PRCTICA 4 DETERMINACION CUANTITATIVA DE RIBOFLAVINA

POR FLUORIMETRIA 1.- Introduccin terica La fluorimetra es una tcnica que presenta sustanciales ventajas analticas, pues a su especificidad se une

su gran sensibilidad. Los procesos de fluorescencia poseen una gran utilidad como base de tcnicas dirigidas a la determinacin

de la intensidad de la emisin fluorescente, dicha seal es funcin, segn Kavanagh, de la intensidad de la emisin de la REM absorbida por el compuesto fluorescente: ( )sf k I I= ' 0 donde sf es la intensidad de la emisin fluorescente, k' una constante de proporcionalidad e I0 e I las intensidades de la radiacin incidente y emergente, respectivamente.

Segn la ley de Lambert-Beer:

I bcI

= 0log bceII 303.20 =bcII = 100

Donde es el Coeficiente de absorcin Molar si b se expresa en cm y c en molL-1. Por tanto la seal de fluorescencia, resulta: ( ) ( )bcbc eIkeIIksf 303.20303.200 1'' == Teniendo en cuenta que e-2.303bc equivale a una expresin del tipo e-x que puede desarrollarse en serie:

( ) ( ) .....!3

3303.2!2

2303.2303.21303.2 ++= bcbcbce bc En una aproximacin razonablemente vlida, se podrn despreciar todos los trminos a partir del tercero,

siempre que bc < 0.05. As pues, la expresin correspondiente a la seal de fluorescencia ser: ( )[ ] bcIkbcIksf 303.2'303.211' 00 ==

y agrupando trminos constantes para un mismo equipo instrumental y una determinacin dada resulta:

sf = k'' c

Segn esta ecuacin la seal de fluorescencia depende de la concentracin c y de factores instrumentales

(ngulo slido visto por el detector, f (); factor de conversin cuntico del detector, f (), paso ptico de la cubeta, b, intensidad incidente de la radiacin excitadora (I0), as como de otros parmetros relacionados con la propia sustancia (coeficiente de absorcin molar, ; eficacia cuntica de fluorescencia, ; todos ellos englobados en k'').

Y como la ecuacin sf=k''c, define la proporcionalidad lineal entre la seal y la concentracin, tenemos la

base del aspecto cuantitativo de la espectrofluorimetra, siempre y cuando el producto bc < 0.05.

Por tanto la linealidad sf y c se cumple para disoluciones diluidas. En efecto, s:

bc

2.- Parte experimental a) Instrumental y productos

1 Gradilla 10 Tubos de ensayo con tapn 1 Cubeta de cuarzo 1 Frasco lavador 2 Vasos de precipitados de 100 mL 1 Matraz aforado de 100 mL 1 Pera de goma 2 Pipetas de 10 mL 1 Soporte para pipetas Espectrofotmetro Hitachi F-2000 Riboflavina solucin acuosa de 5 mg/L.

b) Procedimiento experimental 1. Realizar el espectro de excitacin y emisin siguiendo las instrucciones del instrumento. 2. Preparar a partir de una disolucin riboflavina de 5 mg/L, 100 mL de disolucin de 0.1 g/mL. A partir de esta disolucin preparamos una serie de concentraciones patrn de 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 y 0.10 g/mL (10 mL de cada concentracin). -Determinar la intensidad de fluorescencia (sf) de cada disolucin patrn (media de tres lecturas) y la de la muestra problema -Representar grficamente la intensidad de emisin de los patrones frente a sus respectivas concentraciones. 3. Interpolar la intensidad de fluorescencia de la muestra problema en la grfica anterior para determinar la concentracin de riboflavina.

Datos, medidas y clculos