TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓN TAXONOMÍA Y EVOLUCIÓN BACTERIANABACTERIANA

- BACTERIAS

Pared celular

Cultivables “in vitro”

- BACTERIAS VASCULARES

Pared celular ondulada

Cultivables “in vitro” con dificultad

Viven en el xilema

Se transmiten por Insectos

- MICOORGANISMOS SEMEJANTES A BACTERIAS

Pared celular

No se pueden cultivar “in vitro”

Viven en el floema y/o en el xilema

- ACTINOMICETOS

Pared celular

Cultivables “in vitro”

Forman “micelio”

-MOLICUTES

Carecen de pared celular

Viven en el floema

Se transmiten por Insectos

Sensibles a las Tetraciclinas

* ESPIROPLASMAS

Cultivables “in vitro”

Espiral

* FITOPLASMAS

No se pueden cultivar “in vitro”

Esféricos, pleomóficos

Clasificación estructura los organismos en grupos (taxones) en base

a su similitud

Nomenclatura

asigna nombres a los taxones

Identificación determina a que taxones pertenece un organismo que

se aisla

TAXONOMÍA

• Taxonomía– Caracterización exhaustiva– Aplicación de teoría y método de clasificación– Formación de grupos taxonómicos (taxones)– Nomenclatura

• Identificación– Caracterización por número limitado de

tests adecuados al problema– Comparación con spp conocidas– Asignación a una sp – No identificado: estudio taxonómico

• unidad taxonómica básica

• grupo de cepas que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de otros grupos de cepas

• Cepa: población de organismos que desciende de un único organismo

ESPECIE

• Concepto en revisión continua

ESPECIE BACTERIANA

•Actualmente el criterio es POLIFÁSICO (combinación de características fenotípicas y genómicas)

• Definición metodológica estándar:

- % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

- ΔTm < 5ºC (estabilidad térmica del híbrido ADN1-ADN2)

Longitud de onda (nm)

ADN simple hebra

ADN doble hebra

Abs

orba

ncia

220 260 300

Abs

. re

lativ

a 26

0 nm

80 90 100temperatura (ºC)

Tm = 86ºC

ADN doble hebra

ADN simple hebra

desnaturalización

Tm: punto medio del perfil de desnaturalización térmica de ADN-ADN o de ADN-ARN

Aumento de absorbancia del ADN a 260nm por desnaturalizacion

Ensayo de reasociación de ADN-ADN para cepas a y b

Curvas de desnaturalización térmica de ADN homoduplex y heteroduplex

Taxones: Dominio

Phylum

Clase

Orden

Familia

Género

Especie

Sub-especie

importancia en estudios clínicos y ecológicos

RANGOS TAXONOMICOS EN CLASIFICACION BACTERIANA

Sistema binomial de nomenclatura

(Linneo)

Escherichia coli

Escherichia coli o E. coli

Dominio Phylum Clase Orden Familia Genero Especie

Bacteria Proteobacteria Gamma Proteobacteria Zymobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia Escherichia coliEscherichia coli

•serovariedad o serotipo (antígenos distintos)

•fagovariedad (tipificación por fagos)

•biovariedad (diferencias bioquímicas y fisiológicas)

•patovariedad (patogenicidad)

•morfovariedad (diferencias morfológicas)

•genomovariedad (grupos con ADN similares)

Categorías de clasificacion a nivel de sub-especie (tipificación)

Variedades o tipos

Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology

1923 (1ed)-1994 (9ed)

Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 1a Ed 1984(vol 1)-1989(vol 4)

Bergey´s manual of Systematic Bacteriology 2a

Ed 2001(vol 1)

The Prokaryotes (http:/www.prokaryotes.com)

PUBLICACIONES

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (antes IJSB). Publicado por la Sociedad General de Microbiología

Otros: Applied and Environmental Microbiology, Systematic Applied Microbiology

COLECCIONES (cepas tipo y otras)

ATCC (American Type Culture Collection)

DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Colección alemana)

CIP (Colección del Instituto Pasteur, Francia)

Taxonomía bacteriana

CLÁSICA

• caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, etc.)

• algunos genotípicos: % G+C, hibridación ADN-ADN

• ponderación de caracteres (llaves dicotómicas)

Características fenotípicas clásicas de valor taxonómico

Morfología: forma, tamaño y tinción

Nutrición y fisiología: fotótrofo, quimiótrofo, aerobio o anaerobio, temperatura y pH óptimos, fuentes alternativas de C, N y S

Movilidad: tipo y disposición de flagelos

Otros: pigmentos, inclusiones celulares, sensibilidad a antibióticos, patogenicidad

• Contenido G+C % G+C = G + C x 100

G + C + A + Tdeterminación por gradiente de CsCl, desnaturalización térmica o cromatografía

Amplio rango en procariotas: 20 al 80%Poca información para la caracterización taxonómica

criterio de exclusión: %GC > 3, probablemente especies diferentes

%GC > 10, probablemente géneros diferentes

Características genotípicas clásicas

• Hibridación ADN-ADN

- depende de la secuencia completa del genoma - útil en organismos estrechamente relacionados

- determinación por: % hibridación de ADN1 - ADN2

Δ Tm del híbrido

- es el criterio actual de definición de especie

NUMÉRICA

• Agrupación de unidades taxonómicas o taxones por métodos numéricos

• Se basa en un gran número de caracteres

• Cada carácter tiene igual peso

• La similitud es función de la proporción de caracteres comunes

NUMÉRICA

- caracteres fenotípicos (no menos de 60)

- coeficiente de semejanza = a + d .

a + b + c + d

a: número de caracteres positivos en ambas cepas

b: número de caracteres positivos sólo en cepa 1

c: número de caracteres positivos sólo en cepa 2

d: número de caracteres negativos en ambas cepas

Desventajas de una clasificación artificial

• No permite inferir propiedades• No permite comprender microorganismos

que no se han cultivado en el laboratorio• No permite estudiar el origen y evolución

de funciones celulares (resistencia a antibióticos, aerobiosis, fotosintesis)

Clasificación natural

Estructura los organismos en taxones cuyos miembros reflejan tanto como sea posible su naturaleza biológica.

Es ventajosa si además establece relaciones evolutivas

POLIFÁSICA

Fenotípicos: - clásicos (morfología, nutrición, etc) - marcadores

quimiotaxonómicos- perfil de proteínas

totales y enzimas

Filogenéticos: basados en el gen del ARNr 16S

Genotípicos: clásicos: % G+C hibridación DNA-DNA

nuevos: fingerprinting (ej. perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN)

Es la tendencia moderna. Consenso en la integración de distintos tipos de caracteres:

Esquema de las técnicas e información más frecuente empleadas en la taxonomía polifásica (Vandamme et al., 1996).

Marcadores quimiotaxonómicos

Características

- análisis químico con equipamiento especializado

- no son universales, muy útiles dentro de algunos grupos

- alto grado de discriminación

- presentes en distintas estructuras celulares

CARACTERES FENOTIPICOS

• Pared: peptidoglicanos en todas las bacterias salvo en Planctomyces y Mycoplamas

• Membrana externa Gram negativos: lipopolisacáridos

• Membrana citoplasmática: acidos grasos (Fatty Acid Methyl Ester), ácidos micólicos en un grupo de bacterias Gram positivas (Actinomicetes), pigmentos carotenoides en bacterias fotótrofas anoxigénicas.

• Cadena de transporte electrónico: citocromos, quinonas.

• Sistema fotosintético: bacterioclorofilas.

• Citoplasma: poliaminas en metanogénicas y Gram negativas

• Plantean hipótesis de evolución (determina relaciones de parentesco entre las especies)

• Compara la secuencia de moléculas (cronómetros evolutivos) y establece la relación entre ellas

• Las secuencias de las moléculas son el registro histórico de la evolución

CARACTERES CARACTERES FILOGENETICOSFILOGENETICOS

PROPIEDADES DE UN BUEN CRONÓMETRO EVOLUTIVO

– distribución universal (presente en todos los organismos)

- función homóloga en todos los organismos

- secuencias con zonas altamente conservada para distancias evolutivas grandes (alineamiento) y algunas zonas variables

- ausencia de transferencia horizontal

- cantidad de informacion suficiente

•ARNr: 5S, 16S y 23S (Carl Woese)

•Factor de Elongación Tu

•Subunidad beta de ATPasa

•RecA

•Genes funcionales

Moléculas usadas para la determinación de relaciones filogenéticas de organismos

ARNr en Procariotas

Nombre Tamaño Ubicación (nucleótidos)

5S 120 Subunidad mayor del ribosoma

16S 1500 Subunidad menor

23S 2900 Subunidad mayor

Arboles filogéneticos

Arboles filogenéticos

• Uso de programas para alinear secuencias y construir árboles filogenéticos

• Longitud de la línea entre organismos es proporcional a la distancia evolutiva

• Similitud de secuencias implica similitud en los genes

Ejemplo de un árbol filogenético basado en el gen ARNr 16S. La barra

indica la sustitución de 10 nucleótidos cada 100

• Estructura primaria: Dominios de conservación universal Regiones altamente variables Dominios de nivel intermedio de

conservación, con cambios de secuencia, pero conservación de estructura secundaria

• Estructura secundaria: Similar en todos los organismos Acotada por su función en la síntesis de

proteínas: función ancestral

Secuencia del ARNr 16S

Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli

Líneas gruesas: dominios de conservación universal

Líneas normales: dominios de conservación intermedia

Líneas punteadas: regiones hipervariables

ARBOL FILOGENETICO UNIVERSAL

Bacteria Archaea EucaryaPeptidoglicano Sí No No

Lípidos Enl. ester Enl. eter Enl. ester

Ribosomas 70S 70S 80S

tRNA iniciador Formilme-tionina

Metionina Metionina

I ntrones en tRNA No Sí Sí

RNA polimerasa Una(4 subun)

Varias(8-12 subun)

Tres(12-14 subun)

Ribosoma sensible a:Toxina diftérica No Sensible Sensible

CloranfenicolKanamicinaEstreptomicina

Sensible No No

Características diferenciales entre Bacteria, Archaea y Eukarya

Secuencias signaturas o firma en ARNr

Oligonucleótidos o bases presentes en determinadas posiciones en ciertos grupos de organismos

Ejemplos:

AAACUCAAA (posición 910) en Bacteria

CACACACCG (posición 1400) en Archaea

C (posición 47) en gamma-Protebacteria, Cianobacteria, Bacteroides, Grampositivos

Arbol del ARNr 16S

• Termofilia representada en los grupos mas profundos de Archaea y Bacteria

• Muchos de los linajes profundos son anerobios o microaerofílicos

• Fotosíntesis basada en clorofilas: distribuida en varios linajes de Bacteria

Termofilia en todos los miembros de la rama

Termofilia en algunos miembros de la rama

Propiedades definidas genéticamente que han cambiado

poco

• Estructura de la pared celular:

– peptidoglicano solo presente en Bacteria

– Gram +: linaje filogenéticamente coherente

• Lípidos de membrana (ésteres o éteres)

• Metanogénicos: todos pertenecen a uno de los 4 linajes dentro de Archaea

Caracteres que confirman el árbol universal construido a partir del ARNr

16S • Principales diferencias entre dominios Bacteria,

Archaea y Eukarya

• Procariotas actuales mas cercanos al ancestro relacionadas con las condiciones fisicoquímicas en el origen de la vida: Aquifex y Methanopyrus (termofilia, anaerobiosis)

• Características de los Eukarya mas cercanos a los procariotas: Giardia y Microsporidia

• Secuencias de otras moléculas, especialmente las ligadas a la replicacion, transcripción y traducción

Microsporidia y Giardia: carecen de mitocondria, son parásitos obligados, tienen genoma un poco mayor que los procariotas.

Caracteres similares en taxones filogenéticamente distantes

Chloroflexus y Chlorobium

ambos poseen clorosomas con similar función y estructura, pero diferentes centros de reacción

posibles explicaciones:

transferencia lateral

evolución independiente

el gen del ARNr 16S aportaría información limitada

Arbol del dominio Bacteria

DOMINIO BACTERIA

Actualmente con mas de 40 divisiones (phylum), algunas sin organismos cultivados (secuencias ambientales)

Phylum mejores caracterizados: Proteobacteria (α,β,γ,δ,ε), Gram positivos (LowGC y HighGC)

Origen de mitocondrias (phylum Proteobacteria) y cloroplastos (phylum Cyanobacteria)

Relación entre la definición de especie bacteriana y el análisis del gen ARNr 16S

En general se cumple: secuencia del gen del ARNr 16S difiere en mas del 3% con el resto de las secuencias conocidas de bacterias entonces el % de hibridación ADN-ADN es menor al 70%

especies diferentes

Definición especie: % de hibridación ADN1-ADN2 > 70%

COMPLETAR IDENTIFICACIÓN DE CULTIVOS PUROS

ANÁLISIS DE COMUNIDADES SIN CULTIVO

Secuencia del gen ARNr 16S

Se emplea frecuentemente para:

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S PARA

LA IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

> 3% < 3%

Diferencia de secuencia con la cepa mas similar

Alineamiento y corrección de la secuencia

Comparación con bases de secuencias(http://rdp.cme.msu.edu/html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank)

NUEVA CEPA DE LA MISMA ESPECIE

< 70%

Hibridación ADN-ADN

pruebas fenotípicas

similaresdiferentes

> 70%

Confirmación con pruebas fenotípicas y genotípicas diferentes

NUEVA ESPECIE

¿Por qué hay tanta diversidad entre los Procariotas (Archaea y

Bacteria)?

• son ancestrales

• son ubicuos: ambientes extremos, parásitos o simbiontes de Eukarya

• representan la mayor diversidad de seres vivos, mucha de la cual esta aún inexplorada

Ejemplos de diversidad: estructura y función

• Pared: bacterias sin pared (Mycoplasmas, Thermoplasmas)

• Membranas: diferente composición (Mycobacterium)

• Forma: Espiroquetas, bacterias con prostecas (Caulobacter), formacion de hifas (Streptomyces)

• Mecanismos de movimiento: bacterias deslizantes (Beggiatoa)

• Diferenciacion celular: microcistos de Cyanobacterias, comportamiento social (Myxobacterias)

• Comportamiento frente a otras bacterias: predación (Bdellovibrio)

• Obtención de energía independiente del trasporte de electrones (fosforilación oxidativa o fotosíntesis) y la fermentación, ej.decarboxilasas en Oxalobacter formigenes

•Origen de la tierra 4600 millones de años

•Condiciones de la Tierra primitiva: CH4, CO2, N2 NH3 y muy poco O2 (ambiente reductor). Trazas de FeS y H2S

•Temperatura > 100°C

•Evidencia de vida microbiana en la Tierra primitiva (microfósiles: estromatolitos)

•Vida primitiva: ¿organismos con ARN? (sin ADN)

•Célula moderna: ADN ARN Proteína

•Origen de eucariotas: teoría endosimbiótica

ORIGEN DE LA VIDA