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Curso 2015-2016
GRADO EN QUÍMICA METODOLOGÍAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANALÍTICA
Curso 4º
Curso 201-2015
Anexo Tema 6: Ejemplos biosensores electroquímicos
GRADO EN QUÍMICA METODOLOGÍAS AVANZADAS EN QUÍMICA ANALÍTICA
Curso 4º
Susana Campuzano Ruiz
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Metodologías
Sensores
integrados
Partículas
magnéticas (MBs)
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Biosensores enzimáticos
Glucosa Fructosa Hipoxantina/Teofilina Lactosa Lactulosa Polifenoles Ác. D-y L-láctico Ác. Málico Glicerol Etanol H2O2
ANALITOS SUSTRATOS ELECTRÓDICOS
MUESTRAS
AuE GCE Au-acero inoxidable
Refrescos Bebidas alcohólicas Leche Miel, etc.
SAMs de alcanotioles
Membrana de diálisis
i, A
t, s
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Determinación de antibióticos -lactámicos
Nueva plataforma para inmovilización de bioreceptores con His-tag
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Método de cribado rápido para sulfonamidas, tetraciclinas y cefalosporinas
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetoinmunosensores para S. aureus
Muestras de leche inoculadas
Nivel de contaminación, cfu mL-1
[S. aureus] encontrada, cfu mL-1 Recuperación , %
10 (11.2 0.9)
(n = 6)
(112 10) (n = 6)
100 (106 8)
(n = 6)
(106 8) (n = 6)
Au/SPE
Imán
LEGISLACIÓN
103 cfu mL-1
S. aureus ProtA-HRP
Anti-ProtA
ProtA-MBs
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Inmunosensores impedimétricos para E. coli
Biosensores impedimétricos:
Determinación de E. coli en muestras de agua inoculadas
MUESTRA [E. coli], cfu mL-1
Agua de grifo (11 2) (n = 6)
Agua del río Eresma (12 2) (n = 6)
Sulfo-LC-SPDP
+ anticuerpos
tiolados
Lectinas
(ConA)
Con A
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetogenosensores para E. coli PCR asimétrica directa (DaPCR)
Sensibilidad: capacidad de detectar 1 cfu de E. coli en 100 mL
(Regulación Europea Nº 1441/2007: Agua potable → libre de E. coli en 100 mL)
DISPOSITIVO DE ALARMA PARA CONTROL DE CALIDAD DE LAS AGUAS
No es posible cuantificar!!!
Cultivo
bacteriano
DNA
genómico
Amplicón de cadena
sencilla biotinilado
cfu: unidades formadoras de colonias
1 2 3 4 5 6 7 8
326 bp
1353 bp1078 bp
872 bp603 bp
1 2 3 4 5 6 7 8
326 bp
1353 bp1353 bp1078 bp
872 bp872 bp603 bp603 bp
1/100 1.0104 cfu mL-1
_
0 50 100 150 200
-1.5
-1.0
-0.5
0.0 H2O
2
-i, µ
A
t, s
Amplicons DaPCR:
sterilized H2O
1/100 cfu mL-1
100 cfu mL-1
1.0x104 cfu mL
-1
Magnetogenosensores
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Genosensores integrados para uropatógenos
Identificación y cuantificación Resistencia a antibióticos
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Identificación de aislados clínicos
EC: Escherichia coli
KP: Klebsiella pneumoniae
PA: Pseudomonas aeruginosa
EA: Enterobacter aerogenes
PM: Proteus mirabilis
SM: Serratia marcescens
EH: Enterobacter hormaechei
AB: Acinetobacter baumannii
El sensor es capaz de detectar los aislados clínicos de E. coli (EC) con 100% de sensibilidad y
selectividad en sólo 45 min.
-i, n
A
Genosensores integrados para uropatógenos
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Comparación entre cepas de E. coli susceptibles (EC103) y resistentes (EC135, EC139, and EC197) a
ciprofloxacino (CIPRO).
Determinación electroquímica de pre-rRNAs Detección rápida de la
resistencia bacteriana a antibióticos
Genosensores integrados
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetogenosensores para S. pneumoniae
S. pneumoniae
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
7.55
1.15 blancoicaamperométrSeñal
muestraicaamperométrSeñallaciónRe
Sensibilidad: 91%
Especificidad: 90%
Identificación microbiana
Sp N-Sp Total
Magnetogenosensor Sp 72 3 75
N-Sp 7 25 32
Total 79 28 107
AUC = 0.94
Especificidad
Sen
sib
ilid
ad
1.92
Validación clínica: muestras en placa
Re
laci
ón
se
ñal
/bla
nco
Sp: S. pneumoniae; N-Sp: S. pneumoniae
Magnetogenosensores para S. pneumoniae
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
0.0 0.1 0.2 0.3 0.40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
i, A
[Etanol]sangre
, g L-1
Bioparche electroquímico para etanol en sudor
Estimulación de sudor
Ingesta de alcohol
Medida puntual: 5 min
Medida continua: 6-8 h
I.L. = (0.0005-0.6) g/L
[etanol]sangre 71 % [etanol]sudor
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetoinmunosensores duales para biomarcadores cardiovasculares
Diagnóstico más fiable y objetivo
0 50 100 150 200 -600
-400
-200
0
NT-proBNP
CRP
i, nA
t, s
Parameter CRP NT-proBNP
LOD, ng mL-1 0.47 0.47
Punto de corte 1000 1.0
[Marcador cardiaco]añadido [Marcador cardiaco]encontrada
CRP, 1 µg mL-1 (1.02 ± 0.04) µg mL-1
NT-proBNP, 1 ng mL-1 (1.0 ± 0.1) ng mL-1
(n = 6, = 0.05)
Suero de referencia para CRP contaminado con NT-proBNP
+
Tiempo de ensayo: 60 min
NT-proBNP
CRP
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Chip de microfluídica para determinación de cTnT
Sistema de microfluidica
Parámetro Valor experimental
IL, ng mL-1 0.05 – 1.0
LOD, ng mL-1 0.03
Curva de calibrado y características analíticas
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
[cTnT], ng mL-1
ic, nA
0 50 100 150 200-20.0
-10.0
0.0
10.0
20.0
0
1 ng mL-1
t, s
i, nA
RE: electrodo de referencia
AE: electrodo auxiliar
ImE: electrodo de inmovilización
WE: electrodo de trabajo
1) Modificación de MBs
2) Captura de las MBs modificadas
3) Cronoamperometría (–0.10 V)
Muestras de suero contaminadas
RE
AE WE
ImE
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetoinmunosensor para fibrinógeno basado en nanobodies
Valor de corte [Fib ]plasma : 4.66 mg mL-1
Parámetro Competitivo
directo Competitivo
indirecto
LOD, µg mL-1 0.49 0.044
Estándar internacional ([Fib] = 2.7 mg mL-1)
Competitivo directo [Fib]
Competitivo indirecto [Fib]
(2.8 0.1) mg mL-1
RSDn=9 = 6.9 %
(2.6 0.2) mg mL-1
RSDn=9 = 9.1 %
Tratamiento de muestra mínimo, tiempo ensayo: 90 min
Cáncer de vejiga
His6 tag en C-terminal
Fusionado a MBP en N-terminal
Ab humano Ab camello
Nanobodi
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetoinmunosensor para ErbB2
ErbB2-negativas: MDA-MB-436
ErbB2-bajas: MCF-7
ErbB2-altas: SK-BR-3
Lisado celular
Magnetoinmunosensor* ELISA**
MCF-7 67 14 69 15
MDA-MB-436 64 6 65 12
SK-BR-3 205 23 198 12
*2.5 g de lisado celular; **0.25 g de lisado celular
[ErbB2], pg/g lisado
Células Nº receptores/célula 10-3
MCF-7 22 2
MDA-MB-436 4.7 0.5
SK-BR-3 530 60 *17.500 Células
Determinación en lisados celulares
Determinación en células intactas
Hiperexpresada en el 2025% cánceres de mama invasivos
0 MCF-7 MDA-MB-436 SK-BR-30.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
-i,
A
MCF-7 SK-BR-3
20
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Genosensor integrado para gen TP53
i, nA
t, s
a)
b)
rGO-CMC
a) No target
a) No target
Biotin
Strep-HRP
Sondas de captura tipo horquilla: - Dual modification (5´-Biotin, 3´-NH2)
- spp53 (20 nts)
- lcpp53 (33 nts)
TP53: region of the wtTP53 gene
1-m: missense mutation in codon 175 (G → A)
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Genosensor integrado para gen TP53
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
-i,
A
0 TP53 1-m MCF-10A MCF-7 SK-BR-3
MCF-10A: wtTP53
Células epiteliales no tumorales
Células cancerígenas
MCF-7: wtTP53 SK-BR-3: 1-m TP53
RNAt
RT
DNA Pol
Buffer + dNTPs
Primers específicos
cDNA
RT
La respuesta equivalente a la del SNP ocurre
sólo para las células SK-BR-3
Identificar el estado del gen TP53 en células
5.0 ng L-1 cDNA
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
i /
A
t / s
Chitin-MBs
Magnet
Medida amperométrica
Strep-HRP
p19
antimiR
Biotin
target miR
Strep-MBs
antiMBP-HRP
p19: bioreceptor de captura
p19: bioreceptor de detección
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
Imán
SPCE
Suspensión de MBs
Conector
Célula electroquímica
①
②
③
④
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
0 1.0 nM miR-21
RNAt
MCF-7 RNAt
MDA-MB-231 RNAt
MCF-10A RNAt Hela
Determinación de RNAt (0.5 g) de líneas celulares
Células [miR-21] amol/ng RNAt
MCF-7 18 (1.1107 copias)
MDA-MB-231 10 (6.0106 copias)
Detección fiable del miR diana en 100 ng de RNAt
(3.0104 células MCF-7)
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
T: Tejidos cancerígenos de mama
NT: Tejidos normales adyacentes de mama
C: Citología mamaria * : Quimioterapia antes de cirugía
Determinación en RNAt (1.0 g) de tejidos y citologías
*
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
Identificación inequívoca de subtipos de cáncer de mama (TNBC)
Detección simultánea de miR-21 y miR-205
p19
ca
tho
dic
cu
rren
t
[antibiotic]
miR-205
miR-21
SPdCE
Tiempo, s
i, n
A
WE1
WE2
antimiR-21
miR-21 Biotin
Strep-HRP
Chitin-MBs
antimiR-205
miR-205
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para miRNAs
Detección simultánea en 15 min !!
Líneas celulares
Tejidos frescos
Células de cáncer de mama
metastásicas:
-MCF-7: ER+/PR+
-SK-BR-3: ER-/PR-
-MDA-MB-231: células TNBC
Células epiteliales no tumorales:
-MCF-10A
Muestra Tipo miR-21 miR-205
Células/ Tejidos
Tumoral ↑ ↓
Normal ↓ ↑
ER+/PR+ ↑ ↑
ER-/PR- ↑ ↓
NT T1 T2 T3 T4 T50
400
800
1200
1600
2000
-i,
nA
miR-21
miR-205
MCF-10A MDA-MB-231 MCF-7 SK-BR-30
100
200
300
400
500
-i, nA
miR-21
miR-205
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
0
300
600
900
1200
-i,
nA
miR-21
miR-205
miR-205
miR-21
NT T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
ErbB2+ ErbB2-
Magnetosensores para miRNAs
Tejidos humanos de mama parafinados (PTFE)
miR-21 y miR-205 in todas las muestras T comparadas con las NT
Diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de expresión de miR-21 en tejidos T ErbB2+ y ErbB2-
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado
Los cánceres de cabeza y cuello representa el sexto tipo de cáncer más común en el
mundo y son responsables de 560,000 nuevos casos y 300,000 muertes/año.
IL-8: Citocina proinflamatoria que promueve la angiogénesis, la tumorigenicidad y
metástasis de numerosos tumores.
Se ha demostrado que en el cáncer oral existe concordancia entre los niveles salivares
de la proteína IL-8 y su mRNA asociado.
Saliva como fluido diagnóstico
600 pg mL -1 de proteína IL-8:
valor de corte para discriminar
pacientes con cáncer oral de
individuos sanos
Método de colección no invasivo
Fácilmente manipulable
Barato
Conservación y transporte sencillo
Correlación con niveles en sangre
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado
0
3000
6000
9000
12000
15000
NC
-i, nA
Blank PM 1-m
Selectividad adecuada para
el análisis de ambos
biomarcadores
0
1000
2000
3000
4000
10 µg mL-1
LPO
44 µg mL-1
lysozyme
2,500 pg mL-1
IL-6
-i,
nA
0 pg mL-1 IL-8 protein
2,500 pg mL-1 IL-8 protein
Buffer
S/N
0.0
3.0
6.0
9.0
SELECTIVIDAD
REACTIVIDAD CRUZADA
Factible la determinación simultánea
de ambos biomarcadores!!
Mezcla [IL-8], pg mL -1 [IL-8 mRNA], nM
1 0 0
2 600 0
3 0 2.5
4 600 2.5
5 2,500 0
6 2,500 2.5
Mezclas: Proteína IL-8 + mRNA IL-8
Buffer 2,500 pg mL-1 IL-6
44 g mL-1 lisozima
10 g mL-1 LPO Blanco Target 1-m NC
0 pg mL-1 proteína IL-8 2,500 pg mL-1 proteína IL-8
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado
IL-8 proteína mRNA IL-8
LR 241.3 – 5,000 pg mL -1 0.69 – 7.5 nM
r 0.9992 0.9955
Pendiente (1.47 ± 0.02) nA mL pg -1 (361 ± 12) nA nM -1
LOD 72.4 pg mL -1 0.21 nM
LQ 241.3 pg mL -1 0.69 nM
RSDn=5, % 8.3 (600 pg mL-1) 8.4 (2.5 nM)
0 1000 2000 3000 4000 50000
2000
4000
6000
8000
10000
-i,
nA
[IL-8 protein], pg mL-1
0 1 2 3 4 5 6 7 80
1000
2000
3000
-i,
nA
[IL-8 mRNA], nM
CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS EN MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR CONTAMINADAS
[Proteína IL-8], pg mL-1 [mRNA IL-8], nM
UCM
Metodologías Avanzadas en Química Analítica
Magnetosensores para determinación simultánea de proteína IL-8 y su mRNA asociado
ANÁLISIS DE MUESTRAS DE SALIVA SIN DILUIR
Parámetro Proteína IL-8 mRNA IL-8
[Media] 600 pg mL -1 2.5 nM
[Biomarcador] (615 ± 28) pg mL -1 (2.3 ± 0.2) nM
Recuperación, % 102 ± 5 94 ± 7
RSDn=7, % 5.0 7.7
Magnetobiosensor ELISA
Voluntario [IL-8], pg mL-1 RSDn=3, % [IL-8], pg mL-1 RSDn=3, %
1 (320 ± 36) 4.5 (306 ± 33) 5.0
2 (328 ± 26) 3.2 (339 ± 55) 6.6
3 (352 ± 45) 5.2 (336 ± 44) 5.2
4 (314 ± 34) 4.3 (330 ± 65) 7.9
5 (363 ± 10) 1.1 (370 ± 33) 3.6
6 (323 ± 28) 3.5 (319 ± 63) 8.0
7 (264 ± 43) 6.6 (245 ± 46) 7.6
-MUESTRAS DE SALIVA DE INDIVIDUOS SANOS-
Resultados por debajo del valor de
corte (600 pg mL -1) y concordantes
con los que se obtienen empleando
la metodología ELISA convencional
No hay diferencias significativas entre
diferentes muestras de saliva Calibrado
universal para todas las muestras de
saliva analizadas
-MUESTRAS DE SALIVA CONTAMINADAS-