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TEMA 18. BIOTECNOLOGÍA
• 1. ¿Qué es la Biotecnología?• 2. Microorganismos utilizados en Biotecnología.• 3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología.
– 3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.– 3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).– 3.3 Método de secuenciación de Sanger.
• 4. Industrias alimentarias• 5. Industrias químicas• 6. Industrias farmacéuticas• 7. Microorganismos y medio ambiente
1. ¿Qué es la Biotecnología?
• Biotecnología se designa un conjunto de técnicas surgidas hace poco más de dos décadas, aunque no es algo nuevo (elaboración pan, cerveza, vino, queso, …)
• En stdo amplio: uso de ssvv. para obtener o modificar producto, mejorar spp. todo con fines industriales.
• Depende de ingeniería genética, (conjunto de técnicas que permiten manipular genoma)
2. Microorganismos utilizados en Biotecnología.
• Microbiología industrial: procs. industriales para obtención de productos para el hombre usando microorg.
• 3 grupos de microorg industriales: bacterias, mohos y levaduras.
MICROORGANISMOS PRODUCTO
Saccharomyces cerevisiae (L)
Pan , cerveza, vino, etanol, bebidas destiladas (ron, brandy, whisky, ...)
Streptococcus termophilus (B)Lactobacillus
bulgaricus (B)
Yogur
Penicillium chrysogenum (M)
Penicilinas
Escherichia coli (B)Insulina, somatotropina (hormona del crecimiento)
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.• Introducir ADN foráneo en interior de cél=
tecnología del ADN recombinante, manipulación genética y clonación génica.
• Para realizar la transferencia de forma artificial:– Obtener fragmento de ADN con el gen a clonar. – Insertar dicho fragmento en moléc. ADN
apropiada=vector de clonación. – Introducir vector en célula hospedadora
(transformación de cél md vectores)– Detección y selección del gen clonado.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
– Enzimas de restricción o restrictasa: cortan ADN en fragmentos bt pequeños para ser analizados y manipulados.
• Son endonucleasas que cortan ADN extraño.• Reconocen secuencias concretas (protegidas en la bact
original ya que nucleótidos están metilados)• Pueden dar extremos romos o cohesivos (estos son los que
interesan)
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
– Fragmentos obtenidos se separan md electroforesis en función del tamaño.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
– Fragmentos obtenidos se separan md electroforesis en función del tamaño.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.• FRAGMENTACIÓN DEL ADN
Obtención del ADN de las células:- Célula procariota: no contienen intrones. Se realiza extracto celular (ruptura de céls), dp tto con alcohol (se unen todas las moléc d ADN). Finalmente se centrifugan y obtenemos gdes moléc de ADN
- Cél. Eucariota: ADN con intrones. Se obtiene ARN mensajero (buscar en tejidos dnd se sintetice mucha ctdad de prot que interesa). ARNm se usa de molde para síntesis de ADN (sin intrones) md transcriptasa inversa. Primero moléc híbrida: ARN- ADN.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.
• INSERCIÓN FRAGMENTO DE ADN EN VECTOR DE CLONACIÓN– Vector clonación: moléc pequeña de ADN,
normalmente circular, que puede autorreplicarse dentro de cél hospedadora indpete de cromosomas de ésta. Plásmidos, virus bacteriófagos, cósmidos (plásmido + fago)
– Para inserción: cortamos vector con misma enz de restricción=> presentan mismos extremos cohesivos.
– Unión: ADN ligasas. Obtenemos así el ADN recombinante.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.
• INTRODUCCIÓN ADN RECOMBINANTE EN CÉLULAS HOSPEDADORAS.– Se suele usas Escherichia coli. – Para poder detectar las cél en las que se ha
introducido el vector, marcamos los vectores usados, añadiéndole genes que les dan características fácilmente identificables. (resistencias a antibióticos)
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.1 Tecnología del ADN recombinante o clonación génica.
• DETECCIÓN Y SELECCIÓN DE CÉLULAS CON ADN CLONADO– Si gen proviene de mismo tipo de célula, se
expresará normalmente y solo hay que detectar directamente la proteína.
– Si no se puede detectar fácilmente:• Md el gen que ha incluido para detectar si se ha introducido
el vector en la cél. • Md sonda: cadena de ADN complementaria a gen clonado
marcado radiactivamente. • Anticuerpos específicos para prot codificada por el gen.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• En Biotecnología se necesitan múltiples copias de un determinado fragmento de ADN para manipularlas. Dos métodos :– Clonación génica o tecnología del ADN recombinante (que acabamos
de ver). – Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Poymerase Chain
Reaction)• PCR: ADN puede proceder de una muestra tejido de hospital, de
cabello humano, de sangre o de semen en la escena del delito, de tejido de cerebro momificado o de un mamut muerto hace 40.000 años en hielo.
• Técnica: Primero se diseñan dos oligonucleótidos sintéticos (de 18 a 30 nucleótidos) que han de ser complementarias a los dos extremos 3' de la región de ADN a amplificar. Estos oligonucleótidos serán cebadores para la replicación de cada hebra de ADN. (sólo se pueden amplificar ADN cdo se conocen los extremos)
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• 3 etapas:– Desnaturalización. El fragmento de ADN se desnaturaliza, separando las dos
hebras, para ello calentar ADN entre 68 -95ºC.– Templado o hibridación. A continuación enfriamiento rápido (entre 37 y 65ºC)
que permite la hibridación de cada hebra con un oligonucleótido– Elongación o replicación. ADN polimerasa elonga los cebadores, empleando
como molde ambas hebras. La replicación sentido 5'→3' a partir del extremo 3' de cada cebador, empleando como sustrato los 4 dNTPs, hasta terminar la lectura del molde o hasta que comience una nueva etapa de desnaturalización (siguiente ciclo).
• Para conseguir una amplificación sucesión de ciclos de desnaturalización, hibridación y replicación (entre 20 y 40). Hoy en día se realiza de forma automática mediante instrumentos especializados (termocicladores).
• Se utiliza la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en aguas termales, por lo que todas sus enzimas, incluidas las ADN polimerasas, son funcionales a temperaturas muy elevadas. (no se desnaturalizan) Taq polimerasa, es estable hasta 95º C.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología
3.2 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología3.3 Método de secuenciación de Sanger.
• Determinación de la secuencia de nucleótidos de un ADN. • Hasta los años 70 difícil y costoso secuenciar incluso fragmentos de
sólo 5 a 10 nucleótidos. Primero fue el método químico de Maxan y Gilbert (1977), y después el método enzimático de Sanger (1980).
• Tienen en común algunos aspectos, – Utilización de fragmentos del ADN original cortados con enzimas de
restricción. – Marcaje del ADN de forma radiactiva o química (compuestos
fluorescentes). – Empleo de métodos electroforéticos para separar los fragmentos
generados, etc. • Muestras se amplifican por PCR para disponer de suficiente
cantidad
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología3.3 Método de secuenciación de Sanger.
• MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER.– Secuenciación didesoxi, por ser necesarios
didesoxirribonucleótidos. .– Didesoxirribonucleótidos (ddNTP) son compuestos
similares a los 2'-desoxinucleótidos, pero que también han perdido el grupo -OH del carbono 3', en su lugar tienen un grupo -H. xt cdo la ADN polimerasa incorpora un 2'-3'-didesoxirribonucleótido a la cadena de ADN, ésta ya no puede crecer puesto que carece del grupo -OH en posición 3', necesario para la formación del enlace fosfodiéster con el siguiente nucleótido. Por lo tanto la incorporación de un ddNTP implica la terminación de la cadena.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología3.3 Método de secuenciación de Sanger.
• MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER– Síntesis de un ADN complementario de longitud
variable.• Se parte de una hebra sencilla del ADN que se quiere
secuenciar. Se añade un cebador, marcado radiactivamente, que hibride con el extremo 3'
• Esta mezcla se coloca en 4 tubos de ensayo, a cada uno se le añaden los 4 tipos de nucleótidos (dNTPs). Además a cada tubo se añade uno de los didesoxirribonucleótidos (ddNTP) terminadores de cadena.
• Al añadir a los tubos la ADN polimerasa, comienza la polimerización a partir del cebador, pero cesa al incorporarse un ddNTP.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología3.3 Método de secuenciación de Sanger.
• MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE SANGER– Separación de los fragmentos y análisis.
• A continuación, el ADN de cada tubo se desnaturaliza, para liberar cadena recién sintetizada, que además será radiactiva.
• Las muestras de cada tubo depositadas en gel de poliacrilamida para separar los fragmentos según tamaño (electroforesis)
• Posiciones de las bandas son reveladas por autorradiografía. La sucesión de bandas de cada una de las 4 reacciones, comparándolas entre sí, dan la secuencia del ADN.
3. Principales técnicas empleadas en Biotecnología3.3 Método de secuenciación de Sanger.
4. Industrias alimentarias
• Producción alimentos y bebidas por fermentación=> sector importante en industria alimentaria.
• Fermentación láctica: queso y yogur.– Lactosa de leche -> ác láctico-> coagulación y precipitación de prot
lácteas. – Sg. bact que se utilice cm iniciadoras=> distinto tipo de queso. Tb
influye T. • Fermentación alcohólica: pan y bebidas alcohólicas.
– Panes: Sacharomyces cerevisae (levadura) Degrada azúcares harina=CO2 y EtOH.
– Bebidas alcohólicas: granos de cereales u otras partes de vegetales. • Cerveza tipo ale: S. cerevisae. • Cerveza tipo lager: S. carlsbergensis. • Sidra: S. cidrii. • Vino: S. uvarum.• Sake: Aspergillus oryzae (moho)
5. Industrias químicas
• Microorg producen productos qcos de uso industrial: disolventes, lubricantes, combustibles, adhesivos, acidulantes, plásticos, pesticidas, colorantes, cosméticos, ….
• Las más ¡ dsd pto vista económico: enzimas, comptos orgánicos alifácticos y aa. – Enzimas: pplamente xa descomponer gdes moléc.
Más ¡: protesasas (degradan prot, ag de limpieza en detergentes y coadyuvantes de digestión de piensos xa animales), amilasas (rompen almidón para producir glucosa), glucosa isomerasa (transforma glucosa en fructosa q se usa de edulcorante)
5. Industrias químicas
– Compuestos orgánicos alifácticos: distinguimos disolventes y ác orgánicos.
• Dvtes: – Etanol: dvte, anticongelante, sustrato para síntesis de otros
comptos y combustible en automóviles. (Brasil: gasohol)– N-butanol: fabricación de plastificantes, líq de frenos, aditivos
para gasolina. Se obtiene a partir de almidón con bacterias. Producto secundario: acetona.
– Glicerol: lubricante, emoliente en cosméticos y fármacos. • Ácidos orgánicos: acético, cítrico, lácticos.
– Acético: más ¡. Fabricación goma, plásticos, colorantes, insecticidas, material fotográfico, …
– Aminoácidos: lisina y metionina se añaden a piensos animales. Glutamato: uso potenciador de sabor y aromas.
6. Industrias farmacéuticas
• Aplicación microbiología en industria farmacéutica: gran revolución. • Avances en conocimiento microorg y en técn de manipulación
genética: aplicación rutinaria en identificación nuevas susts terapeúticas. – Antibióticos: uno de los más ¡. Penicilina fue primer antibiótico que se
aisló (Fleming). – Actinomicetos: grupo de bact gram + aerobias que producen varios
tipos de antibióticos. • Cefalosporinas: composición qca semejante a penicilina. Son producidas
por hongo Cephamosporium. Son de amplio espectro. • Estreptomicina (Streptomyces griseues: tuberculosis• Cloranfenicol (Streptomyces venezuelae): infecciones oculares o fiebre
tifoidea. • Tetraciclina (Streptomyces rimosus): ttos alternaticos para personas
alérgicas a la penicilina. – Hormonas: crecimiento, insulina, …– Vacunas: pe contra hep B
7. Microorganismos y medio ambiente
• Se utilizan para la biorremediación:– Contaminación de aguas. En EDAR’s hay
bact que eliminan metales pesados (Thiobacillus), hidrocarburos (Pseudomonas), uranios (Pseudomona aeruginosa), …
– Mareas negras y aguas de lavado de tanques: Se usan cepas de Pseudomonas que consumen distintos hidrocarburos.
– RSU: orgánicos: md microog se transforman en campost o metano,
