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Técnicas de Ingeniería Genética
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR
Kary Mullis de Cetus Corporation……….1985
Video PCR
pcr video1.exe
Termociclador
Tapa que calienta
Tubos de pared delgada
Taq polimerasa
Taq polimerasa: ADN polimerasa termoestable aislada de la bacteria termofílica Thermus acuaticus por Thomas Brock en 1965
Características:
Temperatura óptima 75-80 ºC., vida media 9 min. a 97,5 ºC.
No tiene actividad 3´a 5´exonucleasa baja fidelidad
Deja A en extremos 3´
Otras ADN polimerasas termoestables:
Pfu ADN polimerasa, aislada la bacteria termofílica Pyrococcus furiosus .Tiene actividad 3´a 5´exonucleasa alta fidelidad
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Error rates of different DNA polymerases. Fidelity assays were done using lac I-based method modified from Frey & Suppmann, 1995.
FIDELIDAD
A 3.8 kb human beta globin gene was amplified according to supplier's recommendations using varying extension times.
PROCESSIVITY
Extreme processivity: The Phusion polymerase has the highest processivity of all thermostable DNA polymerases tested
Templado 1 μg ADN humano, copia simple ADN: 105-106 moléculas blanco 10 ng ADN de levadura 1 ng ADN E. coli
Taq: 1-2,5 u
dNTPs : 20- 200 μM
Mg++ : 0.5-2.5 mM
Primers: 0.1-0.5 μM
Diseño de primers
Evitar la presencia de más de 3 nucleótidos iguales seguidos (GGGG)
Evitar fragmentos largos de Gs (problema en síntesis)
Largo 18-30 nuc.
El largo de los primers no debe diferir en más de 3 nuc.
Extremo 3´: G o C, pero evitar 3 o más Gs o Cs seguidas
Tm 50-60 ºC
Contenido de GC: 40 -60 %
Evitar palindromos y repeticiones invertidas
Evitar complementariedad entre los pares de primers
Controlar la formación de dímeros y horquillas : evitar estructuras con ΔG<-5kcal/mol
Primers muy largos, > 50 b deben, ser purificados
Verificar que los primers estén diseñados y encargados en la orientación correcta
Sitios de corte en extremos, agregar bases extra.
Amplificación de un mismo gen de distinto organismo
Primers degenerados Diseño de primers basado en la sec. de aa. de la proteína
Buscar zonas conservadas para ubicar los primers
Largo de primers 6 a 7 aa, (agregar colas)
Buscar el primer menos degenerado
Fragmento de PCR: alrededor de 400 pb
Desventaja: baja especificidad
Touchdown PCR: gradual de la temperatura
1 opción M W2 opciones F Y H Q N K D E C3 opciones I4 opciones V P T A G6 opciones L S R
Cálculo de “degeneración”
DEWVP: 2x2x1x4x4= 64
Condiciones de reacción
Temperatura de Annealing /hibridación: 5ºC por debajo de la Tm
Elongación: 0,5-3 min (2 min para 1 kb), 68-72 ºC
Ciclos: el número depende de la cc. del ADN blanco
Causas del plateau: degradación de dNTPs y enzima, depleción de primers y dNTPs, inhibición por formación de producto (pirofosfato), competición por reactivos por productos inespecíficos,
Impureza Concentración inhibitoria
SDS > 0.005 % (p/v)Fenol > 0.2 % (p/v)Etanol > 1 % (v/v)Isopropanol > 1 % (v/v) Acetato de sodio > 5 mM Cloruro de sodio > 25mM EDTA > 0.5 mMHemoglobina > 1 mg/ml Heparina > 0.15 UI/mlUrea > 20 mMMezcla de reacción de RT > 15 % (p/v)
IMPUREZAS QUE INHIBEN LA PCR
Aditivos
Condiciones de desnaturalización del ADN más fuertes: para ADN con alto contenido de G+C
DMSODMF hasta 10 % (V o P/P)UREAFORMAMIDA
Para amplificar secuencias muy largas:
DMSO ………….ayuda en productos >1 kbFORMAMIDA …… mejora especificidadGLICEROL ………templados con alto contenido de G+CPEG ………………cc. de templado muy baja
ALGUNOS TIPOS DE PCR
PCR ANIDADA
PCR IN SITU
PCR MULTIPLEX
RT-PCR
PCR EN TIEMPO REAL= PCR cuantitativa (qPCR)
PCR DIGITAL
PCR ANIDADA = NESTED PCR
Especificidad
1º: amplificación del ADN blanco. 2º: hibridación in situ con sonda
PCR in situ
PCR multiplex
Uso de varios primers al mismo tiempo
RT PCR
PCR en tiempo real
• Amplificación y detección simultánea, en el mismo vial cerrado
• Se puede medir en cada momento la cantidad de ADN sintetizado, por lo tanto permite conocer la cinética de la reacción de amplificación
• Se mide la fluorescencia emitida por colorantes que se unen al ADN o por sondas específicas marcadas con fluorocromos
FASES DE LA PCR
Nº DE CICLO
Log [ADN]
3 replicados de una misma muestra
Curva de amplificación
El programa calcula el número de ciclo en el que el lector empieza a detectar un incremento de fluorescencia significativo con respecto a la señal de base : ciclo umbral (CT: threshold cycle)
El punto en donde se acumula fluorescencia en la muestra y cruza el umbral se llama ciclo umbral: Ct
El Ct es inversamente proporcional al número de copias del molde, a mayor concentración del ADN molde menor Ct
PCR EN TIEMPO REAL
Los valores de Ct son inversos a la cantidad de ADN en la muestra y se correlacionan con el número de copias. Valores bajos de Ct indican grandes cantidades de ácido nucleico mientras que Ct altos lo opuesto
Distintas curvas de disociación de varios productos de PCR (en colores distintos). Se observan reacciones con amplificación de un producto específico (rosa, azul) y otras con resultado negativo (verde, naranja); se señala con una flecha el pico de fusión dado para los dímeros de los cebadores, diferente al esperado para el producto de amplificación en cuestión.
Curvas de disociación
Colorantes que se unen a ADN ds:
SYBR Green, fluoresce al unirse al ADN
BaratoSe une a productos inespecíficos como dímeros de primers
Sondas de hibridación
CarasEspecíficasSe puede usar en PCR multiplex
PCR EN TIEMPO REAL sondas de hibridación específicas
Sondas de hidrólisis Molecular beacons Sondas FRET
PCR DIGITAL
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
VECTOR CON ORI DE BACTERIÓFAGO
Preparar DNA del fago e hibridar con oligoMutagénico (dot blot) para identificar positivos
+ -+ + -
Vectores con ori de fago: se coinfectan con fago helper para generar viriones simple cadena
MUTAGÉNESIS POR PCR
Phusion™ Site-Directed Mutagenesis Kit Thermo Fisher
Because minute amounts of template DNA are exponentially amplified in this method, the fraction of non-mutated template is minimal. Thus there is no need to destroy it in a separate step. Phusion Hot Start II DNA Polymerase ensures high fidelity for the exponential amplification, thus reducing unwanted secondary mutations and enabling
amplification of large plasmids up to 10 kb
DpnI
Primers mutagénicos
Stratagene
CASSETTE MUTAGÉNESIS
SECUENCIACIÓN DE ADN
SECUENCIACIÓN DE ADN
Degradación química: Maxam y Gilbert
Terminación de cadena: Sanger didesoxi
SECUENCIACIÓN DE ADN
POR DEGRADACIÓN QUÍMICA- MAXAM Y GILBERT
Corte específico de bases por reactivos químicos de una molécula de ADN marcada en el extremo y posterior electroforesis1º se modifican las bases (G, G+A, C+T, C) y luego se incuban con piperidina caliente que rompe el enlace azúcar fosfato
Ventajas.La secuencia se obtiene de la molécula originalSe puede determinar la sec. muy cerca del extremo marcado (2 o 3 bases)Se puede determinar la sec. de ADN totalmente desconocido
DesventajasDiferentes condiciones para cada reacción….+ lento y menos reproducibleSec. Más cortas
MÉTODO DE TERMINACIÓN DE LA CADENA: SANGER DIDESOXI
Emplea a la ADN polimerasa para extender la hebra de ADN hasta que se termina por incorporación de un 2´,3´-didesoxinucleótido (ddNTP)
Marcación de la hebra de ADN
☻Extremo 5´: primer marcado con [γ-32P]ATP por T4 polinucleótido quinasa ☻Hebra sintetizada: se usa un dNTP radiactivo (en general 35S)
☻Extremo didesoxi. Cada didesoxi está marcado con un colorante fluorescente distinto. Para sec. automático.
AZT
Gel de secuencia
Video secuenciación
sec. ADN Sanger video.exe
Secuenciación de ADN (automática en gel)
a) Reacción de secuenciación b) Análisis de la reacción
dena
tura
lizat
ion
Secuenciación de ADN (automática en capilar)
Video sec. automática
secuenciación automática ADN video.exe
Electroferograma: gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis.
Alineamiento de secuencias
https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html
>secuenciaAatgggtttaaacccgaaacgg
>secuenciaBatgggtttaaacccgaaacgg
A. global se intenta que el alineamiento cubra las dos secuencias completamente introduciendo los gaps que sean necesarios.A. local se alinean sólo las zonas más parecidas
Cuando falta una base decimos que hay un gap.Un gap puede corresponder tanto a una deleción
como a una inserción.
gaps
En el alineamiento de secuencias de proteínas, la identidad de secuencias se refiere al porcentaje de coincidencias de los mismos residuos de aminoácidos entre las dos secuencias alineadas.
Por su parte la similitud de secuencias se refiere al porcentaje de residuos alineados que tienen características fisicoquímicas similares y que pueden ser substituídos entre sí
Similitud e identidad de secuencias
Cuando se trata de secuencias de nucleótidos estos dos términos son sinónimos
Sin embargo, para secuencias de proteínas los dos conceptos son muy diferentes
PRIMER WALKING
SHOT GUN
Método para determinar secuencias de fragmentos de ADN muy grandes
Strand Sequence
Origin AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
First shotgun sequence AGCATGCTGCAGTCATGCT----------------------------------------------------TAGGCTA
Second shotgun sequence
AGCATG----------------------------------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Reconstruction AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Principio general de los diferentes sistemas de pirosecuenciación
Ronaghi M Genome Res. 2001;11:3-11
©2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
APS: adenosina fosfo sulfato
PIROSECUENCIACIÓN
Library Preparation Sample Input and Fragmentation
PCR
One Fragment = One Bead emPCR (Emulsion PCR) Amplification
PIROSECUENCIACIÓN
APS:Adenosina fosfo sulfato
Se agregan los dNTPs secuencialmente. Después de cada agregado se lava
Data Analysis
SECUENCIACIÓN ION TORRENT
Se determina el cambio de pH
SECUENCIACIÓN POR NANOPOROS