Televényféreg-tesztTelevényféreg-tesztEnchytraeid Reproduction Test Enchytraeid Reproduction Test

OECD 220OECD 220

Készítette: Rózsa PéterKészítette: Rózsa Péter

környezetmérnök hallgatókörnyezetmérnök hallgató

Gruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyáhozGruiz Katalin Környezettoxikológia c. tárgyához

Teszt alapjaTeszt alapja A tesztférgeket mesterséges talajjal készített A tesztférgeket mesterséges talajjal készített

talajhígítási sorokba teszik.talajhígítási sorokba teszik. Tartomány meghatározó (range-finding) teszt: 2 hét, Tartomány meghatározó (range-finding) teszt: 2 hét,

végpont a mortalitás.végpont a mortalitás. Hatást mérő teszt (definitive): 6 hét, az összes fiatal Hatást mérő teszt (definitive): 6 hét, az összes fiatal

egyed a szülőktől származik.egyed a szülőktől származik.Az első három hét után a felnőtt férgeket eltávolítják a Az első három hét után a felnőtt férgeket eltávolítják a

tesztedényből, és feljegyzik a morfológiai változásokattesztedényből, és feljegyzik a morfológiai változásokatTovábbi 3 hét után a bábakból kikelt utódokat megszámolják.További 3 hét után a bábakból kikelt utódokat megszámolják.Az állatok reproduktív hozamát a kontrolltalajon lévő állatok Az állatok reproduktív hozamát a kontrolltalajon lévő állatok

reproduktív hozamával hasonlítják össze.reproduktív hozamával hasonlítják össze.Ebből meghatározzák NOEC-et és ECEbből meghatározzák NOEC-et és ECxx-et interpolációval -et interpolációval

regreszióanalízis segítségével.regreszióanalízis segítségével.

Információ a tesztelendő Információ a tesztelendő vegyi anyagrólvegyi anyagról

Ismerni kell a vegyi anyag vízoldhatóságát és Ismerni kell a vegyi anyag vízoldhatóságát és gőznyomását.gőznyomását.

Plusz információt ad, ha ismerjük a vegyi Plusz információt ad, ha ismerjük a vegyi anyag hidrolízis és fotolízis sebességét.anyag hidrolízis és fotolízis sebességét.

Nem alkalmazható olyan anyagokra, amelynek Nem alkalmazható olyan anyagokra, amelynek Henry-állandója nagyobb mint 1, vagy a Henry-állandója nagyobb mint 1, vagy a gőznyomása nagyobb mint 0,0133 Pa, vagyis gőznyomása nagyobb mint 0,0133 Pa, vagyis az illékonyakra.az illékonyakra.

Teszt validálásaTeszt validálása A felnőtt mortalitás a A felnőtt mortalitás a

tartománykereső teszt végén és a tartománykereső teszt végén és a reprodukciós teszt első három reprodukciós teszt első három hetében nem haladhatja meg a hetében nem haladhatja meg a 20%-ot.20%-ot.

A teszt kezdetekor 10 felnőttet A teszt kezdetekor 10 felnőttet alkalmazunk edényenként, a alkalmazunk edényenként, a teszt végén átlagosan 25 teszt végén átlagosan 25 felnőttnek kell lennie felnőttnek kell lennie edényenként.edényenként.

A fiatalok átlagának varianciája A fiatalok átlagának varianciája

nem lehet több mint 50%nem lehet több mint 50%..

ReferenciaanyagReferenciaanyag

Egyik a karbedazim 360 Egyik a karbedazim 360 mg/l (32,18%) aktív mg/l (32,18%) aktív összetevőt alkalmazösszetevőt alkalmaz

A reprodukció ECA reprodukció EC5050

értéke 1,2±0,8 mg aktív értéke 1,2±0,8 mg aktív összetevő/kg száraz talaj összetevő/kg száraz talaj intervallumban van. A intervallumban van. A kontrollsor eredménye kontrollsor eredménye alapján ellenőrizzük a alapján ellenőrizzük a tesztorganizmusok tesztorganizmusok megfelelőségét.megfelelőségét.

A teszt leírásaA teszt leírása EszközökEszközök

Üvegből vagy más kémiailag inert anyagból kell készülnie. 0,20-0,25 l; Üvegből vagy más kémiailag inert anyagból kell készülnie. 0,20-0,25 l; 6 cm átmérő6 cm átmérő

Átlátszó fedelűnek (pl. üveg vagy polietilén), mert a víz párolgását Átlátszó fedelűnek (pl. üveg vagy polietilén), mert a víz párolgását csökkenti, amíg a légcserét engedünk az atmoszféra és a talaj köztcsökkenti, amíg a légcserét engedünk az atmoszféra és a talaj közt

A fedő átlátszó legyen, hogy áteressze a fényt.A fedő átlátszó legyen, hogy áteressze a fényt.

sztereomikroszkópsztereomikroszkóp pH-mérő és fotométerpH-mérő és fotométer Analitikai mérlegekAnalitikai mérlegek hőmérőkhőmérők nedvességellenőrző (nem szükséges, hogy az edénynek legyen fedele)nedvességellenőrző (nem szükséges, hogy az edénynek legyen fedele) inkubátor vagy kis szoba légkondicionálóvalinkubátor vagy kis szoba légkondicionálóval csipeszcsipesz fotótálfotótál

A mesterséges talaj előkészítéseA mesterséges talaj előkészítése 10% tőzegmoha, légszáraz, 2±1 mm 10% tőzegmoha, légszáraz, 2±1 mm

szemcseátmérőjűszemcseátmérőjű 20% kaolinitagyag20% kaolinitagyag 0,3-1% CaCO0,3-1% CaCO33 (porítva, analitikai (porítva, analitikai

mennyiségben, elsődlegesen a mennyiségben, elsődlegesen a tőzegmoha minőségétől/természetétől tőzegmoha minőségétől/természetétől függ), hogy a pH 6,0±0,5 legyenfügg), hogy a pH 6,0±0,5 legyen

Kb. 70% légszáraz kvarchomok Kb. 70% légszáraz kvarchomok (CaCO(CaCO33 mennyiségétől függően) 50- mennyiségétől függően) 50-

200 µm szemcseátmérőtől függően200 µm szemcseátmérőtől függően

A mesterséges talaj előkészítéseA mesterséges talaj előkészítése Meg kell bizonyosodni, hogy a talaj nem veszélyes-e, ha a Meg kell bizonyosodni, hogy a talaj nem veszélyes-e, ha a

szerves széntartalmát 4,5%-ra csökkentjük, és ennek szerves széntartalmát 4,5%-ra csökkentjük, és ennek megfelelően megnövekszik a homoktartalmamegfelelően megnövekszik a homoktartalma

A talaj száraz alkotóelemeit alaposan össze kell keverni A talaj száraz alkotóelemeit alaposan össze kell keverni legalább 1 hétig.legalább 1 hétig.

Ezt 2 napig kell tárolni, hogy a pH-ja beálljon.Ezt 2 napig kell tárolni, hogy a pH-ja beálljon. A pH meghatározásához 1 M kálium-klorid-oldatot (KCl) A pH meghatározásához 1 M kálium-klorid-oldatot (KCl)

vagy 0,01 M kalcium-klorid (CaClvagy 0,01 M kalcium-klorid (CaCl22)-oldatot 1:5 arányban kell )-oldatot 1:5 arányban kell használni használni

Ha savasabb, CaCOHa savasabb, CaCO33-tal kell pufferolni.-tal kell pufferolni. Ha túl alkálikus, akkor több keveréket kell hozzáadni, de Ha túl alkálikus, akkor több keveréket kell hozzáadni, de

CaCOCaCO33 kizárásával kizárásával

A mesterséges talaj előkészítéseA mesterséges talaj előkészítése Meg kell határozni a talaj maximális víztartalom-kapacitását; egy vagy két Meg kell határozni a talaj maximális víztartalom-kapacitását; egy vagy két

nappal a teszt megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt ionmentes nappal a teszt megkezdése előtt a száraz mesterséges talajt ionmentes vízzel megnedvesítjük, hogy a végső víztartalom kb. felét elérje, hogy a vízzel megnedvesítjük, hogy a végső víztartalom kb. felét elérje, hogy a maximális víztartókapacitása 40-60% között legyen.maximális víztartókapacitása 40-60% között legyen.

A teszt kezdetén az előnedvesített talajt a tesztkoncentrációk számának A teszt kezdetén az előnedvesített talajt a tesztkoncentrációk számának megfelelően osztjuk el (és a referenciaanyaggal, ahol alkalmas) és a megfelelően osztjuk el (és a referenciaanyaggal, ahol alkalmas) és a kontrollokat, amiket a teszthez használnak fel. kontrollokat, amiket a teszthez használnak fel.

A nedvességtartalmat a maximális WHC 40-60%-ra kell beállítani a A nedvességtartalmat a maximális WHC 40-60%-ra kell beállítani a tesztanyagoldat és/vagy desztillált vagy ionmentes víz hozzáadásával tesztanyagoldat és/vagy desztillált vagy ionmentes víz hozzáadásával

A nedvességtartalmat a teszt kezdetén és végén határozzák meg (105A nedvességtartalmat a teszt kezdetén és végén határozzák meg (10500C-on C-on állandó tömegig szárítva), és azt az optimális tartományt, amit a férgek állandó tömegig szárítva), és azt az optimális tartományt, amit a férgek még túlélnek. még túlélnek.

A talaj nedvességtartalmát ellenőrizni kell;A talaj nedvességtartalmát ellenőrizni kell; a talajt a kezünkben finoman a talajt a kezünkben finoman összenyomjuk, ha a víztartalom kis vízcseppekben megjelenik az ujjak összenyomjuk, ha a víztartalom kis vízcseppekben megjelenik az ujjak közt, akkor alkalmas a tesztre.közt, akkor alkalmas a tesztre.

A tesztállatok kiválasztásaA tesztállatok kiválasztása Enchytraeus albidus Enchytraeus albidus (fehér féreg) az (fehér féreg) az EnchytraeideEnchytraeide családba, családba, Oligochaeták Oligochaeták rendjébe, rendjébe,

AnnelidákAnnelidák törzsébe tartozik. Az echytraeidák egyik leghosszabb faja, 35 mm hosszú törzsébe tartozik. Az echytraeidák egyik leghosszabb faja, 35 mm hosszú is lehet. Világszerte megtalálható, a tengervízben, édesvízben, földön, főképp is lehet. Világszerte megtalálható, a tengervízben, édesvízben, földön, főképp korhadó szerves anyagokon (hínár, komposzt) és ritkán réteken. Széles ökológiai korhadó szerves anyagokon (hínár, komposzt) és ritkán réteken. Széles ökológiai toleranciájának és néhány morfológiai változatosságának köszönhetően különböző toleranciájának és néhány morfológiai változatosságának köszönhetően különböző fajtái léteznek. Kereskedelmileg mint haltápanyag kapható. Ha a kultúra fajtái léteznek. Kereskedelmileg mint haltápanyag kapható. Ha a kultúra megfertőződik, általában kisebbek, fajták (1) (19). Ha a szennyeződés megtörténik, megfertőződik, általában kisebbek, fajták (1) (19). Ha a szennyeződés megtörténik, minden férget Petri-csészében vízzel le kell mosni. Az minden férget Petri-csészében vízzel le kell mosni. Az Enchytraeus albidusEnchytraeus albidus hosszú hosszú felnőtt példányai (sztereomikroszkóp használatával) elkülöníthetők, hogy egy új felnőtt példányai (sztereomikroszkóp használatával) elkülöníthetők, hogy egy új kultúrát elkezdhessünk, és minden egyéb férget elválasszunk. Könnyen tenyészthető kultúrát elkezdhessünk, és minden egyéb férget elválasszunk. Könnyen tenyészthető a szerves anyagok széles skáláján. Életciklusuk lerövidül, mikor fejlődésük során a szerves anyagok széles skáláján. Életciklusuk lerövidül, mikor fejlődésük során elérik 33 napot (18elérik 33 napot (1800C) és 74 napot (12C) és 74 napot (1200C-on). Csak azok a kultúrák tarthatók C-on). Csak azok a kultúrák tarthatók használhatók fel a teszthez, anmelyeket laboratóriumban problémamentesen lehetett használhatók fel a teszthez, anmelyeket laboratóriumban problémamentesen lehetett tartani legalább 5 hétig (egy generáció).tartani legalább 5 hétig (egy generáció).

Használhatók még pl. Használhatók még pl. E. buchholziE. buchholzi és és E. crypticusE. crypticus. Meg kell jegyezni, hogy más faj . Meg kell jegyezni, hogy más faj használatakor a fajoknak tisztán azonosíthatónak kell lenniükhasználatakor a fajoknak tisztán azonosíthatónak kell lenniük ..

TesztállatokTesztállatok A tesztben használt állatok felnőtt férgek. Ikrájuk van (fehér folt) a A tesztben használt állatok felnőtt férgek. Ikrájuk van (fehér folt) a

clitellum területen, és kb. ugyanolyan méretűek (kb. 1 cm hosszúak). A clitellum területen, és kb. ugyanolyan méretűek (kb. 1 cm hosszúak). A tenyészkultúrákat nem szükségszerű összehangolni tenyészkultúrákat nem szükségszerű összehangolni

Ha az enchytraeidák nem tenyészthetők ugyanazon a talajtípuson és Ha az enchytraeidák nem tenyészthetők ugyanazon a talajtípuson és ugyanolyan körülmények közt, akkor akklimatizálni kell őket 1-3 napig is ugyanolyan körülmények közt, akkor akklimatizálni kell őket 1-3 napig is akár.akár.

Ha több felnőttet alkalmazunk, mint ami a teszthez szükséges, kezdetben Ha több felnőttet alkalmazunk, mint ami a teszthez szükséges, kezdetben akklimatizálni kell őket a teszthez, hogy elválasszuk őket a károsodott akklimatizálni kell őket a teszthez, hogy elválasszuk őket a károsodott vagy a tesztre alkalmatlan fajoktól. Az akklimatizált időszak végén csak vagy a tesztre alkalmatlan fajoktól. Az akklimatizált időszak végén csak azok a férgek maradnak meg, amiknek petéjük van, és amelyek nem térnek azok a férgek maradnak meg, amiknek petéjük van, és amelyek nem térnek el a hagyományos viselkedéstől (pl. megpróbálnak elmászni a talajról). A el a hagyományos viselkedéstől (pl. megpróbálnak elmászni a talajról). A férgeket óvatosan elveszik csipesszel, és áthelyezik egy Petri-csészébe, ami férgeket óvatosan elveszik csipesszel, és áthelyezik egy Petri-csészébe, ami kismennyiségű édesvizet tartalmaz, amit frissen kell előkészíteni.kismennyiségű édesvizet tartalmaz, amit frissen kell előkészíteni.

A férgek megfigyelhetőek sztereomikroszkóp alatt, és néhány az, amelyik A férgek megfigyelhetőek sztereomikroszkóp alatt, és néhány az, amelyik nem tartalmaz petét, elkülönülnek. Figyelni kell, hogy elválasszuk és nem tartalmaz petét, elkülönülnek. Figyelni kell, hogy elválasszuk és elkülönítsük az atkáktól, amik megfertőzhetik a kultúrákat. Azok az elkülönítsük az atkáktól, amik megfertőzhetik a kultúrákat. Azok az egészséges férgek, amiket nem használunk a tesztre, visszakerülnek az egészséges férgek, amiket nem használunk a tesztre, visszakerülnek az alapkultúrához.alapkultúrához.

A tesztkoncentrációk előkészítéseA tesztkoncentrációk előkészítése Tesztanyag feloldása vízben (ionmentesben). Annyi ionmentes vízben oldjuk fel, Tesztanyag feloldása vízben (ionmentesben). Annyi ionmentes vízben oldjuk fel,

amennyi elég minden egyes koncentráció ismétlésére. Ajánlatos annyi vizet amennyi elég minden egyes koncentráció ismétlésére. Ajánlatos annyi vizet használni, hogy elérjük a kívánt nedvességtartalmat, pl. a maximum WHC 40-60%-használni, hogy elérjük a kívánt nedvességtartalmat, pl. a maximum WHC 40-60%-át. A tesztanyag minden oldatát alaposan átkeverjük egy előzetesen megnedvesített át. A tesztanyag minden oldatát alaposan átkeverjük egy előzetesen megnedvesített talajjal, mielőtt belehelyeznénk a tesztedénybe.talajjal, mielőtt belehelyeznénk a tesztedénybe.

Ha nem vízoldható a tesztanyag:Ha nem vízoldható a tesztanyag: Ha szerves oldószerben oldódnak, a tesztanyagot először feloldjuk egy Ha szerves oldószerben oldódnak, a tesztanyagot először feloldjuk egy

közvetítő közegben (pl. aceton), és ezt összekeverik kb. 2,5 g apró közvetítő közegben (pl. aceton), és ezt összekeverik kb. 2,5 g apró kvarchomokkal, majd a vivőközeget legalább 1 óráig párolják. A kvarchomok-kvarchomokkal, majd a vivőközeget legalább 1 óráig párolják. A kvarchomok-tesztanyag-keveréket hozzáadják az előnedvesített talajhoz, elkeverik, tesztanyag-keveréket hozzáadják az előnedvesített talajhoz, elkeverik, ionmentes vizet adnak hozzá a kívánt nedvesség eléréséhez. Végül behelyezik a ionmentes vizet adnak hozzá a kívánt nedvesség eléréséhez. Végül behelyezik a tesztedénybe.tesztedénybe.

Ha szerves oldószerben és vízben is kevéssé oldódnak, akkor 2,5 g egyenértékű Ha szerves oldószerben és vízben is kevéssé oldódnak, akkor 2,5 g egyenértékű apró kvarchomokot teszedényenként összekevernek a tesztanyag apró kvarchomokot teszedényenként összekevernek a tesztanyag mennyiségével, hogy a kívánt koncentrációt elérjék. Ezt a keveréket hozzáadják mennyiségével, hogy a kívánt koncentrációt elérjék. Ezt a keveréket hozzáadják az előzetesen nedvesített talajhoz, és alaposan elkeverik, miután hozzáadtak az előzetesen nedvesített talajhoz, és alaposan elkeverik, miután hozzáadtak annyi ionmentes vizet, hogy a nedvességtartalmat elérjék. A végső keveréket annyi ionmentes vizet, hogy a nedvességtartalmat elérjék. A végső keveréket szétosztják a tesztedények közt. A folyamatot minden egyes tesztkoncentrációra szétosztják a tesztedények közt. A folyamatot minden egyes tesztkoncentrációra megismétlik, és elvégzik a kontrollra is egyaránt.megismétlik, és elvégzik a kontrollra is egyaránt.

Az olyan anyagok, amik nagyobbak 1000 mg/kg száraz talajtömeg Az olyan anyagok, amik nagyobbak 1000 mg/kg száraz talajtömeg koncentrációnál, nem alkalmasak a tesztre. koncentrációnál, nem alkalmasak a tesztre.

Tesztcsoportok és kontrollokTesztcsoportok és kontrollok Minden tesztkoncentrációhoz adott mennyiségű teszttalajt - 20 Minden tesztkoncentrációhoz adott mennyiségű teszttalajt - 20

g száraz súlyra vonatkoztatva - helyeznek a tesztedénybe. A g száraz súlyra vonatkoztatva - helyeznek a tesztedénybe. A kontrolltalajokat - a tesztanyagok nélkül - is elkészítik. Ételt kontrolltalajokat - a tesztanyagok nélkül - is elkészítik. Ételt adnak minden edénybe. 10 férget véletlenszerűen elhelyeznek adnak minden edénybe. 10 férget véletlenszerűen elhelyeznek minden tesztedénybe. A férgeket óvatosan áthelyezik minden minden tesztedénybe. A férgeket óvatosan áthelyezik minden tesztedénybe, és elhelyezik a használni kívánt talaj felszínére, tesztedénybe, és elhelyezik a használni kívánt talaj felszínére, pl. csipeszekkel. Az ismétlések száma függ a pl. csipeszekkel. Az ismétlések száma függ a tesztkoncentrációkhoz és a kontrollokhoz használt teszt tesztkoncentrációkhoz és a kontrollokhoz használt teszt típusától. A tesztedényeket véletlenszerűen helyezik el a típusától. A tesztedényeket véletlenszerűen helyezik el a tesztinkubátorba, és ezeket a helyeket hetente újra megkeverik.tesztinkubátorba, és ezeket a helyeket hetente újra megkeverik.

Ha egy vivőközeget használnak a tesztanyagra, egy Ha egy vivőközeget használnak a tesztanyagra, egy kontrollsorozatot – amiben kvarchomok van feloldva az kontrollsorozatot – amiben kvarchomok van feloldva az oldószerben – kell futtatni a tesztsorozaton felül. Az oldószerben – kell futtatni a tesztsorozaton felül. Az oldószerkoncentrációnak meg kell egyeznie, amit a oldószerkoncentrációnak meg kell egyeznie, amit a tesztedényekben használtunk, ami a tesztanyagot tartalmazta. tesztedényekben használtunk, ami a tesztanyagot tartalmazta.

TesztkörülményekTesztkörülmények Teszthőmérséklet 20±2Teszthőmérséklet 20±200C.C. Hogy a kukacok ne hagyják el a talajt, a tesztet Hogy a kukacok ne hagyják el a talajt, a tesztet

irányított világos-sötét ciklusok alatt kell végezni (16 irányított világos-sötét ciklusok alatt kell végezni (16 óra világos-8 óra sötét) 400-800 lux megvilágítássalóra világos-8 óra sötét) 400-800 lux megvilágítással

Talajnedvesség nyomonkövetése: edények lemérése a Talajnedvesség nyomonkövetése: edények lemérése a teszt kezdetén, majd hetente. Tömegveszteséget teszt kezdetén, majd hetente. Tömegveszteséget ionmentes víz hozzáadásával kell pótolni. Nedvesség ionmentes víz hozzáadásával kell pótolni. Nedvesség csökkenthető, ha a tesztinkubátorban magas csökkenthető, ha a tesztinkubátorban magas páratartalmú levegőt (>80%) tartunk fenn.páratartalmú levegőt (>80%) tartunk fenn.

Nedvességtartalmat és a pH-t is mérni kell mindkét Nedvességtartalmat és a pH-t is mérni kell mindkét tesztben a kontrollra és a kezelt talaj minden tesztben a kontrollra és a kezelt talaj minden koncentrációjára egyaránt.koncentrációjára egyaránt.

EtetésEtetés 50 mg összecsavarodott zabot kell alkalmazni, amit a 50 mg összecsavarodott zabot kell alkalmazni, amit a

talajba kevernek bele. Hetente a 21. napig etetni kell a talajba kevernek bele. Hetente a 21. napig etetni kell a férgeket. Az etetés nem fejeződik be a 28. napon férgeket. Az etetés nem fejeződik be a 28. napon addig, amíg a felnőtteket nem vették el erről a addig, amíg a felnőtteket nem vették el erről a helyről, és a fiatal férgeknek szükségük van relatíve helyről, és a fiatal férgeknek szükségük van relatíve kis mennyiségű hozzáadott ételre ezen a ponton túl. kis mennyiségű hozzáadott ételre ezen a ponton túl. Az etetés a teszt alatt 25 mg összecsavart zabot / Az etetés a teszt alatt 25 mg összecsavart zabot / edény tartalmaz, a férgeket gondosan helyezzük a edény tartalmaz, a férgeket gondosan helyezzük a talaj felszínére, így elkerüljük, hogy megsérülnek. talaj felszínére, így elkerüljük, hogy megsérülnek. Azért, hogy csökkentsük a gombák növekedését, a Azért, hogy csökkentsük a gombák növekedését, a zabpelyheket a talajba kell ásni kismennyiségű zabpelyheket a talajba kell ásni kismennyiségű talajjal borítva. Ha az ételt nem fogyasztják el talajjal borítva. Ha az ételt nem fogyasztják el teljesen, akkor mennyiségét csökkenteni kell.teljesen, akkor mennyiségét csökkenteni kell.

Range-finding tesztRange-finding teszt 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg (száraztalaj-súlyra vonatkoztatva). Egy 0,1; 1; 10; 100; 1000 mg/kg (száraztalaj-súlyra vonatkoztatva). Egy

ismétlés mindegyikhez szükséges lehet.ismétlés mindegyikhez szükséges lehet. 2 hetes teszt.2 hetes teszt. Férgek mortalitását megállapítjukFérgek mortalitását megállapítjuk Egy féreg akkor tekinthető halottnak, ha mechanikai stimulusra nem Egy féreg akkor tekinthető halottnak, ha mechanikai stimulusra nem

reagál.reagál. A felnőttek viselkedésében lévő változásokat (pl. nem tudja beásni A felnőttek viselkedésében lévő változásokat (pl. nem tudja beásni

magát a talajba; mozdulatlanul fekszik a tesztedény üvegfalának dőlve) magát a talajba; mozdulatlanul fekszik a tesztedény üvegfalának dőlve) és morfológia (pl. nyílt sebek jelenléte) fel kell jegyezni. és morfológia (pl. nyílt sebek jelenléte) fel kell jegyezni.

LCLC5050 úgy határozható meg, hogy vesszük a mortalitási adatok úgy határozható meg, hogy vesszük a mortalitási adatok geometriai átlagát. A koncentricióintervallumok felállításában a geometriai átlagát. A koncentricióintervallumok felállításában a definitív tesztre a reprodukcióra gyakorolt hatások kisebbek az LCdefinitív tesztre a reprodukcióra gyakorolt hatások kisebbek az LC5050--nél egy 10-es faktorral.nél egy 10-es faktorral.

4 ismétlést végzünk minden tesztanyag-koncentrációra és egy adekvát 4 ismétlést végzünk minden tesztanyag-koncentrációra és egy adekvát koncentrációszámítást, ami legalább 4 statisztikailag különböző átlagot koncentrációszámítást, ami legalább 4 statisztikailag különböző átlagot eredményez ezekre a koncentrációkra ajánlott.eredményez ezekre a koncentrációkra ajánlott.

Kontrollgra használják is ugyanezeket érdemes alkalmazni.Kontrollgra használják is ugyanezeket érdemes alkalmazni.

Kivitel a definitív reprodukciós Kivitel a definitív reprodukciós tesztretesztre

Erre 3 lehetőségünk van:Erre 3 lehetőségünk van: NOEC meghatározására legalább 5 koncentrációsorozatot kell NOEC meghatározására legalább 5 koncentrációsorozatot kell

tesztelni. 4 ismétlést minden koncentrációra plusz 8 kontrol ajánlott. A tesztelni. 4 ismétlést minden koncentrációra plusz 8 kontrol ajánlott. A koncentrációkat 1,8-at meg nem haladó faktorral kell beszorozni.koncentrációkat 1,8-at meg nem haladó faktorral kell beszorozni.

Az ECx (pl. EC10, EC50) meghatározásához legalább 5 koncentrációt Az ECx (pl. EC10, EC50) meghatározásához legalább 5 koncentrációt kell tesztelni, és a koncentrációkat egymás mellé elhelyezni ECx-ek kell tesztelni, és a koncentrációkat egymás mellé elhelyezni ECx-ek szerinti növekvő sorrendjébe, hogy interpolálhassuk, és ne az szerinti növekvő sorrendjébe, hogy interpolálhassuk, és ne az extrapoláljuk. Minden egyes tesztkoncentrációra legalább 4 ismétlés és extrapoláljuk. Minden egyes tesztkoncentrációra legalább 4 ismétlés és 4 kontrollismétlés ajánlott. A faktor szór, pl. kevesebb vagy egyenlő 4 kontrollismétlés ajánlott. A faktor szór, pl. kevesebb vagy egyenlő 1,8-cal az elvárt intervallumban, és 1,8 fölé is mehet magasabb és 1,8-cal az elvárt intervallumban, és 1,8 fölé is mehet magasabb és alacsonyabb koncentrációknál.alacsonyabb koncentrációknál.

Egy egyesített megközelítés megengedi mind a NOEC, mind az ECx Egy egyesített megközelítés megengedi mind a NOEC, mind az ECx meghatározását. 8 koncentrációt kell alkalmazni a geometriai meghatározását. 8 koncentrációt kell alkalmazni a geometriai sorozatokban. 4 ismétlőt minden kezeltre plusz 8-at kontrollra ajánlott. sorozatokban. 4 ismétlőt minden kezeltre plusz 8-at kontrollra ajánlott. A koncentrációkat olyan faktorokkal kell szorozni, amik nem érik el az A koncentrációkat olyan faktorokkal kell szorozni, amik nem érik el az 1,8-at.1,8-at.

ECECxx-ek meghatározása-ek meghatározása

Definitív tesztDefinitív teszt 10 felnőtt férget/tesztedény kell használni. Ételt adnak a tesztedényekbe a teszt 10 felnőtt férget/tesztedény kell használni. Ételt adnak a tesztedényekbe a teszt

kezdetén, majd hetente egyszer a 21. napig. A 21. napon a talajmintákat óvatosan kezdetén, majd hetente egyszer a 21. napig. A 21. napon a talajmintákat óvatosan kezelik, és az élő felnőtt férgeket megfigyelik és megszámolják, és a viselkedésbeli kezelik, és az élő felnőtt férgeket megfigyelik és megszámolják, és a viselkedésbeli változásaikat (pl. a földbe nem tudnak lemenni; mozdulatlanul fekszenek a változásaikat (pl. a földbe nem tudnak lemenni; mozdulatlanul fekszenek a tesztedény üvegének) és a morfológiát (pl. nyílt sebek) feljegyzik. Ezután minden tesztedény üvegének) és a morfológiát (pl. nyílt sebek) feljegyzik. Ezután minden felnőtt férget elvesznek a tesztedényből és a teszttalajról. Ha teszttalaj tartalmaz felnőtt férget elvesznek a tesztedényből és a teszttalajról. Ha teszttalaj tartalmaz néhány bábot, amiket termeltek, azokat inkubálják még 3 hétig ugyanazon néhány bábot, amiket termeltek, azokat inkubálják még 3 hétig ugyanazon tesztkörülmények között kivéve, hogy az etetés csak a 35. napon történik meg 25 tesztkörülmények között kivéve, hogy az etetés csak a 35. napon történik meg 25 mg összecsavart zab/edény).mg összecsavart zab/edény).

6 hét után az új kikelt férgeket megszámolják. A metodika Bengal piros festésen 6 hét után az új kikelt férgeket megszámolják. A metodika Bengal piros festésen alapul, habár más nedves (de nem melegített) extrakciós és flotációs technikák is alapul, habár más nedves (de nem melegített) extrakciós és flotációs technikák is hatásosnak bizonyultak. Bengáli piros festés inkább ajánlott, mert a nedves hatásosnak bizonyultak. Bengáli piros festés inkább ajánlott, mert a nedves extrakció egy talajszubsztrátból a zavarodottság miatt gátolt, amiket a extrakció egy talajszubsztrátból a zavarodottság miatt gátolt, amiket a szuszpendált agyagszemcsék idéznek elő.szuszpendált agyagszemcsék idéznek elő.

Limitáló tesztLimitáló teszt 37.37. Ha nincs megfigyelhető hatás a magasabb koncentrációknál a széleskörű-Ha nincs megfigyelhető hatás a magasabb koncentrációknál a széleskörű-

kereső tesztekben (pl. 1000 mg/kg), a reprodukciós teszt végrehajtható mint egy kereső tesztekben (pl. 1000 mg/kg), a reprodukciós teszt végrehajtható mint egy limitáló teszt, 1000 mg/kg-ot használ fel sorrendben, hogy bizonyítsa, a NOEC a limitáló teszt, 1000 mg/kg-ot használ fel sorrendben, hogy bizonyítsa, a NOEC a reprodukcióra nagyobb mint ez az érték.reprodukcióra nagyobb mint ez az érték.

A teszt összefoglalásaA teszt összefoglalása

IdőIdő Range-finding tesztRange-finding teszt Deifinitív tesztDeifinitív teszt

7 nap vagy 7 nap vagy kevesebbkevesebb

Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók összekeverése)összekeverése)

Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók Mesterséges talaj elkészítése (száraz alkotók összekeverése)összekeverése)

5. nap5. nap A mesterséges talaj pH-jának ellenőrzéseA mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése A mesterséges talaj pH-jának ellenőrzéseA mesterséges talaj pH-jának ellenőrzése

   Megmérni a talaj max WHC-jétMegmérni a talaj max WHC-jét Megmérni a talaj max WHC-jétMegmérni a talaj max WHC-jét

5. naptól5. naptól Csoportférgek akklimatizációraCsoportférgek akklimatizációra Csoportférgek akklimatizációraCsoportférgek akklimatizációra

3. naptól 3. naptól Férgek akklimatizálása legalább 24 órán átFérgek akklimatizálása legalább 24 órán át Férgek akklimatizálása legalább 24 órán átFérgek akklimatizálása legalább 24 órán át

1. nap1. napElőnedvesített mesterséges talaj és Előnedvesített mesterséges talaj és szétosztani frissekreszétosztani frissekre

Előnedvesített mesterséges talaj és Előnedvesített mesterséges talaj és szétosztani frissekreszétosztani frissekre

0. nap0. nap Előkészíteni az alapoldatokatElőkészíteni az alapoldatokat Előkészíteni az alapoldatokatElőkészíteni az alapoldatokat

   Alkalmazni a tesztanyagotAlkalmazni a tesztanyagot Alkalmazni a tesztanyagotAlkalmazni a tesztanyagot

  Megmérni a tesztszubsztrát tömegét Megmérni a tesztszubsztrát tömegét tesztedényekbetesztedényekbe

Megmérni a tesztszubsztrát tömegét Megmérni a tesztszubsztrát tömegét tesztedényekbetesztedényekbe

   Elkeverni az ételtElkeverni az ételt Elkeverni az ételtElkeverni az ételt

   Behelyezni a férgeketBehelyezni a férgeket Behelyezni a férgeketBehelyezni a férgeket

  Megmérni a talaj pH-ját és a Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmatnedvességtartalmat

Megmérni a talaj pH-ját és a Megmérni a talaj pH-ját és a nedvességtartalmatnedvességtartalmat

7. nap7. nap Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát

A teszt összefoglalásaA teszt összefoglalásaIdőIdő Range-finding tesztRange-finding teszt Deifinitív tesztDeifinitív teszt

14. nap14. nap Meghatározni a felnőtt mortalitástMeghatározni a felnőtt mortalitást Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát

   Megbecsülni a fiatalok számátMegbecsülni a fiatalok számát EtetésEtetés

  Megmérni a talaj pH-ját és a Megmérni a talaj pH-ját és a

nedvességtartalmatnedvességtartalmat   

21. nap21. nap    Megfigyelni a felnőtt viselkedéstMegfigyelni a felnőtt viselkedést

   Elvenni a felnőtteketElvenni a felnőtteket

   Meghatározni a felnőtt mortalitástMeghatározni a felnőtt mortalitást

   Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát

      EtetésEtetés

28. nap28. nap    Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát

      Nem etetniNem etetni

35. nap35. nap    Ellenőrizni a talaj nedvességtartalmátEllenőrizni a talaj nedvességtartalmát

      EtetésEtetés

42. nap42. nap    Megszámolni a fiatal férgeketMegszámolni a fiatal férgeket

     Megmérni a talaj pH-ját és a Megmérni a talaj pH-ját és a

nedvességtartalmatnedvességtartalmat

JegyzőkönyvJegyzőkönyv TesztanyagTesztanyag Fizikai és, ahol lehet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízoldhatóság, gőznyomás);Fizikai és, ahol lehet, fizikai-kémiai tulajdonságok (pl. vízoldhatóság, gőznyomás); A tesztanyag kémiai azonosítása IUPAC nomenklatúrának megfelelően, CAS-szám, A tesztanyag kémiai azonosítása IUPAC nomenklatúrának megfelelően, CAS-szám,

struktúrális formula és tisztaságstruktúrális formula és tisztaság A minta lejárati dátuma/felhasználhatósági idejeA minta lejárati dátuma/felhasználhatósági ideje TesztfajokTesztfajok A felhasznált tesztállatok: fajok, tudományos név, organizmusok és tenyésztési A felhasznált tesztállatok: fajok, tudományos név, organizmusok és tenyésztési

kondíciók adataikondíciók adatai TesztkondíciókTesztkondíciók a mesterséges talaj előkészítése és alapanyagoka mesterséges talaj előkészítése és alapanyagok a tesztanyag felhasználásának módszerea tesztanyag felhasználásának módszere a tesztkörülmények leírása beleértve hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb.a tesztkörülmények leírása beleértve hőmérsékletet, nedvességtartalmat, pH-t, stb. a kísérleti felépítés és folyamat teljes leírásaa kísérleti felépítés és folyamat teljes leírása Teszteredmények:Teszteredmények: a felnőtt férgek halálozása 2 hét után és a fiatalok száma a range-finding teszt végén;a felnőtt férgek halálozása 2 hét után és a fiatalok száma a range-finding teszt végén; a felnőtt férgek halálozása 3 hét után, és fiatalok teljes életciklusa a definitív teszt végén.a felnőtt férgek halálozása 3 hét után, és fiatalok teljes életciklusa a definitív teszt végén. Néhány megfigyelt fizikai vagy patológiai szimptómák és viselkedésváltozások a Néhány megfigyelt fizikai vagy patológiai szimptómák és viselkedésváltozások a

tesztorganizmusokban;tesztorganizmusokban; LC50, a NOEC és vagy ECx (pl. EC50, EC10) a reprodukcióra, ha néhány közülük LC50, a NOEC és vagy ECx (pl. EC50, EC10) a reprodukcióra, ha néhány közülük

alkalmazható konfidencia-intervallummal, és a ráillesztett modell rajza felhasználva a alkalmazható konfidencia-intervallummal, és a ráillesztett modell rajza felhasználva a számításukra minden információ és megfigyelések segíthetnek az eredmények számításukra minden információ és megfigyelések segíthetnek az eredmények kiértékelésében.kiértékelésében.

Felhasznált irodalomFelhasznált irodalom OECD iLibrary - Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test OECD iLibrary - Test No. 220: Enchytraeid Reproduction Test http://www.oecd-ilibrary.org/docserver/download/fulltext/http://www.oecd-ilibrary.org/docserver/download/fulltext/

9722001e.pdf?9722001e.pdf?expires=1291765462&id=0000&accname=freeContent&checksum=expires=1291765462&id=0000&accname=freeContent&checksum=FE904F3D99C7CB01C454E491D8719C9FFE904F3D99C7CB01C454E491D8719C9F

Képek forrásaKépek forrásahttp://www.grimas.hu/hu/labortechnika/Lapok/http://www.grimas.hu/hu/labortechnika/Lapok/

Laboratriumi_mrleg_ABS_2204.aspxLaboratriumi_mrleg_ABS_2204.aspxhttp://theaquariumwiki.com/Enchytraeus_albidushttp://theaquariumwiki.com/Enchytraeus_albidushttp://www.allthingsorganic.com/How_To/12.asphttp://www.allthingsorganic.com/How_To/12.asphttp://www.firstfish.de/cms/front_content.php?idcat=57&idart=147http://www.firstfish.de/cms/front_content.php?idcat=57&idart=147