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Tema 3. Aplicaciones y criterios de uso de la espectroscopia de absorción molecular: Espectrofotometría UV-visible
El instrumento tipo: parámetros de interés y calibración.-Descripción de aplicaciones frecuentes.- Selección de
procedimientos adecuados para problemas concretos.- Uso de la espectrofotometría UV-visible como sistema de detección en
otras técnicas instrumentales
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• Fuente de radiación: • lámpara de Deuterio o Hidrógeno: proporcionan espectro continuo en la región UV (160-375 nm)• lámpara de filamento de Tungsteno: radiación visible e IR cercano• arco de xenón: espectro continuo entre 150 y 800 nm
• Selector de longitudes de onda:• filtros• monocromadores: de red, de prisma
• Recipiente muestra: • cubetas cuarzo o sílice fundida para que sean transparentes a la luz (permitan en paso de radiación de la región espectral de interés)
• Detector de radiación: • fotomultiplicadores o fotodiodos
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR UV/VIS
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Espectro Visiblemayor frecuencia menor frecuencia
longitud de onda (nm)Violeta: 400-420 nm
Indigo: 420-440 nm
Azul: 440 -490 nm
Verde: 490-570 nm
Amarillo: 570-585 nm
Naranja: 585-620 nm
Rojo: 620-780 nm:
¿Porqué algunas sustancias se ven coloreadas y otras se ven blancas?
Parte del espectro visible es absorbido y otra parte reflejado (color
complementario)
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Colores complementarios:
Absorción a 420-430 nm: se ve amarillo
Absorción a 500-520 nm: se ve rojo.
Absorción total: se ve negro
Reflexión total: se ve blanco
Sustancias coloreadas que tienen un sistema de enlaces π conjugados
O
O
OH
HOOH
CH3
OH
CO2H
ácido carmínico
NH
HN
O
Oíndigo
OH
O
OH
O
crocetina
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Figura. Instrumento medición UV/vis de un solo haz
Figura. Instrumento medición UV/vis de doble haz
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Instrumento tipo- haz simple
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Espectrofotómetros de doble haz Lambda 3A y 4B (Perkin-Elmer)
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Espectrofotómetros de diodos apilados “diode array”
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Doble haz
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Conceptos básicosRegión de longitudes de onda comprendida entre 160 y 780 nm (UV-vis)
La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la transmitancia T o de la absorbancia A de disoluciones que se encuentran en cubetas transparentes con un camino óptico de b cm
Normalmente, la concentración c de un analito absorbente está relacionada linealmente con la absorbancia
A = -log T = log P0/P = ε b c
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MEDIDA DE LA TRANSMITANCIA Y DE LA ABSORBANCIA
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MEDIDA DE LA TRANSMITANCIA Y DE LA ABSORBANCIA
La disolución del analito debemantenerse en algun tipo de recipiente transparente, o cubeta
En las dos interfasesaire/pared de la cubeta, asicomo en las dos interfasespared/disolucion tienen lugarreflexiones
La atenuación del haz resultante esun factor importante
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MEDIDA DE LA TRANSMITANCIA Y DE LA ABSORBANCIA
Aproximadamente el 8,5 % de un haz de luz amarilla se pierde porreflexión en su paso a través de una cubeta de vidrio rellena de agua
La atenuación del haz puede ocurrir como, consecuencia de la dispersión causada por moléculas grandes y, a veces, de la absorción por las paredes del recipiente
Para compensar todos estos efectos, la potencia del haz transmitido por la disolución del analito se compara, generalmente, con la potencia del haztransmitido por una cubeta idéntica que sólo contiene disolvente
Con las siguientes ecuaciones se obtienen la T y A experimentales que se aproximan estrechamente a la transmitancia y absorbancia verdaderas
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LEY DE BEERConsideremos el bloque de material absorbente (sólido, líquido o gas)
Un haz de radiación monocromático paralelo de potencia Pochoca contra el bloque de forma perpendicular a la superficie; después de pasar a través de una longitud b de material, que contiene n átomos, iones o moléculas absorbentes, su potencia disminuye hasta un valor P como resultado de la absorción.
Consideremos ahora una sección transversal del bloque de área S y espesor infinitesimal dx.
Esta sección contiene do partículas absorbentes; asociada a cada partícula, podemos imaginar una superficie en la cual tendrá lugar la captura del fotón.
Si un fotón, por casualidad, alcanza una de estas áreas, inmediatamente tendrá lugar la absorción
La proyección del área total de estas superficies de captura dentro de la sección se designa como dS
La relación entre el area de captura y el area total, seráentonces dS/S.
Estadísticamente, esta relación representa la probabilidad de captura de fotones en el interior de la sección
A = - log T = log P0 /P = ε b c
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Ley de BeerLa potencia del haz que entra en la sección, Px, es proporcional al numero de fotones por centímetro cuadrado y dPx representa la cantidad absorbida en la sección; la fracción absorbida será, entonces -dP/P, y esta relación también es igual a la probabilidad media de captura. El signo menos indica que P sufre un descenso.
Recordemos, ahora, que dS es la suma de las áreas de captura de las partículas que se encuentran en la sección será proporcional al número de partículas
donde dn es el numero de partículas y a es una constante de proporcionalidad, que puede denominarse sección transversal de captura
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donde n es el numero total de partículas en el bloque
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Ley de Beer
El área de la sección transversal S puede expresarse en términos de volumen del bloque V en cm3 y su longitud b en cm
Como, nlV tiene unidades de concentración, es decir, numero de partículas por centímetro, cúbico, podemos convertir nlV en moles por litro
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Ley de BeerEl número de moles viene dado por:
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Aplicación de la Ley de Beer a mezclasLa ley de Beer también se puede aplicar a un medio que contenga mas de un tipo de sustancias absorbentes
Siempre que no haya interacción entre las distintas especies, la absorbancia total para un sistema multicomponente viene dado por
donde los subíndices se refieren a los componentes absorbentes 1, 2, ..., n.
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Limitaciones de la ley de BeerEn algunas ocasiones estas desviaciones están relacionadas con el fundamento de la ley y representan limitaciones propias de la misma
Otras veces surgen como, consecuencia de la forma en que se realizan las medidas de absorbancia o como resultado de cambios químicos asociados con cambios de concentración; estas alteraciones de la ley de Beer se conocen cómo
desviaciones instrumentales desviaciones químicas
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Limitaciones de la Ley de BeerLIMITACIONES A LA LEY DE BEER
LIMITACIONES PROPIAS INCUMPLIMIENTO DE LAS PREMISAS ERRORES COMETIDOS AL APLICAR LA LEY
Interacciones por mecanismos distintos al de absorción
Radiación no monocromática
Interacciones entre las especies absorbentes de soluto
Falta de uniformidad de la sección transversal de absorción
QUÍMICOS INSTRUMENTALES PERSONALES
Sistemas en equilibrio
E. De dimerización
E. De ácido-base
E. De complejación
Efecto del disolvente
Impurezas de los reactivos
Interferencias de la muestra
Error de lectura
Radiación parásita
Control de la temperatura
Utilización y cuidado de las cubetas de absorción
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Limitaciones propias de la ley de BeerLa ley de Beer describe de forma correcta el comportamiento de absorción de un medio que contiene concentraciones de analito relativamente bajas; en este sentido, es una ley limite
A concentraciones altas (generalmente > 0,01 M), la distancia media entre las moleculas responsables de la absorción disminuye hasta el punto en que cada molécula altera la distribución de carga de las molecular vecinas
Esta interacción, a su vez, puede alterar la capacidad de las moléculas para absorber la radiación de una determinada λ
Como, la magnitud de la interacción depende de la concentración, la aparición de este fenómeno da lugar a desviaciones de la linealidad entre la absorbancia y la concentración
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Limitaciones propias de la ley de Beer
Un efecto similar se encuentra, a veces, en medios que contienenconcentraciones de absorbente bajas pero concentraciones altas de otras especies, especialmente electrolitos
La estrecha proximidad de los iones al absorbente altera la absortividadmolar de este por interacciones electrostáticas; el efecto se reduce mediante dilución
Aunque, normalmente, el efecto de las interacciones moleculares no es significativo para concentraciones inferiores a 0,01 M, entre ciertos iones o moleculas orgánicas grandes aparecen algunas excepciones.
La absortividad del color del azul de metileno en disolución acuosa a 436 nm aumenta un 88 % cuando la concentración del colorante aumenta de 10-5 a 10-2 M; incluso por debajo de 10-6 M no se observa un cumplimiento estricto de la ley de Beer
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Otras limitaciones propias de la ley de Beer
También surgen desviaciones de la ley de Beer como consecuencia de la dependencia de ε del índice de refracción del medio
Si los cambios de la concentración causan alteraciones significativas en el índice de refracción de una disolución, se observan desviaciones de la ley de Beer
Para este efecto puede hacerse una corrección mediante la sustitución de ε por la cantidad εn/(n2 + 2)2 en
En general, esta corrección nunca es muy grande y rara vez es significativa para concentraciones menores de 0,01 M.
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Desviaciones químicas de la ley de Beer
Cuando un analito se disocia, se asocia o reacciona con un disolvente para dar lugar a un producto con un espectro de absorción diferente al del analito, se producen desviaciones de la ley de Beer
Las disoluciones acuosas de los indicadores acido/base son un ejemplo característico de este comportamiento
El cambio de color asociado con un indicador típico HIn se produce como consecuencia de los cambios en el equilibrio
HIn → H+ + In-
color 1 (λ1; ε 1) color 2(λ2; ε2)
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Desviaciones químicas de la ley de Beer
La ley de Beer no se cumple, al menos que el pH sea constante, o se opere a la longitud de onda del punto isosbéstico, esto es, la λ a la cual las dos especies absorbentes en equilibrio presenten la misma ε
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Ejemplo-parte 1Se determinaron las absortividades molares a 430 y 570 nmdel acido debil HIn (Ka = 1,42 x 10-5) y de su base conjugada In- mediante medidas de disoluciones del indicador en medios fuertemente ácidos y fuertemente básicos
Bajo estas condiciones, prácticamente todo el indicador se encontrara como HIn e In-, respectivamente
Los resultados fueron:
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Calcular los datos de absorbancia para las disoluciones no tamponadascuyas concentraciones totales de indicador están comprendidas entre 2 x 10-5 y 16 x 10-5 M
Concentraciones molares de las dos especies [HIn] e [In-] en una disolución donde la concentración total de indicador es 2,00 x 10-5 M
HIn = H+ + In-
Ka = 1,42 x 10-5 = [H+][In-]/[HIn]
considerando que [H+] = [In-]
Además, la suma de las concentraciones de las dos especies del indicador debe ser igual a la concentración analítica molar total del indicador
Por tanto, [In-] + [HIn] = 2,00 x 10-5
Sustituyendo estas ecuaciones en la expresión para el calculo de K, obtenemos [In-]2/(2,00 x 10-5 – [In-]) = 1,42 x 10-5
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Reordenando los términos obtenemos la expresión cuadrática[In-]2 + 1,42 x 10-5 [In-] - 2,84 x 10-10 = 0
La solución positiva de esta ecuación es [In-]=1,12x 10-5; [HIn] = 2,00 x 10-5 - 1,12 x 10-5 = 0,88 x 10-5
Ahora estamos en condiciones de calcular la absorbancia a las dos longitudes de onda. De esta manera, sustituyendo en la ecuación de adición de las absorbancias
A = εInb[In- ] + εHInb[HIn]
A430 = 2,06 x 104 x 1,00 x 1,12 x 10-5 +6,30 x 102 x 1,00 x 0,88 x 10-5= 0,236
A 570 nm, A570 = 0,073
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Otras limitaciones
DimerizacionesCuando una disolución de dicromato potásico no tamponada se diluye se produce una transformación parcial en cromato, como consecuencia del equilibrio dímero-monómero existente en este compuesto
ComplejosCuando se mide la absorbancia de un complejo, por ejemplo, Fe(SCN)6
3- para que se cumpla la ley de Beer hay que mantener constante la concentración de ligando libre, lo cual se consigue frecuentemente operando en gran exceso de ligando respecto al metal
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Datos en relación a las desviaciones químicas de la ley de Beer
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Desviaciones instrumentales originadas por la radiación policromática
El cumplimiento estricto de la ley de Beer sólo se observa cuando la radiación es realmente monocromática
Esto constituye otra manifestación del carácter límite de la ley
Desafortunadamente, en la practica es difícil la aplicación de una sola λ debido a que los dispositivos generan una banda de λs mas o menos simétrica en torno a la deseada
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Expresión de la ley de Beer en presencia de radiación policromática
Considemos un haz formado solo por dos longitudes de onda λ’ y λ’’. Asumiendo que la ley de Beer se aplica estrictamente para cada una de estas longitudes de onda, podemos escribir para la radiación λ’
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Cuando la medida de la absorbancia se realiza utilizando una radiación compuestapor ambas longitudes de onda, la potencia del haz emergente de la disoluciónviene dada por P’ + P" y la del haz del disolvente por P0
’ + P0’’. Por tanto, la medida
de la absorbancia Am
Sustituyendo por P’ y P’’ se convierte en
Ahora bien cuando ε’ = ε’’
Y se cumple la ley de Beer
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Sin embargo, la relación entre A y la concentración deja de ser lineal cuando las absortividades molares difieren entre si
La mayor desviación de la linealidad será mayor cuando lo sea la diferencia entre ε’ y ε’’.
El mismo efecto se produciría al incluir longitudes de onda adicionales
Es un hecho experimental que las desviaciones de la ley de Beer de un haz policromático no son apreciables, si la radiación utilizada no abarca una región del espectro en la cual el absorbente muestre cambios grandes en la absorción en función de la longitud de onda
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Desviaciones de la Ley de Beer
También se ha observado experimentalmente que las medidas de absorbancia en el máximo de los picos estrechos hace que la desviación de la ley de Beer no sea significativa si la anchura de banda efectiva del monocromador o filtro es menor de 1/10 de la mitad de la anchura del pico de absorción en la semialtura
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Ruido instrumental como función de la transmitancia
Una medida espectrofotométrica lleva consigo tres etapas: ajuste del 0 % de transmitanciaajuste del 100 % de transmitanciamedida del porcentaje de T cuando se sitúa la muestra en la trayectoria de la radiación
El ruido asociado a cada una de estas etapas se combina para daruna incertidumbre neta en el valor final de T obtenido
La relación entre el ruido encontrado en la medida de T y la incertidumbre en la medida de la concentración puede deducirse escribiendo la ley de Beer de la siguiente forma
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Para relacionar la desviación estándar de la concentración σc, con la desviación estándar de la transmitancia σT se procede tomando la derivada parcial de esta ecuación con respecto a T, manteniendo b y ε constantes. Es decir
σ2x= (δx/δp)2 σp
2 + (δx/δq)2 σq2 + (δx/δr)2 σr
2 + …
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Dividiendo la ecuación anterior
por el cuadrado de
Se obtiene(σc/c)2 = (σT/T lnT)2
σc/c = σT/T lnT = 0,434 σT/T logT
Para un número limitado de medidas se reemplaza la desviación estándar de la población σc y σT, por la desviación estándar de la muestra sc y sT, y se obtiene:
sc/c = 0,434 sT/T logT
Esta ecuación relaciona la desviación estándar relativa de c (sc/c) con la desviación estándar absoluta de la medida de transmitancia (sT).
Experimentalmente, sT puede evaluarse haciendo, por ejemplo, 20 replicados de la medida de transmitancia (n = 20) de una disolución repitiendo las medidas exactamente de la misma forma
Al examinar la Ecuación de incertidumbre en la medida de la transmitancia, vemos que la incertidumbre en la medida fotométrica de la concentración varia de forma no lineal con la magnitud de la transmitancia.
La situación es algo mas complicada, porque sT depende en numerosas ocasiones también de T
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Debido a la relación logarítmica entre T y A, la precisión de la medida de la concentración difiere según el intervalo de absorbancia que se estémidiendo:
Vamos a suponer que el error relativo en la medida de T es ± 0,5% para todos los valores de T entre 0 y 1
Esto es un error relativo de 0,005 para T
El error relativo en A disminuye de forma continua de mayores a menores valores de A (este error se calcula mediante una expresión matemática).
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El error relativo en la absorbancia, es la medida de nuestra precisión analítica
A bajas concentraciones, 90% T(A = 0,045), y a concentraciones relativamente altas, <2% T(A > 1,70), el error relativo es mayor del 5%
Claramente, en estas condiciones la medida es menos precisa que en otros intervalos
El intervalo en el que el error relativo para los resultados es más pequeño se encuentra en valores de absorbancia entre 0,4-0,7 ó20-60% T
En otras palabras, para alcanzar la mayor precisión en un experimento de absorción, la concentración de la muestra o la longitud del paso óptico a través de la muestra se deberían ajustar, si es posible, a aquella en la que la absorbancia a la salida del instrumento esté en el intervalo de 0,4-0,7
En la práctica, el error en T no es constante a lo largo de todo el intervalo, y cada instrumento tiene sus propias características %T
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Otra forma de interpretar que el error fotométrico es menor entre valores de absorbancia de 0,4 a 0,7 es considerar que:
si la absorbancia es baja, la potencia radiante que atraviesa lamuestra es análoga a la que atraviesa el blanco, y
la incertidumbre de medida relativa a la diferencia de estos dosnúmeros sería grande al comparar intensidades parecidas
Por el contrario si la absorbancia es muy alta llega poca radiación al detector y
disminuye la relación señal-ruido
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Efecto de la anchura de la rendija en las medidas de absorbancia
Para conseguir espectros complejos bien resueltos se requieren anchuras de rendija estrechas.
Se ha obtenido el espectro de T de un cristal de didimio con un ajuste de la rendija que proporciono anchuras de banda efectivas de 0,5; 9 y 20 nm
La perdida progresiva de los detalles espectrales es clara. Para estudios cualitativos, tales perdidas son, con frecuencia, de gran importancia
Un segundo efecto de la anchura de la rendija sobre los espectros compuestos por picos estrechos
Se utiliza el espectro de una disolución de cloruro de praseodimio con rendijas ajustables a 1,0; 0,5 y 0,1 mm
Los valores de absorbancia aumentan significativamente (hasta un 70 por 100 en uno de los casos) cuando la anchura de la rendija disminuye
Para ajustes de la rendija menores de aproximadamente 0,14 mm, las absorbancias eran independientes de la anchura de la rendija
Las áreas bajo los picos individuales son las mismas, pero anchuras de rendija elevadas dan lugar a picos mas anchos y mas bajos
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La medida cuantitativa de las bandas de absorción estrechas requieren el uso de anchuras de rendija estrechas o, alternativamente, ajustes de anchura de rendija muy reproducibles
Una disminución en la anchura de rendija va acompañada por una reducción exponencial de segundo orden en la energía radiante; cuando se usan ajustes muy estrechos pueden perderse detalles espectrales como consecuencia de un aumento en la relación señal/ruido
Esta situación se hace particularmente importante en las regiones espectrales en las cuales la señal de salida de la fuente o la sensibilidad del detector son bajas
El ruido, puede originar una pérdida parcial o total de la estructura fina del espectro
En general, desde el punto de vista práctico, es aconsejable no estrechar la rendija más de lo necesario
Generalmente, se observan alturas de pico constantes cuando la anchura de banda efectiva del instrumento es 0,1 mm ó inferior a la anchura de banda efectiva del pico de absorción
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Efecto de la radiación dispersada. Longitudes de onda extremas de un instrumento
La radiación dispersa puede causar desviaciones instrumentales de la leyde BeerCuando las medidas se realizan a las λ extremas de un instrumento, losefectos de la radiación parasita pueden ser más importantesEn ocasiones pueden llevar a la aparición de falsos picos de absorción
Ejemplo:Consideremos un espectrofotometro que trabaja en la región visible equipado con óptica de vidrio, fuente de wolframio y célula fotovoltaica como detectorA longitudes de onda inferiores a 380 nm, las ventanas, cubetas y prisma comienzan a absorber radiación, reduciendo así la energía que llega al detectorLa señal de salida de la fuente también desciende rápidamente en esta región; la sensibilidad del dispositivo fotoeléctrico también disminuyeComo consecuencia de ello la señal total para el ajuste del 100 % de T puede ser tan baja como el 1 ó 2 % de la señal correspondiente a la región comprendida entre 500 y 650 nm
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Intensidad de la radiación emitida por las fuentes típicas en la zona UV-visible
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Efecto de la radiación dispersada. Longitudes de onda de mayor sensibilidadde un instrumento
Cuando la radiación dispersa está constituida por λ a las cuales el instrumento es muy sensible, el efecto de la radiación dispersa puede ser muy importante
En algunos casos, la señal de salida producida por la radiación parasita puede exceder a la del haz que procede del monocromador
En estos casos la absorbancia medida procede tanto de la radiación parasita como de la radiación que se ha seleccionado en el instrumento
Ejemplo de la aparición de un falso pico a las longitudes extremas de un espectrofotómetro de la región visible
El espectro B corresponde a un dispositivo con óptica de cuarzo
El espectro A (correspondiente a un espectrofotómetro sencillo) muestra un falso pico por el efecto de la radiación dispersa correspondiente a λ > 400 nm, que no son absorbidas por el cromóforo (cerio (IV))
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Cómo se aplica y se utiliza la espectroscopía UV-visible
LA MAGNITUD DE LAS ABSORTIVIDADES MOLARES
Empíricamente, en espectrometría de absorción molecular ultravioleta y visible se observan ε desde cero hasta 105
Para un pico particular, la magnitud de ε depende de la sección transversal de captura de las especies y de la probabilidad de que tenga lugar una transición al absorber energía. Se ha demostrado que la relación entre ε y estas variables es
ε = 8,7 x 10-19 P A
Siendo P la probabilidad de que se produzca la transición y A el área de la sección transversal de la molécula en centímetros cuadrados.
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Cómo se aplica y se utiliza la espectroscopía UV-visible
Para las transiciones permitidas según la mecánica cuántica que dan lugar a bandas de absorción intensas (ε= 104 a 105 ), los valores de P están comprendidos entre 0,1 y 1
Los picos que tienen ε < 103 se clasifican como de baja intensidad
Son el resultado de las llamadas transiciones prohibidas, que tienen una probabilidad de inferior a 0,01
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Especies absorbentes. CromóforosLa absorción de radiación UV-vis por una especie atómica o molecular M se puede considerar como un proceso en dos etapas:
1) Excitación electrónica como se muestra en la ecuaciónM + hv → M*
El producto de la reacción entre M y el fotón hv es una especie excitada electrónicamente simbolizada por M*. El tiempo de vida de la especie excitada es breve (10-8 a 10-9 s), produciéndose distintos proceso de relajación.
2) Relajación en especial la conversión de esa energía de excitación en calor
M * M + calor
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Otras formas de relajación molecular
La relajación puede producirse también por la descomposicion de M* para dar lugar a nuevas especies; dicho proceso se denomina reacción fotoquímica.
Otros casos la relajación puede suponer la reemisión de fluorescencia o fosforescencia.
Es importante destacar que el tiempo de vida de M* es generalmente, muy pequeño y su concentración en cualquier momento es despreciable.
Además, la cantidad de energía térmica desarrollada en la relajación no es, habitualmente, detectable. Por ello, en las medidas de absorción crean una mínima perturbación del sistema en estudio excepto cuando tiene lugar la descomposición fotoquímica.
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Otras formas de relajación molecular
La absorción de radiación ultravioleta o visible resulta, generalmente, de la excitación de los electrones de enlace; como consecuencia, los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces de las especies objeto de estudio.
La espectroscopia de absorción molecular es, por tanto, válida para identificar grupos funcionales en una molécula.
Son importantes las aplicaciones de la espectroscopia de absorción ultravioleta y visible en la determinación cuantitativa de compuestos que contienen determinados grupos absorbentes.
Podemos citar tres tipos de transiciones electrónicas de interés en UV-visible:
(1) electrones σ, π y n(2) eleclrones d y f(3) electrones de transferencia de carga
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Especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n
Las especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n son fundamentalmente iones y moléculas orgánicas, así como algunos aniones inorgánicos. Consideraremos especialmente las primeras.
Todos los compuestos orgánicos son capaces de absorber radiación electromagnética por sus enlaces de tipo σ.
La energía de excitación asociada a los electrones que constituyen la mayoría de los enlaces sencillos es lo suficientemente alta para que su absorción quede restringida a la región ultravioleta de vació(λ < 185 nm), donde también absorben los componentes de la atmósfera.
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Especies absorbentes que contienen electrones σ, π y n
Las dificultades experimentales asociadas con el ultravioleta de vacío son muy importantes, por ello, la mayoría de los estudios de compuestos orgánicos se llevan a cabo a longitudes de onda superiores a 185 nm.
La absorción de radiación visible y ultravioleta de longitud de onda más larga están no obstante restringida a un numero limitado de grupos funcionales (cromóforos) que contienen electrones de valencia con energías de excitación relativamente bajas.
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Tipos de electrones absorbentesLos electrones que contribuyen a la absorción en una molécula orgánica son:
(1) enlazantes, que participan directamente en la formación de enlaces entre átomos, asociándose con más de uno de ellos(2) no enlazantes o electrones que no participan en ningún enlace que están en gran parte localizados alrededor de átomos como oxigeno, halógenos, azufre y nitrógeno
Los O.M. son el resultado del solapamiento de O.A. Cuando se combinan 2 O.A se origina 1 O.M. enlazante (baja energía) y otro antienlazante (alta energía)
Los orbitales moleculares asociados con los enlaces sencillos, en las moléculas orgánicas, se denominan orbitales sigma (σ), y los electrones correspondientes son electrones σ.
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(c) orbital π (d) orbital π*
Tipos de electrones absorbentes
La distribución de la densidad de carga de un orbital sigma es rotacionalmente simétrica alrededor del eje del enlace.
El doble enlace en una molécula orgánica contiene dos tipos de orbitales moleculares: un orbital sigma (σ) correspondiente a un par de electrones enlazantes y un orbital molecular pi (π) asociado con el otro par.
Los orbitales π se forman por el solapamiento paralelo de orbitales atómicos p. Su distribution de carga se caracteriza por un planonodal a lo largo del eje del enlace y una densidad máxima en las regiones superior e inferior al plano
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Muchas moléculas orgánicas contienen electrones no enlazantes. Estos electrones, se designan con el símbolo n. La energía para los distintos tipos de orbitales moleculares difiere significativamente. El nivel de energía de un electrón no enlazante se encuentra entre niveles de energía de los orbitales π y σ enlazantes y antienlazantes. Las transiciones electrónicas entre los distintos niveles de energía, son posible cuatro tipos de transiciones
σ→σ* n→σ * n→π* π→π*
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Transiciones σ→σ*. Poseen una energía asociada muy elevada, y origina bandas de absorción en el UV de vacío. Por ellos no tienen interés práctico y no se le dedica atención en análisis
Transiciones n→σ * . Los compuestos saturados que contienen pares de electrones no compartidos (electrones no enlazantes). En general, estas transiciones requieren menos energía que las del tipo σ→σ* y originan absorciones en la región comprendida entre 150 y 250 nm, apareciendo, la mayoría de los picos de absorción, por debajo de 200 nm.
La Tabla 14-1 muestra los datos de absorción de algunas transiciones n→σ * características.
Los requerimientos energéticos para dichas transiciones dependen fundamentalmente del tipo de enlace y en menor medida de la estructura de la molécula.
Las absortividades molares se encuentran entre 100 y 3000 l mol-1 cm-1
Los máximos de absorción tienden a desplazarse a longitudes de onda más cortas en presencia de disolvente polares como agua o etanol
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Transiciones n π* y π π*
Las transiciones al estado n,π* son generalmente bajas y normalmente las ε se encuentran entre 10 y 100 l mol-1 cm-1
las transiciones π,π* poseen valores ente 1000 y 10000 l mol-1 cm-1.
Otra diferencia característica entre los dos tipos de transiciones es:
Los picos asociados a transiciones n,π* se desplazan a longitudes de onda más cortas (desplazamiento hipsocrómico o hacia el azul), cuando aumenta la polaridad del disolvente
Los picos asociados a transiciones π,π* se desplazan a longitudes de ondas más largas (desplazamiento batocrómico, hacia el rojo)
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Transiciones n π* y π π*
El efecto hipsocromico surge de una mayor solvatación del par de electrones no enlazantes que disminuye la energía del orbital n salto mayor mayor ε λ corta
Los efectos de este tipo más intenso (desplazamiento hacia el azul de 30 nm o más) se observan con disolventes polares próticos, como agua o alcohol, en los cuales es frecuente la formación de enlaces de hidrógeno entre los protones del disolvente y el par de electrones no enlazantes
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Cromóforos orgánicos
Los máximos permiten la identificación de grupos funcionales, pero esta identificación es difícil (efecto del disolvente, etc)
Efecto de la conjugación de los cromóforos
En la teoría de los orbitales moleculares, se considera que los electrones π están deslocalizados por conjugación
El efecto de esta deslocalización es el descenso del nivel de energía del orbital π*, dotándole de menos carácter antienlazante.
Como consecuencia, los máximos de absorción se desplazan hacia longitudes de onda mas largas (menor energía y mayor λ).
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Cromóforos orgánicosComo se ve en la Tabla la absorción de los multicromóforos en una molécula orgánica sencilla, es aproximadamente aditiva.
Olefina-diolefina: aumenta ε porque la probabilidad es mayor (mas dobles enlaces) pero no λ si no está conjugada
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Cromóforos orgánicos
El 1,3-butadieno, CH2=CHCH=CH2, tiene una banda de absorción intensa que se desplaza 20 nm hacia longitudes de onda mas largas si se compara con el pico correspondiente a un dieno no conjugado
Cuando los dobles enlaces conjugados son tres, el efecto batocrómico es aún mayor
La conjugación de cromóforos tiene un profundo efecto sobre las propiedades espectrales.
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Efecto de la conjugación
La conjugación entre el doble enlace del oxígeno de los aldehídos, cetonas y ácidos carboxílicos y un doble enlace olefínico da lugar a un comportamiento similar
Para los aldehídos y cetonas α, β- insaturados, el débil pico de absorción correspondiente a las transiciones n, π* se desplaza40 nm o más hacia longitudes de onda más largas.
Además, aparece un pico de absorción intenso correspondiente a la transición π, π*.
69
A medida que aumenta la
conjugación, el sistema absorbe a λ mayores , o sea
más hacia el visible
70
A mayor conjugación de sistemas aromáticos la absorción se desplaza al visible
Este compuesto es
de color anaranjado
71
Características de absorción de algunos cromóferos comunes
72
Absorción de sistemas aromáticosLos espectros UV de los hidrocarburos aromáticos se caracterizan por tres grupos de bandas cuyo origen son las transiciones π→π*.
Por ejemplo, el benceno presenta un pico de absorción intenso a 184 nm (εmax = 60.000), una banda debil, llamada banda E2 a 204 nm (εmax = 7.900) y un pico aun mas debil, denominado banda B, a 256 nm (εmax = 200).
Las bandas de las longitudes de onda largas del espectro del vapor de benceno, y de muchos otros compuestos aromaticos contienen una serie de picos agudos que se deben a la superposicionde las transiciones vibracionales sobre las transiciones electrónicas básicas.
Los disolventes tienden a reducir (o eliminar) esta estructura fina como lo hacen ciertos tipos de sustitución.
Espectro de absorción de la 1,2,4,5-tetrazina
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Las tres bandas características del benceno se ven muy afectadas por la sustitución del anillo
Los efectos sobre las bandas de las dos longitudes de onda mas largas tienen un interés especial porque pueden estudiarse con un equipoespectrofotométrico común
Por definición, un auxocromo es un grupo funcional que no absorbe en la región ultravioleta pero que tiene el efecto de desplazar los picos del cromóforo hacia longitudes de onda más largas, así como de incrementar sus intensidades.
74
Los grupos –OH y -NH2 tienen un efecto auxocrómico sobre el cromóforo benceno, particularmente en relación con la banda B.
Los sustituyentes auxocrómicos tienen al menos, un par de electrones n capaces de interaccionar con los electrones π del anillo. Esta interacción tiene, aparentemente, el efecto de estabilizar el estado π*, disminuyendo, de ese modo, su energía (aumentando la λ y la absortividad molar)
El resultado es un desplazamiento batocrómico.
75
Además, el efecto auxocrómico es más pronunciado para el anión fenolato que para el propio fenol, probablemente debido a que el anion tiene un par extra de electrones no compartidos que contribuyen en la interaccion.
Por otra parte, con la anilina, los electrones no enlazantesse han perdido al formarse el cation anilinio, y, como consecuencia el efecto auxocromico desaparece.
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Absorción por aniones inorgánicos
Algunos aniones inorgánicos presentan picos de absorción ultravioleta que son consecuencia de las transiciones n π*.
Como ejemplos se incluyen los iones nitrato (313 nm), carbonato (217 nm), nitrito (360 y 280 nm), azida (230 nm) y tritiocarbonato(500 nm).
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ABSORCIÓN EN LA QUE PARTICIPAN ELECTRONES d y f
La mayoría de los iones de los metales de transición absorben en la región ultravioleta o visible del espectro.
Para la serie de lantánidos y actínidos, los procesos de absorción son el resultado de transiciones electrónicas de los electrones 4f y 5 f;
Para los elementos de la 1ª y 2ª serie de los metales de transición, los electrones responsables son los 3d y 4d.
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Absorción por iones lantánidos y actínidos
Los iones de la mayoría de los elementos lantánidos y actínidos absorben en las regiones ultravioleta y visible.
A diferencia del comportamiento de la mayoría de los absorbentes inorgánicos y orgánicos:
sus espectros están formados por picos de absorción característicos, bien definidos y estrechos,
se ven muy poco afectados por el tipo de ligando asociado con el ion metálico.
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Absorción por iones lantánidos y actínidos
Espectros característicos de cuatro lantánidos
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
Los iones y complejos de los 18 elementos de la 1ªde las dos series de transición tienden a absorber radiación visible en todos sus estados de oxidación.
Las bandas de absorción son, con frecuencia, anchas
Están enormemente influenciadas por los factores químicos del entorno.
Ej. del efecto del entorno se encuentra en el color azul pálido del ion cobre (II) acuoso y el color azul, mucho más oscuro, del complejo del cobre con amoníaco.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
82
Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
La serie de los metales de transición se caracteriza por tener cinco orbitales d parcialmente ocupados (3d en la primera serie y 4d en la segunda), cada uno de ellos capaces de alojar a un par de electrones.
Las características espectrales de los metales de transición suponen transiciones entre los distintos niveles de energía de estos orbitales d.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
Se han propuesto dos teorías (campo cristalino y campo ligando) para explicar los colores de los iones de los metales de transición y la profunda influencia del entorno químico sobre estos colores.
La teoría del campo cristalino, es la más sencilla de las dos teorías y es adecuada para una comprensión cualitativa. Sin embargo, el tratamiento, más complejo, de los orbitales moleculares, proporciona un tratamiento cuantitativo del fenómeno más adecuado.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
Premisa común: las energías de los orbitales d de los iones de los metales de transición en disolución no son iguales
la absorción supone la transición de los electrones de un orbital d de menor energía a otro de mayor energía.
en ausencia de un campo eléctrico o magnético externo (como en el estado gaseoso diluido), las energías de los cinco orbitales d son idénticas y, un electrón, para pasar de un orbital a otro, no necesita absorber radiación.
cuando tiene lugar la formación de un complejo en disolución entre el ionmetálico y el agua o algún otro ligando, surge el desdoblamiento de las energías de los orbitales d. Este efecto se debe a las diferentes fuerzas de repulsión electrostáticas entre el par de electrones del donador y los electrones en los distintos orbitales d del ion metálico central.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
Distribución de la densidad electrónica en los cinco orbitales d
Densidades electrónicas dirigidas a lo largo de los ejes
Ocupan los espacios entre los tres ejes densidad electrónica mínima a lo largo de los ejes y máxima en la diagonal entre los ejes
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
Consideremos ahora un ion de un metal de transición unido por enlaces de coordinación a seis moléculas de agua, los ligandos están distribuidos de forma simétrica alrededor del átomo central, cada ligando localizado al final de los tres ejes la estructura octaédrica resultante es la orientación más común para los complejos de los metales de transición.
Los extremos negativos de los dipolos del agua están orientados hacia el ion metálico y los campos eléctricos de estos dipolos tienden a ejercer un efecto repulsivo sobre todos los orbitales d, de este modo aumentan su energía los orbitales han sidodesestabilizados.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transiciónLa densidad de carga máxima de los orbitales dz2 está situada a lo largo de los ejes de unión. El campo negativo de un ligando unido tiene además un efecto mayor sobre este orbital que sobre los orbitales dxy, dxz y dyz, cuyas densidades de carga no coinciden con los ejes de unión.
Estos últimos orbitales se desestabilizarán de la misma forma, puesto que difieren uno de otro sólo en lo que respecta a la orientación.
El efecto del campo eléctrico sobre los orbitales dx2-y2, es menos obvio, pero cálculos cuánticos han demostrado que estáigualmente desestabilizado que el orbital dz2.
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transiciónAsí, el diagrama de niveles de energía para la configuración octaédrica muestra que las energías de todos los orbitales d aumentan en presencia de un campo ligando, pero, además, que los orbitales d se desdoblan en niveles que difieren en un ∆ de energía
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Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
En los diagramas de energía para complejos con cuatro enlaces coordinados:
Configuración tetraédrica, en la que los cuatro grupos se distribuyen simétricamente en el espacio alrededor del ionmetálico,
Configuración plano cuadrada, en la que los cuatro ligandos se encuentran en el mismo plano que el ion metálico y equidistantes al mismo.
Los modelos de desdoblamiento de los orbitales d correspondientes a cada configuración se pueden deducir a partir de argumentos similares a los utilizados en la estructura octaédrica.
90
Absorción por los elementos de la 1ª y la 2ª serie de los metales de transición
La magnitud del ∆ depende de varios factores, que incluyen la carga del ion metálico y la posición del elemento en el sistema periódico.
Una variable importante atribuible al ligando es la fuerza del campo ligando, que es una medida de la intensidad con que un grupo complejante desdoblará la energía de los electrones d;
Es posible ordenar los ligandos más comunes en orden creciente de fuerzas del campo ligando (menor radio-volumen):
I- < Br - < Cl- < F- < OH- < C2O42- ~ H2O < SCN- < NH3 <
etilendiamina < o-fenantrolina < NO-2<CN-.
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ABSORCIÓN POR TRANSFERENCIA DE CARGA
Desde el punto de vista analítico, las especies que presentan absorción por transferencia de carga tienen particular importancia, ya que sus absortividades molares son muy altas (εmáx > 10.000). Así, estos complejos proporcionan una sensibilidad muy elevada para la detección y determinación de especies absorbentes.Muchos complejos inorgánicos presentan
absorción por transferencia de carga y por ello se llaman complejos de transferencia de carga. Ejemplos:
complejos fenólicos y complejos de tiocianato con el hierro(III)complejo de o-fenantrolina de hierro(II)complejo yodo-yoduro coloreado con almidón (I3- )complejo ferro/ferricianuro responsable del color azul de Prusia.
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ABSORCIÓN POR TRANSFERENCIA DE CARGA
Para que un complejo presente un espectro de transferencia de carga, es necesario que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y el otro componente tenga propiedades de aceptor de electrones
La absorción de la radiación implica, entonces, la transferencia de un electrón desde el dador hasta un orbital que está en gran parte asociado con el aceptor
Como consecuencia, el estado excitado es el resultado de un proceso tipo oxidación/reducción interno. Este comportamiento difiere del de un cromóforo orgánico, donde el electrón, en el estado excitado, está en un orbital molecular formado por dos o más átomos
En el ejemplo del complejo hierro(III)/tiocianato. La absorción de un fotón da lugar a la transferencia de un electrón del ion tiocianato a un orbital asociado con el hierro(III). El producto es, por tanto, una especie excitada formada predominantemente por el ion hierro(II) y el radical neutro tiocianato SCN
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ABSORCIÓN POR TRANSFERENCIA DE CARGA
Como en otros tipos de excitación electrónica, el electrón, bajo condiciones normales, tras un breve período, vuelve a su estado original
Sin embargo, ocasionalmente, puede tener lugar la disociación del complejo excitado, originando productos de oxidación/reducción fotoquímica
En la mayoría de los complejos de transferencia de carga que incluyen un ion metálico, el metal actúa como aceptor de electrones
Una excepción es el complejo de ortofenantrolina con el hierro(II) o el cobre(I), donde el ligando es el aceptor y el ion metálico es el dador.
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Complejos de transferencia de carga con compuestos orgánicos
La quinhidrona (complejo 1:1 de quinona e hidroquinona), que muestra una fuerte absorción en la región visible.
Los complejos de yodo con aminas, compuestos aromáticos y sulfuros.
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ANÁLISIS CUALITATIVOLas aplicaciones de la espectrofotometría ultravioleta y visible en el análisis cualitativo son limitadas, ya que el número de máximos y mínimos de absorción correspondiente a una molécula es relativamente pequeño.
Por tanto, una identificación inequívoca es a menudo imposible.
MODALIDADES DE REGISTRO GRÁFICO DE DATOS ESPECTRALES
En espectroscopia molecular cualitativa existen diferentes tipos de registros espectrales.
Lo más habitual es representar en ordenadas el porcentaje de transmitancia, la absorbancia, el logaritmo de la absorbancia o la absortividad molar.
En abscisas es habitual representar la longitud de onda o el número de onda, aunque en algunas ocasiones se emplea la frecuencia.
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DisolventesAl elegir un disolvente no sólo se tiene que tener en cuenta su transparencia sino también sus posibles efectos sobre el sistema absorbente
Con bastante frecuencia, los disolventes polares como el agua, alcoholes, esteres y cetonas tienden a borrar la estructura fina del espectro que resulta de los cambios vibracionales
Es más probable obtener espectros parecidos a los originados en fase gaseosa cuando se utilizan disolventes no polares como los hidrocarburos
Las posiciones de los máximos de absorción se ven afectadas por la naturaleza del disolvente. Es imprescindible utilizar el mismo disolvente cuando se comparan espectros de absorción con fines de identificación.
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DisolventesEn la Tabla se enumeran algunos disolventes comunes y la longitud de onda aproximada por debajo de la cual no pueden usarse debido a la absorción
Este mínimo depende en gran medida de la pureza del disolvente
Entre los disolventes habituales para espectrofotometría ultravioleta se incluyen agua, etanol del 95 por 100, ciclohexano y 1,4-dioxano
Para la región visible, cualquier disolvente incoloro es útil
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Detección de grupos funcionales
Aunque la espectroscopía UV-visible no puede proporcionar la identificación inequívoca de un compuesto orgánico es útil para detectar la presencia de ciertos grupos funcionales que actúan como cromóforos.
Ejemplos:
Una banda de absorción débil en la región de 280 a 290 nm, que se desplaza hacia longitudes de onda más cortas cuando aumenta la polaridad del disolvente, indica firmemente la presencia de un grupo carbonilo.
Una banda de absorción débil próxima a 260 nm con indicios de estructura fina vibracional constituye una evidencia de la existencia de un anillo aromático.
Para confirmar la presencia de una amina aromática o de una estructura fenólica se pueden comparar los efectos del pH en los espectros de las disoluciones de la muestra (caso fenol y anilina) en el análisis cuantitativo.
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Analisis cuantitativoCaracterísticas de los métodos espectrofotométricos
Gran aplicabilidad tanto para sistemas orgánicos como inorgánicos
Sensibilidades características de 10-4 a 10-5 M
Este intervalo puede ampliarse de 10-6 a 10-7 M (con ciertas modificaciones)
Selectividad de moderada a alta
Buena precisión
Adquisición de datos fácil y rápida.
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Campo de aplicaciónEspecies absorbentes
Cromóforos orgánicosCromóforos inorgánicos
Co (II), Ni(II), Cu(II) Nitrito, nitrato y cromato; Tretróxidos de osmio y rutenio (amarillos)Yodo molecular (amarillo en medio acuoso)Ozono (azul)
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Campo de aplicaciónEspecies no absorbentes
Reactivos inorgánicos: SCN- para determinar Fe3+ (rojo), Co2+(azul)
Mo6+(amarillo, rojo en presencia de reductor)
H2O2 para determinar Ti4+(amarillo – TiO(H2O2)2+)
V5+(rojizo, ion peroxivanádico, VO22+)
Cr6+ (color azul intenso extraible en etero alcohol amílico, CrO5, dos grupos
peróxido)I- para determinar Bi3+ , Pd2+, Te4+(rojo TeI62-)
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Campo de aplicaciónEspecies no absorbentes
Reactivos orgánicos:o-fenantrolina Fe(II)Dimetilglioxima Ni(II) y Pd(II)Dietilditiocarbamato Cu(II)Ditizona (difeniltiocarbazona) Pb(II), Hg(II)
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Aspectos prácticos de las determinaciones espectrofotométricas
Es necesario establecer adecuadamente las condiciones de trabajo para qua la determinación espectrofotométrica se aplique al problema analítico que nos interese de manera adecuada.
Una vez fijadas estas condiciones de trabajo se procede a la etapa de calibrado que ya se ha comentado con anterioridad.
Selección de la longitud de onda: Las medidas se realizan normalmente en el máximo de absorción del espectro correspondiente
La variación de absorbancia con la longitud de onda en esa zona es muy pequeña y de esa forma se asegura el cumplimiento de la ley de Beer. En esta zona de medida la sensibilidad del ensayo será máximaSe asegura que la incertidumbre originada por las limitaciones de los instrumentos para reproducir con precisión la selección de la longitud de onda sea más pequeña
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Aspectos prácticos en las medidas espectrofotométricas
Selección de las condiciones del medio de reacción: Las variables más usuales que se tiene en cuenta al poner a punto un procedimiento espectrofotométrico son las siguientes:
Naturaleza del disolventepH de la disoluciónTemperaturaFuerza iónica del medio (que evalúa la presencia de otras sales en la disolución)Presencia de otras especies interferentes. Los efectos de estas variables deben conocerse y elegir las condiciones óptima para la respuesta del sistema.
Limpieza y manipulación de las cubetas: Es necesario contrastar el par de cubetas que se utilice en el análisis para detectar las diferencias que se vayan generando entre ellas como consecuencia de rozaduras, ataques con ácidos y desgaste por el uso.
Es igualmente importante el uso de técnicas de limpieza y secado adecuadas.
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Análisis de mezclas de sustancias absorbentes
La absorbancia total de una disolución, a una longitud de onda dada, es igual a la suma de las absorbancias que presentan los componentes individuales.
A’ = ε’M b cM + ε’N b cN (para λ’) A’’ = ε’’M b cM + ε’’N b cN (para λ’’)
Esta relación hace posible la determinación cuantitativa de los constituyentes individuales de una mezcla, incluso si su espectro se solapa.
Considérese, por ejemplo, los espectros de M y de N, que se muestran en la Figura.
Obsérvese que no existe ninguna longitud de onda en la cual la absorbancia de esta mezcla se deba exclusivamente a uno de los componentes; así, la determinación de M o N es imposible con una única medida
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Las cuatro absortividades molares ε’M, ε’N, ε’’M, ε’’N, pueden calcularse a partir de disoluciones estándar individuales de M y de N, o mejor, a partir de las pendientes de sus representaciones graficas de la ley dc Beer.
Las absorbancias de la mezcla A' y A", se pueden medir experimentalmente, al igual que b, el espesor de la cubeta. Así, a partir de estas dos ecuaciones, se pueden calcular fácilmente las concentraciones de los constituyentes individuales. cM y cN.
Estas relaciones son validas sólo si se cumple la ley de Beer y si los dos componentes se comportan de manera independientes el uno del otro. La mayor exactitud en un análisis de este tipo se alcanza cuando se seleccionan longitudes de onda en las que las diferencias entre las absortividades molares sean grandes.
Se pueden analizar mezclas que contengan más de dos especies absorbentes, si se hace una medida adicional de absorbancia para cada componente añadido. Sin embargo, la incertidumbre en los datos resultantes se hace mayor cuando el número de medidas aumenta.
Para los análisis se necesitan los espectros de las disoluciones patrón de cada uno de los componentes
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Espectrofotometría derivada y de longitud de onda dual
En la espectrofotometría derivada, los espectros se obtienen representando gráficamente la derivada primera o de mayor orden, de la absorbancia o de la transmitancia, con respecto a la longitud de onda, en función de la longitud de onda. A menudo estas representaciones gráficas revelan detalles espectrales que se pierden en un espectro ordinario.
A veces se pueden realizar las medidas de concentración de un analito en presencia de un interferente con más facilidad y exactitud.
Como desventaja hay que señalar una reducción en la relación señal/ruido que acompaña a la obtención de las derivadas.
En muchas zonas de las regiones ultravioleta y visible la relación señal/ruido no es un factor limitante serio; es en estas regiones donde más se utilizan los espectros derivados.
Una desventaja adicional de la espectrofotometría derivada es que, generalmente, necesita un equipo más costoso
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Dispositivos de modulación de la longitud de ondaSe han desarrollado varios procedimientos para conseguir la modulación de la longitud de onda.
En algunos de ellos, se barre un intervalo de longitudes de onda de unos pocos nanómetros rápida y repetitivamente mientras que se hace un barrido del espectro de la forma usual.
La amplitud de la señal de corriente alterna resultante en el detector es una buena aproximación de la derivada del espectro respecto de la longitud de onda. El barrido rápido repetitivo se obtiene por algún medio mecánico, como la oscilación o la vibración de un espejo, una rendija o un elemento dispersante de un monocromador
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Dispositivos de modulación de la longitud de onda-IIUn segundo esquema para la modulación, requiere el uso de un sistema dispersante doble ordenado de tal manera que dos haces de longitudes de onda ligeramente diferentes (normalmente 1 ó 2 nm) van a incidir alternativamente en una cubeta de muestra y su detector; no se utiliza haz de referencia.
El parámetro que se genera es la diferencia entre las señales alternas, que da una buena aproximación de la derivada de las absorbancias en función de la longitud de onda (∆A/∆λ).
La Figura representa un esquema de un instrumento de longitud de onda dual.
Obsérvese que la cubeta de referencia no se utiliza y la cubeta de la muestra se expone alternativamente a la radiación procedente de cada uno de los monocromadores.
Generalmente, los instrumentos de longitud de onda dual también pueden trabajar en la modalidad de longitud de onda sencilla, haciendo pasar alternativamente la radiación a través de la cubeta de referencia y de la muestra.
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Aplicaciones de los espectros derivadosMuchas de las aplicaciones más importantes de la espectroscopia derivada en las regiones ultravioleta y visible son las identificaciones cualitativas de especies, en las cuales la observación en detalle (aumentando la figura) de un espectro derivado hace posible distinguir entre compuestos que tienen espectros solapados.
La Figura ilustra la manera en que una grafica derivada puede revelar los detalles de un espectro formado por tres picos de absorción solapados.
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Aplicaciones de la espectroscopia de derivadas
La espectrofotometría de longitud de onda dual ha demostrado ser particularmente útil para la obtención de espectros de absorción ultravioleta/visible de analitos presentes en disoluciones turbias, donde la dispersión de la luz elimina los detalles de espectro de absorción.
Por ejemplo, tres aminoácidos, el triptofano, la tirosina y la fenilalanina contienen cadenas aromáticas secundarias, que presentan picos de absorción agudos en la zona de 240 a 300 nm.
Estos picos agudos no están claros en los espectros de las preparaciones de proteínas típicas, tales como la albúmina bovina o de huevo, ya que las moléculas grandes dispersan fuertemente la radiación, dando lugar sólo a un pico de absorción suave tal como el que aparece en la Figura a. La estructura fina aromática se descubre en los espectros de primera y segunda derivada, como muestran las curvas (b) y (c).
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Uso de la espectrofotometría dual para reducir interferencias
La espectrofotometría de longitud de onda dual también es útil para el análisis de un analito en presencia de una interferencia espectral.
En estos casos, el instrumento trabaja en la modalidad de no barrido, midiendo las absorbancias a dos longitudes de onda en las cuales la interferencia tiene idénticas absortividades molares, mientras que el analito absorbe con más intensidad en una de estas longitudes de onda que en la otra.
La absorbancia diferencial es directamente proporcional a la concentración del analito
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Valoraciones fotométricasLas medidas espectrofotométricas pueden utilizarse para detectar el punto final de una valoración siempre que el analito, el reactivo o el producto final de la valoración absorban radiación. En ocasiones se añade un indicador coloreado que nos marca el punto final.
Curvas de valoración
Una curva de valoración fotométrica es una representación gráfica de la absorbancia corregida por los cambio de volumen, en función del volumen de valorante.
Si se eligen las condiciones adecuadas, la curva constara de dosregiones lineales con diferentes pendientes, una se obtiene al principio de la valoración y la otra se localiza más allá de la zona del punto de equivalencia; el punto final se conoce por la intersección de los dos tramos lineales extrapolados.
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Se consideran los siguientes casos: (a) La valoración de una especie no absorbente con un valorante coloreado que origina un producto de reacción incoloro da lugar a una línea hori-zontal en las etapas iniciales, seguido de un rápido ascenso de la absorbancia pasado el punto de equivalencia (b) La formación de un producto coloreado, a partir de reactivos incoloros, produce inicialmente un aumento lineal en la absorbancia, seguido de una región en la cual la absorbancia se mantiene independiente del volumen de reactivo añadido(c) La sustancia que se valora es coloreada, pero el compuesto resultante es incoloro, así como el reactivo(d) La sustancia que se valora y el valorante absorben a la longitud de onda de medida, pero no el producto de la reacción(e) Tanto el producto de la reacción como el valorante absorben, pero con absortividades molares diferentes, siendo la del producto de la reacción menor que la del valorante. La muestra no absorbe(f) el mismo caso anterior, pero ahora εproducto de la reacción> εvalorante
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1: Analito no absorbe; reactivo titulante absorbe; producto no absorbe.
2: Analito no absorbe; reactivo titulante no absorbe; producto absorbe.
3: Analito absorbe; reactivo titulante no absorbe; producto no absorbe.
4: Analito absorbe; reactivo titulante absorbe; producto no absorbe.
5: Analito no absorbe; reactivo titulante absorbe; producto absorbe.
6: Analito no absorbe; reactivo titulante absorbe; producto absorbe.
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Condiciones de una valoración fotométrica
Con objeto de obtener un punto final fotométrico satisfactorio, es necesario:
Que el(los) sistema(s) absorbente(s) cumpla(n) la ley de Beer, de otro modo, la curva de valoración carecería de las regiones lineales necesarias para la extrapolación el punto final.
Además, como consecuencia de los cambios de volumen, es necesario corregir la absorbancia. Los valores observados se multiplican por (V + v)/V, donde V es el volumen original de la disolución y v es el volumen de valorante añadido.
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Instrumentación en las valoraciones fotométricasLas valoraciones fotométricas se realizan en un espectrofótometro o un fotómetro que se ha modificado para poder intercalar el recipiente de valoración en la trayectoria de la luz.
Como alternativa, se puede utilizar una cubeta tipo sonda.
Después de ajustar el cero de la escala de medida, se deja pasar la radiación a través de la disolución que contiene el analito y el instrumento se ajusta variando la intensidad de la fuente o la sensibilidad del detector hasta obtener una lectura de absorbancia adecuada.
No es necesario la medida de la absorbancia absoluta relacionada unívocamente con la concentración, sino la variación de la absorbancia con el valorante hasta alcanzar el punto final.
Los datos de la valoración se recogen sin modificar el ajuste del instrumento.
Normalmente se utilizan recipientes cilíndricos y se debe tener cuidado de evitar cualquier movimiento del mismo que pueda alterar la longitud del paso óptico
Para las valoraciones fotométricas se han utilizado tanto los fotómetros de filtro como los espectrofotómetros. Sin embargo, se prefieren los últimos, ya que sus anchuras de banda, más estrechas, aumentan la probabilidad de cumplimiento de la ley de Beer.
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Aplicación de las valoraciones fotométricas
Las valoraciones fotométricas proporcionan resultados más exactos que los obtenidos mediante un análisis fotométrico directo, ya que para determinar el punto final se utilizan los datos de varias medidas.
Además, la presencia de otras especies absorbentes puede no interferir, ya que solo se mide un cambio en la absorbancia.
El punto final obtenido fotométricamente utiliza medidas alejadas del punto final, por lo que las reacciones de valoración no necesitan tener constantes de equilibrio muy elevadas como ocurre en valoraciones que utilizan medidas próximas al punto de equivalencia
Por esta misma razón pueden valorarse disoluciones relativamente diluidas.
El punto final obtenido fotométricamente se ha aplicado a todo tipo de reacciones.
Muchos de los reactivos utilizados en las valoraciones de oxidación/reducción tienen espectros de absorción característicos y, de este modo, producen puntos finales detectables fotométricamente.
Los indicadores ácido/base se han utilizado para valoraciones fotométricas de neutralización.
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Ejemplo de valoración fotométricaLa valoración fotométrica se ha utilizado en las valoraciones con EDTA y con otros agentes complejantes.
En la figura se observa la valoración sucesiva de bismuto(III) y cobre(II) con AEDT.
A 745 nm, ninguno de los cationes ni el reactivo absorben, tampoco lo hace el complejo más estable del bismuto, que se forma en la primera parte de la valoración; sin embargo, si absorbe el complejo del cobre. Por tanto la disolución no presenta absorbancia hasta que todo el bismuto se ha valorado.
En el momento en que comienza a formarse el complejo de cobre tiene lugar un aumento de la absorbancia. Esta continúa aumentando hasta que se alcanza el punto de equivalencia del cobre. Lasposteriores adiciones de reactivo no producen más cambios en la absorbancia.
Se obtienen dos puntos finales bien definido
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Estructura de los ligandos fotométricos: Grupos específicos de reacción
La mayoría de los ligandos usados actualmente en fotometría son sustancias orgánicas.
No siempre es posible predecir cuando un ligando de una constitución dada ha de actuar de una manera selectiva o sensible sobre ciertos iones y solo la experiencia permite resolver estos problemas en muchos casos.
Sin embargo, se conocen las causas de determinadas propiedades selectivas y pueden establecerse unas reglas orientadoras al respecto.
La gran sensibilidad y selectividad que se consigue en la determinación fotométrica de metales mediante la formación de complejos con ligandos orgánicos estriba en que estos poseen en su molécula determinados “grupos activos” que son los que producen las fuerzas de enlace necesarias para la formación del quelato.
Es decir, deben poseer al menos dos grupos ácidos (aniónicos) o dos grupos básicos (Lewis) coordinativos o un grupo acido y otro básico.
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Grupos activos de reacciónLos grupos ácidos capaces de ceder protones pueden ser -OH (hidroxilo) -SH (mercapto) e -NH (imino) entre otros.
Pueden estar unidos directamente a la cadena hidrocarbonada como en el caso del fenol o unidos a otros átomos que a su vez se unen a la cadena formando los grupos:
Los grupos básicos de Lewis poseen átomos con pares de electrones libres para aportar a la configuración electrónica del metal. Estos átomos pueden ser S, O y N y los grupos que forman generalmente enlaces de coordinación son:
La presencia de estos grupos activos no es suficiente para asegurar la capacidad de formación de complejos de un compuesto orgánico. Estos grupos deben localizarse en la molécula en posiciones tales que al formar el complejo con el ionmetálico se originan anillos de un tamaño adecuado; los de cuatro, cinco o seis eslabones son los que confieren mayor estabilidad.
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Grupos activos de reacciónLa reactividad de estos grupos activos va dirigida a ciertos iones metálicos, por eso se les llama “grupos específicos o selectivos de reacción”.
El resto de la molécula, aunque no afecta sustancialmente a la reactividad, condiciona las propiedades del complejo, siendo de mayor importancia desde un punto de vista fotométrico el color y la solubilidad.
Por tanto, la presencia de un grupo específico de reacción no es suficiente para asegurar la selectividad de un ensayo, y en la mayoría de los casos es necesario condicionar el medio para que la reacción coloreada se produzca, fundamentalmente el pH. De ahí que es más correcto hablar de reacciones específicas o selectivas que de reactivos con estas propiedades.
En la Tabla se han recogido los grupos específicos de reacción más importantes. Desde el punto de vista fotométrico unos de los grupos específicos de reacción mas interesantes es el = N-C-C-N = (ferroina) o grupo del Fe (II) y el R-C=N-C-C-N=C-R (cuproina) o grupo del Cu (I), que dan complejos solubles que absorben a 510 nm y 480 nm, respectivamente.
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La formación de un complejo coloreado depende de la naturaleza del ligando y del ion metálico.
Para un mismo ion el color y su intensidad (sensibilidad) están condicionados por la naturaleza del ligando, es decir por la presencia de estas agrupaciones especificas y también por el resto de la molécula.
Los elementos de la serie de transición son los que fundamentalmente originan complejos coloreados dando con frecuencia bandas de transferencia de carga metal-ligando o ligando-metal, en la zona visible del espectro.
Estas bandas se hallan generalmente separadas de la zona de absorción del propio ligando (bandas asociadas a transferencia de electrones de la molécula) y su intensidad es por lo general mayor que las bandas de transición d-d, las cuales también aparecen separadas de las del ligando.
De ahí que, en las medidas fotométricas realizadas en la región espectral de las bandas de transferencia de carga, el exceso de ligando (que generalmente se añade en exceso para asegurar la formación del complejo) no interfiere en la determinación analítica. La gran absortividad molar de estas bandas permite procedimientos analíticos muy sensibles.
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Según el tipo de grupos ácidos o básicos que posea un ligando, la carga del ion metálico y la estequiometría del complejo, este tendrá o no carga y por tanto será o no soluble.
Cuando el ligando posee sólo grupos básico de Lewis (dadores de electrones) los quelatos están cargados y son solubles como los de Fe-ferroína y Cu-cuproína.
Si posee grupos ácidos que compensan las cargas del metal (de acuerdo con el número de ligandos que entran) los complejos son insolubles como el Ni-dimetilglioxima y aunque se puede extraer, no siempre reúnen buenas condiciones para la fonometría.
De ahí que con frecuencia se recurra a la introducción de grupos que confieren solubilidad tales como -OH, -COOH, -SO3H, etc.
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Grupos activos de creación
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Determinación de aniones en aguas
Nitratos y nitritos
Generalmente, el contenido de nitratos en el agua es bajo aunque puede ser apreciable en aguas que han sido contaminadas por fertilizantes de uso agrícola. Otra fuente de este anión es la lluvia ácida. A pesar de que los nitratos son nutrientes, las bacterias lo transforman en iones nitrito que son tóxicos.
La determinación de nitratos puede realizarse por espectrofotometría de absorción molecular, empleando la brucina como reactivo espectrofotométrico. El anión nitrato reacciona con brucina en medio ácido sulfúrico, formando un color rojo que cambia rápidamente a amarillo. El color amarillo es debido a un producto de oxidación de la brucina, la cacotelina. La absorbancia se mide en un espectrofotómetro a 410 nm. Interfieren los oxidantes o reductores fuertes. Los iones del hierro y el manganeso tetravalente interfieren ligeramente cuando se encuentran presentes en concentraciones superiores a 1 mg/l.
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Determinación de nitritos en aguas
La determinación de nitritos en agua se lleva a cabo mediante la diazotación (reacción de Griess) y determinación mediante espectrofotometría del producto formado.
Esta reacción se lleva a cabo en dos etapas. En la primera la sulfanilalamida (amina primaria aromática) reacciona con los nitritos en medio ácidoEn la segunda etapa, el producto se une a la N-(1-naftil)-etilen-diamina teniendo lugar la formación de un complejo coloreado púrpura adecuado para la determinación espectrofométrica de nitritos por medida de la absorbancia a la longitud de onda de 543 nm.
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Fosfatos en aguas
Los abonos inorgánicos están constituidos por diversas clases de fosfatos solubles. El fósforo se puede encontrar en las aguas como aniones meta-(PO3
-), piro- (P2O74−), ortofosfato (PO4
3−), hidrogenofosfato (HPO42-) y
polifosfatos (P3O105-). Debido a su elevada solubilidad, estos aniones son
arrastrados fácilmente por las aguas superficiales hacia ríos, acuíferos, etc.
El método más recomendado para la determinación de fosfatos consiste en la formación de fosfomolibdato (amarillo) con el reactivo vanado-molíbdico (de color amarillo y soluble en agua). Para el ortofosfato, la formación de este complejo tiene lugar según la reacción:
(PO4)3− + (VO3)− + 11(MoO4)2− + 22 H+ = P(VMo11O40)3− + 11 H2O
En esta identificación interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato y arseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la longitud de onda óptima por lo que se selecciona 420 nm.
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Método del azul de molibdenoEl método del azul de molibdeno, se basa en la reducción del complejo anterior con ácido ascórbico dando un complejo de estado de oxidación inferior [Mo(V)] de color azul intenso.
Se han propuesto muchos agentes reductores, sin embargo el ácido ascórbico es el que proporciona una mayor sensibilidad.
No obstante presenta el inconveniente de que a veces el color tarda 12 horas en desarrollarse. Se puede acelerar calentando pero hay que realizar un control estricto del tiempo, generalmente 1 min. La absorbancia se mide a 830 nm.
Existe otra alternativa que consiste en la disolución ácida en presencia de molibdato amónico (exceso), teniendo lugar la formación de un complejo de fosfomolibdato [(NH3)4(PMo12O40)] que reducido por el ácido ascórbico y en presencia de Sb desarrolla la coloración azul (azul de molibdeno) susceptible de determinación espectrofotométrica (colorimétrica) a 882 nm.
La formación de este complejo con Mo se produce porque es más estable el complejo que el ión simple, dando un compuesto de estado de oxidación menor [Mo(V)] y de coloración azul intenso. La coloración se desarrolla en tan sólo 10 minutos. La sensibilidad del método puede aumentarse extrayendo el azul de molibdeno con un disolvente
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Determinación de elementos en tejidos vegetalesBoro
La determinación de boro es importante, porque aunque el elemento es esencial a bajas concentraciones para la salud y desarrollo de las plantas, adquiere carácter tóxico para niveles ligeramente superiores. Los síntomas que señalan la deficiencia de boro se observan fundamentalmente en las raíces de las plantas, en forma de manchas pardas oscuras en su parte superior.
La determinación de boro por espectroscopia de absorción en llama no es muy sensible, y como el elemento se encuentra en niveles pequeños en los tejidos de las plantas, puede ser necesaria una etapa de preconcentración por extracción si se usa la absorción o emisión atómica con llama.
Los métodos colorimétricos son mucho más sensibles y selectivos. Uno de los más conocidos utiliza el complejo coloreado que forma con la curcumina (1,7 - bis (4 - hidroxi - 3 - metoxifenil) -1,6- heptadieno - 3, 5 -diona) en solución etanólica y en presencia de ácido oxálico.
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Azufre-problemática
En la actualidad existe un gran interés por medir el contenido de azufre de las plantas.
Las medidas tendentes a controlar la contaminación de SO2 en la atmósfera, están produciendo una disminución de los niveles de dicho gas, que antes cubría los problemas de deficiencias en las cosechas.
El problema se agrava con la adición de grandes cantidades de fertilizantes, que aportan nitrógeno, fósforo y potasio para incrementar el rendimiento de los cultivos en los que cada vez se detectan con mas frecuencia niveles excesivamente bajos de azufre. Para determinar el azufre orgánico, éste debe convertirse previamente en una forma inorgánica simple de forma cuantitativa, generalmente en sulfato.
Esta transformación se lleva a cabo por oxidación húmeda con ácido nítrico y perclórico, en el que el azufre orgánico se transforma en SO2, y luego en sulfato.
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Azufre- análisisLos sulfatos se determinan mediante turbidimetría, ya que es un método simple, rápido, sensible y selectivo.
La turbidimetría es un método de análisis basado en la medida de la absorbancia aparente de la luz, producida por su dispersión por una suspensión de las especies que se analizan, pero no tiene lugar una absorción verdadera.
En el caso del sulfato, este se convierte en una suspensión de sulfato de bario por reacción con cloruro de bario.
Se determina la turbidez producida por precipitación del sulfato de bario en medio ácido.
La precipitación se lleva a cabo en condiciones tales que se forman cristales de sulfato de bario de tamaño uniforme, que deben mantenerse en suspensión homogénea un periodo de tiempo suficiente para medir la turbidez.
Las lecturas se efectúan en el espectrofotómetro frente a blanco a 650 nm.
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Aniones de azufre
Las especies de azufre que se encuentran con mayor frecuencia en el agua son los sulfatos (SO4
2-), sulfitos (SO32-), sulfuros y tiosulfatos
(S2O32-). Su concentración no debe ser superior a 0,05 ppm.
Los iones sulfuro se determinan espectrofotométricamente por formación del azul de metileno y medida a 670 nm.
Los sulfitos y tiosulfatos se determinan mediante valoración con iodo.
Los sulfatos se determinan por turbidimetría, medida de la turbidez producida por la reacción de precipitación del ion sulfato con una sal bárica en medio ácido.
La precipitación se lleva a cabo en condiciones tales que se forman cristales de sulfato de bario de tamaño uniforme, que deben mantenerse en suspensión homogénea un periodo de tiempo suficiente para medir la turbidez. Las lecturas se efectúan en el espectrofotómetro frente a blanco a 650 nm
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Determinación de metales pesados
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UV-visible como sistema de detección en otras técnicas instrumentales
Cromatografía HPLC
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Detectores UV-visible utilizados en HPLCExisten dos tipos de detectores UV aplicables a cromatografía HPLC
Longitud de onda fijaLongitud de onda variable.
En la Fig se muestra un diagrama del primero de estos dispositivos.
El detector consta de una celda cilíndrica pequeña (de 2.0 a 100.0 μl de volumen) a través de la cuál fluye el eluyente que procede de la columna.
Una lámpara UV suministra radiación UV que pasa a través de la celda hasta alcanzar una celda fotoeléctrica.
En el caso de un dispositivo de longitud de onda fija, la longitud de onda depende del tipo de lámpara que se utilice.
Existen diversas lámparas en el comercio que proporcionan longitudes de onda de 210 nm a 280 nm. Las lámparas comerciales son las siguientes:
228.8, 326.1,340.3, y 346.6 nmLámpara de vapor de cadmio
2123.9 nm y 307.6 nmLámpara de vapor de cinc
253.7 nmLámpara de vapor de mercurio
Longitudes de onda de emisiónTipo de lámpara
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Instrumento de HPLC
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Inyector y columna
