Teklab Sds Page 1
Embed Size (px)
Citation preview
Foundations of Biology©1999 Timothy G. Standish
Protein terdapat dalam semua sel hidup dan mempunyai fungsi penting
untuk kelangsungan hidup
Protein dibutuhkan setiap saat oleh setiap tubuh makluk
hidup.
©1999 Timothy G. Standish
Fungsi protein dalam tubuh :
Sebagai komponen penyusun sel (lipoprotein sebagi membran sel,
nukleo protein dalam ribosom dan kromosom)
Sebagai enzim
Sebagai hormon
Sebagai antibodi
Sebagai cadangan dalam tubuh
©1999 Timothy G. Standish
Protein merupakan rantai asam amino dengan ikatan peptida dan
ikatan disulphida sehingga senyawa protein terdapat dalam bentuk
rantai yang panjang sangat tidak beraturan seperti benang
kusut.
Protein terdapat dalam jenis, sifat, berat molekul dan fungsi
biologis yang berbeda-beda.
Beberapa protein juga mengandung senyawa atau unsur lain selain
asam amino atau disebut protein komplek (conjugated protein),
misalnya :
Glucoprotein, juga mengandung senyawa karbohidrat
Lipoprotein, juga mengandung senyawa lemak
Chromoprotein, mengandung senyawa pewarna misal hemoglobin,
myoglobin, chlorophyl.
©1999 Timothy G. Standish
Protein yang terdapat dalam tubuh atau dalam suatu jenis bahan
mempunyai spesifikasi yang berbeda satu dengan yang lain.
Setiap bahan mempunyai spesifikasi protein tertentu, yang berbeda
dengan bahan lain.
Protein juga kemungkinan besar berubah karena pengaruh
lingkungan.
Untuk mengetahui spesifikasi dan berubah tidaknya protein dalam
suatu bahan, dapat dianalisis dengan menggunakan gel
electrophoresis (SDS-PAGE).
©1999 Timothy G. Standish
Uji kandungan true protein sampel
Identifikasi jenis-jenis protein suatu bahan
Komposisi kandungan protein bahan
Uji kemurnian atau pemalsuan suatu bahan
Uji jenis enzim, hormon, antibodi
Uji DNA, RNA, Gen
©1999 Timothy G. Standish
Memahami prinsip analisis protein dengan SDS-PAGE
Memahami prosedur analisis protein dengan SDS-PAGE secara
rinci
©1999 Timothy G. Standish
Electrophoresis : Pemisahan suatu senyawa berdasarkan ukuran atau
beratnya dengan bantuan medan listrik (kutub negatif dan kutub
positif)
PAGE : Pemisahan senyawa tersebut terjadi pada kolom-kolom pada gel
yang dibuat dari senyawa polyacrylamide (campuran acrylamide-bis
acrylamide)
SDS-PAGE : bahwa sebelum dianalisis dengan PAGE, sampel (protein)
diperlakukan dengan larutan sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk
merubah struktur (meluruskan) bentuk protein dan untuk memberikan
muatan negatif pada protein.
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
Jika protein suatu sampel diberi muatan listrik negatif
(diperlakukan dengan larutan Laemmli bufer) kemudian dituangkan ke
dalam kolom pada ujung gel yang dihubungkan dengan listrik kutub
negatif dan ujung yang lain dihubungkan dengan listrik kutub
positif. Karena adanya gaya tolak dari kutub listrik negatif dan
gaya tarik kutub positif terhadap protein sampel dan larutan
Laemmli bufer yang bermuatan negatif, maka campuran protein dan
larutan Laemmli bufer tersebut akan bergerak menuju ke kutub
positif.
Kecepatan gerakan tiap jenis protein sangat dipengaruhi oleh berat
molekulnya (BM). Protein dengan BM besar bergerak lebih lambat
dibanding protein BM rendah. Pergerakan protein juga lebih lambat
dibanding larutan Laemmli bufer.
©1999 Timothy G. Standish
Adanya perbedaan gerakan tersebut, maka protein yang BMnya lebih
besar akan tertinggal dan terpisah dengan protein yang BMnya lebih
rendah.
Adanya gerakan protein yang lebih lambat dibanding gerakan larutan
Laemmli bufer, menyebabkan larutan Laemmli bufer akan bergerak
lebih cepat, terpisah dan meninggalkan protein. Protein yang
tertinggal, terlepas, dan akhirnya terpisah dengan larutan Laemmli
bufer akan berubah menjadi netral tidak bermuatan listrik, sehingga
protein tidak terpengaruh oleh gaya tolak kutub listrik negatif
maupun gaya tarik kutub listrik positif sehingga protein berhenti
bergerak pada posisinya masing-masing.
Sementara itu larutan Laemmli bufer bergerak terus hingga mencapai
kutub listrik positif dan meninggalkan gel (Proses electrophoresis
selesai).
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
Dalam analisis protein menggunakan SDS-PAGE, protein suatu sampel
yang akan dianalisa (sampel padat maupun cair) harus :
dipersiapkan dalam bentuk larutan,
diberi muatan listrik negatif.
©1999 Timothy G. Standish
Bahan yang digunakan :
Larutan Laemmli bufer konsentrasi ganda untuk sampel cair atau 1
kali konsentrasi (1 bagian larutan konsentrasi ganda + 1 bagian
aquadest) untuk sampel cair.
Bahan kimia yang dibutuhkan untuk membuat Larutan Laemmli bufer
konsentrasi ganda (100 ml) :
No
25 ml
1 ml
©1999 Timothy G. Standish
Larutan bufer Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8 berfungsi sebagai larutan
pengkondisi agar larutan yang dibuat atau sampel bersifat
basa.
Larutan mercaptoethanol : untuk melonggarkan dan memutus ikatan
disuphida antar protein
Larutan SDS : untuk meluruskan struktur protein dan memberikan
muatan negatif pada protein
Larutan gliserol : sebagai pengental sampel agar mempunyai
integritas dan berat jenis yang lebih besar.
Zat pewarna bromo phenol blue : untuk memberi warna pada sampel
sehingga memudahkan pengamatan pergerakan larutan Laemmli buffer
dan protein yang terjadi dalam gel selama proses electrophoresis
berlangsung.
©1999 Timothy G. Standish
C12H25NaO4S
Because it is amphipathic, SDS is a potent detergent as a common
ingredient of shampoos laundry detergent and other cleaning
products
Polar
SDS is a common ingredient in detergents
Other names for SDS include lauryl sulfate and sodium lauryl
sulfate
As a detergent SDS destroys protein secondary, tertiary and
quaternary structure
This makes proteins rod shaped
SDS also sticks to proteins in a ratio of approximately 1.4 g of
SDS for each gram of protein
Negative charge on the sulfate groups of SDS mask any charge on the
protein
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
In aqueous solutions, SDS polarizes releasing Na+ and retaining a
negative charge on the sulfate head
So much SDS binds to proteins that the negative charge on the SDS
drowns out any net charge on protein side chains
In the presence of SDS all proteins have uniform shape and charge
per unit length
SDS nonpolar chains arrange themselves on proteins and destroy
secondary tertiary and quarternary structrure
Thus, protein shape is no longer an issue (complex) as the protein
SDS complex becomes rod shaped
©1999 Timothy G. Standish
Gambar perubahan yang terjadi pada protein akibat diperlakukan
dengan larutan Laemmli bufer
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
Mikro pipet otomatis (1 ml) beserta tipnya
Botol (100 ml)
Sentrifuge (20.000-30.000g atau 12.000-18.000rpm)
Timbang sampel padat 1-10mg ( + 0,1mg protein/ml dalam
supernatan)
Masukkan sampel ke dalam vial (2 ml), tambahkan 2 ml lar. Laemmli
bufer, aduk dengan menggunakan vortex sampai tercampur rata dan
lanjutkan dengan ultrasonicator selama 10 menit
Panaskan sampel dalam air mendidih (90-95oC) selama 2-3 menit, lalu
dinginkan.
Sentrifuge sampel pada kecepatan 13.000-18.000 rpm selama 5
menit
Tampung supernatan dalam vial (1,5 ml) dan sampel siap untuk
dianalisis atau disimpan di freezer maks. 6 minggu.
©1999 Timothy G. Standish
Buat lar. Laemmli bufer (2xkonsentrasi)
Pipet sampel cair sebanyak 0,2 ml dan masukkan sampel ke dalam vial
(1,5 ml),
Tambahkan 0,2 ml lar. Laemmli bufer (2xkons.), aduk dengan
menggunakan vortex sampai tercampur rata
Panaskan sampel dalam air mendidih (90-95oC) selama 2-3 menit, lalu
dinginkan.
Sentrifuge sampel pada kecepatan 13.000-18.000 rpm selama 5
menit
Tampung supernatan dalam vial (1,5 ml) dan sampel siap untuk
dianalisis atau disimpan di freezer maks. 6 minggu.
©1999 Timothy G. Standish
Gel merupakan selembar jelly tipis (tebal +1 mm) yang dicetak di
antara dua lempeng kaca.
Dalam proses electrophoresis, gel berfungsi sebagai media
bergeraknya senyawa dalam sampel (protein) dan lar. Laemmli bufer
selama proses electrophoresis berlangsung dan menjadi tempat
bertautnya protein bands pada hasil proses electrophoresis.
Gel dalam analisis menggunakan SDS-PAGE terbuat dari polimerisasi
campuran larutan acrylamide dan bis solution (bis acrylamide)
2. Tahap pembuatan gel
©1999 Timothy G. Standish
Polyacrylamide Gels
Polyacrilamide gel is a polymer made of acrylamide (C3H5NO) and
bis-acrilamide (N,N’-methylene-bis-acrylamide C7H10N2O2)
Acrylamide
Acrylamide
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
CH2
bis-Acrylamide
O
CH
CH2
NH2
C
Acrylamide
©1999 Timothy G. Standish
Acrylamide polymerizes in the presence of free radicals typically
supplied by ammonium persulfate (AMPER)
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
SO4-
TMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) serves as a catalyst in
the reaction
SO4-.
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
NH2
O
CH
CH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
NH2
O
CH
CH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
O
CH
CH2
NH2
C
CH2
bis-Acrylamide
©1999 Timothy G. Standish
Polyacrylamide Gels
Pore size in gels can be varied by varying the ratio of acrylamide
to bis-acrylamide
Protein separations typically use a 29:1 or 37.5:1 acrylamide to
bis ratio
Lots of bis-acrylamide
Imbangan larutan acrylamide dan bis solution (bis acrylamide) dalam
pembuatan gel akan menentukan kerapatan dan ukuran pori-pori dalam
gel yang terbentuk.
Semakin tinggi proporsi larutan bis solution yang digunakan semakin
padat dan semakin kecil porositas dalam gel yang terbentuk.
©1999 Timothy G. Standish
Ada 2 macam Gel yang dibutuhkan dalam SDS-PAGE yaitu :
Separating gel (gel pemisah) merupakan gel di mana gerakan atau
proses pemisahan protein terjadi karena adanya pengaruh kutub
listrik negatif pada ujung atas gel dan kutub positif pada ujung
bawah gel. Porositas lebih longgar dan besar (rasio acrylamide/bis
solution 37,5 : 1 atau 2,6 % crosslinkers)
Stacking gel (gel padat) merupakan gel, tempat di mana sampel
diletakkan (loading). Porositas lebih padat dan kecil (rasio
acrylamide/bis solution 19:1 atau 5 % crosslinkers)
Keduanya menjadi satu kesatuan, stacking gel terletak di atas
separating gel (lihat gambar berikut).
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
Alat yang digunakan :
Cassete pencetak gel (dua keping kaca bening tebal 2-3 mm ukuran
8x8 cm dan 8x7,5 cm, 2 buah penyekat (spacer) tebal 1 mm ukuran
8x0,5 cm, 4 buah penjepit kertas dan sebuah sisir pencetak kolom
tebal 1 mm ukuran 8 cm dan lubang sisir 3mm
Spuit (5 ml) 2 buah beserta tip kapiler (capilary tips)
Pipet otomatis (1 ml) beserta tip
Kaca tebal 0,5 cm ukuran 40x30 cm sebagai alas.
Prosedur pembuatan gel
©1999 Timothy G. Standish
Bahan yang digunakan :
Larutan agarose (1 %) sebagai penyumbat bagian bawah, samping kiri
dan kanan cassete pencetak gel
Bahan kimia untuk membuat separating gel
Bahan kimia untuk membuat stacking gel
Prosedur pembuatan gel
*) disebut juga larutan starter (katalisator polimerisasi), harus
dicampurkan menjelang pembuatan gel dilaksanakan
No
2,5 ml
5,0 ml
*) disebut juga larutan starter (katalisator polimerisasi), harus
dicampurkan menjelang pembuatan gel dilaksanakan
No
1,0 ml
0,4 ml
Prosedur :
Persiapkan cassete pencetak gel dengan dua keping kaca dan menaruh
penyekat diantaranya pada sisi kanan dan kiri. Sisi kanan, kiri,
dan bawah harus rata.
Jepit kedua lempeng kaca tersebut dengan jepit kertas pada sisi
kanan dan kiri.
Berdirikan cassete pada alas kaca datar.
Sumbat bagian sisi kiri, kanan, dan bawah cassete dengan
menyemprotkan larutan agar panas (cair) menggunakan pipet kapiler
secara pelan dan hati-hati. Yang harus diperhatikan saat menyumbat
cassete adalah harus tersumbat sempurna (tidak bocor), tinggi
larutan agar penyumbat bagian bawah cassete maksimal 2 mm dan rata
(datar), serta tidak ada gelembung udara yang dapat mengurangi gaya
tarik saat electrophoresis berlangsung.
Tunggu sampai larutan agar mengeras, sehingga cassete siap dituangi
larutan pembentuk gel.
Prosedur pembuatan gel
Prosedur :
Jika cassete telah siap, siapkan larutan pembentuk separating gel
dengan melarutkan semua bahan. TEMED dan AMPER yang harus
dicampurkan sesaat menjelang larutan dituangkan ke dalam
cassete.
Isi/basahi dengan larutan SDS sampai penuh. Yakinkan bahwa cassete
tidak bocor dan tidak ada gelembung udara, kemudian hisap larutan
SDS dengan pipet kapiler sampai bersih.
Tuangkan larutan gel ke dalam cassete sampai setinggi + 6 cm atau +
2 dari permukaan atas lempeng kaca yang pendek. Catat volumen yang
dibutuhkan dan perhatikan betul apakah cassete benar-benar tidak
bocor.
Tuangkan aquadest diatas larutan separating gel secara pelan.
Aquadest untuk menutup larutan gel agar tidak kontak dengan udara
dan agar permukaan gel benar-benar datar.
Prosedur pembuatan gel
Biarkan/tunggu sampai gel terpolimerisasi (30-60 menit), terlihat
jika ada garis pemisah jelas antara gel dan aquadest.
Jika sudah terpolimerisasi dengan sempurna, siapkan larutan
pembentuk stacking gel.
Jika larutan stacking gel siap, hisap aquadest dari cassete sampai
bersih dengan menggunakan pipet kapiler.
Pasang sisir pencetak kolom pada cassete kemudian tuangkan larutan
stacking gel ke dalam cassete. Perhatikan jangan sampai ada
gelembung udara terutama di antara gigi sisir. Jika ada gelembung
udara, goyang-goyang sisir agar gelembung hilang atau hisap dengan
pipet kapiler.
Prosedur pembuatan gel
Tunggu gel hingga mengalami polimerisasi (30-60 menit). Perhatian
tambahkan larutan stacking gel jika di dalam cassete berkurang
secara sering agar permukaan atasnya tidak kering.
Setelah terpolimerisasi dengan sempurna (terlihat jelas
terbentuknya kolom pada gigi-gigi sisir), angkat sisir dari
cassete. Cuci dengan aquadest 2 kali dan akhirnya isi dengan
larutan bufer electrophoresis negatif.
Gel siap dipergunakan.
Prosedur pembuatan gel
Electrophoresis ; proses pemisahan/ pergerakan senyawa (protein)
pada gel akibat adanya pengaruh muatan listrik.
Jika sampel di loading pada kolom stacking gel, kemudian ujung
stacking gel dihubungkan dengan listrik kutub negatif dan ujung
separating gel dihubungkan dengan listrik kutub positif dari
electrophoresis power supply (EPS) maka protein sampel akan
bergerak menuju ke kutub positif.
3. Tahap proses electrophoresis
©1999 Timothy G. Standish
0,5 ml
0,5 ml
No
250 ml
250 ml
©1999 Timothy G. Standish
Buat denah atau urutan sampel beserta volume sampel sesuai dengan
urutan kolom di mana masing-masing sampel akan diloading. Selalu
letakkan sampel standar pada kolom pertama.
Letakkan dan urutkan sampel yang akan diloading sesuai dengan denah
yang telah dibuat pada rak sampel
Masukkan (loading) sampel sebanyak 6-10 μl secara pelan-pelan ke
dalam masing-masing kolom sesuai dengan denah menggunakan pipet
kapiler (kapasitas 20 μl).
Jika sampel sudah di loading semua maka cassete sampel siap
dilakukan electrophoresis.
Prosedur loading sampel
Catatan penting dalam meloading sampel :
Jumlah sampel disesuaikan dengan kandungan protein pada sampel.
Jika terlalu banyak band yang terbentuk terlalu tebal sehingga
kemungkinan berhimpitan satu dengan yang lain, sebaliknya sampel
terlalu sedikit band yang terbentukl terlalu tipis sehingga
kemungkinan tidak semua protein dapat teridentifikasi.
Memasukkan sampel ke dalam masing-masing kolom harus benar-benar
tuntas dengan cara menekan pipet secara penuh 3-4 kali sampai
keluar gelembung udara pada ujung pipet dan dengan tetap ditekan
pipet ditarik dari kolom.
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
©1999 Timothy G. Standish
Letakkan bagian bawah cassete sampel pada mangkok yang berisi
larutan bufer electrophoresis positif (dasar cassete sampel harus
terendam dalam larutan)
Pasang mangkok yang lain pada bagian atas cassete sampel dan tutup
lubang antara mangkok dan cassete sampel dengan larutan agarose
(1%) panas. Tunggu hingga lar. agarose mengeras dan menyumbat
dengan sempurna (tidak bocor).
Isi mangkok atas dengan larutan bufer electrophoresis
negatif.
Tutup tataan cassete sampel dengan tutup yang disediakan.
Hubungkan kabel mangkok bawah (warna merah) dengan kutup positif
EPS dan kabel mangkok atas (warna hitam) dengan kutup negatif
EPS.
Maka proses electrophoresis siap dilaksanakan.
Prosedur :
PANAH lalu tekan ENTER
- Set Voltase yang dibutuhkan, tergantung jumlah gel yang
dianalisa setiap gel dibutuhkan voltase 10 V dan minimal 30 V
dengan menekan TANDA PANAH lalu ENTER.
- Set Ampere yang dibutuhkan, yaitu pilih 100 mA dengan
menekan TANDA PANAH lalu ENTER.
- Pemrograman selesai.
Jika selesai setting program selesai, lalu aktifkan EPS dengan
menekan ENTER 3 kali hingga muncul tulisan OFF lalu tekan RUN
Perhatikan adanya gerakan sampel pada gel, jika sudah mencapai
ujung atas separating gel (+ 15 menit) tingkatkan voltase menjadi
80 V, dengan cara :
- Tekan tombol PAUSE CONTINUE untuk menghentikan sementara
proses
electrophoresis.
- Tekan tombol ENTER berkali-kali sampai angka voltase berkedip,
lalu tekan
TANDA PANAH ke atas sampai menunjuk angka 80 V, tekan ENTER sampai
tanda OFF berkedip lalu tekan tombol RUN.
- Dengan cara yang sama tingkatkan voltase setiap 15 menit sebanyak
20 V (lakukan 2 kali) sampai voltase 120 V. Kemudian tunggu sampai
proses electrophoresis selesai (+ 90 menit) lalu tekan tombol
OFF.
Pelaksanaan proses electrophoresis