TAMPILAN IMUNOHISTOKIMIA P53 PADA KARSINOMA SEL …

TAMPILAN IMUNOHISTOKIMIA P53 PADA

KARSINOMA SEL SKUAMOSA

RONGGA MULUT

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi tugas dan melengkapi

syarat memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi

FATIN NABILAH BINTI MOHD RADZUAN

NIM : 140600222

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2018


Fakultas Kedokteran Gigi

Departemen Biologi Oral Kedokteran Gigi

Tahun 2018

Fatin Nabilah binti Mohd Radzuan

Tampilan imunohistokimia p53 pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut

xii + 49 halaman

Karsinoma sel skuamosa (KSS) rongga mulut merupakan jenis keganasan

urutan ke-enam terbanyak dari semua jenis keganasan di negara Barat seperti Negara

Inggeris dan Amerika Serikat. Di Asia Tenggara, insidensi KSS rongga mulut

meningkat sampai mencapai 40,9% yang ada hubungannya dengan faktor

karsinogenik berupa kebiasaan buruk, yaitu mengunyah tembakau, betel quid,

menyirih dan menyuntil. Faktor karsinogenik (iritasi kronis) mengganggu proses

biologis siklus sel (fase G1, S, G2 dan M) menyebabkan gangguan pada gen p53

menjadi gen p53 mutan sehingga terjadinya proliferasi abnormal dan hilangnya

fungsi apoptosis yang akhirnya menyebabkan terjadinya neoplasma ganas.

Penelitian ini bertujuan untuk melihat tampilan imunohistokimia p53 mutan yang

dihubungkan dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga mulut di Medan.

Metode penelitian ini merupakan penelitian deskriptif analitik dengan pendekatan

cross sectional terhadap 12 sampel blok parafin yang telah didiagnosa sebagai KSS

rongga mulut di Laboratarium Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik Medan

tahun 2014-2018. Setiap blok parafin processing di laboratorium untuk dibuat satu

sediaan perwarnaan HE dan satu sediaan pewarnaan imunohistokimia p53.

Preparat diamati di bawah mikroskop cahaya merek Olympus CX21. Analisa data

menggunakan uji Chi-Square dengan kemaknaan (p<0,05). Hasil menunjukkan KSS

berdiferensiasi baik tertinggi (50%). Hasil pewarnaan imunohistokimia p53:

tampilan positif (83,3%) dan tampilan negatif (16,7%); tingkat skor p53 (++)

mendapatkan jumlah frekuensi yang tertinggi (40%). Dapat disimpulkan, hanya 10

dari 12 sampel menunjukkan tampilan positif p53. Tidak terdapat hubungan yang

signifikan antara tingkat skor p53 dengan tingkat diferensiasi KSS rongga mulut.


Daftar Rujukan: 37 (2008-2018)


ii

PERNYATAAN PERSETUJUAN

Skripsi ini telah disetujui untuk dipertahankan

di hadapan tim penguji skripsi

Medan, 5 Desember 2018

Pembimbing: Tanda tangan

1. Rehulina Ginting, drg., M.Si

...........….........................

NIP: 19511018 198003 2 001


iii

TIM PENGUJI SKRIPSI

Skripsi ini telah dipertahankan di hadapan tim penguji

pada tanggal 5 Desember 2018

TIM PENGUJI

KETUA : Rehulina Ginting, drg., M.Si

ANGGOTA : 1. Dr. Betty, M. Ked. (PA), Sp. PA

2. Dr. Ameta Primasari, drg., MDSC., M. Kes


iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas rahmat dan

kurnia-Nya, sehingga skripsi ini selesai disusun dalam rangka memenuhi kewajiban penulis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi di Fakultas

Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

Dengan hati yang tulus, penulis mengucapkan ribuan terima kasih kepada Rehulina

Ginting, drg., M.Si dan dr. Betty, M.Ked. (PA), Sp.PA selaku dosen pembimbing yang telah

banyak meluangkan waktu, tenaga serta pikirannya dengan sabar dalam memberikan

bimbingan dan arahan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Ucapan terima

kasih yang sebesar-besarnya kepada kedua orang tua penulis, Ayahanda Mohd Radzuan, dan

Ibunda Khairulbariah serta adik-adik tersayang yang telah memberikan banyak doa, cinta,

kasih sayang, pengharapan dan pengorbanan, serta segala bantuan baik moril maupun materil

yang sungguh penulis tidak mampu membalasnya. Selanjutnya, penulis mengucapkan terima

kasih kepada:

1. Trelia Boel, drg., M.Kes., Sp RKG(K) selaku Dekan Fakultas Kedokteran

Gigi Universitas Sumatera Utara.

2. Dr. Ameta Primasari, drg., M.DSc., M.Kes selaku ketua Departemen Biologi

Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara.

3. Yendriwati, drg., M.Kes, Lisna Unita R, drg., M.Kes, Minasari, drg., MM,

dan Yumi Lindawati, drg., M.DSc selaku para staf pengajar Departemen

Biologi oral dan Ibu Ngaisah serta Kak Dani Irma Suryani selaku pegawai

Departemen Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera

Utara yang telah banyak membantu penulis dalam melaksanakan penelitian

ini.


v

4. Rini Octavia Nasution, drg., Sp.Perio, M.Kes selaku dosen pembimbing

akademik yang telah membimbing, mendukung dan memotivasi penulis

selama menjalankan akademik.

5. Teman-teman tersayang Syaza, Novira, Thahirah, Syamimi, Aisya, Kak

Syuhada, Anita S, Mira, Wani, Naja, Ezura, dan teman-teman yang lain yang

tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah banyak memberikan

bantuan, dukungan dan motivasi kepada penulis dalam menyelesaikan skripsi

ini.

6. Teman seperjuangan skripsi di Departemen Biologi Oral serta seluruh teman

mahasiswa stambuk 2014 atas dukungan, saran dan bantuannya kepada

penulis.

Penulis menyadari kelemahan dan keterbatasan ilmu yang penulis miliki menjadikan

skripsi ini masih perlu perbaikan, saran, dan kritik untuk membangun skripsi ini nantinya

menjadi lebih baik.

Akhirnya, penulis mengharapkan semoga skripsi ini dapat digunakan dan

memberikan sumbangan pikiran yang berguna bagi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas

Sumatera Utara khususnya Departemen Biologi Oral.

Medan, 5 Desember 2018

Penulis,

(Fatin Nabilah)

NIM: 140600222


vi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL........................................................................................

HALAMAN PERSETUJUAN.........................................................................

HALAMAN TIM PENGUJI............................................................................

KATA PENGANTAR...................................................................................... iv

DAFTAR ISI.................................................................................................... vi

DAFTAR GAMBAR....................................................................................... ix

DAFTAR TABEL............................................................................................ x

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... xii

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang……….................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah......................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian.......................................................................... 4

1.4 Hipotesis Penelitian...................................................................... 4

1.5 Manfaat Penelitian........................................................................ 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Struktur Sel Normal .................................................................... 5

2.1.1 Sitoplasma ................................................................................ 6


vii

2.1.2 Nukleus ..................................................................................... 6

2.2 Siklus Sel ..................................................................................... 8

2.2.1 Mitosis ....................................................................................... 12

2.2.2 Peran p53 Sebagai Checkpoint Siklus Sel ................................. 13

2.3 Gen p53 Mutan ............................................................................ 17

2.3.1 Peran p53 Mutan Terjadinya Kanker ........................................ 19

2.4 Pewarnaan Imunohistokimia p53 ................................................ 20

2.5 Landasan Teori ............................................................................ 24

2.6 Kerangka Teori............................................................................ 26

2.7 Kerangka Konsep ........................................................................ 27

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian............................................................................ 28

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian....................................................... 28

3.2.1 Lokasi Penelitian...................................................................... 28

3.2.2 Waktu Penelitian...................................................................... 28

3.3 Populasi, Sampel dan Besar Sampel........................................... 28

3.3.1 Populasi.................................................................................... 28

3.3.2 Sampel...................................................................................... 28

3.3.3 Besar Sampel............................................................................ 29

3.4 Kriteria Sampel............................................................................ 30

3.4.1 Kriteria Inklusi......................................................................... 30

3.4.2 Kriteria Ekslusi......................................................................... 30

3.5 Kerangka Operasional................................................................. 30

3.6 Variabel Penelitian...................................................................... 31

3.6.1 Variabel Bebas......................................................................... 31

3.6.2 Variabel Terikat........................................................................ 31

3.6.3 Variabel Terkendali.................................................................. 31

3.7 Definisi Operasional.................................................................... 32

3.8 Alat dan Bahan Penelitian........................................................... 33

3.8.1 Alat Penelitian.......................................................................... 33

3.8.2 Bahan untuk pewarnaan HE.................................................... 34

3.8.3 Bahan untuk pewarnaan Imunohistokimia p53......................... 34

3.9 Metode Pengumpulan Data......................................................... 34

3.9.1 Pembuatan sediaan mikrokopis dari blok parafin.................... 34

3.9.2 Prosedur Pewarnaan HE.......................................................... 35

3.9.3 Prosedur Pewarnaan Imunohistokimia dengan Antibodi

Monoklonal p53....................................................................... 36

3.10 Pengolahan dan Analisa Data................................................... 37

3.11 Etika Penelitian......................................................................... 37

BAB 4 HASIL PENELITIAN


viii

4.1 Distribusi Frekuensi Diagnosa Histopatologi pada KSS Rongga

Mulut (Hematoksilin Eosin) ........................................................ 38

4.2 Distribusi Frekuensi Tampilan Imunohistokimia p53 pada KSS

Rongga Mulut ............................................................................. 39

4.3 Hubungan Skor Tampilan Imunohistokimia p53 pada KSS

Rongga Mulut dengan Tingkat Diferensiasi Sel ......................... 40

BAB 5 PEMBAHASAN

5.1 Tingkat Diferensiasi KSS rongga mulut ..................................... 42

5.2 Pewarnaan Imunohistokimia Berupa Tampilan p53 Mutan pada

Kasus KSS Rongga Mulut .......................................................... 43

5.3 Hubungan Tingkat Skor p53 dengan Tingkat Diferensiasi Sel ... 45

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 46

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 47

LAMPIRAN


ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Sel dan organel-organelnya ............................................................................. 5

2. DNA heliks ganda ............................................................................................ 7

3. Siklus sel dan replikasi sel .............................................................................. 8

4. Peran siklin, cyclin dependent kinase dan inhibitornya .................................. 9

5. Peran RB pada checkpoint G1/S dalam regulasi siklus sel ............................. 10

6. Fase M (mitosis) pada siklus sel .................................................................... 12

7. Jalur degradasi proteasome p53 ...................................................................... 14

8. Aktivasi p53 menyebabvkan penghentian siklus sel ....................................... 16

9. Jalur apoptosis p53 .......................................................................................... 17

10. Rincian gen p53............................................................................................... 18

11. Peran p53 pada sel normal dan sel yang mengalami mutasi ........................... 20

12. Tampilan p53 dengan skor 1 (lemah) pada KSS rongga mulut ...................... 22

13. Tampilan p53 dengan skor 2 (sedang) pada KSS rongga mulut ..................... 22

14. Tampilan p53 dengan skor 3 (kuat) pada KSS rongga mulut ......................... 23


x

DAFTAR TABEL

Tabel

Halaman

1. Distribusi frekuensi diagnosa histopatologi pada KSS rongga mulut

(Hematoksilin Eosin) ................................................................................ 39

2. Distribusi frekuensi tampilan imunohistokimia p53 pada KSS rongga

mulut .......................................................................................................... 39

3. Distribusi frekuensi tampilan imunohistokimia p53 (sel-sel positif)

pada KSS rongga mulut ............................................................................ 40

4. Distribusi frekuensi tampilan imunohistokimia p53 (sel-sel positif)

pada KSS rongga mulut dihubungkan dengan tingkat diferensiasi sel ..... 41


xi

DAFTAR SINGKATAN

ATM Ataxia-telangiectasia mutated

CDK Cyclin dependent kinase

DNA Deoxyribonuclei acid

E2F E2 Transcription Factor

HE Pewarnaan Hematoksilin Eosin

IHK Imunohistokimia

KSS Karsinoma sel skuamosa

MDM-2 Mouse double minute 2 homolog

PBS Phosphate Buffer Saline

RB Retinoblastoma

RNA Ribonuclei acid

TGF-β Transforming growth factor-β

TSG Tumor Supressor Gen


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1. Skema alur pikir

2. Skema pencatatan blok parafin

3. Gambar alat dan bahan

4. Prosedur kerja

a. Pembuatan preparat dari blok parafin dan pewarnaan HE

b. Tampilan imunohistokimia p53 pada KSS rongga mulut

5. a. Hasil pewarnaan HE pada KSS rongga mulut

b. Tampilan imunohistokimia p53 pada KSS rongga mulut

6. Tabel hasil

7. Ethical clearance

8. Hasil uji statistik


13

13

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Karsinoma sel skuamosa (KSS) rongga mulut merupakan neoplasma ganas

epitel tatah berlapis (skuamosa).1-3

Menurut American Cancer Society (2016) kanker

rongga mulut (termasuk faring) meningkat dari 3% menjadi 4% yang pada saat ini

merupakan jenis keganasan urutan ke-enam terbanyak dari semua jenis keganasan di

negara Barat yaitu negara Inggeris dan Amerika Serikat.2-4

Persentase kanker rongga

mulut meningkat sampai mencapai 40,9% dari data GLOBOCAN 2012 dari World

Health Organization (WHO): Bangladesh, Pakistan, India dan Sri Lanka.5,6

Hal ini

berhubungan dengan kebiasaan buruk antara lain, mengkonsumsi alkohol, rokok,

tembakau, menyirih, menyuntil dan infeksi virus serta diikuti oleh kebersihan

rongga mulut yang jelek, iritasi kronis dari restorasi, karies gigi, malnutrisi dan

lain-lain.2-6

Ada beberapa teori penyebab terjadinya kanker antara lain perubahan

genetik, feedback deletion, teori multifaktor, teori stadium berganda (multistage

theory), dan multicellular origin of cancer-field theory. Berdasarkan teori di atas,

terjadinya proses pembentukan sel kanker ada hubungan dengan perubahan genetik

pada siklus sel.3

Pertumbuhan dan perkembangan sel di dalam siklus kehidupan yang dialami

sel untuk tetap bertahan hidup. Siklus ini mengatur pertumbuhan sel dengan

meregulasi waktu pembelahan dan mengatur perkembangan sel dengan mengatur

jumlah ekspresi atau translasi gen. Siklus sel terdiri dari empat fase yaitu fase G1

(presintetik), S (sintesis DNA), G2 (premitosis) dan M (mitosis) untuk proses divisi

sel dan transisi dari satu fase ke fase lainnya untuk tujuan pembelahan.3 Fase M

yang berlangsung selama satu jam terdiri dari dua proses besar yaitu pembelahan

nukleus atau mitosis yang terdiri dari tahap profase, metafase, anafase dan telofase di

mana kromosom dan DNA (deoxyribonucleic acid) yang ditranskrip didistribusikan


14

14

ke sepasang inti sel anak setelah inti sel membelah menjadi dua serta pembelahan

sitoplasma atau sitokinesis di mana sel itu sendiri membelah menjadi dua. Hal ini

yang disebut sebagai mitosis.7-9

Dalam proses siklus sel untuk sel membelah (bermitosis), dijumpai dua

checkpoints. Transisi dari satu fase ke fase berikutnya diperiksa pada checkpoints

sebelum progresi siklus sel. Checkpoints bukan hanya mengontrol transisi antara

fase siklus sel akan tetapi juga mengkordinasikan progresi siklus sel dengan

sinyal-sinyal sel. Pada kondisi dimana DNA inti sel rusak, terjadi penghentian

pada siklus sel untuk perbaikan kerusakan DNA. Checkpoints terletak pada fase

G1/S yang memeriksa kerusakan DNA sebelum sel replikasi dan pada fase G2/M

yang memeriksa kerusakan DNA setelah sel replikasi. Checkpoints dikontrol oleh

siklin, cyclin dependent kinases (CDKs) dan inhibitornya, gen retinoblastoma (RB),

gen p21 dan gen p53. Gen p53 normal (p53 wild-type) berperan untuk perbaikan

DNA yang rusak dan mencegah sel memasuki fase S dengan memicu gen p21 untuk

menghentikan proliferasi sel, atau sebaliknya, dalam membimbing sel yang rusak

menuju apoptosis apabila kerusakan DNA gagal diperbaiki. Proses diatas

menyebabkan proliferasi sel berjalan dengan baik.3,10,11

Proses terjadi kanker antara lain yaitu kehilangan fungsi p53 akibat terjadi

mutasi pada gen p53. Perubahan gen p53 menjadi p53 mutan terjadi apabila ada

kerusakan DNA disebabkan oleh faktor fisik dan faktor kimia sehingga terjadi

perubahan pada protein produknya menyebabkan hilangnya fungsi gen. Adanya gen

p53 mutan dalam sel mengakibatkan fungsi apoptosis sel berkurang atau hilang

seterusnya gen ini tidak mampu memicu gen p21 mengakibatkan terhambat ikatan

antara siklin dan CDK sehingga pembelahan sel berjalan terus. Proses ini memicu

transformasi sel normal menjadi sel ganas.3,12

Pewarnaan imunohistokimia p53 menampilkan warna coklat pada inti sel

tumor yang menunjukkan bahwa ada p53 mutan pada sel tumor. Tampilan warna

coklat ini dapat dilihat melalui pemeriksaan imunohistokimia dengan menggunakan

antibodi monoklonal anti-p53 tikus yaitu suatu antibodi monoklonal yang secara

spesifik dapat mengenali p53 mutan dalam sel.13

Protein p53 berakumulasi baik pada


15

15

inti maupun sitoplasma menurut Jansson dkk. (2001).14

Tampilan p53 mutan

dikatakan positif apabila menampilkan warna coklat pada inti sel. Yadong Li (2015)

dan Jinsong Zhang (2015) membagi empat kategori berdasarkan jumlah sel positif

p53 mutan antaranya: negatif, tidak terlihat warna coklat; positif lemah (+), <30%

sel positif p53 mutan; positif sedang (++), 30-70% sel positif p53 mutan; dan positif

kuat (+++), >70% sel positif p53 mutan.12

Berdasarkan klasifikasi World Health Organization (WHO), KSS rongga

mulut dibagi atas sel yang berdiferensiasi baik, sedang dan buruk. Hal ini dapat

dilihat dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin. Menurut Ghanghoria dkk. (2015),

tampilan p53 mutan berhubungan dengan tingkat diferensiasi sel. Semakin buruk

diferensiasi sel, semakin tinggi tingkat skor tampilan p53 mutan. Ini menunjukkan

keterlibatan p53 mutan dalam transformasi neoplastik sehingga dapat digunakan

sebagai penanda awal untuk evaluasi klinis.14

Berdasarkan uraian di atas, peneliti ingin melihat hubungan antara tampilan

p53 mutan dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga mulut di Medan.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang yang telah dijelaskan tersebut di atas, maka

dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:

1. Berapakah tingkat diferensiasi sel dari kasus KSS rongga mulut yang

diteliti?

2. Berapakah tingkat skor berdasarkan jumlah p53 mutan dari KSS rongga

mulut yang diteliti?

3. Apakah ada hubungan antara tingkat skor tampilan p53 mutan dengan

tingkat diferensiasi sel dari KSS rongga mulut yang diteliti?


16

16

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk melihat tampilan imunohistokimia p53 mutan dihubungkan dengan

tingkat diferensiasi sel, lokasi lesi, jenis kelamin dan umur pada KSS rongga mulut

di Medan.

1.3.2 Tujuan Khusus

1. Untuk mendapatkan tingkat diferensiasi sel dari kasus KSS rongga mulut

yang diteliti (Hematoksilin Eosin).

2. Untuk mendapatkan tingkat skor berdasarkan jumlah p53 mutan dari KSS

rongga mulut yang diteliti (imunohistokimia p53).

3. Untuk melihat hubungan antara tingkat skor tampilan p53 mutan dengan

tingkat diferensiasi sel dari KSS rongga mulut yang diteliti.

1.4 Hipotesis Penelitian

Hα: Terdapat hubungan yang signifikan antara tampilan imunohistokimia

p53 mutan dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga mulut.

1.5 Manfaat Penelitian

1.5.1 Manfaat Teoritis

Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi lebih lanjut mengenai hubungan hasil pewarnaan imunohistokimia p53

mutan dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga mulut.

1.5.2 Manfaat Praktis

Pewarnaan imunohistokimia p53 dapat digunakan dalam penatalaksanaan

klinik pasien penderita kanker untuk menentukan tipe terapi dan prognosisnya.


17

17

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Sel adalah unit yang membentuk semua makhluk hidup. Setiap sel adalah

suatu sistem lengkap (self cointained) yang melaksanakan berbagai fungsi yaitu

membentuk dan menggunakan energi dengan melakukan respirasi, reproduksi, dan

eksresi. Sel-sel bergabung membentuk jaringan, organ dan sistem tubuh. Sel juga

merupakan unit kehidupan struktural dan fungsional terkecil dari tubuh dan

sebagian besar reaksi kimia yang mempertahankan kehidupan berlangsung dalam

sel. Sel dan zat intraselular membentuk seluruh jaringan tubuh.3,7-9,11

2.1 Struktur Sel Normal

Sel terdiri atas struktur-struktur internal yang dipisahkan oleh membran

semipermeabel. Fungsi setiap sel berbeda-beda dalam tubuh namun semua sel

memiliki struktur internal yang sama. Setiap sel dapat dibagi menjadi dua bagian

utama, yaitu sitoplasma dan nukleus.3,7-9,11

Gambar 1. Sel dan organel-organelnya

3


18

18

2.1.1 Sitoplasma

Sitoplasma merupakan bagian semi cair (semi-fluid) pada sel yang

terbungkus oleh membran plasma. Komponen sitoplasma meliputi cairan seperti gel

yang disebut sitosol dan organel-organel sel. Sitoplasma berfungsi dalam penyerapan

dan duplikasi sel, di mana organel-organel melakukan tindakan spesifik. Organel

dalam sel adalah struktur spesifik yang aktif secara metabolik dan berfungsi

sesuai dengan kode genetik. Bermula dengan mitokondria yang merupakan

sumber energi sel, sedangkan retikulum endoplasma dan ribosom adalah struktur

sitoplasmik yang paling penting untuk mensintesis protein. Aparatus Golgi

adalah suatu kompleks membran dan vesikel yang berperan dalam sekresi

berbagai mikrotubulus dan mikrofilamen. Sitoskeleton menyokong sel dari

bagian dalam dan memungkinkan terjadinya gerakan tonjolan-tonjolan ke bagian

luar sel, misalnya tonjolan mirip rambut yang disebut silia. Mikrotubulus

berperan penting dalam pemisahan kromosom selama pembelahan sel dan

membantu mempertahankan integrasi struktural.3,7-9,11

2.1.2 Nukleus

Nukleus atau nuklei adalah organel yang paling besar, terpadat dan dapat

terlihat secara mikroskopik. Nukleus ditemukan pada semua sel pada tubuh kecuali

sel darah merah yang sudah matang dan sebagian besar sel hanya memiliki satu

nukleus. Komponen nukleus terdiri atas nukleolus, RNA (ribonucleic acid), DNA

(deoxyribonucleic acid), dan kromosom.3,7-9,11,15

Kromosom muncul pada saat pembelahan sel dan adanya kromatin pada saat

pembelahan sel. Benang kromatin tersusun atas protein dan DNA dimana terdapat

gen. DNA merupakan tempat penyimpanan informasi genetik yang terdiri dari

molekul polinukleotida yang berulang-ulang, tersusun rangkap, membentuk DNA

heliks ganda dan berpilin ke kanan. Setiap nukleotida terdiri dari tiga gugus

molekul, di antaranya gula 5 karbon (2-deoksiribosa), basa nitrogen yang terdiri

golongan purin yaitu adenine (A) dan guanine (G), serta golongan pirimidin yaitu


19

19

cytosine (C) dan thymine (T) dan gugus fosfat. DNA akan mentranskripsi diri

menjadi RNA yang selanjutnya akan dikeluarkan ke sitoplasma.3,11

Gambar 2. DNA heliks ganda

11

RNA merupakan molekul yang berfungsi sebagai penyimpan dan penyalur

informasi genetik. RNA sebagai penyalur informasi genetik misalnya pada proses

translasi untuk sintesis protein. RNA merupakan rantai tunggal polinukleotida yang

terdiri dari tiga gugus molekul, yaitu 5 karbon, basa nitrogen yang terdiri dari

golongan purin (yang sama dengan DNA) serta golongan pirimidin yang berbeda

yaitu cytosine (C) dan urasil (U), dan gugus fosfat. Nukleolus terlihat pada

pertumbuhan sel, yaitu saat terjadi proses transkripsi (sintesis RNA) untuk ribosom.

Nukleolus merupakan bagian tengah dari nukleus yang berbentuk bulat dan padat

yang bersifat asam.3,11,15

Komponen-komponen sel di atas sangat penting untuk pertumbuhan sel.

Pada sel yang sedang tumbuh selalu mengalami siklus sel, yang merupakan

serangkaian proses yang berlangsung sejak sel itu terbentuk hingga siap mulai

membelah.3,11


20

20

2.2 Siklus Sel

Serangkaian langkah yang menyebabkan pembelahan sel disebut siklus sel.

Siklus sel adalah fungsi sel yang paling utama berupa duplikasi akurat sejumlah

besar DNA di dalam kromosom, dan kemudian memisahkan hasil duplikasi tersebut

hingga terjadi dua sel baru yang identik.3,11

Gambar 3. Siklus sel dan replikasi sel

3

Siklus sel terdiri dari fase G1 (Gap 1/presintesis), S (sintesis DNA), G2 (Gap

2/premitosis) dan M (mitosis). Ketiga fase G1, S dan G2 merupakan fase interfase

yang berlangsung selama 23 jam dari 24 jam siklus sel. Sel istirahat (sel yang tidak

membelah) ada dalam fase G0 pada siklus sel dan harus memasuki ke fase G1 untuk

menjalani replikasi. Sel memasuki fase G1 sama ada dari fase G0 atau setelah

melewati fase mitosis. Terdapat dua checkpoints yang utama dalam siklus sel yang

pertama ada di antara G1/S dan yang kedua ada di antara G2/M. Siklus sel

diregulasi oleh aktivator dan inhibitor. Progresi siklus sel dikontrol oleh protein yang


https://id.wikipedia.org/wiki/DNA

https://id.wikipedia.org/wiki/Kromosom

21

21

disebut siklin (sifat sikliknya dari produksi dan degradasi) dan enzim siklin yang

disebut cyclin-dependent kinase (CDK). CDK memandu siklus sel dengan

memfosforilitas (phosphorlating) protein target yang diperlukan untuk progresi

sel untuk tahapan seterusnya pada siklus sel.3,10,11,16

Gambar 4. Peran siklin, cyclin dependent kinase dan inhibitornya

3

Siklus sel dimulai dari masuknya sel dari fase G0 (quiescent) ke fase G1

karena adanya stimulus oleh faktor pertumbuhan (growth factor). Pada fase G1

terjadi duplikasi sentrosom dan pertumbuhan sel yang banyak. Pada awal fase G1,

CDK4 dan CDK6 diaktifkan oleh siklin D. Kompleks siklin D-CDK4/6 akan

menginisiasi fosforilasi dari keluarga protein retinoblastoma (pRb) selama awal G1.

Efek dari fosforilasi ini, fungsi histon deasetilasi (HDAC) yang seharusnya menjaga


22

22

kekompakan struktur kromatin menjadi terganggu, akibatnya struktur DNA menjadi

longgar dan faktor transkripsi yang semula diikat pRb menjadi lepas dan transkripsi

dari gen responsif dengan E2F yang dibutuhkan dalam progresi siklus sel ke fase S

menjadi aktif. Gen tersebut antara lain siklin E, siklin A, dan lain-lain.3,10,11,16

Pada transisi fase G1 ke fase S, terdapat checkpoint G1/S yang akan

memeriksa kerusakan DNA inti sel sebelum sel mereplikasi. CDK2 aktif dengan

mengikat siklin E. Kompleks tersebut melanjutkan proses fosforilasi pRb (status

hiperfosforilasi) supaya proses transkripsi yang dipacu E2F tetap aktif dan progresi

siklus sel dapat melewati titik restriksi (restriction point) yang ada di batas fase

G1/S. Pada saat inilah siklin A ditranskripsi. Selama fase G1/S, kompleks siklin E-

CDK2 juga memfosforilasi inhibitor p27 sehingga p27 terdegradasi. Ketika siklus sel

memasuki fase S, siklin E akan didegradasi dan CDK2 yang dibebaskan akan

mengikat siklin A.3,10,11,16

Gambar 5. Peran gen RB (Retinoblastoma) dalam regulasi siklus sel

3


23

23

Pada fase S di mana berlangsung sekitar 10 sampai 12 jam, terjadi sintesis

DNA, duplikasi kromosom dan replikasi DNA. Selama fase S, sel memerlukan

kompleks siklin A-CDK2 untuk mereplikasi DNA. Kompleks siklin A-CDK2 akan

memfosforilasi protein yang diperlukan dalam replikasi DNA supaya aktif, misalnya

protein CDC6 (Cell Division Cycle 6). Kompleks tersebut juga menjaga supaya tidak

terjadi keserbaragaman replikasi DNA. Pada akhir fase S, siklin A akan melepas

CDK2 dan mengikat CDK1 yang meregulasi transisi sel dari S ke G2. Kompleks

siklin A-CDK1 akan memfasilitasi kondensasi kromatin yang dibutuhkan untuk

penggandaan sel.3,10,11,16

Pada fase G2, perkembangan dan diferensiasi sel terjadi. Sel berkembang

dengan memproduksi protein dan organel sitoplasmik. Pada fase G2, sel juga

memiliki kesempatan melakukan mekanisme perbaikan apabila terjadi kesalahan

sintesis DNA oleh karena adanya checkpoint G2/M yang akan memonitor

penyelesaian replikasi DNA dan memeriksa jika sel dapat memulai mitosis dengan

selamat dan memisahkan kromatin. Siklin B mengaktifkan CDK1 yang

menstimulasi sel masuk ke mitosis pada checkpoint G2/M. Aktivasi kompleks siklin

B-CDK1 memicu progresi siklus sel melewati checkpoint G2/M dan memicu

kejadian awal mitosis yang mengarah ke penyusunan kromatid di bidang ekuator

(equatorial plate).3,10,11,16

Memasuki fase mitosis yang akan berlangsung selama satu jam, siklin A akan

didegradasi dan terjadi peningkatan ekspresi siklin B yang mengikat CDK1.

Kompleks siklin B-CDK1 secara aktif memacu mitosis. Kompleks siklin B-CDK1

berperan penting dalam mengontrol penyusunan kembali mikrotubul (microtubule

rearrangement) selama mitosis. CDK1 dapat dinonaktifkan oleh Wee1 dengan cara

Wee1 memfosforilasi CDK1. Defosforilasi CDK1 dapat dilakukan oleh Cdc25

sehingga CDK1 menjadi aktif kembali dan siklus sel tetap berlangsung. Pada akhir

fase mitosis, siklin B akan didegradasi oleh anaphase promoting complex (APC)

melalui proses proteolitik. APC juga berfungsi untuk memacu kromatid untuk

berpisah bergerak ke masing-masing kutub untuk menyelesaikan mitosis

(anafase).3,10,11,16


24

24

2.2.1 Mitosis

Fase M yaitu fase mitosis yang berlangsung selama satu jam terdiri dari dua

proses besar yaitu pembelahan nukleus atau mitosis yang terdiri dari fase profase,

metafase, anafase dan telofase, di mana kromosom yang ditranskrip didistribusikan

ke sepasang nuklei anak dan pembagian sitoplasma atau sitokinesis, di mana sel itu

sendiri membelah menjadi dua.7,8,11

Gambar 6. Fase M (mitosis) pada siklus sel

8

Fase pertama mitosis adalah fase profase. Benang kromatin dari nukleus

mengental menjadi struktur seperti batang yang disebut kromosom. Setiap kromosom

kemudian dipisah membentuk dua kromatid. Setiap pasangan kromatid melekat pada

badan yang berbentuk bulat yang disebut sentromer. Pasangan sentriol duplikat, dan

kromatid mengikut sentriol bermigrasi ke ujung sel yang berlawanan. Pada saat yang

sama, mikrotubul muncul diantara dua sentriol dan membentuk benang-benang

spindle dan aster. Pada saat ini nukleolus menghilang dan komponen-komponennya

melekat pada kromatid. Akhirnya, pembungkus nukleus terganggu dan berubah

menjadi elemen granular, seperti retikulum endoplasma.7,8,11


25

25

Fase metaphase, masing-masing sentromer mempunyai dua kinetokor dan

masing-masing kinetokor dihubungkan ke satu sentriol oleh serabut kinetokor.

Kromatid pindah ke tengah sel dan disusun di sepanjang bidang ekuator (equatorial

plate). Dua kromatid dari masing-masing kromosom melekat di tengah-tengah bidang

ekuator ke sentromer. Kromatid ini kemudian membelah di sentromer menjadi dua

set kromosom.7,8,11

Seterusnya fase anafase, kromosom anak bergerak ke kutub yang berlawanan

dari sel. Hal ini diduga terjadi oleh karena mikrotubulus kinetokor memendek

menyebabkan penarikan kromatid menuju ke kutub masing-masing. Suatu lekukan

mulai muncul di sekitar bagian tengah sel.7,8,11

Fase telofase, kromosom dilepaskan dari mikrotubulus dan benang-benang

spindle hilang. Selanjutnya, kromosom memanjang dan menyebar menyebabkan

kehilangan identitasnya (tidak terlihat) dan memperoleh kembali penampilan benang

kromatin. Kedua nukleolus di dalam nukleus dan pembungkus nukleus kemudian

muncul kembali. Selama fase akhir pembelahan mitosis (sitokinesis), muncul lekukan

membran sel di tengah sel dan lekukan makin dalam sehingga terbelah menjadi dua

sel anak. Sitokinesis terjadi karena dibantu oleh protein aktin dan myosin.7,8,11

2.2.2 Peran p53 Sebagai Checkpoint Siklus Sel

Gen p53 merupakan gen supresor tumor, yaitu suatu gen yang menyandi 53-

kDa fosfoprotein nukleus yang terdiri atas 393 asam amino, terletak pada lengan

pendek kromosom 17 manusia di posisi 17p13.1 (lokasi band dari gen). Nama p53

diberikan pada tahun 1979 menggambarkan massa molekulnya yang menunjukkan

bahwa itu adalah protein 53-kilodalton (kDa). Gen p53 disebut sebagai penjaga

genom (informasi genetik: DNA) dan berperan sebagai faktor transkripsi dengan

mentranskripsi gen targetnya untuk mengatur berbagai proses biologis seluler yaitu

penghentian siklus sel, apoptosis, dan penuaan (senescence) untuk mencegah

tumorigenesis (proses pembentukan tumor). Berbagai tekanan dapat memicu jalur

respon p53, termasuk hipoksia (tidak adanya oksigen), ekspresi onkogen yang tidak

tepat (misalnya, MYC atau RAS), kerusakan integritas DNA dan deplesi


26

26

ribonukleotida. Dengan mengelola respon kerusakan DNA, p53 memainkan peran

utama dalam menjaga integritas genom.3,11,17-19

Gambar 7. Jalur degradasi proteasome p5319

Dalam kondisi normal (sel sehat), protein p53 dipertahankan pada tingkat

rendah dalam sel melalui jalur degradasi proteasome (Gambar 7). MDM2 (Mouse

Double Minute 2 homolog) merupakan pengatur negatif paling kritis untuk p53. Gen

p53 memiliki waktu paruh pendek (20 menit) karena berhubungan dengan MDM2,

protein yang menargetkannya untuk degradasi. Saat sel ditekan, misalnya dengan

serangan pada DNA, p53 distabilkan melalui modifikasi pasca-transkripsi oleh

berbagai macam enzim termasuk kinase, fosfatase, acetyltransferases, deacetylases,

ubiquitin ligases, deubiquitinases, methylases, dan sumoylases yang melepaskannya

dari MDM2 dan meningkatkan waktu paruhnya. Selanjutnya, p53 menjadi aktif

sebagai faktor transkripsi dengan mengikat ke urutan DNA tertentu, yaitu elemen

responsif p53 (p53-resposive element) pada gen targetnya untuk mengatur ekspresi

gen tersebut. Elemen tersebut terdiri dari RRRCWWGYYY (spacer dari nukleotida 0-

21) RRRCWWGYYY, di mana R adalah purin, W adalah A (adenine) atau T (thymine),

dan Y adalah pirimidin. Melalui regulasi transkripsi gen targetnya, p53 mengatur

berbagai proses biologis seluler untuk mempertahankan integritas genom dan

mencegah pembentukan tumor, termasuk apoptosis, penghentian siklus sel, dan

penuaan (senescence).17-21


27

27

Gen p53 menginduksi penghentian siklus sel (Gambar 8). Dalam respon

terhadap sinyal stres, p53 mengaktifkan beberapa gen target mengakibatkan cellular

growth arrest (penghambatan pertumbuhan sel) pada checkpoint siklus sel untuk

mencegah akumulasi kerusakan DNA dan mutasi DNA. Gen p53 dapat menginduksi

penghentian G1 (G1 arrest) dengan menginduksi transkripsi p21 (cyclin-dependent

kinase inhibitor). Dalam siklus sel, p21 berikatan dengan siklin D dan merupakan

komponen penting dari kompleks aktif siklin D-CDK4/6. Saat kerusakan DNA, siklin

D yang ada didegradasi dan aktivasi transkripsional oleh p53 menyebabkan p21

meningkat. Produksi protein p21 dapat mengikat dan menghambat aktivitas siklin

E/CDK2 sehingga mencegah fosforilasi pRB dan dengan demikian, progresi siklus sel

berhenti untuk perbaikan DNA. Selain itu, p53 juga secara transkripsi mengaktifkan

GADD45 (Growth Arrest and DNA-Damage-inducible 45) dan 14-3-3σ (tyrosine 3-

monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, sigma polypeptide)

untuk menghentikan G2 (G2 arrest) dengan menghambat kompleks siklin B-CDC2.

Penghentian sementara G1 atau G2 yang disebabkan oleh stres, terutama sinyal stres

ringan memungkinkan sel untuk bertahan hidup sampai kerusakan diperbaiki atau

sampai sinyal stres dihilangkan. Gen p53 juga dapat menstimulasi jalur perbaikan

DNA dengan mekanisme transkripsi independen. Jika kerusakan DNA berhasil

diperbaiki, p53 mengatur ulang transkripsi MDM2, yang mengarah ke degradasi p53

dan pelepasan blok siklus sel. Jika kerusakan tidak dapat diperbaiki, sel dapat

menginduksi penuaan atau menjalani apoptosis.17-21

Gen p53 menginduksi apoptosis sel apabila terjadi kerusakan DNA ireversibel.

Hal ini merupakan mekanisme perlindungan utama terhadap transformasi neoplastik.

Gen p53 secara transkripsi menginduksi sekelompok gen target yang terlibat dalam

apoptosis, termasuk PUMA (p53 up-regulated modulator of apoptosis), Bax (BCL2-

associated X protein), Noxa (PMAIP1), PIG3 (tumor protein p53 inducible protein

3), Killer/DR5 (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10b), Fas

(reseptor kematian permukaan sel Fas), Perp (p53 apoptosis effector related to PMP-

22), dan p53AIP1 (tumor protein p53 regulated apoptosis inducing protein 1).

Apoptosis secara efektif diaktifkan sebagai respons kegagalan terhadap stres


28

28

genotoksik atau onkogenik. Selain bertindak sebagai pengatur transkripsi gen

proapoptotik (Bax, Bak), p53 juga bertindak sebagai represor transkripsi gen

antiapoptotik (Bcl-2, Bcl-xL). Jika sel normal (terpapar oleh faktor pertumbuhan dan

sinyal survival lainnya), Bcl-2 dan Bcl-xL akan menghambat apoptosis. Sementara

sel yang kekurangan faktor pertumbuhan, terpapar dengan agen yang menyebabkan

kerusakan DNA, atau mengakumulasi banyak protein yang salah terbentuk (stres

retikulum endoplasma) akan mengaktifkan Bax dan Bak serta mengurangi Bcl-2 dan

Bcl-xL. Peningkatan konsentrasi sitosolik dari kalsium menyebabkan kerusakan

atau hilangnya fungsi mitokondria. Jika konsentrasi sitosolik dari kalsium

meningkat, maka laju influks Ca2+

mitokondria meningkat. Permeabilitas

mitokondria akan meningkat menyebabkan terjadi kebocoran protein mitokondria

dan sitokrom c keluar ke sitoplasma sel. Sitokrom c bersama dengan beberapa

kofaktor mengaktivasi kaspase-9 sementara protein lainnya akan menghambat

aktivitas antagonis kaspase. Kaskade kaspase ini akan memberi sinyal ke nukleus

menyebabkan fragmentasi DNA seterusnya terjadi apoptosis (Gambar 9).17-21

Gambar 8. Aktivasi p53 menyebabkan penghentian siklus sel

21


29

29

Gambar 9. Jalur apoptosis p53

19

Gen p53 menginduksi penuaan (senescence). Banyak agen perusak DNA yang

digunakan dalam kemoterapi dapat mengaktifkan p53 dan memicu penuaan. Namun,

mekanisme p53 dalam menginduksi penuaan tidak sejelas mekanisme p53 dalam

apoptosis dan penghentian siklus sel tetapi tampaknya melibatkan perubahan

kromatin global yang secara drastis dan permanen mengubah ekspresi gen. Banyak

sinyal penuaan mengaktifkan p53 sehingga mengaktifkan p21 dan PAI-1

(plasminogen activator inhibitor-1) selanjutnya menginduksi penuaan.17-21

2.3 Gen p53 Mutan

Gen p53 mutan merupakan gen p53 yang telah berubah akibat terjadinya

mutasi sehingga menyebabkan fungsinya sebagai penekan tumor berkurang atau

hilang. Mutasi gen p53 merupakan perubahan yang paling sering ditemukan

dalam jumlah yang besar, yaitu sebanyak 50% dari seluruh insidensi kanker


30

30

yang terjadi pada manusia mempunyai abnormalitas p53.22

Mutasi germline pada

p53 merupakan penyebab sindrom Li-Fraumeni yang memungkinkan terjadinya

serangan awal tumor.23-25

Gen p53 mempunyai urutan spesifik atom yang terdiri dari domain

transaktivasi terminal NH2- (residu asam amino 1–45), domain pengikatan DNA

(residu asam amino 102-292), dan domain oligomerisasi terminal COOH- (residu

asam amino 319-359) seperti yang terlihat pada Gambar 10. Mutasi missense (kodon

untuk satu asam amino diganti dengan kodon untuk asam amino lain) sering terjadi

pada domain pengikatan DNA (DNA-binding domain) dan menyebabkan protein tidak

berfungsi. Protein ini mengandung 393 asam amino dan satu substitusi asam amino

menyebabkan hilangnya fungsi gen.22-24

Gambar 10. Rincian gen p53

22

Gen p53 mutan menunjukkan perilaku negatif dominan terhadap p53 wild-

type dengan menekan ekspresi dan fungsi p53 wild-type melalui efek negatif dominan

p53 mutan. Protein p53 mutan dapat heterodimerisasi (membentuk dimer dari dua

monomer yang berbeda) dengan protein p53 wild-type membentuk kompleks yang

dapat mengurangkan fungsi p53 wild-type melalui perubahan bentuk atau

menghambat aktivitas pengikatan DNA p53 wild-type pada gen target. Alel p53

mutan ini dapat menekan kontrol siklus sel dan fungsi apoptosis yang dimediasi oleh

alel p53 wild type.22,24,25


31

31

2.3.1 Peran p53 Mutan Terjadinya Kanker

Gen p53 mutan mendapatkan fungsi onkogenik baru yang disebut p53 mutan

gain-of-function (mutasi peningkat fungsi). Banyak penelitian telah menunjukkan

aktivitas gain-of-function yang berbeda dari p53 mutan, termasuk mempromosikan

proliferasi sel, anti-apoptosis, perubahan metabolik, migrasi, invasi, angiogenesis,

dan metastasis.23-25

Penelitian terbaru melaporkan p53 mutan mendapatkan aktivitas onkogenik

baru dalam sel tumor melalui beberapa mekanisme, yaitu interaksi dengan protein

dan faktor transkripsi sehingga menyebabkan perubahan ekspresi gen. Gen p53 mutan

dapat mengubah atau melemahkan ekspresi gen target serta menginduksi ekspresi gen

yang terkandung dalam tempat (site) yang berbeda dari genom.23,24

Protein p53 mutan berperan melalui interaksi protein-protein dengan faktor

transkripsi yang meningkatkan atau mengurangi transaktivasi gen target. Protein p53

mutan meningkatkan ekspresi proliferasi faktor transkripsi seperti c-Myc, Bcl-XL, dan

lain-lain yang mendorong pertumbuhan tumor. Gen p53 mutan mempromosikan

proliferasi sel, anti-apopotosis, peradangan, dan angiogenesis (pembentukan

pembuluh darah baru) melalui regulasi transkripsi gen-gen ini. 18,22-24

Selain itu, protein p53 mutan berinteraksi dengan p63 dan p73, yaitu dua

homolog struktural dan fungsional p53. p63 dan p73 mengikat dan mengaktifkan gen

target p53 dan bertindak sebagai perantara untuk penghentian siklus sel, apoptosis,

dan penuaan dalam respon terhadap stres. Interaksi p53 mutan dengan p63 dan p73

mengurangi aktivasi gen target menyebabkan chemoresistance (resistensi kemo),

peningkatan motilitas sel, migrasi, invasi, dan metastasis.18,22-24

Berdasarkan mekanisme gain-of-function p53 mutan diatas, p53 mutan ini

dapat mempromosikan proliferasi sel yang tidak terkontrol dan fungsi menginhibisi

kanker hilang. Seterusnya, terjadi ekspansi klonal dan mutasi tambahan sehingga

memicu transformasi sel normal menjadi sel kanker.3


32

32

Gambar 11. Peran p53 pada sel normal dan sel yang mengalami mutasi

3

2.4 Pewarnaan Imunohistokimia p53

Gen p53 diidentifikasi pada tahun 1979 oleh Arnold Levine, David Lane dan

William Old, masing-masing bekerja di Universitas Princeton, Universitas Dundee

(Inggris) dan Rumah Sakit Sloan-Kettering Memorial. Gen p53 telah dihipotesiskan

sebelumnya sebagai target virus SV40 yang menginduksi perkembangan tumor.

Meskipun pada awalnya dianggap sebagai onkogen, karakternya sebagai gen supresor

tumor terungkap pada tahun 1989. Perubahan produk gen ini berperan penting dalam

karsinogenesis multi-tahap.17,19,21,22

Tumor ganas Sel normal


33

33

Imunohistokimia merupakan metode yang biasa digunakan untuk menentukan

adanya antigen dalam suatu jaringan yang telah dilabel dengan antibodi. Dalam

identifikasi ekspresi protein p53 mutan, digunakan antibodi monoklonal yang secara

spesifik dapat mengenali p53 mutan yaitu antibodi monoklonal anti-p53 tikus.26,27

Sel yang mengekspresikan p53 mutan terlihat berwarna coklat pada inti sel

seperti yang terlihat pada Gambar 12, 13 dan 14.28

Evaluasi pewarnaan p53 berdasarkan skor imunoreaktif yang merupakan

metode semi-kuantitatif. Pewarnaan p53 mutan dilihat dari proporsi kelompok sel

yang terwarna (luas tampilan). Persentase didapatkan dari hasil penjumlahan sel

yang positif (menunjukkan warna coklat) pada seluruh lapangan pandang

sediaan tumor yang diperiksa dengan memakai mikroskop cahaya. Saat ini tidak

terdapat sistem scoring yang baku, namun berdasarkan referensi penelitian

Yadong Li (2018), sistem scoring yang digunakan adalah: Skor 0 bila tidak ada

sel yang terwarnai; Skor 1 bila sel positif berjumlah <30%; Skor 2 bila sel

positif antara 30-70%; dan skor 3 bila sel positif >70%.12

Beberapa referensi

mengamati intensitas pewarnaan: Skor 0 untuk negatif; Skor 1 untuk pewarnaan

lemah; Skor 2 untuk pewarnaan sedang; dan skor 3 untuk pewarnaan kuat.29-31

Hasil

pewarnaan imunohistokimia (perkalian luas tampilan dengan intensitas pewarnaan)

selanjutnya diinterpretasi sebagai berikut: Skor 0 menunjukkan tampilan negatif;

Skor 1 menunjukkan hasil kali 1-3 (tampilan lemah); Skor 2 menunjukkan hasil kali

4-6 (tampilan sedang); dan skor 3 menunjukkan hasil kali >7 (tampilan kuat).28

Pada

penelitian ini, peneliti hanya mengamati luas tampilan imunohistokimia p53.

Protein p53 normal memiliki waktu paruh yang sangat pendek selama 6-20

menit sehingga sulit untuk dideteksi pada jaringan normal, namun protein p53 yang

telah berubah (mutasi), yaitu p53 mutan memiliki waktu paruh yang lebih panjang

sekitar 6 jam karena peningkatan stabilitas seluler sehingga dapat dideteksi pada

jaringan premalignan dan malignan melalui imunohistokimia. Oleh karena itu,

protein p53 mutan diekspresikan dalam sel yang aktif berproliferasi (sel ganas).27,29,32


34

34

Gambar 12. Tampilan p53 dengan skor 1 (lemah) pada KSS

rongga mulut33

Gambar 13. Tampilan p53 dengan skor 2 (sedang) pada KSS

rongga mulut33


35

35

Gambar 14. Tampilan p53 dengan skor 3 (kuat) pada KSS

rongga mulut33

Laporan yang dilakukan oleh Abrahao dkk. (2011) menemui bahwa lebih dari

50% sampel KSS rongga mulut menunjukkan p53 positif sesuai dengan hasil peneliti-

peneliti sebelumnya. Pendeteksian ekspresi p53 dalam persentase besar pada kasus

KSS rongga mulut menunjukkan perubahan status protein ini.30,33

Martinez dkk.

(2013) melaporkan bahwa ekspresi p53 terbatas hanya pada lapisan sel basal mukosa

mulut normal. Mukosa mulut tanpa potensi ganas yang mengekspresikan p53

ditafsirkan sebagai respon fisiologis sel terhadap stres genotoksik. Pada kasus

displastik, p53 diekspresikan pada lapisan basal dan suprabasal. Ekspresi p53 dalam

sel suprabasal hanya terdeteksi pada lesi premalignan yang menunjukkan adanya sel

yang berproliferasi dengan kerusakan DNA pada lapisan superfisial epitel. Ekspresi

p53 pada lesi oral premalignan mungkin merupakan episode awal dalam

karsinogenesis oral.34

Warnakulasuriya dan Johnson (1992) melaporkan bahwa p53

positif pada karsinoma tanpa invasi yang mendalam menunjukkan p53 mutan dapat

terjadi pada tahap awal perkembangan keganasan.27

Dengan demikian, ekspresi p53 diamati berhubungan dengan transformasi

mukosa mulut yang ganas. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa protein p53

terlibat dalam karsinogenesis oral dan perubahannya terjadi pada awal perkembangan


36

36

transformasi neoplastik mendahului perubahan histologis.

Semua kasus yang

menunjukkan ekspresi p53 yang lebih tinggi harus dikelola secara agresif dengan

sarana terapeutik tambahan baik bedah maupun non-bedah. Hal ini sangat bermanfaat

saat menggunakan p53 untuk biopsi dan operasi radikal dapat direncanakan dengan

lebih baik. Operasi radikal dapat dihindari pada kasus ekspresi p53 negatif atau kasus

p53 dengan ekspresi rendah dimana eksisi dan wait and watch (tunggu dan observasi)

dapat diterapkan. Korelasi yang signifikan antara perkembangan epitelium oral dari

normal ke neoplasia dan peningkatan ekspresi p53 dilaporkan pada semua tumor yang

diteliti sampai hari ini menunjukkan bahwa p53 dapat menjadi biomarker yang

berguna dalam transformasi maligna.27,33,34

2.5 Landasan Teori

Setiap sel di dalam proses pembentukan sel baru terdiri dari komponen

sitoplasma meliputi cairan seperti gel yang disebut sitosol dan organel-organel sel

serta komponen nukleus yang menyebabkan pembelahan sel meliputi nukleolus,

RNA (ribonucleic acid), DNA (deoxyribonucleic acid), dan kromosom. Pembelahan

sel ini mengikuti aturan daripada siklus sel.3,7-9,11,15

Siklus kehidupan sel terdiri atas fase G0 (sel istirahat), G1, S, G2 dan

Mitosis. Fase M yaitu fase mitosis yang berlangsung selama satu jam terdiri dari dua

proses besar yaitu pembelahan nukleus atau mitosis yang terdiri dari tahap profase,

metafase, anafase dan telofase serta pembelahan sitoplasma atau sitokenesis. Dalam

proses siklus sel, dijumpai dua checkpoints. Checkpoints dikontrol oleh siklin, cyclin

dependent kinases (CDKs) dan inhibitornya, retinoblastoma (RB), dan p53. Transisi

dari satu fase ke fase berikutnya diperiksa pada checkpoints sebelum progresi

siklus sel. Pada kondisi dimana DNA inti sel rusak, terjadi penghentian pada

siklus sel untuk perbaikan kerusakan DNA. Penghentian fase G1/S untuk

mencegah replikasi DNA sel yang rusak dan penghentian pada fase G2/M untuk

menghambat segregasi kromosom-kromosom yang rusak. Peran p53 dalam

penghentian siklus sel, di mana p53 akan memicu proses transkripsi dari p21,

GADD45 (Growth Arrest and DNA-Damage-inducible 45) dan 14-3-3σ (tyrosine 3-


37

37

monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, sigma polypeptide).

Sel mengalami apoptosis (kematian) apabila kerusakan DNA tersebut gagal

diperbaiki. Gen p53 menginduksi apoptosis sel dengan bertindak sebagai pengatur

transkripsi gen proapoptotik (Bax, Bak) dan transkripsi gen antiapoptotik (Bcl-2, Bcl-

xL). Proses di atas menyebabkan proliferasi sel berjalan dengan baik.3,10,17-20

Apoptosis tidak terjadi disebabkan gangguan p53 dimana p53 sudah

menjadi p53 mutan. Perubahan p53 menjadi p53 mutan terjadi apabila ada

kerusakan DNA disebabkan oleh faktor fisik dan faktor kimia. Banyak protein p53

mutan yang berhubungan dengan tumor tidak hanya kehilangan fungsi penekanan

tumornya, tetapi juga mendapatkan fungsi onkogenik baru yang disebut p53 mutan

gain-of-function (mutasi peningkat fungsi). Bila terjadi mutasi dari gen p53, maka

p53 mutan yang dihasilkan inaktif, sehingga protein ini tidak mampu memicu

pembentukan p21. Rendahnya kadar p21 mengakibatkan CDK tidak terhambat

dan akhirnya siklus pembelahan sel berjalan terus. Pada kondisi kerusakan p53,

gen ini tidak mampu memicu aktivitas BAX dan sel tidak dapat mengalami

apoptosis sehingga mengalami mutasi DNA dan terus berproliferasi

menyebabkan terjadinya sel kanker.20-25

Tampilan p53 mutan dapat dilihat melalui pemeriksaan imunohistokimia sel

dengan menggunakan antibodi monoklonal anti-p53 tikus yaitu suatu antibodi

monoklonal yang secara spesifik dapat mengenali p53 mutan dalam sel. Tampilan

p53 mutan dikatakan positif apabila menampilkan warna coklat pada inti sel.

Akumulasi p53 mutan menunjukkan kejadian awal karsinogenesis rongga mulut dan

dapat dijadikan sebagai penanda dalam bidang kanker.27,33,34

Hasil dari penelitian

tingkat diferensiasi sel KSS rongga mulut dihubungkan dengan tampilan

imunohistokimia p53 (sel-sel positif yang menandakan p53 mutan) berdasarkan

lokasi lesi, jenis kelamin dan umur.


38

38

2.6 Kerangka Teori

Mutasi gen

DNA gagal

G1

terhenti G2

terhenti

aktif

Kerusakan DNA

Sel normal

Siklus sel

Biopsi

Pewarnaan Imunohistokimia p53 Pewarnaan Hematoksilin Eosin

Diagnosa histopatologi KSS:

Berdiferensiasi baik

Berdiferensiasi sedang

Berdiferensiasi buruk

Hasil pewarnaan p53 mutan yang

berwarna coklat pada inti sel

tumor dengan menggunakan

antibodi monoklonal anti-p53

tikus.

Checkpoint G1/S

dan G2/M

Fase G1, S,

G2, Mitosis

p53

p21 GADD45

14-3-3σ

BAX

Apoptosis

Perbaikan

DNA berhasil

p53 mutan

Kehilangan

kontrol

siklus sel

Penonaktifan

gen supresor

tumor

Perubahan gen

pengendali

regulasi

apoptosis

Disregulasi

proliferasi sel

Apoptosis ( ) / (-)

Ekspansi klonal dan mutasi

tambahan (progresi)

Karsinoma sel skuamosa


39

39

2.7 Kerangka Konsep

Blok Parafin KSS

Processing Laboratorium

Slide 2 Slide 1

Pewarnaan Imunohistokimia p53 Pewarnaan Hematoksilan

Eosin

Diagnosa histopatologi:

Berdiferensiasi baik

Berdiferensiasi sedang

Berdiferensiasi buruk

Data Klinis:

Lokasi lesi

Jenis kelamin

Umur

Jumlah sel positif p53 mutan:

Negatif (-) = tidak terlihat warna coklat

Positif lemah (+) = <30% sel positif

Positif sedang (++) = 30-70% sel positif

Positif kuat (+++) = >70% sel positif

p53 (-) p53 (+)


40

40

BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian ini menggunakan rancangan deskriptif analitik yang

bertujuan untuk melihat tampilan imunohistokimia p53 dengan pendekatan cross-

sectional, dimana setiap sampel hanya diperiksa satu kali dan pada satu saat.

3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

3.2.1 Lokasi Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran USU/RSUP Haji Adam Malik Medan.

3.2.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini dimulai dari bulan Februari 2018 sampai Desember 2018

yang mencakup penelusuran kepustakaan, pembacaan proposal, pengumpulan data

serta penulisan dan pembacaan hasil.

3.3 Populasi, Sampel dan Besar Sampel

3.3.1 Populasi

Populasi penelitian mencakup sediaan blok parafin yang berasal dari

jaringan biopsi rongga mulut yang didiagnosa sebagai KSS rongga mulut secara

histopatologi dengan pewarnaan Hematoksilin Eosin di Laboratarium Patologi

Anatomi FK USU/RSUP Haji Adam Malik Medan.

3.3.2 Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah sedian blok parafin yang berasal dari

biopsi jaringan rongga mulut yang didiagnosa sebagai KSS rongga mulut


41

41

memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi yang sesuai dengan hitungan besar sampel

penelitian.

3.3.3 Besar sampel

Penentuan jumlah sampel menggunakan rumus Penaksiran Proporsi

Populasi dengan ketelitian absolut (Absolute Precision) dengan teknik sampling.

Purposive sampling yaitu pemilihan sampel dengan menentukan pengambilan

sampel dengan memenuhi kriteria khusus penelitian dimasukkan dalam penelitian

dalam kurun waktu tertentu, sehingga jumlah sampel minimum yang diinginkan

dapat terpenuhi.

n = Zα2.P.Q

d2

Keterangan :

n : Jumlah sampel

Zα : tingkat kepercayaan (5% Z score = 1.96)

P : proporsi (seluruh lesi), bila tidak dianggap 50% atau 0,5

d : selisih proporsi (ketepatan) = 30%

Hasil perhitungan

n = (1.96)2. 0,5 0,5

(0,3)2

n = 10,67

Jadi jumlah sampel minimal adalah 11 sampel KSS rongga mulut. Jumlah

sampel pada penelitian ini adalah sebesar 12 sampel.


42

42

3.4 Kriteria Sampel

3.4.1 Kriteria Inklusi

1. Blok parafin yang didiagnosa sebagai KSS rongga mulut dengan

pewarnaan Hematoksilin Eosin dari tahun 2014-2018.

2. Informasi data klinis yang mencakup diagnosa histopatologi, umur

pasien, jenis kelamin dan lokasi lesi.

3. Sediaan merupakan tumor primer.

3.4.2 Kriteria Eksklusi

1. Kasus dengan diagnosa histopatologi KSS rongga mulut yang tidak

terdapat jaringan sel tumor apabila dipotong kembali.

2. Blok parafin KSS rongga mulut yang telah rusak (terdapat jamuran,

pecah, tidak utuh).

3.5 Kerangka Operasional

Blok parafin (2014-2018) dari biopsi lesi di rongga mulut di Lab Patologi

Anatomi FK USU/RSUP Haji Adam Malik Medan yang didiagnosa secara

histopatologi dengan pewarnaan HE sebagai KSS rongga mulut.

Data klinis

Lokasi lesi

Jenis kelamin

Umur

Pemotongan blok parafin

Pewarnaan

Hematoksilin Eosin

Pewarnaan

Imunohistokimia p53

Tingkat histopatologi

Diferensiasi baik

Diferensiasi sedang

Diferensiasi buruk

Jumlah sel positif p53 mutan

Negatif (-) = tidak terlihat warna coklat

Positif lemah (+) = <30% sel positif

Positif sedang (++) = 30-70% sel positif

Positif kuat (+++) = >70% sel positif


43

43

3.6 Variabel Penelitian

3.6.1 Variabel Bebas

Karsinoma sel skuamosa rongga mulut (blok parafin).

3.6.2 Variabel Terikat

1. Diagnosa tingkat diferensiasi karsinoma sel skuamosa (pewarnaan HE).

2. Diagnosa hasil pewarnaan p53.

3.6.3 Variabel Terkendali

1. Blok parafin KSS rongga mulut dari tahun 2014-2018.

2. Processing laboratorium pewarnaan Hematoksilin Eosin.

3. Processing laboratorium pewarnaan p53.

4. Data-data rekam medis pasien dari tahun 2014-2018.

5. Keterampilan operator (dua ahli patologi, peneliti dan laboran).

Variabel Bebas

Karsinoma sel skuamosa

rongga mulut (blok parafin).

Variabel Terikat

Diagnosa tingkat diferensiasi karsinoma

sel skuamosa (pewarnaan HE).

Diagnosa hasil pewarnaan p53.

Variabel Terkendali

1. Blok parafin KSS rongga mulut dari tahun 2014-2018.

2. Processing laboratorium pewarnaan Hematoksilin Eosin.

3. Processing laboratorium pewarnaan p53.

4. Data-data rekam medis pasien daritahun 2014-2018.

5. Keterampilan operator (dua ahli patologi, peneliti, dan laboran).


44

44

3.7 Definisi Operasional

Blok Parafin adalah jaringan-jaringan biopsi atau operasi lesi keganasan

rongga mulut dari tahun 2014-2018 yang dikirim ke bagian patologi.

Karsinoma sel skuamosa (KSS) merupakan neoplasma ganas yang berasal

dari sel epitel skuamosa berlapis. Secara histopatologi, berdasarkan tingkat

diferensiasi sel KSS dapat dibagi menjadi:

1. KSS berdiferensiasi baik adalah adanya sel keratinisasi, pertumbuhan

sejumlah sel epitel atau keratin dengan besar dan variasi. Terdapat Gambaran

keratin seperti mutiara (pearl horn formation). Interselular bridge masih terlihat.

Pertumbuhan lambat dan tidak mengalami metastasis yang cepat, sehingga memiliki

prognosa yang baik.

2. KSS berdiferensiasi sedang di mana epitelium skuamosa kurang jelas.

Bentuk karakteristik dari sel ini berubah dari satu dan yang lainnya, tersusun secara

tipikal. Laju pertumbuhan sel individu lebih cepat dan menunjukkan mitosis yang

lebih besar. Lebih bervariasi dalam ukuran bentuk dan kegagalan untuk melakukan

fungsi sel skuamosa yang berdiferensiasi terbentuknya keratin.

3. KSS berdiferensiasi buruk yaitu menghasilkan sedikit petunjuk sel-

sel asal karena Gambaran histologis malignan yang primitif tidak memiliki

karakteristik yang cepat membagi sel-sel. Sel-sel ini bahkan menunjukkan

kurangnya daya kohesif yang sangat tidak teratur, adanya anaplasia, pembentukan

giant tumor cell serta tidak ada pembentukan keratin.

Pewarnaan Hematoksilin Eosin prosedur ini digunakan dalam proses

pembuatan preparasi histopatologi pada sel tumor KSS rongga mulut yang terlihat

berwarna ungu kebiruan pada inti sel dan berwarna merah jambu pada sitoplasma.

Dari pemeriksaan histologis, pada sel ganas (KSS) akan menunjukkan sel-sel

anaplasia, karakteristik pleomorfik, kehilangan polaritas dan mitosis besar.

Imunohistokimia merupakan proses untuk mendekteksi antigen pada sel

jaringan dengan prinsip reaksi antibodi yang berikatan terhadap antigen pada

jaringan. Imunohistokimia menggunakan antibodi untuk mendeteksi keberadaan

dan lokalisasi protein spesifik.


45

45

Pewarnaan imunohistokimia p53 adalah suatu pewarnaan dengan

menggunakan antibodi monoklonal p53 dari Leica Biosystem (NCL-L-p53-DO7).

Tampilan imunohistokimia p53 adalah tampilan warna kecoklatan pada

inti sel epitel KSS rongga mulut dari pemeriksaan patologi dengan teknik

pewarnaan Immunohistochemical Staining (IHC). Banyak kriteria yang telah

ditetapkan oleh peneliti-peneliti terhadap tampilan p53 mutan. Cara pemeriksaan

p53 mutan diadop dari penelitian Yadong Li (2015) dan Jinsong Zhang (2015) yang

membagi empat kategori berdasarkan jumlah sel positif p53 mutan antaranya:

- Negatif : tidak terlihat warna coklat

- Positif lemah (+) : <30% sel positif p53 mutan

- Positif sedang (++) : 30-70% sel positif p53 mutan

- Positif kuat (+++) : >70% sel positif p53 mutan

Berdasarkan kategori di atas, peneliti dapat menghubungkan jumlah sel positif

p53 mutan dengan prognosa.

Lokasi lesi pada rongga mulut yaitu lidah, mukosa bukal dan gingiva yang

paling sering terjadi keganasan.

Jenis kelamin adalah kelompok orang yang dibagikan kepada dua yaitu

laki-laki dan perempuan.

Usia adalah umur yang dihitung dari terakhir kali ulang tahun dan

dikelompokkan kepada dua kategori: 40-59 tahun dan 60-79 tahun.

3.8 Alat dan Bahan Penelitian

3.8.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperti berikut: mikrotom

Leica RM2245, kaca obyek merek Sail Brand, kaca obyek merek Sandon Superfrost

plus, pipet mikro, staining jar, inkubator dan aluminium chamber, rotator dan

mikroskop cahaya binokuler Olympus CX21.


46

46

3.8.2 Bahan untuk Pengecatan Rutin Hematoksilin dan Eosin

1. Parafin Blok KSS rongga mulut.

2. Larutan Hematoksilin Harris

3. Alkohol 100%, 96% dan 70%

4. Xilol

5. HCl 0,4%

6. Litium karbonat 5%

7. EZ-Mount

3.8.3 Bahan Pengecatan Imunohistokimia p53

1. Larutan standar yang digunakan dalam Imunohistokimia

2. 0.5% v/v hydrogen peroxidase

3. 50mM Tris-buffered saline (TBS) pH 7.6

4. Antibodi Biotinylated sekunder.

5. Avidin/ Biotin Complex-Horseradish (ABC-HRP)

6. 3.3’ Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)

7. Hemotoksilin counterstain

8. Antibodi monoklonal p53 dari (Leica Biosystems), dilusi 1:100 dengan

clone DO7, kontrol positif kolorektal/ karsinoma payudara.

9. Larutan antigen retrievel: 0.01 M citrate retrieval solutions (pH 6.0)

1mM EDTA retrieval solution (pH 8.0) dan 20mM Tris/ 0.65 mM EDTA/0.0005%

Tween 20 retrieval solution (pH 9.0).

3.9 Metode Pengumpulan Data/ Pelaksanaan Penelitian

3.9.1 Pembuatan Preparat Blok Parafin

Blok parafin yang telah dikumpulkan, disimpan cukup dingin, selanjutnya

dipotong tipis dengan menggunakan mikrotom dengan tebal 1µm. Setiap blok

parafin, dipotong sebanyak 2 kali, masing-masing untuk pewarnaan HE dan

perwarnaan imunohistokimia p53.


47

47

a) Pewarnaan HE

1. Potongan tipis parafin dimasukkan ke dalam waterbath.

2. Potongan tipis parafin diambil dengan menggunakan spuit dan dilekatkan

pada kaca objek merek Sail Brand.

b) Pewarnaan Imunohistokimia p53

1. Potongan tipis parafin dimasukkan ke dalam waterbath.

2. Potongan tipis parafin diambil dengan menggunakan spuit dan dilekatkan

pada kaca objek Shandon Superfrost Plus.

3.9.2 Prosedur Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin (HE)

1. Siapkan blok yang akan dicat dengan pewarnaan HE. Potong blok sesuai

dengan permintaan yang diinginkan serta kontrol positif (+).

2. Titiskan slide sebentar kemudian ditekan menggunakan kertas saring

pelan-pelan. Panaskan sebentar di atas hot plate dan disimpan dalam inkubator suhu

45 derajat Celcius selama semalam.

3. Deparafinisasi dengan urutan xilol (4 kali), alkohol 95% (4 kali) dan air,

masing-masing selama 2 menit.

4. Dicelupkan dalam hematoksilin selama 5 menit lalu dibilas dengan air

yang mengalir selama 3 menit.

5. Kaca obyek tersebut dicelupkan ke dalam acid alkohol 1% 1-2 celup lalu

dibilas kembali dengan air yang mengalir selama 3 menit.

6. Lakukan pewarnaan dengan eosin untuk mewarnai sitoplasma selama 2-3

menit lalu dibilas kembali dengan air mengalir selama 3 menit.

7. Kemudian kaca obyek dicelupkan ke dalam alkohol 80% selama 30

menit, alkohol 95% selama 3 menit dan alkohol absolut selama 3 menit.

8. Kaca obyek dicelupkan ke dalam xilol selama 3 menit sebanyak 3 kali

pengulangan.


48

48

9. Mounting menggunakan entelan dan preparat ditutup dengan kaca

penutup. Lakukan pengamatan pada sel menggunakan mikroskop cahaya dengan

pembesaran 40x, 100x dan 400x.

3.9.3 Prosedur Pewarnaan Imunohistokimia dengan Antibodi

Monoklonal p53 dari Leica Biosystem (NCL-L-p53-DO7)

1. Mengumpulkan blok parafin dari sediaan HE terpilih dan melakukan

pewarnaan imunohistokimia p53.

2. Siapkan blok yang akan dilakukan pewarnaan imunohistokimia.

3. Potong blok sesuai dengan permintaan yang diinginkan serta kontrol positif

(+).

4. Titiskan slide sebentar kemudian ditekan menggunakan kertas saring

pelan-pelan. Panaskan sebentar di atas hot plate dan disimpan dalam inkubator suhu

45 derajat Celcius.

5. Deparafinisasi dengan urutan xilol (4 kali), alkohol 95% (4 kali) dan air,

masing-masing selama 2 menit.

6. Cuci dengan aquadest, rotator selama 5 menit.

7. Dilanjutkan dengan penetesan H2 O2 3% selama 20 menit dalam

Chamber.

8. Slide digunakan pada wadah lalu dilanjutkan dengan cuci aquadest

sambil digoyang-goyang selama 5 menit dan dilanjutkan dengan pencucian memakai

PBS selama 5 menit pada rotator.

9. Dilanjutkan dengan penetesan antibodi p53 100µ antibodi primer

menggunakan antibodi monoklonal p53 dari Leica Biosystem (NCL-L-p53-DO7)

yang telah diencerkan (pengenceran 1:100) selama 60 menit pada suhu kamar atau

semalam pada suhu 40 C.

10. Slide dicuci dengan PBS sebanyak 5 menit pada rotator sebanyak dua

kali.

11. Ditetesi kromogen DAB selama 10 menit.


49

49

12. Ditetesi dengan Hematoksilin Mayer selama 4 menit saja. Dicuci dengan

air mengalir sampai bersih.

13. Dicelupkan sebentar pada alkohol bertingkat dilanjutkan dengan xilol

analitik sebanyak 4 tahapan.

14. Mounting menggunakan entelan dan slide ditutup dengan deck-glass.

15. Amati tampilan imunohistokimia p53 pada sel menggunakan mikroskop

cahaya dengan pembesaran 40x, 100x dan 400x.

16. Dokumentasi setiap pengamatan dan lakukan pemotretan tiap preparat.

3.10 Pengolahan dan Analisa Data

Teknik analisa data dilakukan tabel cross-sectional, pelaporan data penelitian

adalah dengan memaparkan hasil pulasan imunohistokimia p53 dalam bentuk

persentase dan tabel.

3.11 Etika Penelitian

Penelitian ini dilakukan setelah mendapat persetujuan dari Komisi Etik

Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran USU (NO:522/TGL/KEPK FK USU-

RSUP HAM/2018). Adapun pengurusan Komisi Etik dari tanggal 7 Agustus 2018

sampai 7 September 2018 tanpa melalui sidang.


50

50

BAB 4

HASIL PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan terhadap kasus KSS rongga mulut, yang

bertujuan untuk melihat tingkat skor p53 mutan pada tampilan imunohistokimia

yang dihubungkan dengan tingkat diferensiasi sel, lokasi lesi, jenis kelamin dan

umur pada kasus KSS rongga mulut di Medan. Sampel diperoleh dari rekam

medis berupa blok parafin di Laboratarium Patologi Anatomi RSUP Haji Adam

Malik Medan yang didiagnosa sebagai KSS rongga mulut selama kurun waktu

2014-2018, sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi, didapati sebanyak 12

kasus. Processing laboratorium terhadap dua sediaan slide untuk perwarnaan HE

dan pewarnaan imunohistokimia p53 masing-masing sampel. Sediaan slide

dengan pewarnaan HE bertujuan untuk menentukan tingkat diferensiasi KSS

rongga mulut, sedangkan sediaan slide dengan pewarnaan imunohistokimia p53

bertujuan untuk melihat jumlah p53 mutan yang terekspresi. Pengamatan

dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus CX21 menggunakan pembesaran

40x, 100x dan 400x. Berdasarkan pewarnaan HE tingkat diferensiasi KSS dibagi

atas diferensiasi baik (I), diferensiasi sedang (II) dan diferensiasi buruk (III),

dan berdasarkan pewarnaan imunohistokimia p53 dibagi atas kategori jumlah sel

positif p53 mutan tidak terlihat warna coklat (-), terlihat <30% warna coklat

pada inti sel (+), terlihat 30-70% warna coklat pada inti sel (++) dan terlihat

>70% warna coklat pada inti sel (+++).

4.1 Distribusi Frekuensi Diagnosa Histopatologi pada KSS Rongga Mulut

(Hematoksilin Eosin)

Berdasarkan pewarnaan HE pada diagnosa histopatologi KSS rongga mulut ,

diperoleh frekuensi dan persentase tingkat diferensiasi sel yang dapat dilihat pada

Tabel 1.


51

51

Tabel 1. Distribusi Frekuensi Diagnosa Histopatologi pada KSS Rongga Mulut

(Hematoksilin Eosin)

Diagnosa

Histopatologi HE Kategori Frekuensi (n) Persentase (%)

Berdiferensiasi Baik I 6 50,0

Berdiferensiasi Sedang II 3 25,0

Berdiferensiasi Buruk III 3 25,0

Total

12 100,0

Hasil pewarnaan histopatologi KSS rongga mulut pada penelitian ini yang

berdiferensiasi sedang dan buruk mempunyai jumlah frekuensi yang sama yaitu

masing-masing sebanyak 3 kasus (25%) lebih sedikit dibandingkan dengan KSS

berdiferensiasi baik yaitu 6 kasus (50%).

4.2 Distribusi Frekuensi Tampilan Imunohistokimia p53 pada KSS

Rongga Mulut

Berdasarkan tampilan imnohistokimia p53, distribusi frekuensi tampilan

imunohistokimia p53 pada KSS rongga mulut dapat dilihat pada Tabel 2 dan Tabel 3.

Tabel 2. Distribusi Frekuensi Tampilan Imunohistokimia p53 pada KSS Rongga Mulut

Tampilan

Imunohistokimia p53 Frekuensi (n) Persentase (%)

Negatif 2 16,7

Positif 10 83,3

Total 12 100

Hasil tampilan imunohistokimia p53 dari 12 preparat pada penelitian ini yang

tidak menunjukkan p53 mutan (tampilan negatif) yaitu sebanyak 2 preparat (16,7%),

sementara kasus yang menunjukkan p53 mutan (tampilan positif) yaitu sebanyak 10

preparat (83,3%).


52

52

Tabel 3. Distribusi Frekuensi Tampilan Imunohistokimia p53 (Sel-sel Positif) pada

KSS Rongga Mulut

Tampilan Imunohistokimia

p53 (sel-sel positif) Kategori Frekuensi (n) Persentase (%)

<30% + 3 30

30-70% ++ 4 40

>70% +++ 3 30

Total 10 100

Berdasarkan 10 preparat yang menunjukkan tampilan imunohistokimia p53

positif, preparat yang menunjukkan tingkat skor tampilan imunohistokimia p53

(++) yang menampilkan 30-70% sel-sel positif mendapatkan jumlah frekuensi

yang tertinggi yaitu sebanyak 4 preparat (40%), sedangkan tingkat skor tampilan

imunohistokimia p53 (+) yang menampilkan <30% sel-sel positif dan tingkat skor

tampilan imunohistokimia p53 (+++) yang menampilkan >70% sel-sel positif

masing-masing sebanyak 3 preparat (30%).

4.3 Hubungan Skor Tampilan Imunohistokimia p53 pada KSS Rongga

Mulut dengan Tingkat Diferensiasi Sel

Berdasarkan tampilan imnohistokimia p53, distribusi frekuensi tampilan

imunohistokimia p53 dihubungkan dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga

mulut dapat dilihat pada Tabel 4.


53

53

Tabel 4. Distribusi Frekuensi Tampilan Imunohistokimia p53 (Sel-sel Positif) pada

KSS Rongga Mulut Dihubungkan dengan Tingkat Diferensiasi Sel

Tingkat

Diferensiasi Sel

Tampilan Imunohistokimia p53

<30% 30-70% >70% Total Nilai p*

(+) (++) (+++)

n (%) n (%) n (%) N (%)

Baik 1 10,0 2 20,0 2 20,0 5 50,0

0,539 Sedang 1 10,0 2 20,0 0 0 3 30,0

Buruk 1 10,0 0 0 1 10,0 2 20,0

Total 3 30,0 4 40,0 3 30,0 10 100.0

*Uji chi-square, tidak signifikan dengan p>0,05

Dari 10 sampel yang menunjukkan hasil pewarnaan imunohistokimia p53

positif pada penelitian ini, skor tampilan imunohistokimia p53 (+) dijumpai pada

KSS yang berdiferensiasi baik, KSS yang berdiferensiasi sedang, dan KSS yang

berdiferensiasi buruk yaitu masing-masing 1 kasus (10%). Skor tampilan

imunohistokimia p53 (++) dijumpai pada KSS yang berdiferensiasi baik dan KSS

yang berdiferensiasi sedang yaitu masing-masing sebanyak 2 kasus (20%). Skor

tampilan imunohistokimia p53 (+++) dijumpai terbanyak pada KSS yang

berdiferensiasi baik sebanyak 2 kasus (20%) dibanding KSS yang berdiferensiasi

buruk (10%) dan tidak dijumpai pada KSS yang berdiferensiasi sedang.

Berdasarkan uji Chi-Square diperoleh nilai p=0,539 (p>0,05) artinya tidak ada

hubungan yang signifikan antara tampilan imunohistokimia p53 dengan tingkat

diferensiasi sel.


1

BAB 5

PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan pada 12 blok parafin yang telah didiagnosa sebagai

KSS rongga mulut diperoleh dari Laboratarium Patologi Anatomi RSUP Haji Adam

Malik Medan selama kurun waktu 2014-2018. Penelitian ini bertujuan untuk

melihat hubungan antara tampilan imunohistokimia p53 mutan pada KSS rongga

mulut dengan tingkat diferensiasi sel, lokasi lesi, jenis kelamin dan kelompok umur.

Blok parafin yang diterima dilakukan processing laboratorium dan diinterpretasikan

kembali sebagai kasus KSS rongga mulut dengan tingkat diferensiasi sel baik,

sedang dan buruk. Processing laboratorium diperoleh dua sediaan slide untuk

perwarnaan HE dan pewarnaan imunohistokimia p53. Sediaan slide dengan

pewarnaan HE bertujuan untuk menentukan tingkat diferensiasi KSS rongga

mulut, sedangkan sediaan slide dengan pewarnaan imunohistokimia p53

bertujuan untuk melihat jumlah p53 mutan yang terekspresi pada gen kromosom

dalam inti sel (17p13.1) berupa warna coklat dengan menggunakan mikroskop

cahaya Olympus CX21.

5.1 Tingkat Diferensiasi KSS Rongga Mulut

Umumnya, secara standar digunakan pewarnaan HE untuk menentukan

tingkat diferensiasi sel. Berdasarkan perwarnaan HE (Tabel 1), diperoleh kasus KSS

rongga mulut berdiferensiasi baik tertinggi sebesar 50% dibandingkan dengan kasus

yang didiagnosa sebagai diferensiasi sedang maupun diferensiasi buruk (masing-

masing menunjukkan sebesar 25%). Hal ini menunjukkan bahwa pasien yang

datang lebih banyak dalam tingkat stadium awal (berdiferensiasi baik) dibandingkan

tingkat stadium sedang dan lanjut (berdiferensiasi sedang dan buruk). Gambaran

KSS yang berdiferensiasi baik menunjukkan keratin seperti tanduk mutiara (pearl

horn formation) dengan ukuran yang bervariasi, pertumbuhan yang lambat, tidak

cepat bermetastasis dan mempunyai prognosa yang baik (Lampiran 5 Gambar 6).


2

Gambaran KSS untuk yang berdiferensiasi sedang, berbeda dari satu dengan yang

lainnya, dimana tersusun secara tipikal, sehingga epitel skuamosa juga kurang jelas.

Laju pertumbuhan sel individu lebih cepat dengan pembelahan mitosis yang lebih

meningkat dan bahkan ukuran bentuknya yang lebih bervariasi (Lampiran 5 Gambar

7). Gambaran KSS yang berdiferensiasi buruk, sering sekali menghasilkan petunjuk

sel-sel yang tidak jelas sehingga menimbulkan kesulitan dalam mendiagnosis. Sel-

sel ini menunjukkan kurangnya daya kohesif yang sangat tidak teratur,

pembentukan sel tumor raksasa, adanya anaplasia, peningkatan mitosis, serta tidak

adanya pembentukan keratin yang menunjukkan prognosa lebih jelek (Lampiran 5

Gambar 8).35

Penelitian yang dilakukan oleh Xu dkk. (2018) mendapatkan hasil

bahwa pasien KSS rongga mulut tingkat diferensiasi baik menunjukkan angka

kekambuhan yang lebih rendah dan angka harapan hidup yang lebih tinggi

dibandingkan KSS tingkat diferensiasi sedang atau tingkat diferensiasi buruk.36

Oleh karena itu, tenaga medis khususnya dokter/ dokter gigi perlu mengadakan

penyuluhan agar meningkatkan kesadaran masyarakat untuk memeriksakan diri

sedini mungkin.

5.2 Pewarnaan Imunohistokimia Berupa Tampilan p53 Mutan pada

Kasus KSS Rongga Mulut

Terdapat beberapa penyebab kanker rongga mulut berupa faktor intrinsik

dan ekstrinsik. Faktor intrinsik termasuk hormonal, imunologik, malnutrisi dan

genetik dan faktor ekstrinsik termasuk menyirih, tembakau, alkohol, infeksi virus,

dan trauma kronis.2

Faktor-faktor karsinogenik ini mengganggu proses biologis dan

metabolisme sel sehingga menyebabkan gangguan dalam siklus sel. Siklus sel

merupakan proses pertumbuhan sel berupa serangkaian proses yang berlangsung

sejak sel itu terbentuk, membelah, hingga apoptosis. Siklus sel terdiri dari fase G1

(duplikasi sentrosom), S (sintesis DNA), G2 (diferensiasi sel) dan M (mitosis). Gen-

gen yang terdapat dalam siklus sel adalah gen-gen seperti p53, Rb dan lainnya. Gen

p53 berperan dalam penghentian siklus sel dan apoptosis dengan memicu proses

transkripsi dari p21, GADD45 dan 14-3-3σ sehingga menyebabkan proliferasi sel


3

berjalan dengan baik. Apabila DNA terkena paparan karsinogen, akan terjadi

kerusakan yang mengakibatkan mutasi pada gen p53 menjadi p53 mutan. Hal ini

menyebabkan tidak terjadinya apoptosis dan penghentian siklus sel sehingga sel akan

terus berproliferasi secara abnormal dan bertransformasi menjadi kanker.3,17,19,20

Dari hasil pewarnaan p53, menunjukkan sel yang mengekspresikan p53 mutan yang

diamati di bawah mikroskop akan tampak berwarna coklat pada inti sel tumor.

Dalam identifikasi tampilan protein p53 mutan, digunakan antibodi monoklonal

DO7 yang secara spesifik dapat mengenali p53 mutan dan dicat dengan kromogen

DAB untuk menampilkan warna coklat (positif).13,28

Pada Tabel 2 menunjukkan

distribusi frekuensi tampilan imunohistokimia p53 pada KSS rongga mulut

tertampil positif sebanyak 83,3% dan negatif sebanyak 16,7%. Dengan

ditemukannya tampilan positif protein p53 mutan pada 83,3% dari KSS rongga

mulut, ini membuktikan bahwa p53 mutan berperan dalam terjadinya KSS rongga

mulut. Hasil tampilan negatif p53 mutan sebanyak 16,7% bukan berarti tidak

terdapat gen p53 mutan dan memungkinkan juga bukan gen p53 mutan penyebab

terjadinya kanker, melainkan kontribusi dari gen lainnya. Penelitian Ara dkk.

(2014) pada KSS rongga mulut melaporkan tampilan imunohistokimia p53 negatif

menunjukkan tampilan positif p53 mutan dengan analisis PCR-SSCP (Polymerase

Chain Reaction - Single Strand Conformation Polymorphism).29

Kelemahan pada

penelitian ini terletak pada keterbatasan peneliti dalam mengukur p53 mutan

dikarenakan alat dan teknik yang digunakan. Oleh sebab itu tampilan

imunohistokimia p53 negatif tidak selalu menunjukkan bahwa tidak terdapat p53

mutan, dan perlu dilanjutkan lagi dengan teknik lainnya seperti Single Strand

Conformation Polymorphism (SSCP), Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

(DGGE), dan Denaturant High Performance Liquid Chromotography (DHPLC).37

Dari 10 sampel yang diteliti (Tabel 3), menunjukkan distribusi frekuensi

tampilan imunohistokimia p53 (++) tertinggi sebesar 40% sementara tampilan

imunohistokimia p53 (+) dan p53 (+++) masing-masing sebesar 30%. Tingkat skor

tampilan p53 yang tinggi akan menunjukkan prognosa yang jelek.14

Hal ini dapat


4

disimpulkan pada prognosa yang baik akan berpengaruh terhadap rencana

perawatan.

5.3 Hubungan Tingkat Skor p53 dengan Tingkat Diferensiasi Sel

Dari 10 sampel yang menunjukkan tampilan imunohistokimia p53 mutan,

pada sel yang berdiferensiasi baik tersebar tampilan p53 (+), (++) dan (+++),

sementara pada sel yang berdiferensiasi sedang dan buruk tidak menunjukkan

sebaran p53 (++) dan p53 (+++) (Tabel 4). Banyak penelitian telah menunjukkan

aktivitas gain-of-function yang berbeda dari p53 mutan, termasuk mempromosikan

proliferasi sel, anti-apoptosis, perubahan metabolik, migrasi, invasi, angiogenesis,

dan metastasis.23-25

Hal ini didukung oleh Yadong Li dan Jinsong Zhang (2015),

tingkat positif p53 mutan lebih tinggi pada pasien KSS rongga mulut dengan

metastasis kelenjar getah bening dibandingkan yang tidak metastasis.12

Penelitian Lan

Yang dkk. (2015) menunjukkan ada hubungan yang signifikan antara tampilan

imunohistokimia p53 dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga mulut. Hal

ini menunjukkan tampilan p53 meningkat seiring dengan bertambahnya tingkat

diferensiasi sel.30

Pada penelitian peneliti, berdasarkan analisis uji Chi-Square,

diperoleh hasil p>0,05 menunjukkan tidak ada hubungan yang signifikan antara

tampilan imunohistokimia p53 dengan tingkat diferensiasi sel pada KSS rongga

mulut (Tabel 4). Hal ini sesuai dengan penelitian Thomas K. Hoffman dkk. (2011)

yang dikarenakan jumlah sampel yang menunjukkan tampilan imunohistokimia p53

mutan sedikit sehingga tidak dapat mewakili hasil.13


5

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah dilakukan dalam penelitian

ini, maka dapat disimpulkan beberapa hal sebagai berikut:

1. KSS rongga mulut yang berdiferensiasi baik (50%) tertinggi

dibandingkan yang berdiferensiasi sedang (25%) dan berdiferensiasi buruk (25%).

2. Hasil tampilan imunohistokimia p53 yang positif (83,3%) sementara

yang negatif (16,7%). Tingkat skor tampilan imunohistokimia p53 (++)

mempunyai frekuensi yang tertinggi (40%) dibandingkan tingkat skor tampilan

imunohistokimia p53 (+) dan (+++) (masing-masing 30%).

3. Tingkat skor tampilan imunohistokimia p53 tidak ada perbedaan yang

signifikan (p>0,05) dengan tingkat diferensiasi sel KSS rongga mulut.

6.2 Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh dapat disarankan hal-hal

sebagai berikut:

1. Penelitian lebih lanjut disarankan untuk menggunakan jumlah sampel

blok parafin yang lebih banyak mewakili KSS berdiferensiasi baik, sedang dan

buruk agar meningkatkan keakuratan hasil.

2. Perlu penelitian lanjut dengan menggunakan teknik lainnya seperti PCR

(Polymerase Chain Reaction) untuk memperoleh lebih banyak hasil p53 mutan.


6

DAFTAR PUSTAKA

1. Rivera C, Venegas B. Histological and molecular aspects of oral squamous cell

carcinoma (Review). Oncology Letters. 2014; 8(1): 7-11.

2. Cawson R, Odell E. Cawson's Essentials of Oral Pathology and Oral Medicine.

8th ed. London: Elsevier Health Sciences UK; 2008: 277-85.

3. Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbins Basic Pathology. 10th ed.

Philadelphia: Elsevier Saunders; 2008: 189-217.

4. Warnakulasuriya S. Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer.

Oral Oncology. 2009; 45(4-5): 309-16.

5. Shield K, Ferlay J, Jemal A, Sankaranarayanan R, Chaturvedi A, Bray F et al.

The global incidence of lip, oral cavity, and pharyngeal cancers by subsite in

2012. CA: A Cancer J for Clinicians. 2016; 67(1): 51-64.

6. Gupta N, Gupta R, Acharya A, Patthi B, Goud V, Reddy S et al. Changing

Trends in oral cancer – a global scenario. Nepal J Epidemiology. 2017; 6(4):

613-9.

7. Popowics T, Fehrenbach M. Illustrated dental embryology, histology, and

anatomy. 4th ed. St. Louis (Mo.): Elsevier Saunders; 2016: 95-103.

8. Chiego D, Avery J. Essentials of oral histology and embryology. 4th ed. St.

Louis, Mo.: Elsevier Mosby; 2014: 1-7.

9. Tripathi Y. Concise textbook of physiology for dental students. 2nd ed. New

Delhi: Elsevier; 2010: 3-22.

10. Regezi JA, Sciubba JJ, Jordan RCK. Oral Pathology: Clinical Pathology

Correlations. 5th ed. St. Louis, Mo.: Elsevier/Saunders; 2008: 48-55.

11. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular

biology of the cell. 5th ed. New York: Garland Pub.; 2008: 1053-256.

12. Li Y, Zhang J. Expression of mutant p53 in oral squamous cell carcinoma is

correlated with the effectiveness of intra-arterial chemotherapy. Oncology

Letters. 2015; 10(5): 2883-7.

13. Hoffman TK, Trellakis S, Okulicz K, Schuler P, Greve J, Arnolds J et al. Cyclin

B1 Expression and p53 Status in Squamous Cell Carcinomas of The Head and

Neck. Anticancer Res. 2011; 31: 3151-8.

14. Ghanghoria S, Ghanghoria A, Shukla A. p53 Expression in Oral cancer: A

study of 50 cases. J Pathol Nepal. 2015; 5(9): 747-51.

15. Pederson T. The nucleolus. Cold Spring Harb Perspect Biol 2011; 3: 1-12.

16. Vicchioli Buim M, Fregnani J, Lourenço S, Nagano C. Prognostic Value of Cell

Cycle Proteins in Squamous Cell Carcinomas of the Oral Cavity. J Mol

Biomarkers & Diagnosis. 2011; 02(03): 1-9.

17. Lane D, Levine A. p53 research: the past thirty years and the next thirty years.

Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2: 1-10.

18. Liu J, Zhang C, Feng Z. Tumor suppressor p53 and its gain-of-function mutants

in cancer. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2013; 46(3): 170–9.


7

19. George P. p53 how crucial is its role in cancer. Int J Curr Pharm Res. 2011;

3(2): 19-25.

20. Kumari R, Sen N, Das S. Tumour suppressor p53: understanding the molecular

mechanisms inherent to cancer. Curr Sci. 2014; 107(5): 786-94.

21. Denaro N, Nigro CL, Natoli G, Russi EG, Adamo V, Merlano MC. The role of

p53 and mdm2 in head and neck cancer. ISRN Otolaryngology. 2011: 1-8.

22. Dasgupta A, Roy AG, Chakraborty A. p53ness in human cancers: an overview.

ARC J of Cancer Sci. 2016; 2(2): 15-24.

23. Muller PAJ, Vousden KH. Mutant p53 in cancer: new function and therapeutic

opportunities. Cancer Cell. 2014; 25: 304-17.

24. Kim MP, Lozano G. Mutant p53 partners in crime. Cell Death and

Differentiation. 2018; 15: 161-8.

25. Goh AM, Coffill CR, Lane DP. The role of mutant p53 in human cancer. J

Pathol. 2011; 223: 116-26.

26. Sukamdi DP, Asyhar A, Febriansah R, Ashari RA, Jenie RI, Meiyanto E.

Peningkatan ekspresi p53 oleh ekstrak etanolik rumput mutiara (Hedyotis

corymbosa) pada sel hepar tikus sprague dawley terinduksi 7,12-

dimethylbenz[a]antrasena. Pharmacon. 2010; 11(1): 1-6.

27. Dundy G, Kumar H, Singh A, Chandrakanta. P53 immunohistochemical

staining patterns in oral squamous cell carcinoma. J Pathol Nepal. 2016; 6:

1013-7.

28. Jasmeet K, Rahul M, Mridu M, Sonam S, Singh BT, Amritpal K. Can p53

expression and staining intensity correlate with histopathological prognostic

parameter and clinical staging in head and neck squamous cell carcinoma. J

Pathol Nepal. 2017; 7: 1141-8.

29. Ara N. Atique M, Ahmed S, Bukhari SGA. Frequency of p53 gene mutation

and protein expression in oral squamous cell carcinoma. J College Physicians

Surgeons Pakistan. 2014; 24(10): 749-53.

30. Yang L, Wang Y, Guo L, Wang L, Chen W, Shi B. The expression and

correlation of iNOS and p53 in oral squamous cell carcinoma. BioMed Res Int.

2015: 1-8.

31. Li Y et al. Expression of p53, p21CIP1/WIF1

and elF4E in the adjacent tissues of

oral squamous cell carcinoma: establishing the molecular boundary and cancer

progression model. Int J Oral Sci. 2015; 7: 161-8.

32. Patil NN, Wadhwan V, Chaudhary M, Nayyar AS. KAI-1 and p53 expression

in oral squamous cell carcinomas: markers of significance in future diagnostic

and possible therapeutics. J Oral Maxillofac Pathol. 2016; 20: 384-9.

33. Abrahao AC, Bonelli BV, Nunes FD, Diaz EP, Cabral MG.

Immunohistochemical expression of p53, p16 and hTERT in oral squamous cell

carcinoma and potentially malignant disorders. Braz Oral Res. 2011; 25(1): 34-

41.

34. Martinez EA, Gomez RJ, Medina CMA. Immunoexpression of p53 in oral

squamous cell carcinoma and oral dysplastic lesions in the patients with the

habit of reverse smoke. Int J Odontostomat. 2013; 7(2): 185-91.


8

35. Neena D, Siddharth S, Keyuri P, Munira J. Histological grading of oral cancer:

a comparison of different systems and their relation to lymph node metastasis.

National J of Community Med. 2011; 2(1): 136.

36. Xu QS, Wang C, Li B, Li JZ, Mao MH, Qin LZ, Feng Z. Prognostic value of

pathologic grade for patients with oral squamous cell carcinoma. Oral diseases

2018; 24(3): 335-46.

37. Suyanto PY, Utomo AR, Sandra F. Mutasi gen p53: f aktor prediktif kanker

payudara. Indonesian J of Cancer 2008; 4: 138-43.


LAMPIRAN 1

SKEMA ALUR PIKIR

1. Karsinoma sel skuamosa (KSS) rongga mulut merupakan neoplasma ganas

pada sel epitel tatah berlapis skuamosa.

2. Menurut American Cancer Society (2016) kanker rongga mulut (termasuk

faring) meningkat dari 3% menjadi 4% yang pada saat ini merupakan

tingkat ke-enam dari kanker seluruh tubuh di negara Barat yaitu UK dan

Amerika Serikat.

3. Persentase kanker rongga mulut meningkat sampai mencapai 40,9% dari

data GLOBOCAN 2012 dari World Health Organization (WHO):

Bangladesh, Pakistan, India dan Sri Lanka.

4. Terjadinya proses pembentukan sel kanker ada hubungan dengan

perubahan genetik pada siklus sel.

5. Siklus sel terdiri dari empat fase yaitu fase G1, S, G2 dan M (mitosis)

untuk proses divisi sel dan transisi dari satu fase ke fase lainnya untuk

tujuan pembelahan.

6. Checkpoints terletak pada fase G1/S yang memeriksa kerusakan DNA

sebelum sel replikasi dan pada fase G2/M yang memeriksa kerusakan

DNA setelah sel replikasi. Checkpoints dikontrol oleh siklin, cyclin

dependent kinases (CDKs) dan inhibitornya, retinoblastoma (RB), dan

p53.

7. Gen p53 merupakan gen supresor tumor yang berubah menjadi p53 wild-

type apabila diaktifkan oleh berbagai tekanan (stres) sehingga berperan

untuk perbaikan DNA yang rusak dengan menghentikan proliferasi sel,

atau sebaliknya, dalam membimbing sel yang rusak menuju apoptosis

apabila kerusakan DNA gagal diperbaiki.


8. Bila terjadi mutasi pada p53 maka akan terjadi perubahan pada protein

produk yang disebut protein p53 mutan, sehingga tidak mampu memicu

pembentukan p21, mengakibatkan ikatan CDK-siklin tidak terhambat

sehingga siklus pembelahan berjalan terus.

9. Tampilan p53 mutan dapat dilihat melalui pemeriksaan imunohistokimia

sel dengan menggunakan antibodi monoklonal anti-p53 tikus yaitu

suatu antibodi monoklonal yang secara spesifik dapat mengenali p53

mutan dalam sel.

10. Tampilan p53 mutan dikatakan positif apabila menampilkan warna coklat

pada inti sel.

11. Akumulasi p53 mutan menunjukkan kejadian awal karsinogenesis rongga

mulut dan dapat dijadikan sebagai penanda dalam bidang kanker.

Berdasarkan uraian di atas, peneliti ingin melihat tampilan p53 mutan pada kasus

karsinoma sel skuamosa rongga mulut di Medan.


Rumusan Masalah

1. Berapakah tingkat diferensiasi sel dari kasus KSS rongga mulut yang

diteliti?

2. Berapakah tingkat skor berdasarkan jumlah p53 mutan dari KSS rongga

mulut yang diteliti?

3. Apakah ada hubungan antara tingkat skor tampilan p53 mutan dengan

tingkat diferensiasi sel dari KSS rongga mulut yang diteliti?

4. Apakah ada hubungan antara tingkat skor tampilan p53 mutan dengan lokasi

lesi, jenis kelamin dan umur dari KSS rongga mulut yang diteliti?

Tujuan Penelitian

1. Untuk mendapatkan tingkat diferensiasi sel dari kasus KSS rongga mulut

yang diteliti (Hematoksilin Eosin).

2. Untuk mendapatkan tingkat skor berdasarkan jumlah p53 mutan dari KSS

rongga mulut yang diteliti (imunohistokimia p53).


tingkat diferensiasi sel dari KSS rongga mulut yang diteliti.


lokasi lesi, jenis kelamin dan umur dari KSS rongga mulut yang diteliti.


Manfaat Penelitian

1. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi lebih lanjut mengenai hubungan hasil pewarnaan

imunohistokimia p53 mutan dengan derajat diferensiasi sel pada KSS

rongga mulut berdasarkan lokasi lesi, jenis kelamin dan umur.

2. Pewarnaan imunohistokimia p53 dapat digunakan dalam penatalaksanaan

klinik pasien penderita kanker untuk menentukan tipe terapi dan

prognosisnya.


LAMPIRAN 2

DEPARTEMEN BIOLOGI ORAL

FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI


KRITERIA PEMILIHAN SAMPEL PENELITIAN

No. Sampel : ____________________

Tanggal Sampel : ____________________

Tanggal Penelitian : ____________________

T. Pengambilan Sampel : _________________________

I. DATA BLOK PARAFIN

1. Umur :

2. Jenis kelamin : a. pria

b. wanita

TAMPILAN IMUNOHISTOKIMIA P53 PADA

KARSINOMA SEL SKUAMOSA

RONGGA MULUT


3. Lokasi lesi :

a. lidah b. mandibula

c. bibir d. gingiva

e. palatum f. dasar mulut

g. tonsil h. orafaring

i. mukosa bukal

5. Diagnosa Histopatologi : a. KSS berdiferensiasi baik

Pewarnaan H&E

b. KSS berdiferensiasi sedang

c. KSS berdiferensiasi buruk

6. Kondisi Blok Parafin :

a. baik

Ya Tidak

b. Jelek

Ya Tidak


Medan, 2018.

Ahli Patologi,

( )

KESIMPULAN

Sampel diterima :

Sampel tidak diterima :


LAMPIRAN 3

ALAT DAN BAHAN

Gambar 1. Mikrotom Leica RM2245

Gambar 2. Rotator


Gambar 3. Mikroskop cahaya merek Olympus CX21


Gambar 4. a) Kaca objek merek b) Kaca objek merek Sail Brand

Superfrost Plus


Gambar 5. a) Antibodi monoklonol b) Ez-Mount (Xylene Base)

p53

c) Peroxidase Block


LAMPIRAN 4

4a) Pembuatan preparat dari blok parafin dan pewarnaan HE

1. Pemotongan blok parafin dengan

mikrotom.

2. Potongan tipis parafin dimasukkan

ke dalam waterbath.

3. Potongan tipis parafin ditempelkan

ke kaca objek merek Sail Brand.


4. Slide diletakkan di atas hot plate

dengan suhu 45 derajat Celcius.

5. Deparafinisasi dengan urutan xilol

(4 kali), alkohol 95% (4 kali) dan

air masing-masing 2 menit.

6. Dicelupkan dalam hematoksilin

selama 5 menit.


7. Dibilas dengan air yang mengalir

selama 3 menit.

8. Kaca objek tersebut dicelupkan ke

dalam acid alkohol 1% 1-2 celup

lalu dibilas.

9. Dibilas kembali dengan air yang

mengalir selama 3 menit.


10. Lakukan pewarnaan dengan eosin

untuk mewakili inti sel selama 2-

3 menit lalu dibilas kembali

dengan air mengalir selama 3

menit.

11. Kemudian kaca obyek dicelupkan

ke dalam alkohol 80% selama 30

menit, alkohol 95% selama 3

menit dan alkohol absolut selama

3 menit.

12. Mounting dengan menggunakan

entelan dan preparat ditutup

dengan kaca penutup.


13. Dilakukan pengamatan pada sel

menggunakan mikroskop cahaya

dengan pembesaran 40x, 100x

dan 400x.


4b) Cara pewarnaan imunohistokimia p53

1. Pemotongan blok parafin dengan

mikrotom.

2. Potongan tipis parafin dimasukkan

ke dalam waterbath.

3. Potongan tipis parafin ditempelkan

ke kaca objek merek Superfrost

Plus.


4. Slide diletakkan di atas hotplate

dengan suhu 45 derajat Celcius.

5. Deparafinisasi dengan urutan xilol

(4 kali), alkohol 95% (4 kali) dan

air masing-masing 2 menit.

6. Blocking dengan Peroxidase Block

selama 10 menit.


7. Slide dicuci dengan Phosphate

Buffered Saline (PBS) selama 5

menit.

8. Blocking dengan Super Block

(AAA) selama 5 menit.

9. Slide dicuci dengan PBS selama 5

menit.


12. Diteteskan Anti-Polyvalent HRP

Polymer kemudian inkubasi

selama 30 menit.

10. Diteteskan dengan antibodi

primer p53 (Ready to use)

kemudian inkubasi selama 1 jam.

11. Slide dicuci dengan PBS selama

5 menit.


15. Slide dicuci dengan dengan air


13. Slide dicuci dengan PBS selama

5 menit.

14. Diteteskan campuran

kromogen/substrat DAB

kemudian inkubasi selama 5

menit.


16. Counterstain dengan

Hematoxylin selama 5 menit.



18. Counterstain dengan Lithium

selama 5 menit.


20. Mounting dengan menggunakan

entelan dan preparat ditutup

dengan kaca penutup.



21. Dilakukan pengamatan tampilan

imunohistokimia p53 pada sel

KSS rongga mulut dengan

pembesaran 40x, 100x dan 400x.


LAMPIRAN 5

5a) Hasil pewarnaan Hematoksilin Eosin (HE) pada KSS rongga mulut

Gambar 6. KSS rongga mulut berdiferensiasi baik

(A). Pembentukan pearl horn formation (HE, 100x)

Gambar 7. KSS rongga mulut berdiferensiasi sedang

(A). Interselular bridge masih ada

(B). Perubahan karakteristik sel (HE, 100x)

A

A

B


Gambar 8. KSS rongga mulut berdiferensiasi buruk

(A). Sel-sel yang tidak teratur, sel anaplasia dan

pembentukan sel giant (HE, 100x).

A


5b) Hasil pewarnaan imunohistokimia p53 pada KSS rongga mulut

Gambar 9. KSS rongga mulut dengan tampilan p53 (-)

(IHK, 400x)

Gambar 10. KSS rongga mulut dengan tampilan p53 lemah (+)

(IHK, 400x)


Gambar 11. KSS rongga mulut dengan tampilan p53 sedang (++)

(IHK, 400x)

Gambar 12. KSS rongga mulut dengan tampilan p53 kuat (+++)

(IHK, 400x)


LAMPIRAN 6

Tabel: Hasil perwarnaan HE dan tampilan imunohistokimia p53 dengan lokasi lesi,

jenis kelamin dan umur pada KSS rongga mulut.

NO

.

No.

Sampel

Lokasi

Lesi

J.

Kelami

n

Umu

r

Derajat

Diferensias

i

Frekuensi Tampilan

IHK p53

I II II

I

- + ++ +++

1 B/1573/1

7

Lidah L 63 98

%

2 B/2797/1

6

Lidah P 55 5%

3 B/3098/1

6

Gingiv

a

P 66 7%

4 B/4565/1

6

Lidah P 77 30

%

5 B/4672/1

4

Lidah P 44 95

%

6 B/4851/1

6

Gingiv

a

P 74 75

%

7 B/5277/1

4

Lidah P 78 65

%

8 B/7225/1

5

M.

Bukal

L 79 0

%

9 B/3689/1

8

Lidah L 58 31

%

10 B/4015/1

8

Lidah L 45 60

%

11 O/2813/1

8

Lidah P 57 0

%

12 O/3860/1

8

Lidah P 71 10

%

Jenis Kelamin: P = Perempuan L = Lelaki

Derajat Diferensiasi: Kategori I = Berdiferensiasi Baik Kategori II =

Berdiferensiasi Sedang Kategori III = Berdiferensiasi Buruk

Skor Tampilan IHK p53 (sel-sel positif): Kategori - = tidak terlihat warna coklat

Kategori + = <30% sel positif p53 mutan


Kategori ++ = 30-70% sel positif p53

mutan

Kategori +++ = >70% sel positif p53

mutan

LAMPIRAN 7


ETHICAL CLEARANCE

LAMPIRAN 8


DATA HASIL UJI STATISTIK

Derajat Diferensiasi

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid Baik 6 50.0 50.0 50.0

Sedang 3 25.0 25.0 75.0

Buruk 3 25.0 25.0 100.0

Total 12 100.0 100.0

Frekuensi Tampilan IHK p53

Frequency Percent Valid Percent

Cumulative

Percent

Valid - 2 16.7 16.7 16.7

+ 3 25.0 25.0 41.7

++ 4 33.3 33.3 75.0

+++ 3 25.0 25.0 100.0

Total 12 100.0 100.0


Derajat Diferensiasi * Frekuensi Tampilan IHK p53 Crosstabulation


Total + ++ +++

Derajat

Diferensiasi

Baik Count 1 2 2 5

% within Derajat Diferensiasi 20.0% 40.0% 40.0% 100.0%

% within Frekuensi Tampilan

IHK p53 33.3% 50.0% 66.7% 50.0%

% of Total 10.0% 20.0% 20.0% 50.0%

Sedang Count 1 2 0 3



IHK p53 33.3% 50.0% 0.0% 30.0%

% of Total 10.0% 20.0% 0.0% 30.0%

Buruk Count 1 0 1 2



IHK p53 33.3% 0.0% 33.3% 20.0%

% of Total 10.0% 0.0% 10.0% 20.0%

Total Count 3 4 3 10



IHK p53 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%

% of Total 30.0% 40.0% 30.0% 100.0%

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square 3.111a 4 .539

Likelihood Ratio 4.637 4 .327

Linear-by-Linear Association .246 1 .620

N of Valid Cases 10

a. 9 cells (100.0%) have expected count less than 5. The minimum

expected count is .60.

Lokasi Lesi * Frekuensi Tampilan IHK p53 Crosstabulation



Total - + ++ +++

Lokasi

Lesi

Lidah Count 1 2 4 2 9

% within Lokasi Lesi 11.1% 22.2% 44.4% 22.2% 100.0%

% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 66.7% 100.0% 66.7% 75.0%

% of Total 8.3% 16.7% 33.3% 16.7% 75.0%

Gingiva Count 0 1 0 1 2


% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 0.0% 33.3% 0.0% 33.3% 16.7%

% of Total 0.0% 8.3% 0.0% 8.3% 16.7%

Mukosa

Bukal

Count 1 0 0 0 1


% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 0.0% 0.0% 0.0% 8.3%

% of Total 8.3% 0.0% 0.0% 0.0% 8.3%

Total Count 2 3 4 3 12


% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%

% of Total 16.7% 25.0% 33.3% 25.0% 100.0%

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)



Linear-by-Linear Association 1.323 1 .250

N of Valid Cases 12



J. Kelamin * Frekuensi Tampilan IHK p53 Crosstabulation



Total - + ++ +++

J. Kelamin Laki-laki Count 1 0 2 1 4

% within J. Kelamin 25.0% 0.0% 50.0% 25.0% 100.0%

% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 0.0% 50.0% 33.3% 33.3%

% of Total 8.3% 0.0% 16.7% 8.3% 33.3%

Perempuan Count 1 3 2 2 8

% within J. Kelamin 12.5% 37.5% 25.0% 25.0% 100.0%

% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 100.0% 50.0% 66.7% 66.7%

% of Total 8.3% 25.0% 16.7% 16.7% 66.7%


% within J. Kelamin 16.7% 25.0% 33.3% 25.0% 100.0%

% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%

% of Total 16.7% 25.0% 33.3% 25.0% 100.0%

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)




N of Valid Cases 12



Kelompok Umur * Frekuensi Tampilan IHK p53 Crosstabulation



Total - + ++ +++

Kelompok

Umur

40-59 Count 1 1 2 1 5

% within Kelompok Umur 20.0% 20.0% 40.0% 20.0% 100.0%

% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 33.3% 50.0% 33.3% 41.7%

% of Total 8.3% 8.3% 16.7% 8.3% 41.7%

60-79 Count 1 2 2 2 7


% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 50.0% 66.7% 50.0% 66.7% 58.3%

% of Total 8.3% 16.7% 16.7% 16.7% 58.3%



% within Frekuensi

Tampilan IHK p53 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%

% of Total 16.7% 25.0% 33.3% 25.0% 100.0%

Chi-Square Tests

Value df

Asymp. Sig. (2-

sided)

Pearson Chi-Square .343a 3 .952

Likelihood Ratio .345 3 .951


N of Valid Cases 12




Documents

TAMPILAN IMUNOHISTOKIMIA P53 PADA KARSINOMA SEL …