TÉCNICA DE TÉCNICA DE FERREMIA Y FERREMIA Y TRANSFERRINATRANSFERRINACarlos Pozo - Cristóbal LeytonHematología2010

ContenidoContenido

Metabolismo del Hierro Ferritina Transferrina Alteración del

Metabolismo del Hierro Uso clínico Técnicas de Medición

Metabolismo del HierroMetabolismo del Hierro

FerritinaFerritina

• Es la principal proteína almacenadora de hierro.• Se encuentra principalmente en el

hígado, bazo, mucosa intestinal y médula ósea.• El hierro es depositado en los tejidos en dos

formas: - ferritina (soluble y móvil) - hemosiderina (insoluble).•Útil para diagnostico de Anemias ferropénicas, su valor es proporcional a los depósitos de hierro, indica la cantidad de hierro disponible en el organismo

TransferrinaTransferrina

• Proteína transportadores especifica de hierro en el plasma (Hierro sérico).

• Regula la absorción de hierro.• Una beta globulina, de forma elipsoidal

formada por una cadena simple de polipéptidos que tiene 2 sitios activos de unión por el hierro.

• La absorción celular del hierro unido a la transferrina, depende de la expresión de sus receptores (IRP1 e IRP2).

• Los receptores se encuentran principalmente en: hepatocitos, eritrocitos inmaduros, y en las células de división rápida malignas y no malignas

• La transferrina toma el hierro liberado por los macrófagos producto de la destrucción de los eritrocitos o el procedente de la mucosa intestinal y se ocupa de transportarlo y dejarlo disponible para todos los tejidos que lo requieren.

Alteración del Metabolismo Alteración del Metabolismo del Hierrodel Hierro

ANEMIAS Trastorno frecuente de la sangre que ocurre cuando la cantidad de glóbulos rojos es menor que lo normal, o cuando la concentración de hemoglobina en sangre es baja.

TALASEMIA Es un grupo de enfermedades hereditarias en

las que se produce un defecto en la síntesis de la hemoglobina.

HEMOCROMATOSIS Enfermedad hereditaria que afecta al metabolismo del hierro, provocando un acumulo excesivo e incorrecto de éste.

INFLAMACIÓN Provoca un bloqueo de la absorción de hierro.

FerremiaFerremia Tecnica: “Fer color” del laboratorio Winer lab. Método: Colorimétrico para la determinación de hierro sérico

sin desproteinización. Fundamento: El hierro sérico se libera de su unión con su proteína

transportadora específica, la transferrina, en buffer succinato de pH 3,7 y en presencia de un reductor, el ácido mercaptoacético.

Posteriormente reacciona con el reactivo de color, piridil bis-fenil triazina sulfonato (PBTS) dando un complejo color magenta, que se mide a 560 nm.

TRANSFERRINA

Hierro unido a Transferrina

FerremiaFerremia Procedimiento: Mezclar y leer el tubo de blanco , llevar a 0 con agua. Agregar, manteniendo el frasco gotero en posición

vertical, 1 gota de Reactivo PBTS a cada tubo. Mezclar inmediatamente cada tubo y leer todos los

tubos a 560 nm entre 6 y 20 minutos (10 minutos de tiempo de reacción).

Blanco Standard Muestra

Agua bidestilada

500 ul - -

Standard - 500 ul -

Suero - - 500 ul

Buffer/Reductor

2 ml 2 ml 2 ml

FerremiaFerremia Cálculos de resultados: Corregir las lecturas de S (estándar) y D

(desconocido), restándoles los Blancos correspondientes:

S - B = S corregida

D - (B + BS) = D corregida

Fe (ug/dl) = D corregida x f donde: f = 100 ug/dl S corregida Valor referencia: Hombres 65 - 75 μg/dL

Mujeres 50 - 170 μg/dL Lineal hasta 500ug/dL

PrecaucionesPrecauciones

Preparacion de material y reactivos: Muestra sanguínea debe obtenerse sin trazas de

hemolisis, ya que ésta desvirtúa los resultados. H20 bidestilada obtenida en destilador de vidrio. Usar H2O libre hierro y envasada en frascos de

vidrio neutro o de polibreno. Material de vidrio tratado previamente con HCl

al 20% v/v o mezcla sulfocrómica limpia, por 24 hrs y enjuagado repetidas veces con agua bidestilada.

No usar ningún instrumento de hierro (ni gradillas), para evitar la contaminación.

TransferrinaTransferrina

La molecula de Transferrina se puede medir teniendo en cuenta su saturacion con el Hierro:

UIBC: Capacidad latente de Fijacion

TIBC: Capacidad total de fijacion % de saturacion, en condiciones

normales esta ocupado el 1/3 de la molecula unido a hierro.

Normalmente hay cerca de 200mg de Tf/dl que transportan 115± 50μg de hierro/dL, con una saturación de Tf de 35±15%.

TransferrinaTransferrina

% Saturación de Tf: mide la cantidad de proteínas que fijan el hierro circulante.

Niveles normales:Hombres del 20 al 50%Mujeres del 15 al 50%

CAPACIDAD TOTAL DE FIJACION (TIBC) Máxima capacidad de transporte de hierro por la

transferrina. (normalmente ocupado el 30%) La TIBC se calcula, agregando hierro in vitro, (FeCl3,

Sal de Mohr) saturando completamente la proteína y volver a determinar el hierro con la misma técnica.

TransferrinaTransferrina

Fundamento:La cantidad de hierro que la transferrina sérica puede

fijar cuando se halla completamente saturada con un exceso de Fe3+ es la capacidad de fijación total (CFT).

El método mide la CFT saturando primero la transferrina con un exceso de Fe3+. El hierro sobrante es adsorbido con carbonato magnésico y una vez el proceso de fijación se ha completado se elimina éste por centrifugación y se procede a determinar el hierro en el sobrenadante.

La cantidad de transferrina se expresa como los microgramos de Fe+3 con los que está saturado.

TransferrinaTransferrina MUESTRASSuero o plasma heparinizado libre de hemólisis. Centrifugar la

muestra a la mayor brevedad posible. El ensayo debe efectuarse a partir de una muestra matinal y tras la abstención con varios días de anterioridad de medicamentos con un contenido de hierro, así como de anticonceptivos.

La capacidad de fijación de hierro sérica es estable 7 días a 2-8ºC.

Reactivos:R1: Solución de hierro. 500 μg/dL Fe3+ ( 89,5 μmol/L)

R2: Carbonato magnésico. Carbonato de hidróxido magnésico.

TransferrinaTransferrina Procedimiento:I. Adsorción1)Pipetear en tubos de centrífuga desechables:

2) Mezclar y dejar reposar 5-20 minutos a temperatura ambiente.3) Añadir a cada tubo una cucharilla (aprox. 100 mg) de R2 y

dejar reposar 30 minutos, mezclando vigorosamente a intervalos de 5 minutos.

4) Centrifugar 10 min a 3000 r.p.m.5) Decantar el sobrenadante claro.

TransferrinaTransferrina Procedimiento:

II. Colorimetría:Equilibrar los reactivos del kit de hierro a temperatura ambiente y proceder a determinar la concentración de hierro a partir de una alícuota del sobrenadante (usar técnica anterior)

Cálculos:- Capacidad de fijación total (CFT)

CFT = μg/dL sobrenadante x 3 (Factor Dilución).

- Capacidad de fijación residual (CFR): CFT-HS

- Saturación de transferrina (%)

TSat = Hierro sérico x 100

CFT

TransferrinaTransferrina

VALORES DE REFERENCIA

HS en Suero: Hombres 65 - 75 μg/dL

Mujeres 50 - 170 μg/dL

CFT: Niños 100 - 400 μg/dL

Adultos 250 - 425 μg/dL

Tsat: Hombres 20-50%

Mujeres 15-50%

- Limite de detección: 0,66 μg/dL- Linealidad: Hasta 1000 μg /dL

Caso ClínicoCaso Clínico

AntecedentesHombre de 31 años sin antecedentes de enfermedad, que en un

examen de salud le encuentran una saturación de transferrina aumentada. No fumador, bebedor ocasional moderado. No consume habitualmente suplementos. Sin antecedentes familiares de importancia.

Examen físico: Normal

Laboratorio hemograma: Glóbulos rojos: 5.200.000 /μL CHCM: 32.1 %

Hematocrito: 43 % VCM: 82.8 fL

Hemoglobina: 13.8 g/dL Leucocitos: 7944 /μL

Indice Ictérico: < 5 U Plaquetas: 321.000 /μL

VSG : 10 mm/Hr

Reticulocitos: 0.7 %

Caso ClínicoCaso Clínico RECUENTO DIFERENCIAL: Basófilos: 1 Segmentados: 53 Linfocitos: 38 Monocitos:

5

Frotis de sangre periférico:· Glóbulos rojos: Normales.· Leucocitos: Normales.· Plaquetas: Normales.

Saturación de transferrina: 80% (VN: 80-180 μg/dL)

Ferritina sérica: 600 μg/dL (VN: 80-180 μg/dL)

Ecotomografía abdominal: hígado de tamaño y aspecto normal

Caso ClínicoCaso Clínico Estudio del DNA mediante la reacción de polimerasa en

cadena, demuestra que es doble heterocigoto para mutaciones C282Y/H63D del gen de la hemocromatosis.

Diagnóstico: Hemocromatosis hereditaria. En el paciente existe una sobrecarga de hierro asintomática.

A liver with hemochromatosis Iron staining: blue granules of hemosiderin

Bibliografía

Kit de técnica “Fer color”, Wiener lab. Kit de técnica “TIBC”, LINEAR

CHEMICALS www.linear.es