TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

• Rta inmune adaptativa mediada por linfocitos es estudiada mediante:

Aislamiento Separación poblaciones-subpoblaciones comportamiento

• No es posible diferenciar los linfocitos T de los B por microscopía ordinaria, ni en la sangre ni en los órganos linfoides,  aunque sí se observan algunas diferencias por microscopía electrónica de barrido. No obstante, se disponen de varios métodos que permiten diferenciar y cuantificar los linfocitos, sus diferentes subpoblaciones e incluso su capacidad de responder a distintos antígenos. Los métodos para el estudio de los linfocitos, más utilizados en la actualidad, los podemos agrupar en:

.- Determinación de marcadores y receptores de

membrana.

.- Determinación de antígenos de membrana.

.- Pruebas funcionales.

TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS• Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968) Humanos: Sangre Periférica – Organos

M. experimental : bazo, NL, timo

Importante conocer si se requiere esterilidad . Rendimiento: 1-2 x 106cel / ml

TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

1.- Marcadores y receptores de membrana.

Estos métodos han sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y

cuantificar poblaciones de linfocitos B y T. Estos marcadores convencionales,

están basados en las características específicas de ciertos receptores de

membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. Los principales

marcadores son:

Principales receptores utilizados

tradicionalmente para diferenciar los linfocitos T de los B

Linfocitos B: Inmunoglobulinas de superficie

Linfocitos T:Rosetas con eritrocitos de carnero

Linfocitos B

Linfocitos T

.- Para los linfocitos T:Rosetas con los eritrocitos. Los linfocitos T presentan la característica de formar Rosetas cuando se

unen a los eritrocitos de carnero.Actualmente se usan métodosen los que GRC se tratan con

neuroaminidasa o AET( 2-aminoethylisothiouronium bromide) para aumentar la unión de las cel. T.

Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el  marcaje con naranja de acridina y la posterior

observación al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con la

naranja de acridina, presentando los linfocitos T rosetas mientras que los B se marcan con la naranja de

acridina pero no forman rosetas. E

EE

E

EE

E

E

E

.- Para los linfocitos B: inmunoglobulinas de superficie que pueden ser detectadas coninmunoglobulinas de superficie que pueden ser detectadas con

suerosuero policlonales o Acs. monoclonales policlonales o Acs. monoclonales marcados con fluorescencia marcados con fluorescencia ( (isoisotiotiocianato cianato de de fluoresceínafluoresceína). ). En el En el microscopio de fluorescenciamicroscopio de fluorescencia se puede observar que en la se puede observar que en la membranamembrana aparece una reacción fluorescente positiva.aparece una reacción fluorescente positiva.

Rendimiento: > 95% cel. T, < 1% cel. B y ~ 2% monocitos

Población no T: < 2% cel. T, 40% cel. B y 60% monocitos

2.- Antígenos de membrana : Expresión diferencial de marcadores de superficie y disponibilidad de AcMo con especificidad deseada

 Técnicas:.- Lisis Ac/Complemento.- Panning.- S. Magnética.- Análisis por citometría de flujo..- Inmunohistoquímica.  

SeparaciónIdentificación

Ag -

Ag+Ag+

Ag+

Ag+

Ag -

Ag -

Ag -

Ag -

Ag -

Placa sensibilizada Ac

- positiva

Panning:

- negativa

Wysocki y Sato,1978; Mage y col,1977

Engleman y col,1982; Payne y col, 1981

Rendimiento: > 90% pureza y viabilidad

Subpoblaciones de linfocitos pueden ser separados fisicamente usando Acs acoplados a perlas magnéticas

Ventajas: pureza, reproducibilidad, manejo de cantidades variables de células ( 106 a 1010 células).

Rendimiento: > 98% pureza

Análisis por citometría de flujo.

• El citómetro de flujo es un aparato que permite caracterizar e incluso separar las diferentes poblaciones linfocitarias “in vitro” mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína, PE,etc; frente a los marcadores de superficie específicos de cada subpoblación que se desee estudiar.

• Las células, sobre las que se adicionan los monoclonales (se pueden valorar varios a la vez) frente al marcador objeto de estudio (CD2, CD4, CD8, etc.) pasan a través de un haz de un láser que detecta su capacidad para dispersar la luz (tamaño de las células) y la fluorescencia que emiten (tipo de célula). Las mediciones obtenidas se indican en porcentajes de cada población.

Costoso... Exacto, rápido y fácil en manos experimentadas

Citometría de Flujo

• Inmunohistoquímica. Utilizando anticuerpos monoclonales, marcados con fluorescencia o con peroxidasa,  frente a los diferentes linfocitos,  se puede valorar la situación de estas células en cualquier tejido. Incluso utilizando dos anticuerpos monoclonales, cada uno frente a una población linfocitaria distinta, y cada uno marcado con una enzima diferente (doble marcaje) (peroxidasa –fosfatasa alcalina) se pueden estudiar dos poblaciones celulares a la vez en cualquier tejido .

Forward scatter (size)

Side scatter

E

L

MG

3.- Pruebas funcionales:

• Estos métodos de estudio se basan en valorar la capacidad que tanto los linfocitos T como los B  tienen para reconocer a un antígeno determinado. Las técnicas más utilizadas son:

• ·         Estimulación blástica o  Blastogénesis

• ·         La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+)

La utilización de la transformación linfocitaria, blastogénesis o proliferación es actualmente una de las técnicas  más precisas y difundidas para el estudio de la capacidad de estimulación específica y no específica de los linfocitos “in vitro”. Esta técnica se basa en la capacidad que los linfocitos tienen para responder frente a un antígeno (respuesta específica) que por vacunación o por sufrir una infección, ha inducido linfocitos memoria.

Los linfocitos al estar de nuevo en contacto con el antígeno inducen una proliferación, la cual puede ser inducida de forma no específica gracias a la capacidad de los linfocitos de reaccionar con diferentes tipos de lectinas o mitógenos. Los mitógenosinducen una estimulación blástica de tipo inespecífico tanto en los linfocitos B como en los T.

• TECNICAS:a.- Incorporación de 3H dentro del ADN de las células.b.- FACS contenido de ADN-ARN (proliferación de células individuales)c.- Ensayos colorimétricos: MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5diphenyltetrazolium

bromide) y SDS

• Funciones efectoras de cel. T . ¿ Qué podemos medir ? Secreción de citoquinas en Sn de cultivo. Efectos regulatorios sobre cel. B ( por ej. cuantificar niveles de Ig) Actividad citotóxica.

La actividad citotóxica de los linfocitos T(CD8+)La actividad citotóxica de los linfocitos T (CD 8+) frente a una célula blanco se puede

estudiar, midiendo la capacidad de destrucción, que un determinado número de

linfocitos T tienen para destruir un determinado número de células blanco, al estar

ambas poblaciones en contacto. Hay varios métodos para poder valorar el porcentaje de

lisis o muerte celular que expresan las células blanco, aunque el más utilizado por su

precisión, sensibilidad y reproducibilidad, es el de la liberación de cromo 51 procedente

de las células blanco.

Este método consiste, brevemente, en lo siguiente: Las células blanco

(que expresan los antígenos determinados en su membrana) son

marcadas con Cromo 51 y puestas en contacto en una proporción

adecuada con las células efectoras (linfocitos T). Tras incubar ambas

poblaciones celulares conjuntamente por un periodo de incubación

determinado, se centrifugan y seguidamente una parte del sobrenadante

resultante es medido mediante un contador de partículas gamma para

conocer el porcentaje de cromo 51 liberado al medio. A mayor cantidad

de cromo liberado mayor actividad citotóxica.

Ventajas: Especificidad, rapidez y facilidadDesventajas: sensibilidad (10-50 pg /ml) <<< Bioensayo. No diferencia citoquinas activas de fragmentos inactivos.

Producción de citoquinas in vitro:a.- Inmunoensayos.b.- Bioensayos

• INMUNOENSAYOS: ELISA

ELISPOT ASSAY

BIOENSAYOS:

Ensayos muy sensibles ( 1 pg/ml) bioactividad y potencia.TECNICAS:a.- Proliferación Crecimiento cel. Blanco susceptibles ( IL-1,2,3,4,5,6,7).b.- Citotoxicidad Muerte o inhibición del crecimiento de cel. Blanco

susceptibles ( TNF L929, IL-1 A375).c.- Diferenciación de cel. Blanco susceptibles ( CSF, IL-3 crecimiento sobre agar

suave; INF- ( expresión de MHC clase II, fagocitosis macrófagos).

Desventajas: Dificil de realizar, mayor tiempo( dias a semanas) y <<especificidad.

Cel. Viables Multiples Citoquinas compartiendo actividadCel. Viables Multiples Citoquinas compartiendo actividad

Cuidadosos controlesCuidadosos controles