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TBC, "the reemergent killer ". aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati crescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT). la diagnostica tradizionale. esame microscopico esame colturale identificazione antibiogramma. esame microscopico. - PowerPoint PPT Presentation
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TBC, "the reemergent killer"TBC, "the reemergent killer"
aumento della tubercolosi nei paesi industrializzaticrescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT)
la diagnostica tradizionalela diagnostica tradizionale
esame microscopicoesame colturaleidentificazioneantibiogramma
esame microscopicoesame microscopico
colorazione di Ziehl-Neelsenfluorescenza
tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica
Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen
1000x
fluorescenzafluorescenza
400x
metodi colturali "alternativi"metodi colturali "alternativi"
metodo radiometricoterreno bifasicoterreno con indicatore fluorescenteterreno Redox
il metodo radiometricoil metodo radiometrico
flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14Cmiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioniliberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo battericorilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi
notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
il terreno bifasicoil terreno bifasico
flacone di terreno liquido per micobatterimiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazionislide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato)arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido
moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
medium con indicatore fluorescentemedium con indicatore fluorescente
provetta di terreno liquido per micobatterimiscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazionifluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigenocomparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo battericorilevamento della fluorescenza
visivo, sotto una lampada UV automatizzato
accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità
il terreno Redoxil terreno Redox
i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniformei sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazzano dai micobatteri in crescitail formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento
automazione nella coltura dei micobatteriautomazione nella coltura dei micobatteri
metodo radiometrico la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata da
un -counter
metodo pressometrico l’aumento di pressione, dovuto a produzione di CO2,
viene rilevato da un manometro
metodo fluorimetrico la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla
presenza di ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del consumo di ossigeno
metodo refrattometrico la produzione di CO2 fa virare un sensore che a sua
volta modifica l’intensità di un raggio di luce riflessa
l’emocoltura per micobatteri 1l’emocoltura per micobatteri 1
la ricerca dei micobatteri nel sangue è giustificata per i pazienti immunodepressi nei quali può essere richiesta anche la mielocolturala bassa sensibilità rende inutile l’esecuzione dell’esame microscopico un tipo particolare di emocoltura è quello che si esegue sul sangue mestruale quando si sospettano forme tubercolari a carico dell’apparato genitale
l’emocoltura per micobatteri 2l’emocoltura per micobatteri 2
semina diretta del sangue nei flaconi Bactec 13A nei flaconi BacT ALERT MB blood nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic
semina dopo lisi-centrifugazione (sistema Isolator) su tutti i terreni solidi (a base di uovo o
sintetici) in tutti i terreni liquidi compresi quelli,
non dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi automatizzati
nel terreno bifasico
l’emocoltura per micobatteri 3l’emocoltura per micobatteri 3
la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente inferiore a quella dei terreni liquiditempi di incubazione inferiori alle otto settimane sono sconsigliati anche per i terreni liquidile specie appartenenti al MAC sono di gran lunga quelle di più frequente reperimentolo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza della specie M. genavense
accumulo di niacinariduzione dei nitraticatalasi quantitativa termoresistente
idrolisi del Tween 80ureasiarilsolfatasiriduzione del tellurito
identificazione tradizionale, test biochimici
identificazione tradizionale, test biochimici
velocità di crescitaaspetto delle colonie rugose lisce fotocromogene scotocromogene non pigmentate
crescita a varie temperaturetest di inibizione selettiva
identificazione tradizionale, test colturali
identificazione tradizionale, test colturali
NAP testNAP test
il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex ma non quello dei micobatteri non tubercolari risultati accettabili solo in terreno liquido
test di screening rapido (4-7 gg)
metodi di identificazione “alternativi”metodi di identificazione “alternativi”
DNA probeHPLC degli acidi micolicisequenziamento genico16S rDNASODHSP65
il sistema AccuProbeil sistema AccuProbe
lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNAprobe marcato costituito da un frammento di DNA a filamento singolo contenente una sequenza specie-specifica presente in una regione ipervariabile del rRNAibridizzazione in presenza di complementarità fra rRNA e proberimozione della marcatura dal DNA non ibridizzatoeccitazione della molecola marcatrice chemioluminescenterilevamento della luce prodotta in presenza di molecole ibride di acidi nucleici
metodo rapido (2 h) altamente specifico
HPA (hybridization protection assay)HPA (hybridization protection assay)
gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori emettono luce se eccitati chimicamentenel DNA a catena singola la molecola marcatrice è esposta all'azione di eventuali agenti inattivantila struttura assunta dall'acido nucleico a catena doppia protegge la molecola marcatrice dall'azione di eventuali agenti inattivantil'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni possibilità di emissione di segnale da parte di molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è pertanto indice di avvenuta ibridizzazione
Line Probe Assay (LiPA) Line Probe Assay (LiPA)
LiPA, interpretazione LiPA, interpretazione
acidi grassi, ramificati in posizione presenti nella parete batterica dei generi:
Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordona: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C
presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici
alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-
gli acidi micolici gli acidi micolici
HPLC degli acidi micoliciHPLC degli acidi micolici
saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatterifrazionamento mediante HPLCindividuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento
profilo HPLC del M. tuberculosis complexprofilo HPLC del M. tuberculosis complex
ad eccezione del ad eccezione del M. bovisM. bovis BCG BCG
SI
esempi di profili HPLCesempi di profili HPLC
SI
SI
TLC degli acidi micoliciTLC degli acidi micolici
gas-cromatografiagas-cromatografia
RNA ribosomiale 16S RNA ribosomiale 16S
i farmaci antitubercolari maggioriil principio del metodo delle proporzionil’antibiogramma manualel’antibiogramma automatizzatol’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari
antibiogrammaantibiogramma
antibiogramma radiometricoantibiogramma radiometrico
inoculo di una serie di flaconcini radiometrici, addizionati con antibiotici, con una sospensione micobatterica standardizzatainoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione 1/100 della sospensione precedentelettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento, da parte del controllo, di una soglia prefissatasensibilitàflaconcini con incremento giornaliero inferiore a
quello del controlloresistenzaflaconcini con incremento giornaliero superiore a
quello del controllometodica di riferimento, durata 5-10 gg
le fasi dellaPolymerase Chain Reactionle fasi dellaPolymerase Chain Reaction
pretrattamento del materiale e liberazione dell'acido nucleico– fluidificazione ed eventuale
decontaminazione– lavaggio– lisi delle cellule
amplificazione dell'acido nucleicorilevamento dell'amplificato
componenti principali dellamiscela di amplificazionecomponenti principali dellamiscela di amplificazione
NUCLEOTIDI
PRIMER: oligonucleotidi complementari di sequenze presenti alle due estremità della regione da amplificare
POLIMERASI: enzima che determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione
i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis
i componenti della Mastermix del sistema Amplicor M. tuberculosis
NUCLEOTIDIassenza di nucleotidi contenenti timina (sostituiti da quelli contenenti uracile)
PRIMERcomplementari di sequenze che delimitano una regione del genoma specifica del genere Mycobacterium marcati con biotina
POLIMERASITaq polimerasi
il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni
il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni
il DNA-target non contiene uracileil DNA-amplificato contiene uracile al posto della timinal'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al materiale da amplificare determina la distruzione di qualsiasi traccia di DNA contaminante (frutto di precedenti amplificazioni); l'enzima è invece del tutto inattivo sul DNA-target
i cicli termici della reazione di amplificazionei cicli termici della reazione di amplificazione
20 sec a 94°C: la doppia elica del DNA si separa ed i filamenti singoli costituiscono lo stampo per successive amplificazioni20 sec a 62°C: i primer si legano alle sequenze complementari presenti sul DNA-target (annealing)45 sec a 72°C: la polimerasi determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione
30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la formazionedi un miliardo di copie del DNA originale
il rilevamento dell'amplificatoil rilevamento dell'amplificato
trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di una piastra microtiter, coated con probe complementari di una sequenza dell'amplicone specifica per il M. tuberculosisincubazione (ibridizzazione)lavaggi (eliminazione dell'amplificato non ibridizzato)aggiunta del coniugato avidina-enzimaincubazione (legame avidina-amplicone biotinilato)lavaggi (eliminazione del coniugato non legato)aggiunta del substratoincubazione (reazione enzimatica)bloccaggio della reazione enzimaticalettura fotometrica a 450 nm
fluidificazione e decontaminazione del campionelisi (ultrasuoni) delle celluletrasferimento del lisato in provette contenenti la miscela di amplificazione e breve incubazione a 95°Caggiunta della miscela enzimatica e amplificazione isotermica (2 h a 42°C) di una regione del rRNA specifica del genere Mycobacteriumblocco dell'amplificazione ed ibridizzazione dell'eventuale amplificato con un DNA-probe specifico per il M. tuberculosis complexrilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione
le fasi della Transcriptase Mediated Amplification
le fasi della Transcriptase Mediated Amplification
il principio della TMAil principio della TMA
annealing dei primer, presenti nella miscela di reazione, con il rRNA liberato mediante lisi cellularesintesi di DNA a partire da RNA grazie alla transcriptasi inversaseparazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera della RNasiutilizzo del DNA come stampo per la sintesi di molte copie di RNA ad opera della polimerasiulteriore annealing del RNA sintetizzato con nuovi primer
non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazioneformazione di 10 miliardi di copie in 2 ore
bamper primer
sito di restrizione
5’ 3’target
la Strand Displacement Amplificationla Strand Displacement Amplification
TARGET: IS6110PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI AMPLIFICAZIONE:
bamper primer polimerasi enzima di restrizione
non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione
SDA: amplificazione esponenzialeSDA: amplificazione esponenziale
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDAil rilevamento dell’amplificato nella SDA
ricerca del M. tuberculosis mediante amplificazione, pro e contro
ricerca del M. tuberculosis mediante amplificazione, pro e contro
rapiditàmetodiche in-house elevata sensibilità manualità complessa alto rischio di contaminazioni
metodiche commerciali sensibilità non superiore a quella della
coltura parzialmente automatizzabili minimo rischio di contaminazioni standardizzate solo per i materiali respiratori
indicazioni delle tecniche di amplificazioneindicazioni delle tecniche di amplificazione
utilizzabili per la ricerca di nuovi casinon utilizzabili per il monitoraggio della terapia
interpretazione del risultato dell’amplificazione 1interpretazione del risultato dell’amplificazione 1
Microscopia POS Amplificazione POS M. tuberculosis
Microscopia NEG Amplificazione NEG probabile NEG
Microscopia NEG Amplificazione POS probabile M. tuberculosis
Microscopia POS Amplificazione NEG probabile MOTT
interpretazione del risultato dell’amplificazione 2
interpretazione del risultato dell’amplificazione 2
Coltura POS Amplificazione POS M. tuberculosis
Coltura NEG Amplificazione NEG NEG
Coltura NEG Amplificazione POS ???
Coltura POS Amplificazione NEG M. tuberculosis o MOTT