Universitatea de Medicina si Farmacie “Grigore T. Popa” Iasi

Facultatea de Bioinginerie Medicala

Master: BIOTEHNOLOGII MEDICALE SI BIOMATERIALE AVANSATE

1

Tehnici de analiza si caracterizare a biomaterialelor si produsilor de biosinteza

Introducere� Analit – substanţa de interes dintr-o probă� Analiza instrumentală:

� Analiză – analusis (lb. Greacă) = descompunere• Desfacerea întregului în părţi constitutive

� Instrument – aparat sau echipament care permite efectuarea unei măsurători

• Ex. Termometru

� dezvoltă şi aplică metode şi strategii în scopul obţinerii de informaţii cu privire la compoziţia şi natura materiei în spaţiu şi timp utilizând instrumente de măsură

INFORMAŢII CALITATIVE(identitatea, puritatea)

INFORMAŢII CANTITATIVE

ANALIZA INSTRUMENTALĂ

3

FUNDAMENTE ALE TEHNICILOR DE ANALIZA INSTRUMENTALE

4

I.1. Proprietate fizică, chimică şi fizico-chimică

� Proprietate fizică a unei substanţe – însuşire măsurată sau observată direct fără schimbarea naturii substanţei� Ex. Culoarea, mirosul, curgerea lichidelor etc.

5

� Proprietate chimică a unei substanţe – se observă în cursul unei reacţii chimice în urma căreia natura substanţei iniţiale se schimbă� Ex. Arderea compuşilor organici

6

� Proprietate fizico-chimică – însuşire de natură fizică care poate fi observată / măsurată indirect (cu ajutorul instrumentelor)� Ex. Densitatea, pH,

absorbţia luminii etc.

Absorbţia luminii

Măsurarea pH-ului

7

I.2. Tipuri de metode de analiză

�� ClasiceClasice

� CALITATIVE – identificare prin culoare, indicatori, miros, temperatură de topire, temperatură de fierbere etc.

� CANTITATIVE – măsurarea directă a masei sau volumului - metode gravimetrice, volumetrice

8

�� InstrumentaleInstrumentale

� Aceleaşi instrumente (aparate) se folosesc atât pentru determinări calitative, cât şi cantitative

Fluxul procesuluiFluxul procesului

de analizăde analizăinstrumentalăinstrumentală

Energie /Stimul

Analit(matrice)

Răspunsanalitic

Dateexperimentale 9

� Analiza instrumentală calitativă – proprietatea măsurată (fizico-chimică) depinde de natura probei; proprietatea este o caracteristică intrinsecă a analitului de măsurat din probă şi are o valoare predeterminată în condiţiile specifice de măsurare

• Ex. Indicele de refracţie n – măsoară modul în care o anumită probă refractă lumina (refracţia = abaterea luminii de la direcţia de propagare atunci când întâlneşte un mediu cu densitate optică diferită de cea a mediului din care provine)

• nDapă = 1,333 la 20 ºC

• nDmetanol = 1,3288 la 20 ºC 10

Probă

Rază de lumină

Refracţia luminii

Aparat/instrument: refractometrur

in

sin

sin=

i

r

11

� Analiza instrumentală cantitativă:� măsoară o proprietate (fizico-chimică)

caracteristică analitului din probă şi care depinde de concentraţia acestuia.

• Ex. Indicele de refracţie depinde direct proporţional cu concentraţia

• Pentru aflarea concentraţiei analitului dintr-o probă:a) se compară semnalul măsurat al acesteia cu semnalul corespunzător unor soluţii standard ale analitului în cauză (CEA MAI DES ÎNTÂLNITĂ METODĂ)b) Se ţine cont de valoarea unor constante fizico-chimice şi de legile care leagă semnalul măsurat de concentraţie prin intermediul acestor legi (Ex. Legea Lambert-Beer) 12

Serie de soluţii standard cu concentraţii crescânde:

C1 < C2 < C3 < ..... < Ciatunci

n1 < n2 < n3 < ..... < ni

nici

…n1c1

n2c2

n3c3

n

c

n3

n2

n1

c3c2c1

Creştere direct proporţională a mărimii n cu creşterea concentraţiei c

n=f(c) 13

a) Metoda cantitativă bazată pe folosirea unor soluţii standard

nX

cX

14

b) Metoda cantitativă bazată pe folosirea unor constante fizico-chimice

Legea LAMBERT-BEER

unde:A – absorbanţăε- absorbtivitate molară sau coeficient molar de absorbţie → caracteristică a substanţei absorbante într-un solvent datl - lungimea cuvei în care se află soluţiac - concentraţia substanţei în soluţieI0 – intensitatea radiaţiei incidenteI – intensitatea radiaţiei transmise

de unde c = A/(εl)

Exemple de tipuri de metodeinstrumentale

Proprietatea măsurată Metoda instrumentală

Absorbţia de radiaţii Spectrometrie de absorbţie în UV-VIS, IR etc.

Rotaţia luminii Polarimetrie

Împrăştierea luminii Turbidimetrie

Potenţialul electric Potenţiometrie

Rezistenţa electrică/conductanţa electrică

Conductometrie

Aceste metode instrumentale sunt adesea combinate (cuplate) cu tehnici cromatografice şi electroforetice 15

I.3. Designul instrumental şi natura răspunsului instrumental

16

Factorii care influenţează o măsurătoare

proba

FACTORI DE INFLUENŢĂ

(Variabile independente)

RĂSPUNSURILE MĂSURATE

(Variabila dependentă)

X1

X2

Y3

Y2

Y1

Exemplu:�Concentraţia analitului�Solventul probei�Temperatura�Matricea probei etc.

Exemplu:�Absorbţia luminii – absorbanţa A�Conducerea curentului electric –conductanţa K�Fluorescenţa – Intensitatea de fluorescenţă Ifl 17

I.4. Procesul de măsurare instrumentală şi relaţia semnal-proprietate

Procesul de Procesul de

măsuraremăsurare

Problema Problema

analiticăanalitică

18

19

� Pregătirea/prelucrarea probei în vederea analizei

A. OperaA. Operaţţii preliminareii preliminare

� Verificarea calibrării instrumentelor de măsură

� Calibrarea instrumentelor de măsură etc.

20

B. B. Măsurarea Măsurarea şşi transformarea i transformarea

semnaluluisemnalului

21

Moduri de detecţie

Senzorul/traductorul instrumental transformă stimulul recepţionat (din probă) în

semnal electric care apoi este tradus într-o valoare numerică corespunzătoare

unei proprietăţi fizico-chimice. 22

C. AchiziC. Achiziţţia semnalelor ia semnalelor şşi procesarea datelori procesarea datelor

DATEEXPERIMENTALE

Probe

Standarde

DATE TABELARE

Constantefizico-chimice

Factori de conversie(diluţii, unităţi de

măsură etc.)

Date statistice

Procesarea datelor Procesarea datelor

(computerizat)(computerizat)

RezultateRezultate

RapoarteRapoarte23

I.5. Elemente de prelucrare şi interpretare a datelor experimentale

24

� Tabelele ≈ “bază de date”� conţin valorile numerice ale datelor experimentale� sunt matrici în care valorile variabilelor independente sunt trecute în prima

coloană, iar valorile interdependenţelor momentane între variabile sunt trecute pe rânduri

� elementele caracteristice• titlul tabelului – clar, complet, concis• capul de tabel – denumirea variabilelor, simbolurile şi unităţile lor de măsură

� tabelele prezintă interdependenţe discrete între variabile, iar datele introduse în tabele:

• pot fi folosite ca atare în calcule statistice• pot fi prelucrate ulterior prin grafice şi ecuaţii

� Diagramele� prezintă în sistem cartezian relaţia dintre două sau mai multe variabile sub

forma unei linii, curbe sau suprafeţe de răspuns

� permit aprecierea calitativă a unei dependenţe matematice între mărimile reprezentate şi, în unele cazuri, se poate deduce forma relaţiei matematice corespunzătoare

25

Concentraţia[% m/V]

A pH n K [S]

1 0,234 1,23 1,3324 4,23

4 0,456 2,67 1,3398 6,78

5 0,678 5,90 1,3467 8,92

Valorilevariabilei

independente

Valorile interdependenţelor momentane între variabile

Explicarea simbolurilor:�A – absorbanţa�pH�n – indice de refracţie�K – conductanţa, S – unitatea de măsură, Siemens

26

Variabila indepenentă27

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1st Qtr 2nd Qtr 3rd Qtr 4th Qtr

East

West

North

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

1st Qtr 2nd Qtr 3rd Qtr 4th Qtr

North

West

East

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1st Qtr 2nd Qtr 3rd Qtr 4th Qtr

East

West

North

1st Qtr

2nd Qtr

3rd Qtr

4th Qtr

28

Prelucrarea şi interpretarea datelor experimentale

Rezultatele suntinterpretate faţă de limite de

acceptanţă sau

de referinţă → în conformitate cu domeniul de aplicare(medicină, farmacie etc.)

29

� Modele matematice = funcţii matematiceY = f(X1,X2,…,XN)

� Statistica – verificarea modelelor matematice

REPREZENTAREA DATELOR EXPERIMENTALE PRIN ECUAŢII (FUNCŢII) MATEMATICE

� Ecuaţiile (funcţiile) matematice reprezintă forma cea mai compactă şi mai uşor de utilizat pentru exprimarea datelor experimentale.

30

� Evaluarea formei ecuaţiilor care descriu evoluţia perechilor de date Y – X

� necesită o analiză calitativă a datelor experimentale

� forma ecuaţiilor poate rezulta:• prin analogie cu fenomene asemănătoare• prin compararea curbelor obţinute prin

reprezentarea datelor experimentale cu grafice ale unor funcţii matematice tipice

� valabilitatea formei alese rezultă din precizia cu care ecuaţia obţinută reprezintă datele experimentale (fitarea - potrivirea datelor experimentale pe curba care descrie funcţia aleasă – apreciere vizuală sau prin calcule matematice → calcularea unor mărimi statistice, coeficient de corelare r sau coeficient de determinare r2, notat și R2)

0

50

10 0

15 0

20 0

25 0

30 0

35 0

40 0

45 0

0 1 2 3 4 5 6 7

ex

p(x

)

x

xexf =)(

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

0 1 2 3 4 5 6

ln(x

)

x

xxf ln)( =31

Model linear Y = aX + bNu corespunde, R2 < 0,99

Model exponenţial Y = aX2 + bX + cCorespunde, R2

→ 1Curba fitează punctele experimentale

32

R sau R2 trebuie să fie cel puțin 0,99, în valori absolute, pentru a aprecia că funcția matematică aleasă se potrivește punctelor experimentale.

� De ce se lucrează cu modele matematice?

� Cunoscând modul în care o mărime Y depinde de X, din ecuația matematică care leagă Y de X se poate afla care este valoarea X1 ce corespunde unei mărimi Y1 măsurate:

• De exemplu, dacă ecuaţia este Y = a X + b, atunci X = (Y – b) / a, de unde X1=(Y1 – b) / a

• Grafic, problema poate fi rezolvată prin interpolare

33

34

Y

X

Y1

X1

Interpolarea grafică în cazul unei funcţii liniare Y = a X + b. Permite aflarea valorii X1 ce corespunde variabilei Y1

� Cum se obţine ecuaţia y = f(x)?

� Se folosesc sisteme de referinţă cărora li se cunoaşte caracteristica X, ex. soluţii standard de analit cu concentraţiile X cunoscute.

� Se determină pentru fiecare soluţie standard proprietatea Y corespunzătoare, ex. cu ajutorul unor instrumente de măsură li se măsoară pH-ul.

35

� Cum se obţine ecuaţia y = f(x)? (cont.)

� Se reprezintă grafic punctele corespunzătoare perechilor Y – X

� Se apreciază ce funcţie matematică se potriveşte cel mai bine punctelor şi cu ajutorul aplicaţiilor soft se calculează ecuaţia care leagă Y de X, de exemplu poate fi o ecuaţie liniară Y = a X + b.

� Modelul se verifică prin calcularea coeficientului r sau r2 care trebuie să fie > 0,99

36

Bibliografie orientativă

� Atkins P. The Elements of Physical chemistry, 3rd Edition. Oxford University Press, 2003.� Bojiţă M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza şi controlul medicamentelor.

Volumul 2. Metode instrumentale în analiza şi controlul medicamentelor. EdituraIntelcredo Deva, 2003.

� Watson D.G. Pharmaceutical Analysis. A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemists. 2nd Edition. Editura Elsevier, 2005.

� Duşa S. şi col.: Chimie Analitică Instrumentală, Editura University Press, Tg. Mureş, 2007.

� Gocan S. Cromatografia de înaltă performanţă, partea a II-a: Cromatografia de lichidepe coloane. Editura Risoprint, Cluj-Napoca, 2002.

� Burgot G., Burgot J.L. Méthodes Instrumentales d’Analyse Chimique et Applications. Méthodes chromatographiques, electrophoreses et méthodes spectrales. Editions Médicales Internationales, 2002.

� Rouessac F., Rouessac A. Analyse chimique. Méthodes et techniques instrumentales modernes. 5e Edition, Dunod, Paris, 2000.

� Skoog D.A., Holler F.J., Nieman T.A. Principles of Instrumental Analysis. 5TH Edition. Saunders College Publishing, 1998.

� Walcarcel M. Principles of Analytical Chemistry, Springer-Verlag, Berlin, 2000.

37