1

Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)

tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

tm = 81.5 + 16.6 (log10[K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)

T

T

% G + C

%¿Qué es la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR:polymerase chain reaction) es una técnica deamplificación de secuencias de DNA in vitro

5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’

5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’5’ AGGTCG

GCTATC 5’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA 5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’

5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’

5’ AGGTCG

GCTATC 5’

5’ AGGTCG

GCTATC 5’

AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA

5’ ….AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’

3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC.... 5’AATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG.... 3’5’ AGGTCG

GCTATC 5’3’ ….TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAA

PCR

DesnaturalizaciónUnión de oligosExtensión

DesnaturalizaciónUnión de oligosExtensión

1er ciclo

2ndo ciclo

2

La PCR según Mullis

Desnaturalización (100oC)

Unión cebadores

Polimerización (37oC)

Eritrocitos sanos Eritrocitos falciformes

IndividuosSanos

Glu

Individuoscon anemia

Val

Diagnóstico de un tipo de anemia falciforme

110 p.b. 110 p.b.

5’ …CGACTCCTGAG.... 3’3’ …GCTGAGGACTC.... 5’

DdeI

Sano5’ …CGACTCCTGTG.... 3’3’ …GCTGAGGACAC.... 5’

DdeI

Enfermo

DNA polimerasa termoestableThermus aquaticus: Taq polimerasa

Comparación entre Klenow yTaq polimerasaSaiki et al. Science. (1988) 239: 487

3

Termoestabilidad de la TaqN-terminal:13 Pro

Fragmento completo:• 17 nuevos aminoácidos - hidrófobos - aromáticos• 4 Lys 4 Arg

Interfase (hélices G,Q,R):• Asn524 Trp428• Asp819 Phe724• Arg858 Leu763• Arg909 Tyr811

NÚCLEO HIDROFÓBICO MAYOR EN TAQ

Actividad exonucleasa: unión de NMP aKlenow TaqHebra 2: Asp355 Phe309

Glu357 Desaparecido Thr358 Desaparecido

Hélice C: Asp424 Leu356Leu345Val307

Actividad correctora de pruebas (KlenTaq)

Pasos en la PCR

KLENOW

• Desnaturalización100oC

• Unión cebadores ypolimerización37oC

Taq POLIMERASA

• Desnaturalización95oC

• Unión cebadores(45-55oC) Tm

• Polimerización72oC

Elementos de la PCR

• DNA Molde• Cebadores (oligonucleótidos)• DNA polimerasa termoestable• Desoxinucleótidos trifosfatos• Tampón de reacción

• pH• Cationes divalentes• Cationes monovalentes

Optimización de la PCR

Rendimiento extracción DNA en tejidos humanos

Fuente de DNA

Cantidad de partida

Rendimiento

Sangre

30 µl

0.5 - 1 µg

Suspensionescelulares

5 105 células

2 - 5 µg

Células bucales

Lavado bucal

0.1 - 1 µg

Semen

30 µl

5 - 10 µg

Raíz de pelo

1 raíz

10 - 200 ng

Bloque de tejido

50 mg

0.1 - 10 µg

4

Diseño de cebadores

• LONGITUD: 18-25 nucleótidos complementarios

• COMPOSICIÓN: G+C entre 40% y 60%

• DIMERIZACIÓN: No deben unirse entre si

• CONCENTRACIÓN: 0.1-0.5 µM de cada cebador

Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)

tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

tm = 81.5 + 16.6 (log10[K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)

T

T

% G + C

%

3’ AGGTCGAATTCGATGGTTT---------5’

TCCAGCTTAAGCTACCAAA5´ 3´

3’ ACGTCTAATACGATGGCTT---------5’

TCCAGCTTAAGCTACCAAA5´ 3´

tm = 52oC

tm = 36oC

Grado de homología y tm

• 100 % homología

• 75 % homología

Nuevas DNA polimerasas termoestables

0

2

4

6

8

10

12

14

0 10 20 30 40 50 60Número de ciclos

Lo

g d

e N

f

Nf = número final de moléculasNo = número inicial de moléculasY= eficiencian= no de ciclos

Eficiencia de la amplificación en la PCR

Log

Nf

Número de ciclos (n)

Nf = No (1+Y)n EjemploNf = 1012

No = 3 x 105 (1µg DNA)Y = 0,7n = 28.8

Otros componentes de la reacción

5

Optimización de la técnica

• ↓ No ciclos

• ↑ [molde]

• Cambiar polimerasa

Reducir el error↑ Fidelidad

• Cambiar cebadores

• ↑ T hibridación

• Cambiar [Mg2+]

• Cambiar polimerasa

Eliminar P no deseados↑ Especifidad

RecomendacionesRazón

• ↑ t extensión

• Cambiar polimerasa

• Cambiar [Mg2+]

• ↓ t desnaturalización

• ↑ [molde]

↓ errores↑ Fidelidad

• ↑ No ciclos

• ↑ [molde]

• ↓ T hibridación

• Cambiar polimerasa

• ↑ t extensión

↑ Moléculas↑ Rendimiento

RecomendacionesRazón

Aplicaciones• Clonaje de genes• Diagnóstico• Evolución molecular• Cuantificación de mRNAs• Secuenciación• Localización de AN in situ• Forense• Otras

Ventajas de la PCR en clonación

• A partir de RNA total y en un solo paso (RT-PCR) pueden obtenerse cDNAs específicos

• No es necesario el empleo de librerías paraobtener fragmentos genómicos definidos

Alineamiento de pectin esterasas

FP1

FP2

RP2 RP1

6

1a PCR

2a PCR

PCR anidado (Nested PCR)

FP1 FP2 RP1RP2

FP1+RP1

FP2+RP2

FP2 RP1

Deteccion de mutaciones: SSCP

...CAA...

...GTT...

N-Ras Normal (A)

P32

P32

...CTTA...

...GAAT...

N-Ras Mutado (B)

P32

P32

...CAA... ...GTT... ...CTTA... ...GAAT...

Desnaturalización

CAA

GTT

CTA

GAT

(A) (A/B) (B)

Evolución molecular. DNA shuffling

1

2

3

4DNAsa I

PCR sin oligos

PCR con oligos

Mutaciones útiles Mutaciones nuevas

Posición TEM-1 (MIC 0.02)

ST-1 (MIC 320)

ST-2 (MIC 640)

ST-4 (MIC 10)

14 A V A A 42 A A G A 92 G G S G 104 E K K K 182 M T T T 238 G S S S 241 R R H R

DNA shuffling: β-lactamasa

• TEM-1: β-lactamasa• ST-1: descendiente de TEM-1 tras 3 ciclos de

mutagénesis/recombinación/selección• ST-2: descendiente de ST-1 por retrocruzamientos• ST-4: construcción diseñada resultante

[Cefotoxima] (µg/mL)0.02 320 640 10

Posición ST-1 ST-2 ST-4TEM-1