}enja nukleinskihkiselina, kako DNK tako i ribonukleinske kiseline –RNK. Osim indirektnih o{te}enja, apsorbirana energijazra~enja moè ih o{tetiti i direktno. Procesi sinteze DNKi RNK te stvaranje proteina mogu biti poreme}enizra~enjem na vi{e na~ina, a zajedni~ko im je da remeteraspored baza u DNK i RNK ili pak prekidaju prijenosinformacija o redoslijedu tih baza. Neka od osnovniho{te}enja DNK-molekule koja remete njezinu replikaci-ju ili prijenos {ifre na RNK, a izazvana su radijacijom,jesu: hidriranje baze, pri ~emu jedna baza prelazi udrugu (tranzicija i transverzija), depurinacija, dimerizaci-ja, odnosno proces spajanja baza istog lanca, unakrsnopovezivanje DNK i proteina te dvostruki ili jednostrukiprekid lanca izme|u {e}era i fosfata ili {e}era i baza 4

Energija ioniziraju}e ~estice moè istodobno uzroko-vati lom oba lanca iste molekule na susjednim mjestima.Lomovi mogu biti i posljedica djelovanja dvije neovisne~estice, pri ~emu dolazi do prekida lanaca molekulaDNK na razli~itim mjestima.

IZVORI I ZAŠTITA OD IONIZIRAJU]EG ZRAÊNJA

Ioniziraju}e zra~enje ne osje}a se pri radu, niti se moèsa sigurno{}u tvrditi postoji li, i koji je prag izloènostiradijaciji bez {tetnih posljedica za profesionalno osoblje.S porastom spoznaja i novih mogu}nosti na podru~juznanosti i tehnike, raste i udio ioniziraju}eg zra~enja izumjetnih izvora (tablica 1.).

Primjenu radijacije u medicini, danas je gotovonemogu}e izbje}i. Sve je ~e{}a i sve je vi{e ljudi izloènozra~enju. Zra~enja su nu`na za ranu i to~nu dijagnozubolesti, a upotrebljavaju se i pri lije~enju nekih bolesti.Za na{e je prilike ustanovljeno da je izloènoststanovni{tva umjetnim izvorima radijacije gotovo jedna-ka izloènosti iz prirodnih izvora, a medicinska rend-genska dijagnostika daje oko 85% od ukupne doze kojupu~anstvo prima iz svih umjetnih izvora.5 Medicinskiizvori radijacije za stanovni{tvo jesu radiografija, rend-gen prosvjetljavanja (dijaskopije), stomatolo{ke snimke,scintigrafija i radioterapija.6

Pravilno provo|enje mjera za{tite na radu moèsmanjiti neèljene posljedice ioniziraju}eg zra~enja.Dana{nji propisi o za{titi od ioniziraju}eg zra~enja uskladu su s preporukama Me|unarodne komisije zaza{titu od zra~enja. Vaè}i Zakon o za{titi od ionizira-ju}ih zra~enja u Republici Hrvatskoj donijet je 19. oùjka1999. (Narodne novine broj 27/99), a kao jednu odmjera za{tite od ioniziraju}ih zra~enja navodi mjere za

utvr|ivanje i pra}enje zdravlja djelatnika koji su na rad-nomu mjestu izloèni ioniziraju}im zra~enjima. Natemelju ovog zakona, ministar zdravstva donosi Pravil-nik o zdravstvenim uvjetima za rad s izvorima ionizira-ju}ih zra~enja te mjerilima, sadràju, na~inu i rokovima~uvanja podataka o zdravstvenim pregledima osobakoje rade s izvorima ioniziraju}ih zra~enja (NN 76/00).Prema tom pravilniku, analiza kromosomskih aberacijaizvodi se pri zdravstvenom pregledu prije po~etka radana novom radnome mjestu (tzv. prethodni pregled),zatim pri pro{irenom nadzornom zdravstvenom pregle-du (svakih 60 mjeseci) i pri izvanrednom nadzornomzdravstvenom pregledu djelatnika koji su primiliprekomjernu dozu zra~enja. Analiza kromosomskihaberacija nije uklju~ena u redovit zdravstveni pregled(svakih 12 mjeseci) djelatnika koji rade s izvorima ioni-ziraju}ih zra~enja.

CITOGENETI^KA ANALIZA KROMOSOMSKIHABERACIJA

Najpouzdaniji biolo{ki pokazatelji izloènosti ionizira-ju}em zra~enju jesu kromosomske aberacije, i to poseb-no promjene strukture kromosoma. Aberacije koje nas-taju, mogu biti vidljive na kromatidama ili kromosomi-ma, ovisno o fazi stani~nog ciklusa u kojoj je do{lo doo{te}enja.7

Analiza kromosomskih aberacija izvodi se na kromo-somskim preparatima limfocita periferne krvi. Kultivaci-ja limfocita periferne krvi traje 48 sati u sterilnim uvjeti-ma na 37°C. Kromosomski preparati boje se 20%-tnomotopinom Giemse, nakon ~ega se analizira 200 mitozapo osobi. Pri uzimanju krvi za analizu, prikupljaju sepodaci o kroni~nim, preboljelim i nasljednim bolestima,primljenoj terapiji i rendgenskim pretragama, prethod-nim zaposlenjima i izloènosti mutagenima te za{titnimsredstvima i apsorbiranim dozama na radnomu mjestu,

N. Star~evi} îzmarevi}, A. Bureti}-Tomljanovi}, S. Ostoji}, M. Kapovi} CITOGENETI^KA ANALIZA KROMOSOMSKIH ABERACIJA... Medicina 2004;42(40):305-309

306

Tablica 1. Izvori ioniziraju}ih zra~enja

Table 1 Sources of ionising radiation

a) prirodni izvori 49%

kozmi~ko zra~enje 12%

radioizotopi izvan tijela 27%

radioizotopi u tijelu 10%

b) umjetni izvori 51%

rtg dijagnostika 40%

radioterapija 5%

radioaktivni otpad 5%

ostali umjetni izvori 1%

kao i podaci o konzumaciji potencijalnih genotoksi~nihsupstancija.

Detaljno prikupljanje anamnesti~kih podataka va`noje zato {to postoji ~itav niz ~imbenika o kojima ovisiu~estalost kromosomskih aberacija, kao {to su: dozaioniziraju}eg zra~enja, na~in primanja doze – akutnadoza (odre|ena doza primljena jednokratno) ilikroni~na doza (izloènost radijaciji traje duè vrijeme),vrsta ioniziraju}eg zra~enja (rendgensko zra~enje, γ-zra~enje, β-zra~enje itd.), vremenski razmak odizloènosti zra~enju do izvo|enja analize (s vremenom,stanice s tipi~nim aberacijama nestaju iz cirkulacije izamjenjuju ih nove neo{te}ene stanice), istodobna pro-fesionalna izloènost razli~itim fizi~kim i kemijskimagensima ili pak istodobna profesionalna i dijagno-sti~ka/terapijska izloènost, geneti~ka predispozicija teunutarnji unos radionukleida (u slu~aju terapijskog ilislu~ajnog unosa radioaktivnih elemenata u organizam,ova analiza ima ograni~enu vrijednost).8,9

Kromosomske aberacije koje nastaju kao posljedicaioniziraju}eg zra~enja jesu kromatidni i kromosomskiprekidi (engl. – gap) te lomovi, minute, acentri~ni frag-menti, dicentri~ni i prstenasti (engl. – ring) kromosomi(slika 1.–4.). Kromatidne lomove imaju i osobe koje nisuprofesionalno izloène radijaciji, ali u manjem postotku(1–2%). Gapovi nisu pravi lomovi kromatida ve} privid-no odvojeni dijelovi zbog neobojenosti manjega kro-matidnog dijela, a mi{ljenja o njihovu zna~enju razlikujuse. Minute su acentri~ni fragmenti manji od {irine kro-matide. Acentri~ni fragmenti su odlomljeni dijelovi kro-mosoma koji nemaju centromeru. Dicentri~ni kromo-som podrazumijeva kromosom s dvije centromere, anastaje kao posljedica loma na dva razli~ita kromosomai spajanjem tih dvaju kromosoma. Uz dicentri~ne kro-mosome obvezno su prisutni i pripadaju}i acentri~nifragmenti, {to pomaè pri identifikaciji dicentri~nih kro-mosoma. Ring-kromosom nastaje kao posljedica lomana oba kraka jednog kromosoma, nakon ~ega nastajuacentri~ni fragmenti, a preostali terminalni dijelovi kro-mosoma koji sadrì centromeru, spajaju se u “prstenas-ti” kromosom. Dicentri~ni kromosomi javljaju se uneozra~enih osoba u svega 1 na 1000 slu~ajeva, dok jeu~estalost ring-kromosoma oko 5% u~estalosti dicen-tri~nog kromosoma.10 Stoga nalaz s dicentri~nim ili ring--kromosomima popra}enim acentri~nim fragmentimaupu}uje na prekomjernu izloènost ioniziraju}emzra~enju.11

Pri procjeni o{te}enja kromosoma radijacijom va`naje ne samo vrsta nego i u~estalost pojedinih aberacija.Tako, npr., ako se citogeneti~kom analizom ustanovipet ili vi{e acentri~nih fragmenata, dva ili vi{e dicen-tri~nih kromosoma ili jedan prstenasti kromosom, ili pakako je ukupan zbroj acentri~nih fragmenata i dicentri~-nih kromosoma jednak ili ve}i od 5, u~estalost i tip kro-


307

Slika 3. Parcijalna metafaza s kromatidnim lomom (chtb)

Figure 3 Partial metaphase with chromatide break (chtb)

Slika 2. Parcijalna metafaza s dicentri~nim kromosomom (dic)

i prate}im acentri~nim fragmentom (ace)

Figure 2 Partial metaphase with dicentric chromosome (dic)

and accompanying acentric fragment (ace)

Slika 1. Parcijalna metafaza s ring-kromosomom (r)

Figure 1 Partial metaphase with ring chromosome (r)

mosomskih aberacija odstupaju od kontrolnih vrijed-

nosti za op}u populaciju Republike Hrvatske. Takav

nalaz pokazuje pretjeranu izloènost ioniziraju}em

zra~enju pa se ispitanik smatra nesposobnim za rad u

podru~ju nadzora oko izvora ioniziraju}eg zra~enja i

upu}uje se na kontrolni pregled za 180 dana.

Ako pak u~estalost i tip kromosomskih aberacija

odgovara gornjoj kontrolnoj vrijednosti za op}u popu-

laciju Republike Hrvatske, odnosno ako je tijekom anali-

ze ustanovljeno da je ukupan zbroj acentri~nih fragme-

nata i dicentri~nih kromosoma jednak 4, ispitanik nije

nesposoban za rad u podru~ju nadzora oko izvora ioni-

ziraju}eg zra~enja, ali se valjanost lije~ni~ke svjedod`be

izdaje na vrijeme od 180 dana i pretraga se ponavlja u

tom vremenu.

Za pisanje nalaza upotrebljava se internacionalna

nomenklatura An International System for Human Cyto-

genetic Nomenclature (1995) – ISCN 1995 (tablica 2.).

KRATKI PRIKAZ I KOMENTAR NAŠIH REZULTATA

Analiza kromosomskih aberacija osoba profesionalnoizloènih ioniziraju}em zra~enju izvodi se na Zavodu zaBiologiju i medicinsku genetiku Medicinskog fakulteta uRijeci od 1989. godine. Ukupno je ispitano 800 osoba(tablica 3.), od toga 76,5% (n=612) do srpnja 2000., kada jeobjavljen novi i danas vaè}i Pravilnik o zdravstvenim pre-gledima osoba koje rade s izvorima ioniziraju}ih zra~enja.

U razdoblju do 2000. godine obra|en je ve}i brojispitanika i zabiljeèno je pet grani~nih nalaza te petnalaza koji odstupaju od grani~nih vrijednosti. Me|utim,prema tada vaè}im propisima, grani~ni nalaz podrazu-mijevao je 4%–8% kromosomskih lomova, dok je prisut-nost svega jednog dicentri~nog kromosoma upu}ivalana prekomjernu izloènost zra~enju.

Od 2000. godine analizirano je 188 osoba. Njih 126su zdravstveni djelatnici, od ~ega je 45 obavljaloprethodni pregled prije po~etka rada u zoni ionizira-ju}eg zra~enja, a 81 djelatnik ve} je radio s izvorima ion-


308

Slika 5. Primjer grani~nog nalaza

Figure 5 Example of a borderline result

Slika 4. Parcijalna metafaza s kromosomskim lomom (chrb)

Figure 4 Partial metaphase with chromosome break (chrb)

Tablica 2. Naj~e{}e rabljene kratice kromatidnih i kromosomskih aberacija

Table 2 Most frequently used abbreviations of chromatide and chromosomal aberrations

Kromatidne aberacije Kromosomske aberacije

chtg - od engl. chromatid gap (kromatidni gap) chrg - od engl.chromosome gap (kromosomski gap)

chtb - od engl. chromatid break (kromatidni lom) chrb - od engl. chromosome break (kromosomski lom)

smin - od engl. single minute (jednostruka minuta) dmin - od engl. double minutes (dvostruka minuta)

ace - od engl. acentric fragment (acentri~ni fragment

dic - od engl. dicentric chromosome (dicentri~ni kromosom)

r - od engl. ring chromosome (prstenasti kromosom)

mar - od engl. marker chromosome (biljeg kromosom)

iziraju}eg zra~enja. Niti jedan nalaz nije odstupao od

kontrolnih vrijednosti za op}u populaciju Republike

Hrvatske, dok su u jedne osobe vrijednosti dobivene

citogeneti~kom analizom bile grani~ne (slika 5.).

Iz tablice 3. vidljivo je da se strukturne aberacije kro-

mosoma na|u u osoba profesionalno izloènih ionizira-

ju}em zra~enju puno ~e{}e nego u op}oj populaciji.

Tako je u~estalost dicentri~nih kromosoma u skupini

na{ih ispitanika 19 puta ve}a, a marker-kromosoma i

prstenastog kromosoma ~ak 25 puta ve}a nego u op}oj

populaciji. Nalaz prstenastog kromosoma vrlo je rijedak

pa smo i u na{em uzorku od 800 ispitanika prona{li

samo jedan takav kromosom. Ve} smo naveli da je nalaz

jednoga prstenastog kromosoma pokazatelj prekom-

jerne izloènosti zra~enju i ~ini osobu privremeno nes-

posobnom za rad u zoni radijacije.

ZAKLJUÂK

Citogeneti~ka analiza poradi procjene doze {tetnog

djelovanja ioniziraju}eg zra~enja, dobar je pokazatelj

izloènosti ioniziraju}em zra~enju, {to potvr|uju i znat-

no vi{e u~estalosti kromosomskih aberacija u na{ih ispi-

tanika u odnosu prema vrijednostima u op}oj populaciji.

To je sloèna pretraga koja obuhva}a analizu velikog

broja metafaza i odre|eno iskustvo citogeneti~ara. Za

korektnu procjenu i pra}enje osoba profesionalno

izloènih ioniziraju}em zra~enju, uz analizu kromosom-

skih aberacija potrebni su i podaci koji uklju~uju trajanje

izloènosti ioniziraju}em zra~enju, primljene doze,

rabljene za{tite i vrste agensa.

LITERATURA

1. Cardoso RS, Takahashi-Hyodo S, Peitl P Jr, Ghilardi-NetoT, Sakamoto-Hojo ET. Evaluation of chromosomalaberrations, micronuclei, and sister chromatid exchangesin hospital workers chronically exposed to ionizingradiation. Teratog Carcinog Mutagen. 2001; 21: 431-9.

2. Erol MK, Oztas S, Bozkurt E, Karakelleoglu S. Sisterchromatid exchange analysis and chromosoma aberrationstudies in interventional cardiology laboratory workers:one war follow up study. Jpn Heart J. 2002; 43:159-66.

3. Jakobovi} Z. 1991. Biolo{ko djelovanje ioniziraju}egzra~enja. U: Ioniziraju}e zra~enje i ~ovjek. Školska knjigaZagreb: 70-78.

4. Brusick D. 1987. Fundamentals of Genetic Toxicity. U:Principles of Genetic Toxicology. Second Edition. PlenumPress New York and London: 13-52.

5. Hebrang A., Petrov~i} F. 1987. Izvori radijacije kojima jeizloèn ~ovjek. U: Radijacija i za{tita u medicinskojdijagnostici. Praxis medica, Medicinska knjiga Beograd –Zagreb: 93-134.

6. Al-Haj AN, Lagarde CS. Statistical analysis of historicaloccupational dose records at a large medical center. HealthPhys. 2002; 83:854-60.

7. Pincheira J, Lopez I, Sanhueza S, Ferruz P, Navarrete MH,Santos MJ, Lopez-Saez JF. G2 repair and chromosomaldamage in lymphocytes from workers occupationallyexposed to low-level ionizing radiation. Biol Res. 1999;32:297-306.

8. Bender MA, Awa AA, Brooks AL, Evans HJ, Groer PG,Littlefield LG, Pereira C, Preston RJ, Wachholz BW. Currentstatus of cytogenetic procedures to detect and quantifyprevious exposures to radiation. Mutat Res. 1988; 196:103-59.

9. Maffei F, Angelini S, Forti GC, Violante FS, Lodi V, MattioliS, Hrelia P. Spectrum of chromosomal aberrations inperipheral lymphocytes of hospital workers occupationallyexposed to low doses of ionizing radiation. Mutat Res.2004 22; 547: 91-9.

10. Rozgaj R, Kasuba V, Simic D. The frequency of dicentricsand acentrics and the incidence of rogue cells in radiationworkers. Mutagenesis. 2002; 17:135-9.

11. Horvat \. 1986. Strukturne aberacije kromosoma u sistemuza{tite od zra~enja. U: Zdravstveni i dozimetrijski nadzorosoba zaposlenih u zoni ionizirajuaeg zra~enja. Sveu~ili{nanaklada Liber Zagreb: 19-26.

12. Rauch A, Pfeiffer RA, Trautmann U, Liehr T, Rott HD,Ulmer R. A study of ten small supernumerary (marker)chromosomes identified by fluorescence in situhybridization (FISH). Clin Genet. 1992; 42:84-90.


309

Tablica 3. U~estalost dicentri~nog i prstenastog kromosomau ispitanika i u op}oj populaciji10,12

Table 3 Incidence of dicentric and ring chromosome in tes-tees and in general population

Vrste kromosomskih Ispitanici Op}a populacijaaberacija n (%) (%)

dic 15 (1,2) 0,1

r 1 (0,1) 0,005

SA@ETAK

Zbog svoje u~estalosti i potrebe za ranom dijagnozom, oslabljeni jesluh epidemiolo{ki i javnozdravstveni problem. Mutacija del35G uGJB2 genu naj~e{}i je uzrok genetski uzrokovane gluho}e, a vizua-lizira se PCR-metodom. Uvo|enje analize mutacije u dijagnosti~kialgoritam oslabljenog sluha omogu}uje brzu, preciznu i etiolo{kudijagnozu, a i informativno geneti~ko savjetovanje. Ispitivanjemhrvatske populacije iz Istarske i Primorsko-goranske ùpanije, mutaci-ja je na|ena u 36% osoba oslabljenog sluha, sli~no do sada ispitivanimpopulacijama ustanovljena je incidencija mutacije u populacijinovoro|en~adi od 1/1091 (95CI: 1/372 – 1/3205).

KLJU^NE RIJEÎ: gluho}a, GJB2 mutacije

ABSTRACT

Due to its frequency and the implications of early detection, hearingimpairment has become an important epidemiological and publichealth care problem. Del35G/GJB2 mutation is the most commoncause of genetic deafness, visualized by the PCR method. The muta-tion analysis has been successfully introduced in the diagnostics ofdeafness, and it enables fast, precise and etiologic diagnosis, as well asinformative genetic counselling. The study of the Croatian populationfrom the counties of Istria and Primorje-Gorski kotar revealed that thedel35G mutation is involved in 36% of hearing impaired subjects; theincidence of the mutation in the population of newborns being 1/1091(95CI: 1/372 – 1/3205).

KEY WORDS: deafness, GJB2 mutations

Tematski rad Medicina 2004;42(41): 310-312Main theme UDK: 616.28-008.14:575.224.2

MUTACIJE U GENU GJB2/CONNEXIN 26 KAO NAJÊŠ]I UZROK OSLABLJENOGSLUHA

MUTATIONS IN GENE GJB2/CONNEXIN 26 AS THE MOST FREQUENT CAUSE OF IMPAIREDHEARING

Igor Medica1, Manuela Balaban1, Igor Prpi}2, Sanja Zaputovi}2, Sa{a Ostoji}3, Miljenko Kapovi}3,

Herman Haller2, Borut Peterlin4

Ustanova: 1Specijalisti~ka pedijatrijska ordinacija, Pula, 2Klinika za ginekologijui porodni{tvo, KBC Rijeka, 3Zavod za biologiju i medicinsku genetiku, Medicin-ski fakultet Sveu~ili{ta u Rijeci, 4Slu`ba za medicinsku genetiku, Klinika zaginekologiju i porodni{tvo, KC Ljubljana


Adresa za dopisivanje: Doc. dr. sc. Igor Medica, dr. med., Specijalisti~kapedijatrijska ordinacija, Istarska 13, 52100 Pula. Tel./faks (052) 223 222. [email protected]

podrazumijeva i uspje{niju habilitaciju. Problem utvr|i-vanja etiologije, a time i prognoze i informativnogageneti~kog informiranja, u velikom dijelu rje{avauvo|enje molekularno-geneti~kih tehnika u dijagnos-tiku o{te}enja sluha.3 Identifikacija gena ~ije mutacijedovode do o{te}enja sluha, bila je oteàna zboggeneti~ke i klini~ke heterogenosti gluho}e.2 Metodamapozicijskog kloniranja, velik je broj geneti~kih lokusapovezivih s nesindromskom recesivno naslje|uju}omgluho}om (NRG) lokalizirano u zadnjih desetak godina,vi{e od 50.4 Najva`niji je me|u njima – jer je poveziv s~ak 50% NRG-a – lokus DFNB1 na 13. kromosomu, ukojemu je identificiran gen GJB2 koji kodira proteinconnexin 26.5,6 Me|u mutacijama u ovom genu, kaonaj~e{}a isti~e se delecija jednoga gvanina iz serije od{est u kodiraju}oj regiji gena (del35G), koja je u raznimdo sada ispitivanim populacijama indoeuropskog podri-jetla na|ena kao uzrok NRG-a u ~ak 80%.5-9 Velika

GLUHO]A I GENETIKA

Gubitak sluha koji }e zahtijevati medicinsku intervenci-ju poradi pobolj{anja komunikacije ustanovi se u 1/1000novoro|ene djece.1 U 50% slu~ajeva, i vi{e, uzrok jegenetski, i moè biti tek sastavni dio sindroma (Usher,Pendred, Jervell, Lange-Nielsen sindrom), ili samostalnientitet: 80% genetskog o{te}enja sluha je nesindromsko,nasljedivo po autosomno recesivnom tipu.2 Nakonuvo|enja otoakusti~ke emisije u novoro|ena~ki probir,omogu}ena je rana dijagnostika oslabljenog sluha, koja

310

u~estalost mutacije i mogu}nost njezine vizualizacijemolekularno geneti~kim tehnikama,10 ~ine NRG jednomod niza monogenskih bolesti ~ija se dijagnostika danaszasniva ponajprije na molekularno-geneti~kim meto-dama. Velika u~estalost mutacije del35G u op}oj popu-laciji (druga naj~e{}a mutacija u op}oj populaciji nakondelta F508), ~ine je intrigantnom za populacijsko--geneti~ka ispitivanja.

MOLEKULARNA GENETIKA MUTACIJA GJB2

Unatrag deset godina, temeljem studija konsangvinihobitelji razli~itog etni~koga podrijetla, mapiran jeDFNB1 lokus i njegova povezanost s NRG-om,11 a zatimje identificiran gen GJB2 i njegove mutacije te njihovapovezanost s NRG-om.5 Kodiraju}a sekvenca GJB2 genasastoji se od 681bp i prevodi se u protein od 226aminokiselina. Mutacija del35G je hot spot mutacijavjerojatno podràna Chi konsenzus motivom GCTG-GTGG od nukleotida 50 do 57 ili sekvencom TGGGGod nukleotida 29 do 33: oba motiva su ve} utvr|ena kaohot spot mutacije u drugim genima.12 Mutacija del35Gdelecija je jednog od {est gvanina koji se nalaze u slije-du na poziciji 30–35. Uz tu mutaciju, otkriven je jo{ velikbroj drugih mutacija u genu – sveukupno ~etrdesetak,minornoga klini~kog i epidemiolo{kog zna~enja.2,4,12

Vizualizacija mutacije osniva se na PCR alel specifi~nojmetodi u kojoj se uz upotrebu razli~itih klica na istomDNA-materijalu uspije razli~ito amplificirati DNA, ovisnoo tome sadrì li ili ne sadrì mutaciju.10

POPULACIJSKA GENETIKA MUTACIJE DEL35G

Nakon identifikacije gena, uslijedilo je utvr|ivanjeu~estalosti njegovih mutacija u raznim etni~kim inacionalnim studijama – studije mediteranskih naroda,tj. osoba oslabljenog sluha talijanskog, {panjolskog, por-tugalskog, francuskog, ali i alìrskog, tuniskog i libanon-skog podrijetla, studije gluhih osoba iz Velike Britanije,Novog Zelanda i Australije, ameri~ke studije, studijepopulacija iz sjeverne i srednje Afrike te studije Izraela-ca.6-9,13-15 U svim tim studijama na|ena je mutacijadel35G u homozigornom statusu kao naj~e{}i uzrokgluho}e. Za izraelsku populaciju (A{kenazi) utvr|ena jedruga ~esta mutacija, klini~ki i epidemiolo{ki zna~ajna:167delT.16 U studijama populacija gluhih iz Japana, Kinei Koreje nije na|ena del35G kao naj~e{}i uzrokgluho}e.17-19 U~estalost mutacija u GJB2 genu kaouzroku NRG-a, izra~unata je kao 14/100 000.2 Istodobnoje ustanovljena visoka u~estalost od 2,5% mutacijedel35G u heterozigotnom statusu u op}oj populaciji, {toje postavilo pitanje izvora te mutacije: analize haplotipaisklju~ile su efekt osniva~a kao uzrok visoke prevalenci-je prenositelja mutacije.13,16,20 Studije koje su uzele u

obzir sociolo{ki pristup, takvu visoku frekvencijuobja{njavaju time {to su u nekim sredinama u pro{lostiizrazito ~esti bili brakovi samo izme|u gluhih osoba.

KLINI^KA GENETIKA MUTACIJE DEL35G

O{te}enje sluha uzrokovano mutacijama u GJB2 genuo~ituje se razli~itim intenzitetom. Razli~ita ispitivanjaustanovila su o{te}enja sluha od blagog i umjerenog dote{kog. Dijelom su te razlike posljedica nedovoljne stan-dardizacije u izvje{tavanju, a one se odnose i na razlikeu izvje{tavanju o asimetriji i progresiji smetnji.21-23

Me|utim, nema dvojbe o tome da sve osobe o{te}enogsluha uzrokovanog tim mutacijama nemaju drugih,pridruènih simptoma ili popratnih pridruènih bolesti.Nije prona|ena udruènost pojedine mutacije s inten-zitetom o{te}enja sluha ~ak ni unutar iste obitelji. Velikbroj klini~kih studija omogu}uje ipak uop}avanje:o{te}enje sluha je prelingualno i zna~ajno, varijabilnogje intenziteta – od umjerenog do te{kog, motori~kirazvoj djece redovito je uredan, o{te}enje sluha jenaj~e{}e obostrano i neprogresivno.

Povezivanje novoro|ena~kog probira na gluho}uotoakusti~kom emisijom i molekularnog dijagnosticira-nja mutacija, omogu}uje danas ne samo ranu dijagnozuza dijete ve} i zna~ajnu informaciju roditelju igeneti~aru. Utvr|ivanje genotipa omogu}uje pribli`nuprognozu: ve}ina ispitanika imat }e teè o{te}enjesluha. Omogu}it }e i precizno utvr|ivanje rizika ponav-ljanja o{te}enja sluha u budu}ih potomaka roditeljadjeteta s utvr|enim genotipom. Klini~ka ispitivanjahabilitacije sluha nakon kohlearnog implanta pokazalasu najbolje rezultate upravo u djece ~ije je o{te}enjesluha uzrokovano mutacijama u genu, {to pridonosiva`nosti detekcije mutacije i u terapeutskom smislu. 24

Uvo|enje molekularno-geneti~kog testa u dijagnos-ti~ki algoritam o{te}enja sluha i utvr|en pozitivan rezul-tat na mutaciju u homozigotnom statusu, omogu}uje eti-olo{ku/definitivnu dijagnozu i isklju~uje druge, sada ve}nepotrebne, skupe ili agresivne/{tetne pretrage.

ISPITIVANJE MUTACIJE U HRVATSKOJ

Unatrag dvije godine, u okviru programa uvo|enjamolekularno-geneti~kih tehnika u rutinsku dijagnostikumonogenskih bolesti, Upravnog odjela za zdravstvoIstarske ùpanije, a u suradnji s ljubljanskom Slu`bom zamedicinsku genetiku Ginekolo{ke klinike KC, provodise i ispitivanje mutacije del35G u GJB2 genu u osobao{te}enog sluha iz Istre i Primorsko-goranske ùpanije,uklju~uju}i novoro|en~ad o{te}enog sluha ustanov-ljenog novoro|ena~kim probirom otoakusti~kom emisi-jom. U skupini do sada molekularno ispitanih osoba so{te}enjem sluha iz prelingualne faze razvoja, mutacija

I. Medica, M. Balaban, I. Prpi} i dr. MUTACIJE U GENU GJB2/CONNEXIN 26 KAO NAJÊŠ]I UZROK OSLABLJENOG SLUHA Medicina 2004;42(40):310-312

311

je ustanovljena u 36% ispitanika. Izra~unata incidencijamutacije u novoro|en~adi je 1/1091 (95CI: 1/372 –1/3205), zna~ajno vi{a od o~ekivane. Ustanovljena jezna~ajna uloga mutacije u skupini kongenitalnegluho}e, jo{ ve}a nego u skupini prelingualne gluho}e.Preporu~ili smo uklju~enje molekularnog ispitivanjadel35G u sastavni dio novoro|ena~kog probira ako seotoakusti~kom emisijom i evociranim slu{nim potenci-jalima ustanovi gluho}a.25 U tijeku je priprema ispitiva-nja u~estalosti del35G u heterozigotnom statusu u op}ojpopulaciji.

LITERATURA

1. Morton NE. Genetic epidemiology of hering impairment.Ann N Y Acad Sci 1991; 630: 16-31

2. Smith RJH, Van Camp G. Hereditary Hearing Loss Home-page. 2004 World Wide Web URL: (http://dnalab-www.uia.ac.be/dnalab/hhh/)

3. Cohn ES, Kelley PM. Clinical phenotype and mutations inconnexin 26 (DFNB1/GJB2), the most common cause ofchildhood hearing loss. Am J Med Genet 1999; 89: 130-136

4. Avraham K, Davis N. GeneDis. Human Genetic DiseaseDatabase Homepage. 2003 World Wide Web URL:(http://life2.tau.ac.il/GeneDis/)

5. Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, Lench NJ, Liang JN, ParryG et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syn-dromic sensorineural deafness. Nature 1997; 387: 80-83

6. Kelley PM, Harris DJ, Comer BC, Askew JW, Fowler T,Smith SD et al. Novel mutations in the connexin 26 gene(GJB2) that cause autosomal recessive (DFNB1) hearingloss. Am J Hum Genet 1998; 62: 729-799

7. Denoyelle F, Weil D, Maw MA, Wilcox SA, Lench NJ, Allen-Powell DR et al. Prelingual deafness: high prevalence of a30delG mutation in the connexin 26 gene. Hum Mol Genet1997; 6: 2173-2177

8. Estivill X, Fortina P, Surrey S, Rabionet R, Melchionda S,D’Agruma l et al. Connexin-26 mutations in sporadic andinherited sensorineural deafness. Lancet 1998; 351: 394-398

9. Zelante L, Gasparini P, Estivill X, Melchionda S, D’AgrumaL, Govea N et al. Connexin 26 mutations associated withthe most common form of non-syndromic neurosensoryautosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans.Hum Mol Genet 1997; 6: 1605-1609

10. Scott DA, Kraft ML, Carmi R, Ramesh A, Elbedour K, YairiY et al. Identification of mutation in the connexin 26 genethat cause autosomal recessive nonsyndromic hearing loss.Human Mutation 1998; 11: 387-394

11. Guliford P, Ben Arab S, Levilliers J, Weissenbach J, Belka-hia A, Petit C. A non-syndromic form of neurosensory deaf-ness maps to the pericentromeric region of chromosome13q. Nature Genet 1994; 6: 24-28

12. McKusick VA. Online Mendelian Inheritance in ManHomepage. 2004 World Wide Web URL:(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ )

13. Carrasquillo MM, Zlotogora J, Barges S, Chakravarti A. Twodifferent connexin 26 mutations in an inbred kindred seg-regating nonsyndromic recessive deafness: implicationsfor genetic studies in isolated populations. Hum Mol Genet1997; 6: 2163-72

14. Brobby GW, Muller-Myhsok B, Horstmann RD. Connexin26 R143W mutation associated with recessive nonsyn-dromic sensorineural deafness in Africa. N Engl J Med1998; 338: 548-50

15. Lench NJ, Markham AF, Mueller RF, Kelsell DP, Smith RJ,Willems PJ et al. A Moroccan family with autosomal reces-sive sensorineural hearing loss caused by a mutation in thegap junction protein gene connexin 26 (GJB2). J MedGenet 1998; 35: 151-2

16. Morell RJ, Kim HJ, Hood LJ, Gotorth L, Friderici K, Fisher Ret al. Mutations in the connexin 26 gene (GJB2) amongAshkenazi Jews with nonsyndromic recessive deafness. NEngl J Med 1998; 339: 1500-1505

17. Abe S, Usami S, Shinkawa H, Kelley PM, Kimberling PM.Prevalent connexin 26 gene (GJB2) mutations in Japanese.J Med Genet 2000; 37: 41-43

18. Yuhe L, Xiaomei K, Yu Q, Wei L, Ping Z. Connexin 26 gene(GJB2): prevalence of mutations in the Chinese popula-tion. J Hum Genet 2002; 47: 688-90

19. Kudo T, Ikeda K, Kure S, Matsubara Y, Oshima T, Watan-abe K et al. Novel mutations in the connexin 26 gene(GJB2) responsible for childhood deafness in the Japanesepopulation. J Med Genet 2000; 90: 141-5

20. Green GE, Scott DA, McDonald JM, Woodworth GG,Sheffield VC, Smith RJ. Carrier rates in the MidwesternUnited States for GJB2 mutations causing inherited deaf-ness. JAMA 1999; 281: 2211-6

21. Cohn ES, Kelley PM, Fowler TW, Gorga MP, Lefkowitz DM,Kuehn HJ et al. Clinical studies of families with hearing lossattributable to mutations in the connexin 26 gene(GJB2/DFNB1). Pediatrics 1999; 103: 546-50

22. Denoyelle F, Marlin S, Weil D, Moatti L, Chauvin P,Garabedian EN et al. Clinical features of the prevalent formof childhood deafness, DFNB1, due to a connexin 26 genedefect: implications for genetic counseling. Lancet 1999;353: 1298-303

23. Gualandi F, Ravani A, Berto A, Sensi A, Trabanelli C, Fal-ciano P et al. Exploring the clinical and epidemiologicalcomplexity of GJB2-linked deafness. Am J Med Genet2002; 112:38-45

24. Green GE, Scott DA, McDonald JM, Teagle HF, Tomblin BJ,Spencer LJ et al. Performance of cochlear implant recipi-ents with GJB2- related deafness. Am J Med Genet 2002;109: 162-170

25. Medica I, Rudolf G, Balaban M, Prpi} I, Stanojevic M, Peter-lin B. Implications of del35G/GJB2 mutation analysis inevaluation of hearing impairment. Eur J Hum Genet 2004;12 (suppl)

I. Medica, M. Balaban, I. Prpi} i dr. MUTACIJE U GENU GJB2/CONNEXIN 26 KAO NAJÊŠ]I UZROK OSLABLJENOG SLUHA Medicina 2004;42(40):310-312

312

313

314

Documents

TEMATSKI BROJ - MEDICINSKA GENETIKA MEDICINSKA GENETIKAbib.irb.hr/datoteka/318376.Medicina_-_Medicinska_genetika_4-2004.… · MEDICINSKA GENETIKA. 242 THEMATIC EDITION – MEDICAL