GravityPlus™ System

1

www.insphero.com

GravityPLUS™マニュアル

Technical Bulletin TBC001

InSp

hero

Con

sum

able

s

GravitPlus™ System

2

www.insphero.com

目次

 

GravityPLUS™ システムの概略 3 

GravityPLUS™ プレートの構成 3 

マイクロティッシュの生成と培養 4 

マテリアル  4 

手順  4 

化合物/試薬の添加 5 

化合物の添加  5 

試薬の添加  5 

培地の交換とサンプリング 5 

マイクロティッシュの移動と分離 6 

マイクロティッシュの 96 穴プレートへの移動  6 

 GravityTRAP™への移動  6 

Appendix 1 マイクロティッシュの顕微鏡による観察 7 

Appendix 2 蒸発のキャラクタリゼーション 8 

GravityPLUS™ Manual, 5/2012, Version 1.2 JP Draft InSphero AG Technoparkstrasse 1 CH-8005 Zurich Switzerland www.insphero.com Phone: +41-44-515049-0 e-mail: sales@insphero.com

GravityPlus™ System

3

www.insphero.com

GravityPLUS™システムの概略

GravityPLUS™ システムは196 穴のプレートを構成要素として含んでおり、ハンギングドロップ法による生体器官類似のマイ

クロティシュの作製と加工のために開発されました。このシステムでは、哺乳類細胞の 3 次元培養に関する以下の様な操作

を 適な方法で実現できるよう設計されています。

マイクロティッシュの作製

培地のサンプリング

候補化合物や試薬の添加

培地の交換

マイクロティッシュの移動と分離

従来のハンギングドロップ法を利用した技術とは異なり、標準的なマルチチャネルのピペットを用いて、プレートを裏返す

ことなく上方から全ての作業を行うことが可能です。また、マイクロティッシュの形成のための遠心のステップは不要です。

GravityPLUS™プレートの構成

GravityPLUS™ プレートは以下の様なパーツから構成されております。

リザーバー(E)付き底面プレート (A)2

12×8 穴ストリップ付きラスタープレート(B)

フタ(C)

蒸発防止用溝 (D)

ハンギングドロップ法に適合した 8 穴ストリッ

プ (プレートへのはめ込み構成物, F)

加湿パッド (底面プレートに組み入れて使用)

12 個のプレートへのはめ込み構成物（ストリップ）は、各々8 個づつの、確実にドロップを形成できるウェルから構成され

ています。上部の注入口から細胞懸濁物や培地の注入が可能です。ドロップはマイクロチャネルを通じて注入口と通じてい

る下部の空間に形成されます。形成されたドロップは、毛細管現象により安定化されております。

1The GravityPLUS™ プレートと関連する技術は以下の特許により保護されています: WO2007/098933A1, WO2010/031194A1 and US61/367,993.

2 OmniTray (NUNC Cat. Nr. 242811)

フタ(C)

ストリップ付 ラスター プレート(B)

底面 プレート(A)

リザーバー(E)

蒸発防止用溝

(D)

ばね付き ウェル(F)

GravitPlus™ System

4

www.insphero.com

マイクロティッシュの作製

準備するもの:

1. 哺乳類細胞（細胞株またはプライマリ細胞）

2. 個々の細胞種に適した培地3

3. 加湿機能付 CO2インキュベータ

4. 5 倍の対物レンズまたは 10 倍のリング付き長距離対物レンズが付属した倒立顕微鏡（appendix 1 参照）

5. 細胞計数器 例： Neubauer chamber

6. 8- または 12 チャネルピペット 例： Viaflo (Integra Biosciences 社製)

7. マルチチャネルピペット用の培地リザーバー

8. 全てのウェルに対し、顕微鏡による評価が必要な場合、追加の底面プレート

9. マイクロティッシュのレシーバープレート。 良のパフォーマンスを得るためには GravityTRAP™（InSphero Cat.Nr. CS-01-001 (non-coated) または CS-01-002 (coated)） をお使い下さい。または代替的には v 字形状の底面を持つプレートの使

用も可能です。例：NUNC Cat. Nr. 249662

10. マイクロタイタープレート用遠心機

手順:

1. リザーバーに加湿パッドを挿入します。次に溶液が均一に広がるように、0.5x PBS4 を 15mL パッドに充填します。

2. 標準的なプロトコルに従い、培養フラスコ中で培養した細胞をトリプシン等で処理することにより、細胞懸濁液を準備

します。

3. 細胞を計数します。

4. 細胞の濃度を調整します。

5. 播種時の溶液としては、長期間の成長プロファイリングのためには 250～500 細胞、より大きなサイズのマイクロティッ

シュが短期間で必要な場合 2,500～25,000 細胞を、40μL中に懸濁した液をご使用下さい5 。

6. GravityPLUS™ システムの各ウェルの注入口にしっかりとピペットを密着させ、弱く圧力をかけながら 40μL の細胞懸

濁液をゆっくりウェルに注入します6。

7. オプション: 2 ml の滅菌水をラスタープレート(B)の外側の蒸発防止用溝 (D) に満たします。

8. GravityPLUS™ プレートにフタ(C)をかぶせます。

9. GravityPLUS™ システムを 37℃に設定した加湿機能付き CO2インキュベータに入れます。

10. 定期的にマイクロティッシュの形成を観測して下さい。大抵の細胞種では 2～4 日後に再凝集し、マイクロティッシュが

形成されます。

3 ほとんどの場合、各細胞種の増殖に適した培地はマイクロティッシュ形成にも適しています。

4 CO2 インキュベータの湿度コントロールに依存します。適切な湿度の場合、0.5x PBS (相対湿度 95%以上) , 湿度が低い場合、0.2x PBS(<95%以下の相対湿度)を

ご使用下さい。 5 細胞数とサイズの関係は使用する細胞種に強く依存します。実験の開始前に 500、2,500、5,000、10,000 個の細胞を使用して細胞数とサイズの関係を評価する

ことをお勧めします。 6 ピペット操作のスピードは 10～50μL/秒に設定して下さい。

200 µm 200 µm 200 µm

a b c

Figure 1:ドロップ中の HCT-116 500 細胞から構成されたマイクロティッシュを顕微鏡で直接観察し

た画像。(a)播種後 30 分時点では、細胞はドロップの底部に位置しています。(b) 播種後 1 日で、

初の細胞間接触が起こります(c)播種後 3 日でコンパクトなマイクロティッシュが形成されます。

GravityPlus™ System

5

www.insphero.com

薬剤候補化合物/試薬の添加

化合物の添加

インキュベータの湿度に依存して、ドロップから培地が蒸発します。インキュベータ内が低湿度の場合、そのインキュベー

タ内での蒸発率を測定することを推奨します(Appendix II 参照)。 初に培地に対して適切な倍率で希釈し、次にドロップ中で

4 倍に希釈する方法を取り、2 段階で化合物を希釈します(例えば 1,000 倍濃度の DMSO 溶液を使用する場合、 初に培地中で

1:250 に、2段階目にドロップ中で 1:4 に希釈します)。

1. 8 チャネルピペット（単一チャネルでも可）を使用して培地を除去し、30μL のドロップを作成します。培地の除去の際

は低速度でピペット操作を行います7。

2. 4 倍濃度の化合物と培地の混合液 10μL をドロップに加えます。

試薬の添加

試薬の添加のためには、20μL のドロップに 20μL の 2倍濃度の試薬溶液を加えます。これにより、界面活性剤を使用した際

でもドロップの安定性が保たれます。

1. 8 チャネルピペットを使用して培地を除去し、20μL のドロップを作成します。培地の除去の際は低速度でピペット操作

を行います。

2. マイクロティッシュの溶解を起こすための試薬の場合、2 倍濃度の試薬を 20μL ドロップに添加し、ゆっくりしたピペッ

ティング速度（～30μL/秒）で混合します。

3. ドロップを完全に吸引し、溶解した細胞を分析用プレートに移します。

4. 細胞の溶解を引き起こさない試薬の場合、事章以降に記載される分析のためのレシーバープレートに移動させることを

推奨します。

培地の交換とサンプリング

細胞の種類と初期に形成されるマイクロティッシュのサイズにより日数は異なりますが、播種後 2～6 日後に培地を交換して

下さい。マイクロティッシュは密度が高いため、ドロップの底部に位置しています。これを利用することで、マイクロティ

ッシュをプレートから移動することなく、導入口から培地の除去および追加を行ったり、培地のサンプリングを行うことが

可能です。

1. 8 チャンネルピペット（単一チャネルでも可）を使用し、低速度（10μL/秒）で培地を吸引して下さい。

2. 大 75%の培地を除去することが可能です（例： 初に 40μL のドロップが存在した場合、30μL まで除去することが

可能です）。できるだけ完全に培地を入れ換えたい場合は、このステップを数回繰り返して下さい。

7 ピペット操作速度はドロップ内での乱流の発生により生じうるマイクロティッシュの吸い込みを防止するため、10μL/秒以下に設定して下さい。これにより、

交換できる培地の容積を 大にすることが可能になります。空気の吸い込みを防止するためには、ピペットのチップとウェルの注入口を密着させることが重要

です。

GravitPlus™ System

6

www.insphero.com

レシーバープレートへの移動とドロップからの収集

処理や分析、あるいは長期間培養のためにマイクロティッシュを GravityTRAP™プレートに移動させることが可能です。

GravityTRAP™プレートのかわりに標準的な NUNC ブランドの 96 穴プレートへ移すことも可能です。組織学的な処理を行う場

合は、細菌用ペトリ皿に集めることも可能です8 。

96 穴プレートへのマイクロティッシュの移動

InSphero ではマイクロティシュの長期培養や光学的な解析やアッセイプレートリーダーを用いた解析のために特別にデザイ

ンされた GravityTRAP™プレートをご提供しております(Cat. Nr. CS-01-001/002)。GravityTRAPTM プレートを用いることによ

り、底面から観測する際に自動的にマイクロティッシュを視野の中心に位置させることが可能であり、また、マイクロティ

ッシュを吸い上げることなく培地を交換することも可能です。また、GravityPLUSTMシステムは GravityTRAPTMプレート以外

にも、全ての NUNC ブランドの 96 穴プレートと互換性があります（例えば v-bottom plates NUNC Cat. Nr. 249662）。

GravityTRAPTMプレートへの移動

1. ラスタープレートを GravityTRAP™プレートの上に設置し、3 個のピンを GravityTRAP™プレートの穴と合わせて下さい。

2. ゆっくり（10μL/秒以下）と培地または溶媒 70μL を上部の注入口から加えます。播種の際と同様に、ウェルの注入口

とピペットチップを密着させ、ピペットから徐々に圧力をかけて下さい。溶液の追加に伴い、マイクロティシュは

GravityTRAP™のウェルに移動します。

3. ドロップを移動する際に気泡がウェルの底部にたまる場合があります。この場合、気泡は GravityTRAP™プレートをマ

イクロプレート用遠心機で 250×RCF で 2 分間処理することにより取り除いて下さい。

4. 定められた容積と培地組成を厳密に達成するためには、一旦ウェル内の培地を除去し 70μL の新しい培地を追加して下

さい9 。

8 技術資料 TBP001「組織学のためのマイクロティッシュの処理」をご参照ください。 9 より詳細な FGravityTRAPTMシステムについての情報と操作手順は GravityTRAPTMのマニュアル(TBC003)をご参照ください。

GravityPlus™ System

7

www.insphero.com

Appendix 1 マイクロティッシュの顕微鏡観察

マイクロティッシュの形成過程や形状、成長プロファイルを倒立型明視野顕微鏡を使用して観察・評価することが可能です。

GravityPLUS™ プレートの構造と、底面プレートに存在する加湿用溶液とドロップの間の空間の存在により、顕微鏡観察には

長作動距離対物レンズ(LWDO)（拡大率 10 倍が好ましい）が必要です。底面プレートの底面と対物レンズ上面の間の 小ギャ

ップ(D1)に依存して作動距離が D1+11.5mm 以上となることを考慮して対物レンズの仕様の決定する必要があります。長作動

距離対物レンズは、標準的な対物レンズより短いため、長作動距離対物レンズの上面を通常の対物レンズの高さまで上昇さ

せるためにディスタンスリング(R)が必要となります。96 穴全ての顕微鏡での評価が必要な場合、追加で空の底面プレートが

必要となります。

ストリップ付き ラスタープレート

ハンギングドロップ

マイクロティッシュ

加湿用溶液

底面プレート

長作動距離 対物レンズ

ディスタンスリング

対物レンズ 作動距離

GravitPlus™ System

8

www.insphero.com

Appendix 2 蒸発特性の評価

蒸発 適当な蒸気圧を実現する PBS 溶媒(0.1% TritonX-100 を含む)5mL を底面のリザーバーに入れます。リザーバー部分に置いた

加湿パッドに、バッファー（TritonX-100）15mL を染み込ませる方法を取ることも可能です。湿度が低いインキュベータ内で

は溶液が高い速度で蒸発します。適切な湿度制御ができないインキュベータでは、蒸気圧を上昇させ、高い速度での蒸発を

補うために低イオン強度溶媒(0.2×PBS)を使用します。適切に湿度制御されているインキュベータ（95%以上の相対湿度）で

は、高イオン強度溶媒（例えば 0.5×PBS）を使用します。低湿度インキュベータで適切な湿度管理を行うためには、ラスタ

ープレート(B)の蒸発防止用溝(D)を 2mL の滅菌水で満たして使用します。低イオン強度溶媒はプレート内部の構成物とイン

キュベータ内部の空気の間に、水蒸気によるバリアを形成し、ドロップの蒸発に対する安定性を向上させます。

設定 40 µL の培地(DMEM/10% FCS)を各ウェルに導入します。

0.5x PBS を 15 mL、底面プレート中の加湿パッドに加えます。

2 mL の滅菌水を溝に導入します。

プレートは CO2インキュベータ中に 3 日間置かれます。蒸発速度はインキュベーションの期間中におけるドロップの重量変化

により計算されます。

結果 1 日あたり蒸発量の平均はウェルあたり 0.35±0.32

µL でした。周辺部に位置するウェルの場合は 1 日当

たり 0.52±0.41 µL、中心部のウェルでは 0.25±0.19 µL

でした。

結論 ハンギングドロップでは、表面積と体積の比率が大

きく、長期の培養では蒸発の影響が大きくなります。

適切な湿度コントロールがなされていない場合、

低イオン強度溶媒を底面プレートのリザーバーまたは加湿パッドに供給する必要があります。加えてプレート上部の横に存

在する蒸発防止用溝に水を入れることにより、内部のプレート構成要素とインキュベータ内の雰囲気の間に蒸気によるバリ

アを構築することも可能です。この方法により通常の 96 穴プレートと同様の蒸発コントロールが可能になります。

蒸発速度マップ（μL/日）

GravityPlus™ System

9

www.insphero.com

Notes:

GravitPlus™ System

10

www.insphero.com

Notes:

GravityPlus™ System

11

www.insphero.com

Notes:

GravitPlus™ System

12

www.insphero.com

InSphero AG Technoparkstrasse 1

CH-8005 Zurich Switzerland

www.insphero.com Phone: +41-44-515049-0

e-mail: support@insphero.com

© 2012, InSphero AG, Switzerland. 翻訳：株式会社ビジコムジャパン All technical and pricing information subject to change. All products are for research use only. They are not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use unless oth-erwise stated.

日本国内お問い合わせ先： 株式会社ビジコムジャパン

〒108-0074 東京都港区高輪 3-12-4-103 TEL: 03-6277-3233 FAX: 03-6277-3265 e-mail: support@bizcomjapan.co.jp