TA-HAYATI

HANDBOOK OF TA HAYATI 1

BAB I

MEDIA

Media adalah suatu substrat yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme.

Syarat-syarat Media

1. Mengandung komposisi :

Air

Sumber energi metabolik (fermentasi, respirasi, fotosintesis)

Zat hara (sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, oksigen, hidrogen &

trace elements)

Asam amino, vitamin, nukleosida

2. Memiliki pH, temperatur dan tekanan osmotik yang sesuai dengan kebutuhan

mikroorganisme.

3. Steril, agar tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme pencemar.

Fungsi Komponen-komponen Media

Mayoritas sel terdiri atas karbon, oksigen, hidrogen, nitrogen, fosfor. Senyawa diatas dibutuhkan dalam pembentukan membran sel, protein,

asam nukleat dan struktur lain dari sel.

Senyawa tersebut diatas dibutuhkan dalam jumlah banyak, meliputi 1% dari berat kering sel, disebut MAKRONUTRIEN.

Senyawa lainnya yang dibutuhkan dalam jumlah yang lebih kecil antara lain kalsium, potassium, magnesium, sulfur, besi, mangan. Senyawa ini

disebut MIKRONUTRIEN. Mikronutrien meliputi 0.1-1.0% dari berat

kering sel. Walaupun dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit, mikronutrien

berperan penting dalam fungsi sel.


Trace elements dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil yang sukar ditentukan. Jumlah yang dibutuhkan adalah konsentrasi cairan intrasel terjadi dehidrasi dan pengkerutan sel (PLASMOLISIS).

HIPOTONIK konsentrasi cairan ekstrasel < konsentrasi cairan intrasel terjadi pembengkakan.

Jenis media

Berdasarkan konsistensi :

Media padat (agar/gelatin)

Dibuat dengan cara menambahkan agen pemadat, misalnya agar, gelatin

atau silica gel ke dalam media cair.


Agen pemadat yang baik adalah tidak diuraikan oleh mikroorganisme,

tidak menghambat pertumbuhan mikroorganisme, tidak mencair pada

suhu ruang.

Agar dan silica gel tidak mencair pada suhu ruang dan tidak diuraikan

oleh mikroorganisme. Sebaliknya, gelatin, diuraikan oleh

mikroorganisme dan mencair pada suhu ruang.

Contoh : agar nutrien, agar darah, Saborauds agar.

Media cair (broth)

Meliputi nutrient broth (kaldu nutrien), citrate broth, glucose broth,

litmus milk dsb.

Media cair digunakan dalam propagasi banyak mikroorganisme, uji

fermentasi dan uji lainnya.

Media semi-padat

Berdasarkan kimiawi :

Media sintetik

Media non-sintetik (alami)

Berdasarkan sifat :

Media Umum

Untuk pertumbuhan atau perkembangan satu atau lebih kelompok

mikroorganisme.

Media Pengaya

Untuk memberikan kesempatan terhadap suatu jenis/kelompok

mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang biak lebih cepat dari

jenis/kelompok lain dalam satu media.

Media Penguji

Media yang digunakan untuk pengujian senyawa atau benda tertentu

dengan bantuan mikroorganisme.

Media Perhitungan

Media yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme pada

suatu bahan


Media Selektif Media yang hanya menumbuhkan mikroorganisme yang diinginkan saja

yang dapat tumbuh karena tidak adanya nutrien penting bagi

mikroorganisme yang tidak diinginkan untuk tumbuh dan kehadiran

substansi inhibitor seperti NaCL, asam, kristal violet (toksik), antibiotika

(misal : streptomisin) dsb.

Media Diferensial Media yang mengandung substansi yang dapat menyebabkan munculnya

karakteristik dari masing-masing mikroorganisme yang ditumbuhkan.

Contoh media selektif dan diferensial : Levine EMB agar untuk analisis koliform dalam air.

Contoh Media


Pembuatan Media

Bila tabung/cawan petri yang digunakan untuk pembuatan media sudah dalam keadaan bersih dan bebas kontaminasi, maka tidak perlu dilakukan pencucian.

Pencucian dilakukan dengan menggunakan air hangat dan deterjen, bagian dalamnya disikat. Cuci sebanyak dua kali, pada pencucian kedua, gunakan

aquadest untuk membersihkan sisa-sisa deterjen yang masih tertinggal.

Tempatkan tabung/cawan petri tersebut pada keranjang/rak untuk pengeringan. Jangan dikeringkan dengan menggunakan handuk.

Sterilisasi.

Pembuatan Media Sintetik

Glukosa 0,2 g

Kalium fosfat 0,1 g

Ammonium klorida 0,05 g

Magnesium sulfat 0,02 g

Feri klorida 0,0005 g

Aquadest 100 ml

Siapkan 100 ml kaldu glukosa garam mineral dengan kandungan seperti pada

tabel

Siapkan labu erlenmeyer 250 ml

Masukkan aquadest sebanyak 75 ml


Tambahkan setiap bahan sesuai urutan pada tabel

Kocok pada setiap penambahan bahan dan biarkan larut dulu

sebelum penambahan bahan berikutnya

Tambahkan sisa aquadest sebanyak 25 ml

Masukkan 10 ml larutan ke dalam 10 buah tabung dengan menggunakan pipet 10 ml

Tutup tabung dengan kapas yang dibalut oleh kain kasa

Beri label dan sterilisasi

Pembuatan Media Non-Sintetik

KALDU NUTRIEN

Pepton 1,0 g

NaCl 1,6 g

Ekstrak daging 0,6 g

Aquadest 200 ml


Siapkan 1 labu erlenmeyer 250 ml.

Masukkan 150 ml aquadest.

Tambahkan ketiga bahan berikutnya, campur dan kocok pada setiap

penambahan bahan.

Tambahkan 50 ml sisa aquadest.

Panaskan larutan ini hingga semua bahan larut.

Ukur pH

Masukkan 10 ml larutan ke dalam 10 tube steril

Tutup tabung

Beri label

Tempatkan ke rak

Sterilkan

Untuk membentuk media padat tambahkan 1.5 g agar pada sisa larutan

Panaskan larutan supaya agar larut

Kocok labu supaya agar tidak menempel pada dasar labu

Masukkan 10 ml larutan ke dalam tube steril


Tutup tabung

Beri label

Tempatkan ke rak

Sterilisasi

PERHATIKAN :

Pemanasan larutan dengan menggunakan api bunsen atau electric hot plate.

Tandai tinggi larutan awal sebelum dipanaskan untuk menghindari water loss.

Bila terjadi water loss tambahkan aquadest.

Suhu pemanasan tergantung komposisi medium, ada yang 600C.

Agar akan membeku pada suhu 40-420C.


BAB II

STERILISASI

Pengertian

Suatu proses (dengan metode tertentu) yang memberikan hasil akhir suatu keadaan

dimana tidak dapat ditunjukkan lagi adanya mikroorganisme hidup.

Prinsip Dasar Sterilisasi

Adanya derajat kontaminasi yang serendah mungkin sebagai pra-kondisi.

Pemilihan metode sterilisasi yang paling tepat.

Ada tolak ukur yang tepat untuk mengukur efisiensi proses sterilisasi atau hasil

akhir.

Ada sarana penunjang untuk menjaga mutu hasil akhir produk steril.

Dekontaminasi

Jumlah kontaminan tinggi hasil akhir meragukan atau akan membutuhkan waktu proses lebih lama.

Proses dekontaminasi meliputi :

- pembilasan

- penyikatan

- pencucian (dengan desinfektan), baik dengan manual/alat

Pemilihan Metode Sterilisasi

Sifat bahan yang akan disterilkan.

Proses yang paling mudah, murah, namun cukup efektif.


Cara sterilisasi menurut FI Ed. IV

1. Sterilisasi Panas Basah (Uap)

Proses sterilisasi termal menggunakan uap jenuh di bawah tekanan

berlangsung di suatu bejana yang disebut autoclave.

Metode yang paling sering digunakan.

Suhu 1210C selama 15-20 tergantung bahan/prosedur sterilisasi.

Prinsip : Udara di dalam bejana diganti dengan uap jenuh.

Fase Siklus Sterilisasi

Pemanasan/Vakum (Conditioning)

Fase Pemaparan Uap (Exposure)

132C 2

121C 12

116C 30

Pembuangan Uap (Exhaust)

Fase Pengeringan (Drying)

Metode ini paling banyak digunakan karena :

Hampir 80% alat dan bahan dapat disterilkan dengan metode ini, seperti

karet.

Biaya operasional cukup rendah dibanding metode lain.

Temperatur merata pada setiap tempat selama proses.

Cepat dan hasil kering.


Bejana autoclave

Prinsip kerja autoclave


2. Sterilisasi Panas Kering

Alat : Oven

Prinsip :

Udara dipanaskan dan disaring.

Didistribusikan secara merata ke seluruh bejana dengan cara

sirkulasi atau radiasi.

Temperatur dan waktu yang digunakan :

1500C 60-150

1600C 45-120

1700C 20-60

1800C 20-30

Kelebihan :

Hasil kering.

Dapat digunakan untuk semua bahan termostabil, seperti alat-alat gelas.

Mudah dilaksanakan.

Kekurangan :

Waktu yang dihabiskan cukup lama.

Penetrasi panas terbatas pada lapisan tertentu.

Dibutuhkan tenaga listrik cukup besar.

Oven


3. Sterilisasi Gas

Sebagai alternatif dari sterilisasi termal dilakukan bila bahan yang

disterilkan tidak tahan terhadap suhu tinggi seperti pada proses sterilisasi

uap atau panas kering.

Daya penetrasi dan absorpsi tinggi sehingga sterilisasi dapat dilakukan pada

pembungkus akhir.

Sterilisasi dengan menggunakan gas kimia :

Etilen oksida (EtO2)

Sifat : mudah meledak dan iritatif.

Dalam perdagangan dicampur dengan gas CO2 atau freon dalam kadar 10-

90%.

Mekanisme kerja : melalui alkilasi gugus biologis esensial dari

mikroorganisme.

Meninggalkan residu toksik.

Mutagenik.

Afinitas tinggi sehingga perlu diangin-anginkan sebelum digunakan, tujuan

untuk menghilangkan EtO2 yaitu selama 8-30 jam pada 450C atau 4-10 hari pada temperatur kamar.

Formaldehida

Mekanisme kerja :

Melalui ikatan dengan gugus imino dan amino dari protein

mikroorganisme.

Keunggulan dibanding etilen oksid :

Lebih murah

Kurang meninggalkan residu

Tidak mudah meledak

Kurang toksik


4. Sterilisasi dengan radiasi ion

Digunakan sinar beta (sinar elektron) dari generator Van De Graaf. Atau sinar gamma. Sterilisasi dingin karena dilakukan pada temperatur kamar. Kemampuan daya tembus baik penyebaran energi homogen.

5. Sterilisasi dengan penyaringan/filtrasi

Digunakan untuk mensterilkan udara atau bahan dalam bentuk cairan. Contohnya adalah filter udara seperti HEPA ( High Efficiency

Particulated Air) untuk menghindari terjadinya kontaminasi atau infeksi

silang.

HEPA Filter

6. Sterilisasi dengan radiasi ultraviolet (UV)

Efek maksimum : pada gel. radiasi 265 nm Aplikasi :

Untuk sterilisasi ruangan/udara.

Inaktivasi mikroorganisme pada permukaan bahan.

Produk yang tidak stabil, dan sulit disterilkan dengan cara

konvensional.


INDIKATOR STERILISASI

Indikator Fisik/Mekanik

Indikator Kimia

Indikator Biologis

INDIKATOR FISIK/MEKANIK

Bagian dari mesin sterilisasi.

Biasanya menunjukkan bahwa alat berfungsi baik.

Contoh : Pada alat high prevacum autoclave yang menunjukkan hub. T dan P

konstan proses sterilisasi sempurna.

INDIKATOR KIMIA

Yaitu indikator dari bahan kimia yang pada temperatur tertentu ( 121OC) akan

berubah warna.

Contoh : autoclave tape, wipack med.


INDIKATOR BIOLOGIS

Menggunakan bakteri thermophilus dan kertas pH/pH meter.

Kontrol Kualitas

Selain dengan penggunaan indikator, kontrol kualitas sterilisasi juga dapat dilakukan

dengan kalibrasi alat secara periodik dan ditetapkan standar deviasinya.


BAB III

INOKULASI MIKROORGANISME

INOKULASI=KULTUR=BIAK=TUMBUH

Inokulasi adalah penempatan sesuatu dengan tujuan penumbuhan atau reproduksi.

Inokulasi mikroorganisme penempatan mikroorganisme dari suatu suspensi ke media steril agar dapat tumbuh dan berkembangbiak.

Media steril yang dimaksud disini media padat dan cair dalam petri/tabung. Ketika kita akan mengamati dan mempelajari flora bakteri pada tubuh, tanah,

air, makanan dan lingkungan sekitar kita lainnya, kita akan menemukan

populasi mikroorganisme campuran. Mikroorganisme jarang ditemukan dalam

satu spesies.

Hal yang penting dilakukan agar dapat mempelajari karakteristik kultur, morfologi dan fisiologi satu spesies mikroorganisme adalah pemisahan

mikroorganisme tersebut dari spesies lainnya. Dengan kata lain, kita harus

membuat suatu biakan murni dari mikroorganisme tersebut.

Pure culture = biakan murni.

BIAKAN MURNI

Bagaimana memperoleh suatu biakan murni teknik aseptik. Tidak tercemar dari luar biasanya dari udara. Media yang digunakan harus steril. Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan

menggunakan bahan cair atau bahan padat.


TEKNIK ASEPTIK

Teknik aseptik mengacu pada praktek yang dilakukan oleh para ahli mikrobiologi untuk mematikan seluruh mikroorganisme yang dapat

mencemari media, sel/jaringan hidup dan suatu proses pemindahan

mikroorganisme pada biakan.

Transfer atau pemindahan meliputi pemindahan suatu mikroorganisme dari koloninya pada media padat ke media cair atau

inokulasi mikroorganisme pada suatu media padat maupun cair

(Dibutuhkan saat memindahkan mikroorganisme dari suspensi

mikroorganisme ke media steril).

Suatu proses aseptik dikatakan sukses apabila tidak terdapat mikroorganisme pencemar yang dapat mencemari proses.


Prosedur Umum

Desinfeksi area kerja.o Area kerja harus didesinfeksi terlebih dahulu untuk mengurangi

kontaminan yang dapat mencemari proses aseptik.

Ose dan jarum harus steril. o Cara sterilisasi adalah dengan cara fiksasi dengan panas/pemijaran

menggunakan lampu bunsen.

o Pemanasan dapat mematikan mikoorganisme pencemar.

Pemijaran/pemanasan pada tabung.o Pada mulut tabung terkandung mikroorganisme yang dapat mencemari

biakan. Oleh karena itu, lakukan pemijaran/pemanasan pada mulut

tabung menggunakan lampu bunsen.

Desinfeksi akhir.o Setelah melakukan suatu proses aseptik, lakukan desinfeksi akhir untuk

mematikan mikroorganisme yang kemungkinan tertinggal.

Teknik Biakan Murni

Teknik Penggoresan Agar (Streak plate method)

Teknik Agar Tuang (Pour plate method)

Teknik Agar Sebar

Teknik Tusukan gelatin

Media Biakan

Media biakan yang digunakan pada inokulasi :

Media pembiakan dasar

Media pembiakan penyubur

Media pembiakan selektif


Media Pembiakan Dasar

Adalah media pembiakan sederhana yang mengandung zat-zat yang umum diperlukan oleh sebagian besar mikroorganisme dan dipakai sebagai komponen

dasar dalam pembuatan media pembiakan lainnya.

Mengandung pepton dan ekstrak daging.

Media Pembiakan Penyubur

Komponen sama seperti pada media pembiakan dasar, ditambah darah, ekstrak hati, dsbnya.

Zat tambahan untuk mempersubur pertumbuhan mikroorganisme tertentu, yang pada media pertumbuhan dasar tidak dapat tumbuh dengan baik.

Media Pembiakan Selektif

Menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak dicari. Berdasarkan konsistensi :

Bentuk cair broth

Bentuk padat (lempeng, miring, tegak)

BIAKAN MURNI

Dengan biakan murni nantinya akan diperoleh koloni terpisah yang mengandung satu macam mikroorganisme dalam satu petri.

Hasil akhir koloni yang terpisah.

Urutan : Suspensi mikroorganisme campuran biakan murni isolasi (satu macam mikroorganisme).

Setelah mendapatkan biakan murni, lakukan proses identifikasi mikroorganisme.


STREAK PLATE METHOD

Dikenal dengan teknik penggoresan agar. Metode ini hemat waktu dan ekonomis, hanya saja membutuhkan keterampilan

menggores yang dapat diperoleh dengan pengalaman.

Penggoresan yang baik nantinya akan dapat menghasilkan isolat yang baik. Untuk mendapatkan koloni terpisah pada saat penggoresan, perhatikan :

o Dinginkan ose setelah dipijarkan.

Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan lempengan agar.

Ose yang panas akan mematikan mikroorganisme sehingga tidak terjadi pertumbuhan pada bekas goresan.

o Ose disentuhkan pada lempengan agar.

Pada saat menggores, ose dibuat meluncur diatas permukaan lempengan agar.

Agar jangan sampai terluka, karena agar yang luka mengganggu pertumbuhan

mikroorganisme sehingga nantinya akan sulit memperoleh koloni

terpisah.

o Pijarkan ose setelah menggores satu daerah.

Pemijaran ose mematikan mikroorganisme yang melekat pada mata ose dan mencegah pencemaran pada penggoresan daerah

berikutnya.

o Gunakan tutup cawan petri untuk melindungi permukaan agar dari

pencemaran.

o Balikkan lempengan agar untuk mencegah air kondensasi jatuh ke atas

permukaan agar.

o Apabila air kondensasi jatuh ke koloni, akan menghancurkan koloni dan

seluruh teknik biakan yang telah dilakukan.


Beberapa teknik goresan :

Goresan T : Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan membentuk huruf T pada

bagian luar dasar petri.

Inokulasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah

II.

Pijarkan ose dan biarkan dingin kembali. Ulangi prosedur 3-5 untuk menggores daerah III. Pijarkan ose.

Goresan Kuadran : Sama dengan goresan T, hanya saja lempengan agar dibagi 4.

Goresan Radian Goresan dimulai di bagian pinggir lempengan. Pijarkan ose dan dinginkan kembali. Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari bagian

pinggir lempengan.

Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya.

Pijarkan ose. Goresan Sinambung

Ambil satu mata ose suspensi dan gores secara sinambung pada setengah permukaan lempengan agar.

Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar.


Contoh hasil penggoresan

POUR PLATE METHOD

Dikenal dengan teknik agar tuang.

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran.

Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel dalam tabung.

Pada metode ini, dilakukan pengenceran satu mata loop suspensi ke dalam tiga tabung, sehingga akan diperoleh lempengan dengan jumlah bakteri yang

optimum untuk isolasi.

Teknik ini lebih mudah karena tidak memerlukan keterampilan seperti pada teknik penggoresan.


TEKNIK AGAR SEBAR

Langkah pertama sama dengan POUR PLATE METHOD.

Kemudian media agar yang telah ditanami oleh mikroorganisme disebari oleh cairan dibantu dengan suatu alat penyebar yang telah disterilkan.

Alat penyebar terbuat dari gelas.

Cara :

Pipet 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir ke atas permukaan agar.

Cairan disebarkan dengan alat penyebar.

Sterilisasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan ke alkohol dipanaskan.

Setelah itu penyebar didinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan untuk menyebarkan cairan di permukaan agar.

Penyebaran dilakukan dengan memutar petri.

TEKNIK TUSUKAN

Menggunakan jarum (needle), bukan ose.

Jarum (needle) ditusukkan hingga ke dasar media.

Sterilisasi jarum (needle) sama dengan ose.

Media gelatin.


Cara Pemeriksaan Pertumbuhan Mikroorganisme

Media Pembiakan Cair

Media menjadi keruh merata (homogen) atau tampak granuler melekat pada dinding dan dasar tabung.

Permukaan cairan berbentuk membran.

Apakah pertumbuhan menghasilkan gas atau tidak.

Apakah pertumbuhan menimbulkan bau yang khas.

KOLONI

Sifat Koloni

Adalah sifat yang berhubungan dengan bentuk, susunan, permukaan, pengkilatan dsb.

Dapat diamati tanpa mikroskop makroskopi.

Media Pembiakan Padat

Pada semua media pembiakan padat umumnya, baik yang berbentuk lempeng maupun miring perlu diperhatikan sifat-sifat koloni:

Bentuk koloni koloni bulat, memanjang, tepi rata, tidak rata.

Ukuran koloni menurut diameter rata-rata, ukuran koloni berbeda-beda pada berbagai jenis, selebar titik hingga menutupi

permukaan media.

Kenaikan permukaan koloni yang rata dengan permukaan media, ada koloni yang timbul diatas permukaan media.


Sifat-sifat Umum Koloni

Halus kasarnya permukaan koloni yang permukaannya halus, ada juga yang kasar.

Wajah permukaan koloni yang permukaannya mengkilap, ada yang kusam.

Warna keputihan atau kekuning-kuningan, kemerah-merahan, coklat, jingga, biru, hijau, ungu.

Kepekatan koloni lunak seperti lendir, lunak seperti mentega, ada juga yang keras dan kering.

Bau koloni ada koloni yang berbau khas dan ada yang tidak berbau sama sekali.

Gambar contoh koloni baik pada media cair (broth), agar, maupun gelatin


TEKNIK SUBKULTUR

Langkah selanjutnya setelah mendapatkan biakan murni adalah memindahkan mikroorganisme dari cawan petri ke tabing berisi nutrient

broth atau nutrient agar (subkultur). Hasil dari subkultur kemudian

diinkubasi selama 24 jam. Pewarnaan mikroorganisme dilakukan untuk

memeriksa apakah sudah terbentuk biakan yang benar-benar murni atau

belum.

Ketika memindahkan mikroorganisme dari suatu cawan petri yang mengandung media, sebaiknya menggunakan jarum yang ditusukkan.

Jarum ditusukkan pada bagian tengah koloni untuk mendapatkan koloni

yang benar-benar mengandung satu macam mikroorganisme saja.


BAB IV

PEWARNAAN BAKTERI

BAKTERI

Hanya dapat dilihat dengan mikroskop mikroskopi.

Satuan untuk ukuran bakteri mikron.

Bakteri rata-rata berukuran lebar 0,5-1 mikron dan panjang hingga 10 mikron.

1 mikron = 10-3 mm.

BENTUK BAKTERI

Bulat/bola :

Monococcus

e.g. Neisseria gonorrhoeae (penyebab kencing nanah).

Diplococcus

e.g. Diplococcus pneumoniae (penyebab penyakit pneumonia).

Sarkina.

Streptococcus.

Staphylococcus.

Batang (Basil)

Basil tunggal

e.g. Salmonella typhi (penyebab penyakit tifus).

Diplobasil

Streptobasil

e.g. Bacillus anthracis (penyebab penyakit antraks).


Melilit

Spiral; sel tubuh umumnya kaku.

e.g. Spirillum.

Vibrio; seperti koma.

e.g. Vibrio cholerae (penyebab penyakit kolera).

Spirochaeta; dapat memanjang dan memendek karena sifatnya yang sangat lentur.

PEWARNAAN BAKTERI

Tubuh bakteri tidak mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga sukar diamati walau sudah menggunakan mikroskop.

Untuk melihat bakteri dengan jelas tubuhnya diisi dengan zat warna PEWARNAAN BAKTERI.

Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras tubuh bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan

o Sudah dilakukan sejak pertengahan abad ke-19, oleh Louis Pasteur dan Robert Koch.

o Ada 2 macam zat warna yang sering dipakai:

Zat warna bersifat asam : komponen warnanya adalah anion (-). Zat warna bersifat alkali : komponen warnanya adalah kation (+).

Muatan negatif banyak ditemukan pada dinding sel, membran sel, dan sitoplasma muatan positif pada zat warna alkali akan berikatan dengan muatan negatif dalam sel bakteri akan lebih jelas terlihat.

Zat warna asam digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif.

Pewarnaan Positif :

Yang diwarnai adalah bakteri. Bisa menggunakan zat warna asam dan alkali

Pewarnaan Negatif

Beberapa bakteri sukar diwarnai dengan zat warna alkali lakukan pewarnaan negatif. Latar belakang di sekeliling bakteri diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan bakteri yang tidak

berwarna.


Cara bakteri dicampur dengan nigrosin gesekkan di object glass zat warna akan mewarnai lingkungan sekitar bakteri, bukan bakteri dengan mikroskop, bakteri akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam.

Pada metode ini preparat tidak dipanaskan, tetapi dikeringkan di udara.

Ciri pewarnaan negatif :

Menggunakan zat warna asam (bermuatan negatif). Penggunaan zat warna asam menyebabkan zat warna tidak akan mewarnai permukaan sel yang

mempunyai muatan negatif.

Pewarnaan ini bukan merupakan pewarnaan sel bakteri karena sel bakteri tetap tidak berwarna setelah penambahan zat warna.

Larutan zat warna yang digunakan larutan encer (


Misal : kristal violet, methylen blue, safranin (zat warna alkali), nigrosin, merah kongo (zat warna asam).

Pewarnaan Khusus

Untuk melihat salah satu struktur sel.

Pewarnaan Kapsel

Pewarnaan Spora

Pewarnaan Flagela

Pewarnaan Badan Inklusi

Pewarnaan Diferensial

Digunakan lebih dari satu zat warna.

Adakalanya menggunakan pelarut yang sama (satu larutan mengandung dua atau lebih zat warna).

Adakalanya menggunakan pelarut yang berbeda.

Contoh : pewarnaan Gram, pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen).

Sediaan (preparat) untuk proses pewarnaan

Dibuat ulasan bakteri diatas object glass

Jumlah bakteri dalam ulasan jangan terlalu padat dan jangan terlalu encer.

Apabila terlalu padat, akan terlihat menumpuk di bawah mikroskop. Apabila terlalu cair, tidak akan terlihat dibawah mikroskop.

Keringkan di udara sebentar.

Fiksasi melewatkan preparat diatas api.

Fiksasi berguna untuk melekatkan bakteri pada object glass dan mematikan bakteri.

Proses pewarnaan.


PEWARNAAN KHUSUS

Pewarnaan Kapsel

Kapsel lapisan yang melekat di luar dinding sel yang terdiri dari polisakarida atau polipeptida.

Fungsi kapsel melindungi bakteri terhadap sel fagosit.

Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, S.mutans.

Lapisan kapsel tebal, sukar diwarnai Jadi digunakan pewarnaan negatif.

Pada pewarnaan negatif latar belakang diwarnai zat warna asam, sedangkan bakteri diwarnai dengan zat warna alkali. Kapsel tidak menyerap warna sehingga

terlihat sebagai lapisan tembus-terang dengan latar belakang yang berwarna.

Pewarnaan Spora

Spora pada bakteri struktur tahan panas dan bahan kimia.

Spora dibentuk oleh bakteri pada saat keadaan/ lingkungan tidak menguntungkan.

Bacillus, Clostridium.

Lapisan luar spora penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sukar diwarnai.

Spora bakteri diwarnai dengan cara dipanaskan.

Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna dapat masuk.

Pewarnaan Flagela

Flagela tipis dan panjang sukar dilihat di bawah mikroskop cahaya.

Flagela pada bakteri sebagai alat gerak.

Pewarnaan menggunakan mordant untuk membengkakkan flagela.

Pewarnaan Badan Inklusi

Beberapa bakteri mensintesis badan inklusi atau granula yang disimpan dalam sitoplasma.


Granula cadangan bahan makanan dan merupakan sumber karbon dan energi yang siap pakai.

Dalam sel bakteri badan inklusi berupa granula metakromatik, asam poli-beta-hidroksibutirat, pati dan glikogen.

PEWARNAAN DIFERENSIAL

Pewarnaan Gram

Dilakukan pertama kali oleh Christian Gram.

Paling banyak digunakan di laboratorium.

Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif dan Gram-negatif.

Bakteri Gram-positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal violet-iodium tetap bertahan walaupun sudah diberi larutan pemucat.

Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan menjadi warna merah.

Memberikan hasil baik bila digunakan biakan segar berusia 24-48 jam.

Biakan segar dinding sel belum mengalami kerusakan.

Biakan tua dinding sel sudah mulai mengalami kerusakan zat warna dapat keluar saat diberikan larutan.

Gram-positif Gram-negatif

Kristal violet Ungu Ungu

Larutan mordant

(lugol)

Ungu Ungu

Larutan pemucat

(aseton, alkohol)

Ungu Tidak

berwarna

Safranin Ungu Merah


Perbedaan pada tahapan pewarnaan Gram disebabkan oleh :

Perbedaan struktur dinding sel bakteri Gram-positif dan Gram-negatif

Bakteri Gram-positif : dinding sel mengandung peptidoglikan.

Bakteri Gram-negatif : dinding sel mengandung lipida.

Pada bakteri Gram-negatif, lipida akan larut saat diberikan larutan pemucat (aseton, alkohol).

Kompleks kristal violet-iodium yang terbentuk pada dinding sel juga ikut larut.

Safranin. Pada bakteri Gram-negatif, penambahan safranin menyebabkan sel bakteri berwarna merah.

Fungsi safranin sebagai pembeda (kontras) terhadap warna kristal violet-iodium.

Larutan mordant meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat.

Setelah penambahan larutan mordant zat warna lebih sulit dilarutkan sehingga zat warna akan lebih jelas terlihat.

Larutan mordant lugol.

Tanpa penambahan larutan lugol zat warna kristal violet-iodium akan larut sewaktu penambahan larutan pemucat, sehingga bakteri Gram-positif tidak akan

berwarna ungu.

TABEL PEWARNAAN DIFERENSIAL (pewarnaan Gram)

No Bakteri Gram-positif Bakteri Gram-negatif

1 Sensitif terhadap penisilin Sensitif terhadap streptomisin

2 Resisten terhadap alkali;tidak larut

oleh 1% KOH

Sensitif terhadap alkali;larut oleh

1% KOH

3 Biasanya coccus atau basil

pembentuk spora

Biasanya basil bukan pembentuk

spora

4 Dapat bersifat tahan asam Biasanya tidak pernah tahan

asam


Pewarnaan Ziehl-Neelsen

Untuk memisahkan bakteri menjadi kelompok tahan asam dan tidak tahan asam.

TABEL PEWARNAAN DIFERENSIAL (pewarnaan Ziehl-Neelsen)

Zat warna pertama karbol fuksin.

Pada bakteri yang tidak tahan asam, setelah diberi larutan pemucat karbol fuksin akan melarut dengan cepat sel bakteri tidak berwarna.

Setelah penambahan zat warna kedua (biru metilen) bakteri tidak tahan asam berwarna biru.

Mycobacterium dan Nocardia bakteri tahan asam.

Memiliki keistimewaan karena dinding sel mengandung lipida yang terlihat sebagai lapisan lilin.

Kandungan lipida mencapai 60% dari berat dinding sel sukar diwarnai karena zat warna tidak bisa menembus lapisan lilin.

Oleh karena itu, digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri yang mengandung lipida.

Tahan Asam Tidak Tahan Asam

Karbol fuksin Merah Merah

Larutan pemucat

( mengandung asam

dan alkohol)

Merah Tidak berwarna/pucat

Biru metilen Merah Biru


BAB V

UJI IDENTIFIKASI BAKTERI

Media untuk uji identifikasi bakteri Endo Agar

Brilliant Green Agar

Mac Conkey Agar

China-Blue Lactose Agar

Manitol Salt Agar

Agar Darah

Litmus Milk

Media selektif : mengandung paling sedikit 1 bahan yg menghambat perkembangan bakteri yg tidak diinginkan dan membolehkan perkembangbiakkan bakteri tertentu yg ingin diisolasi.

Contoh : antibiotika (streptomycin, penisilin), kristal violet dsb.

Media diferensial : berbagai kelompok bakteri dapat tumbuh pada media ini. Kelompok bakteri dapat dibedakan berdasarkan perubahan pada media biakan atau penampilan

koloninya.

ENDO AGAR

Mengandung : laktosa, Na-sulfit Sifat pertumbuhan koloni :

Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni yang tembus terang, tidak berwarna dan dikelilingi oleh media yang berwarna merah muda.

Bakteri yang memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni yang berwarna merah metalik dan dikelilingi oleh media yang berwarna kemerahan.


TABEL ENDO AGAR

BRILLIANT GREEN AGAR

Mengandung gula laktosa dan sukrosa.

Zat warna brilliant green menghambat pertumbuhan E. coli, Proteus dan Pseudomonas.

Media ini banyak digunakan untuk isolasi dan identifikasi Salmonella dari tinja dan bahan makanan.

Indikator : merah fenol merah (basa) , kuning (asam).

Sifat pertumbuhan koloni :

Salmonella Koloni berwarna merah muda dikelilingi oleh media berwarna merah.

Proteus Akan terlihat sebagai koloni merah tanpa penyebaran koloni.

Pseudomonas Koloni kecil berwarna merah dengan permukaan yang menjorok ke dalam.

Bakteri yang memfermentasikan laktosa atau sukrosa Pertumbuhan kelompok bakteri ini juga dihambat. Akan tampak sebagai koloni hijau-kuning dikelilingi oleh

media yang berwarna hijau-kuning.

Koloni Bakteri

Tidak berwarna, bening Laktose negatif

(Salmonella, Shigella)

Merah metalik Laktose positif (E.coli)

Merah muda Enterobacter, Klebsiella,

Citrobacter


MAC CONKEY AGAR

Mengandung laktosa, garam empedu.

Media ini menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif.

Koloni dari bakteri Gram-negatif yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu.

Endapan garam empedu karena penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam empedu.

Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen tidak memperlihatkan perubahan pada media. Warna koloni = warna media.

TABEL MAC CONKEY AGAR

CHINA-BLUE LACTOSE AGAR

Untuk membedakan bakteri yang memfermentasikan dan tidak memfermentasikan laktosa.

Tidak ada bahan yang menghambat pertumbuhan bakteri. Bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dapat tumbuh pada media ini. Penguraian laktosa menjadi asam akan terlihat karena adanya indikator china blue

sehingga warna akan menjadi biru tua.

Koloni Bakteri

Serupa media Salmonella, Shigella

Merah, dikelilingi oleh

zona keruh

E. coli

Merah muda Enterobacter, Klebsiella

Kecil dan tidak terang

tembus

Enterococcus,

Staphylococcus


TABEL CHINA-BLUE LACTOSE AGAR

Koloni Bakteri

Biru tua dikelilingi oleh zona biru E. coli

Putih, kadang-kadang dikelilingi

zona bening

Laktose-negatif

Biru hijau dan tidak terang tembus Staphylococcus

Biru muda dan tidak terang tembus Enterococcus

MANITOL SALT AGAR

Mengandung NaCl 7.5%, manitol. Digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen dan yang tidak

patogen.

Indikator untuk melihat adanya pembentukan asam merah fenol. Zona warna merah disebabkan oleh manitol yang tidak terfermentasikan. Zona warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam.

Misal : S. aureus membentuk zona kuning patogen. S. epidermidis membentuk zona merah tidak patogen.

AGAR DARAH

Untuk menumbuhkan bakteri yang sulit untuk dibiakkan dan untuk membedakan kelompok bakteri yang melisis atau tidak melisiskan butir darah merah.

Mengandung 5% darah domba. Lisis butir darah merah terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni. Jenis-jenis hemolisis :

o Beta-hemolisis : lisis sempurna, wilayah benar-benar jernih.

o Alpha-hemolisis : proses lisis tidak sempurna, media berwarna kehijauan.


o Gamma-hemolisis : bakteri tidak mampu melisiskan butir darah merah dan tidak

menyebabkan perubahan nyata pada media.

o Proses hemolisis disebabkan oleh enzim yang dilepaskan bakteri.

LITMUS MILK

Mengandung skim milk dan indikator litmus. Reaksi yang terjadi :

o Asam : Media berubah warna menjadi merah muda.

o Basa : Media berubah warna menjadi biru atau ungu.

o Reduksi : Media berubah warna menjadi putih.

o Koagulasi : Media akan terlihat padat karena koagulasi protein pada keadaan asam.

o Peptonisasi : Media berubah warna menjadi biru.

o Pembentukan Gas : Terjadi penguraian laktosa menjadi asam dan gas.

Contoh media uji identifikasi bakteri

Isolasi dan identifikasi mikroorganisme penyebab penyakit ataupun keracunan

harus dilaksanakan dengan cepat dan tepat sehingga pengobatan dapat diberikan

sedini mungkin. Morfologi mikroorganisme seperti bentuk, ukuran dan penataan

belum cukup untuk melakukan identifikasi suatu mikroorganisme. Oleh karena itu,

diperlukan teknik lain dalam uji identifikasi mikroorganisme, misalnya sifat biakan


dan uji biokimia. Mikroorganisme yang akan diisolasi berasal dari biakan murni.

Setelah biakan murni diperoleh, serangkaian uji dilakukan untuk memperoleh sifat

biokimiawi mikroorganisme.

Acuan yang digunakan dalam identifikasi bakteri pada saat ini adalah

Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. Identifikasi Bergeys mendasarkan pada

morfologi, sifat faal dan sifat biokimiawi bakteri. Adapun tahapan dalam isolasi dan

identifikasi bakteri dari suatu suspensi sebagai berikut :

1. Pembiakan ; untuk mengetahui sifat biakan. Suspensi bakteri digoreskan pada

agar lempengan, agar miring atau media cair. Koloni yang terbentuk harus

diperhatikan untuk mengetahui sifat pertumbuhan bakteri pada biakan.

2. Pewarnaan

Pewarnaan Gram dibuat untuk mengetahui sifat Gram serta morfologi bakteri.

Jika diperoleh suatu bakteri berbentuk batang Gram-positif, harus ditentukan

ada dan tidak adanya endospora serta letaknya. Bakteri berbentuk batang

Gram-negatif jarang menghasilkan spora. Jika bakteri yang ditemukan

berbentuk batang, Gram-positif dan tidak membentuk spora, maka perlu

dilakukan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Apabila diperlukan, pewarnaan khusus

dapat dilakukan.

3. Uji Biokimia

Setelah diperoleh koloni yang terpisah pada biakan, dapat dilakukan uji

biokimia. Uji biokimia memerlukan berbagai media, maka perlu dibuat biakan

harian (working culture) dari koloni terpisah tersebut.


Penggunaan zat hara pada media (zat pati, lemak, protein, asam nukleat, asam

amino, sakarida) tergantung aktivitas metabolisme bakteri. Hasil sampingan dari

metabolisme tersebut dapat digunakan untuk identifikasi bakteri.

1. Uji Fermentasi Karbohidrat

Hasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat bakteri, media

biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan antara lain suhu dan pH.

Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasikan

dan difermentasikan oleh bakteri. Pembentukan asam hasil fermentasi dapat

diketahui dengan cara pemberian indikator ke dalam media.

Media : Kaldu karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa).

Media digunakan untuk uji pembentukan asam dan gas hasil fermentasi.

Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung Smith

atau Durham.

Tabung Smith digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus

ditentukan.

Tabung Durham digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan

tidak perlu diketahui. Bila terbentuk gas, gas masuk ke dalam tabung

Durham dan mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai

gelembung udara yang terperangkap dalam tabung Durham.

Asam hasil fermentasi menyebabkan penurunan pH. Indikator yang

digunakan : merah fenol dan bromcresol purple. Pembentukan asam

ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning.


2. Uji Metil Merah

Uji metil merah sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang

menempati saluran pencernaan.

Pada uji fermentasi menggunakan tabung Durham, hasil produksi

fermentasi tidak diketahui.

Uji metil merah digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam

campuran dengan menggunakan media : MR-VP (Methyl Red-Voges

Proskauer).

Fermentasi asam campuran ditentukan dengan menumbuhkan bakteri dalam

kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan indikator metil merah

ke dalam kaldu setelah masa inkubasi. Indikator berwarna merah pada pH

4.4 dan berwarna kuning pada pH 6.2.

Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna

merah karena terjadi penurunan pH pada kaldu biakan. Bila tidak terjadi

fermentasi asam campuran maka kaldu biakan akan menjadi berwarna

kuning.

3. Uji Voges-Proskauer

Uji ini digunakan untuk identifikasi bakteri yang memfermentasikan

karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol.

Asetoin (asetilmetilkarbinol) adalah senyawa pendahulu dari 2,3-

butanadiol.


Penambahan KOH dan alphanaphtol dapat menentukan adanya asetoin.

Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna

kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan

penambahan larutan alphanaphtol.

Media yang digunakan : MR-VP.

4. Respirasi Karbohidrat

Bakteri menggunakan glukosa sebagai sumber energi dengan

mengoksidasikannya menjadi piruvat melalui glikolisis. Piruvat masuk ke dalam

siklus Krebs. Dalam siklus Krebs, terjadi oksidasi menghasilkan proton dan

elektron. Proton dan elektron masuk ke dalam sistem transport elektron untuk

menghasilkan ATP. Proton dan elektron akan ditangkap oleh akseptor elektron,

misalnya oksigen atau nitrat. Bila akseptor elektron terakhir berupa oksigen,

prosesnya disebut respirasi aerobik. Bila akseptor elektron terakhir berupa

nitrat atau molekul inorganik lainnya, prosesnya disebut respirasi anaerobik.

a. Uji Oksidase

o Uji ini berguna untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang

ditemukan pada bakteri tertentu.

o Uji ini berguna dalam identifikasi bakteri patogen seperti Neisseria

gonorrhoea dan Pseudomonas aeruginosa.

o Bila koloni bakteri yang bersifat oksidase-positif diberi reagen oksidase

(dimetil-p-fenillendiamin oksalat), maka warna koloni berubah menjadi

hitam. Perubahan warna ini disebabkan oleh oksidase sitokrom yang


mengoksidasi larutan reagen. Bila tidak terjadi proses oksidasi, misalnya

terjadi reaksi reduksi, tidak akan terjadi perubahan warna pada koloni.

b. Uji Katalase

o Pada bakteri berbentuk coccus, uji katalase berguna untuk membedakan

Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Staphylococcus bersifat

katalase-positif, sedangkan kelompok Streptococcus bersifat katalase-

negatif.

o Uji katalase menggunakan larutan H2O2. Pada bakteri bersifat katalase-

positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni. Reaksi :

22/1222 OOHOH

Katalase Gelembung O2

o H2O2 bersifat toksik terhadap sel karena menginaktivasikan enzim dalam

sel.

o H2O2 terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga bakteri yang tumbuh

pada lingkungan aerob harus menguraikan zat toksik tersebut.

c. Uji Reduksi Nitrat

o Nitrat digunakan oleh beberapa bakteri sebagai akseptor elektron terakhir.

o Nitrat (NO3-) direduksi menjadi nitrit (NO2

-) kemudian menjadi N2.

o Kemampuan mereduksikan nitrat digunakan sebagai ciri dalam identifikasi

bakteri. E. coli mereduksi nitrat menjadi nitrit, sedangkan P. aeruginosa

mereduksi mereduksi nitrat hingga menjadi N2.


o Uji reduksi nitrat menggunakan kaldu nutrien yang mengandung KNO3 dan

tabung Durham. Perhatikan apakah terbentuk gas pada tabung serta nitrit

pada media biakan.

o Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2

dan CO2.

o Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat, sedangkan CO2 berasal dari

siklus Krebs.

o Penambahan asam sulfamat dalam media biakan yang mengandung nitrit

akan menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai hasil reduksi

(NO2-) menjadi N2.

5. Uji Indol

Gugus indol merupakan bagian dari asam amino triptofan. Dalam media

biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lain

dari molekul triptofan digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara

bakteri.

Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan

penambahan reagens (Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme) yang

mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Reagens akan bereaksi

dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan

berwarna merah pada permukaan media biakan.

Media yang digunakan bersifat semipadat, oleh karena itu dapat digunakan

juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat

pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media.


6. Uji IMViC

Uji untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan E. coli.

Uji IMViC terdiri dari Uji Indol-Metil Merah-Voges Proskauer-Citrat.

TABEL UJI IMViC

I M Vi C

E. coli + + - -

A. aerogenes - - + +

7. Uji Hidrogen Sulfida

Asam amino sistein dan metionin dihasilkan saat protein dihidrolisis untuk

memenuhi kebutuhan zat hara bakteri.

Sistein dan metionin mengandung sulfur.

Bakteri yang menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dalam media yang

kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk H2S. Fe++

dalam biakan bereaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang

berwarna hitam dan tidak larut dalam air.

8. Uji Dekarboksilase Lisin

Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu

molekul organik.

Proses dekarboksilasi asam amino menghasilkan CO2.


Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan bakteri

dalam biakan yang mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan

(glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH. Indikator yang

digunakan adalah brom cresol purple (BCP).

Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH

media biakan dan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning.

Dalam suasana asam, proses dekarboksilasi lisin dapat berlangsung sehingga

terjadi pembentukan amin yang menetralisasi suasana asam.

Proses netralisasi asam ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning

menjadi ungu seperti sebelumnya.

Perubahan warna ungu ini menunjukkan bahwa lisin mengalami

dekarboksilasi.

Uji dekarboksilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalam

pencirian bakteri, terutama yang menempati saluran pencernaan.

9. Uji Deaminase Fenilalanin

Deaminase mengkatalisasi pemindahan gugus amino (NH2) dari asam amino

dan molekul lainnya yang mengandung NH.

Asam organik yang dihasilkan dapat digunakan bakteri untuk biosintesis.

Proses deaminasi menetralisasi amin yang menghambat pertumbuhan.

Uji deaminasi fenilalanin dapat digunakan dalam identifikasi bakteri saluran

pencernaan.


Proses deaminasi fenilalanin menghasilkan asam fenilpiruvat. Reaksi asam

fenilpiruvat dengan ferri klorida (FeCl3) menghasilkan senyawa berwarna

hijau.

Aktivitas enzim deaminase fenilalanin ditentukan dengan cara menumbuhkan

bakteri dalam media biakan yang mengandung fenilalanin dan menambahkan

beberapa tetes larutan FeCl3. Warna hijau setelah penambahan reagens

menunjukkan bahwa fenilalanin telah dideaminasikan.

10. Uji Sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat

sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.

Digunakan media sitrat-Koser (cair) atau sitrat-Simmon (padat).

Sitrat-Simmon mengandung Na sitrat (sumber karbon), NH4+ sebagai sumber

N dan biru bromtimol sebagai indikator.

Pada media sitrat-Koser, tidak terkandung indikator.

Bila bakteri mampu menggunakan sitrat yang terkandung pada media sitrat-

Simmon, maka asam akan dihilangkan dari media biakan, terjadi peningkatan

pH dan mengubah warna media dari hijau menjadi biru.

Pada media sitrat-Koser, kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh

kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.


BAB VI

UJI MIKROORGANISME KUANTITATIF

Uji Kuantitatif Bakteri

Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara, antara lain :

Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count); dihitung semua bakteri

baik yang hidup maupun yang mati.

Jumlah bakteri yang hidup (viable count); dihitung bakteri yang hidup saja.

A. Perhitungan Jumlah Bakteri secara Keseluruhan

a. Menghitung langsung secara mikroskopik

Digunakan object glass khusus (Petroff-Hauser) berbentuk persegi. Jumlah

cairan yang terdapat antara object glass dan kaca penutup memiliki volume

tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam persegi juga tertentu.

Hanya cairan yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi yang dapat

menggunakan cara ini. Perhitungan langsung dengan menggunakan mata

atau alat bantu hitung.

b. Menghitung dengan cara kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Cahaya yang

diabsorbsi ~ banyaknya sel bakteri.


B. Perhitungan Jumlah Bakteri Hidup

1. standard plate count/hitungan cawan/angka lempeng total.

Setiap satu sel bakteri dalam suspensi diasumsikan akan tumbuh menjadi satu

koloni setelah diinkubasikan dalam media dan lingkungan yang sesuai.

Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk

menghitung jumlah bakteri karena :

1. Hanya sel bakteri yang masih hidup yang dihitung.

2. Beberapa jenis bakteri dapat dihitung sekaligus.

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri karena koloni

yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel bakteri dengan

penampakan pertumbuhan spesifik.

Kelemahan metode hitungan cawan :

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel bakteri yang

sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk

satu koloni.

2. Media dan kondisi yang berbeda menghasilkan nilai yang berbeda.

3. Bakteri yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan

membentuk koloni yang jelas.

4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga

pertumbuhan koloni dapat dihitung.


Metode hitungan cawan :

Metode Tuang (Pour Plate)

Cara :

1. Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml dipipet ke dalam cawan

petri.

2. Kemudian ke dalam cawan petri tersebut, masukkan agar cair yang telah

didinginkan hingga 500C 15 ml.

3. Cawan petri digerakkan dengan gerakan melingkar untuk menyebarkan sel-sel

bakteri secara merata.

4. Setelah agar memadat, cawan petri tersebut diinkubasi dalam inkubator dengan

posisi terbalik.

5. Koloni yang terbentuk dihitung.

Metode Permukaan (Surface/Pour Plate)

Cara :

1. Agar steril dituang ke dalam cawan petri steril, biarkan membeku.

2. Setelah membeku sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah

diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, ratakan.

3. Inkubasi.

4. Hitung koloni yang terbentuk.


Cara menghitung koloni :

Contoh. Penetapan jumlah bakteri dalam susu.

Pengenceran awal 1:10 (=10-1) dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu

ke dalam 9 ml larutan pengencer, dilanjutkan dengan pengenceran yang

lebih tinggi, misalnya hingga 10-5 atau 10-6, tergantung pada mutu susu.

Semakin tinggi jumlah bakteri yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi

pengenceran yang harus dilakukan.

Jika setelah inkubasi misal didapat 60 dan 64 koloni masing-masing pada

cawan duplo yang mengandung pengenceran 10-4, maka jumlah koloni

dapat dihitung sebagai berikut :

Faktor pengenceran (fp) = Pengenceran x jumlah yang ditumbuhkan.

= 10-4 x 1.0

= 10-4

Jumlah koloni = Jumlah koloni x 1/fp per cawan

= (60+64)/2 x 1/10-4

= 6.2 x 105


Gambar contoh pengenceran

Standar perhitungan (Standard Plate Count)

Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut :

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah

koloni antara 30 dan 300. Cawan dengan jumlah koloni yang tinggi

(>300 koloni) sulit untuk dihitung sehingga kemungkinan kesalahan

perhitungan sangat besar. Pengenceran membantu untuk memperoleh

perhitungan yang tepat, tetapi pengenceran yang terlalu tinggi akan

menghasilkan cawan dengan jumlah koloni yang rendah (


Data yang dilaporkan harus mengikuti peraturan sebagai berikut :

1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di

depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang ketiga sama

dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada

angka yang kedua.

Jumlah koloni per pengenceran Standard

Plate

Count

Ket

10-2 10-3 10-4

234 28 1 2.3 x 104 28 dan 1 300;10300

* TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung

2. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan angka kurang dari 30

koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang

dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan

besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan

dalam tanda kurung.



Plate

Count

Ket

10-2 10-3 10-4

16 1 0 3.0 x 106

(3.6 x 106)

Hit.

pengenceran

pada 10-4

TBUD 325 20 > 3.0 x 105

(3.3 x 105)

Hit.

pengenceran

pada 10-3


4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah

antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari

kedua pengenceran tersebut adalah lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan

rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya.

Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang

dilaporkan hanya hasil terkecil.


Plate

Count

Ket

10-2 10-3 10-4

293 41 4 3.5 x 104 Hit. rata-

ratanya

karena

41000/29300

= 1.4 (2)


5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil

harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun

salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat diantara 30 dan

300.


Plate

Count

Ket

10-2 10-3 10-4

175

208

16

17

1

0

1.9 x 104 Rata-rata dari

pengenceran

10-2

138

162

42

43

2

4


pengenceran

10-2 karena

perbandingan

antara

pengenceran

10-3 dan 10-2

adalah 2.8

(>2)

290

280

36

32

4

1


pengenceran

10-2 dan 10-3


karena

perbandingan

antara kedua

pengenceran

adalah 1.2

(300

(angka yang

lain


Uji kualitatif koliform terbagi atas uji penduga, uji penguat, uji lengkap. Uji

penduga merupakan uji kuantitatif koliform menggunakan metode MPN.

2. Metode MPN (Most Probable Number)

Dikenal dengan metode Jumlah Perkiraan Terdekat.

Dalam metode MPN digunakan media cair di dalam tabung reaksi, dimana

perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang

ditumbuhi oleh bakteri tertentu setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

Pengamatan tabung yang positif dilihat dari timbulnya kekeruhan, atau

terbentuknya gas dalam tabung Durham untuk bakteri pembentuk gas.

Pada umumnya untuk setiap pengenceran digunakan tiga atau lima seri tabung.

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah bakteri dalam

sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk sampel

berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1 : 10 dari sampel

tersebut.

Pengenceran harus lebih tinggi dibandingkan metode hitungan cawan.

Cara kerja :

1. Buat seri pengenceran (minimal 3).

2. Inokulasikan tiap pengenceran pada 3 atau 5 seri tabung media MPN, yaitu

Lactosa Broth kemudian dilanjutkan dengan media Brilliant Green Lactose

Bile Broth.

3. Inkubasi dan diamati hasilnya.

4. Uji positif jika keruh atau terbentuk gas.

5. Gas dapat terlihat dari adanya rongga kosong pada tabung Durham.


6. Sesuaikan dengan tabel MPN.

7. Hitung jumlah bakteri.

Rumus :

Jumlah bakteri = Indeks MPN x 1/Pengenceran tabung yang di tengah.

o Kombinasi : 3-2-1

o Nilai MPN dari tabel MPN 3 seri : 1.50

o MPN Bakteri = Indeks MPN x 1/pengenceran tabung yang di tengah

= 1.50 x 1/10-3

= 1.5 x 103

Uji Penduga

1. Buat seri media laktosa cair (Lactosa Broth) dengan suatu takaran air

tertentu (10 ml, 1 ml, 0.1 ml).

2. Inkubasi 24 jam, 370C.

3. Amati terjadinya gas.

Uji Penguat

1. Dari tabung yang memberi hasil positif timbul gas, ditanam ke dalam

media agar Endo atau EMB (Eosin Metilen Blue) atau BGLBB (Brilliant

Green Lactose Bile Broth).

2. Inkubasi pada suhu 370C selama 18-24 jam.

3. Amati terdapar E.coli bila :

o Pada Endo Agar warna merah mengkilap logam

o Pada EMB warna biru tua mengkilap logam

o Pada BGLBB gas positif


Uji Lengkap

1. Dari koloni yang timbul (positif/meragukan) ditanam ke dalam media

laktosa dan agar miring.

2. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam.

3. Amati pada :

o Laktosa timbul gas.

o Koloni khas pada agar miring.

o Pewarnaan Gram-negatif bentuk batang dan tidak berspora.

4. Untuk menentukan antara E.coli dengan golongan bentuk E.coli lainnya,

maka dari pemeriksaan uji lengkap diteruskan uji IMViC.

3. Metode Membran Filter

Sebanyak 25-100 ml sampel (misal air atau susu) disaring melalui membran

filter steril dengan pori-pori 0.22 0.45 mikron dan diameter sekitar 5 cm.

Membran filter diletakkan diatas agar cawan EMB atau Endo Agar dan

diinkubasikan pada suhu 350C 370C. Jumlah koliform dinyatakan dalam

jumlah koliform per 100 ml sampel.

Pada EMB :

1. Koloni koliform fekal diameter 0.5-1.5 mm dan berwarna gelap

dengan sinar hijau metalik (keemasan).

2. Koloni koliform non-fekal diameter 1.0-3.0 mm berwarna merah

muda dan bagian tengah berwarna gelap seperti mata ikan.


Pada Agar (mengandung laktosa) :

1. Koloni yang memfermentasikan laktosa (e.g. koliform) membentuk

warna merah pada bagian atas koloni dan sekelilingnya.

2. Koloni bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa (e.g. Salmonella

dan Shigella) akan membentuk koloni yang tidak berwarna.

Uji Angka Kapang

1. Media PDA steril yang telah dicairkan dan didinginkan pada temperatur 40C

ditambahkan kloramfenikol sebesar 1ml/L, dan dituang ke dalam piring petri

hingga membeku.

2. Sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran sampel dituang pada permukaan

media PDA yang telah beku dalam piring petri, yang mengandung

kloramfenikol, dan diratakan dengan bantuan spreader glass.

3. Piring petri selanjutnya diinkubasi pada temperatur 20-25C selama 3-5 hari.

Perhitungan jumlah koloni kapang/khamir yang tumbuh pada media dilakukan

sesuai cara perhitungan angka lempeng total (ALT) pada bakteri.

Syarat jumlah bakteri dalam suatu sediaan


BAB VII

DESINFEKTAN

1817, Joseph Lister menggunakan desinfektan yang mengandung fenol untuk

mendesinfeksi peralatan bedahnya. Hingga sekarang, fenol digunakan sebagai larutan

baku penentu kekuatan desinfektan.

Desinfektan adalah zat yang digunakan untuk mencegah atau mengendalikan

penularan dengan cara membasmi mikroorganisme patogen, apabila digunakan

pada objek yang tidak hidup/benda mati, misalnya desinfeksi pada alat kesehatan,

alat bedah dsb.

Antiseptik adalah zat yang mampu membunuh/menghambat pertumbuhan

mikroorganisme dan digunakan pada jaringan hidup, misalnya kulit, gigi, mata.

Desinfektan yang ideal :

1. Cepat membasmi mikroorganisme yang patogen dan potensial termasuk spora.

2. Penetran yang baik ke dalam bahan organik, misal kapas, karet.

3. Dapat bercampur dengan bahan-bahan organik, misal sabun, deterjen.

4. Tidak menjadi inaktif oleh jaringan hidup.

5. Tidak bersifat korosif.


Pengendalian = mereduksi jumlah kegiatan suatu mikroorganisme.

Tujuan pengendalian :

1. Mencegah transmisi penyakit dan infeksi.

2. Mencegah pencemaran/pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan.

3. Mencegah peruraian/pembusukan bahan tertentu oleh mikroorganisme.

Faktor-faktor yang mempengaruhi potensi desinfektan :

1. Konsentrasi

2. Waktu

3. pH

4. Suhu

5. Sifat mikroorganisme

6. Kehadiran bahan extraneus

Berdasarkan mekanisme kerja, desinfektan terbagi atas :

1. Bahan yang merusak membran sel

oSurface active bahan kationik, bahan anionik, bahan non-ionik.

oSenyawa fenol fenol dan kresol.

oAlkohol

2. Bahan yang mendenaturasi protein

o Protein merupakan molekul organik yang sangat banyak terdapat di dalam sel.

Tiap protein memiliki konformasi karakteristik yang diperlukan. Jika terdapat

bahan yang dapat mengubah konformasi dari protein dengan denaturasi, maka

akan terjadi pembukaan rantai polipeptida hingga rantai menjadi melipat atau

memutar tidak beraturan.


o Contoh bahan kimia yang mendenaturasi protein :

1. Asam

2. Alkali

3. Alkohol

4. Aseton

o Asam dan alkali

Bahan asam dan alkali menunjukkan daya antibakterinya melalui ion H+

atau OH- bebas, yaitu melalui molekul yang tidak terdisosiasi.

Asam kuat dan alkali kuat mempunyai kandungan desinfektan sebanding

dengan disosiasinya dalam cairan.

3. Bahan yang memodifikasi kelompok fungsional dari protein dan asam

nukleat.

Bagian katalitik dari enzim menjadi kelompok fungsional khas yang akan

mengikat substrat dan memulai proses katalisis. Inhibisi kegiatan enzim

berhasil jika satu atau lebih dari kelompok fungsional diubah atau dirusak.

Kelompok fungsional penting dari dinding sel, membran sel dan asam nukleat

adalah peka terhadap inaktivasi.

a. Logam berat : misal Hg fenil merkuri : untuk membunuh bakteri Gram-

positif dan Gram-negatif, kapang, khamir. Ag AgNO3 :

untuk membunuh gonococcus.


b. Bahan pengoksidasi :

Halogen; misal klorin (sebagai desinfektan air), iodin (sebagai

desinfektan kulit).

Hidrogen peroksida (H2O2); merupakan desinfektan yang banyak

digunakan untuk desinfeksi yang tidak hidup, seperti peralatan bedah

dan lensa kontak.

c. Pewarna; beberapa jenis pewarna tidak hanya mewarnai bakteri, tetapi juga

menghambat pertumbuhannya pada enceran sangat tinggi. Misal :

Pewarna trifenilmetan (pewarna anilin), derivatnya : hijau berlian, hijau

malakit, violet kristal. Ketiga derivatnya bersifat selektif terhadap Gram-

positif.

Pewarna akridin (disebut juga flavin), misal : proflavina, akriflavina.

Keduanya bersifat sebagai antiseptik luka.

Berbeda dengan pewarna anilin, pewarna akridin tidak terpengaruh daya

antimikrobanya dengan kehadiran serum atau nanah.

d. Bahan pengalkil; inhibisi yang dihasilkan bahan pengalkil adalah

irreversible sehingga terjadi modifikasi enzim dan inhibisi kegiatan enzim.

Misal :

1. Aldehida ;

Formaldehida; digunakan sebagai pengawet jaringan segar dan bangkai.

Dalam konsentrasi tinggi merusak semua jenis mikroorganisme, termasuk


spora. Formaldehida dalam bentuk gas digunakan untuk mendesinfeksi

ruangan, bahan tekstil dan instrumen.

Glutaraldehida; memiliki kemampuan 10 x dari formaldehida. Digunakan

sebagai bahan sterilisasi dingin untuk alat bedah.

2. Etilen oksida; merupakan bahan dalam bentuk gas, untuk sterilisasi materi

yang rusak karena panas, misalnya peralatan elektronik, kedokteran, biologik

dan obat. Selain bereaksi dengan protein juga bereaksi dengan ADN dan ARN.

Untuk membandingkan kekuatan desinfektan dalam menghambat pertumbuhan

bakteri dapat digunakan cakram kertas.

Pada cakram kertas dibasahi dengan desinfektan, kemudian diletakkan pada

lempengan agar yang telah diinokulasi.

Lempengan agar kemudian dierami selama 48 jam. Jika desinfektan menghambat

pertumbuhan bakteri, maka akan terlihat daerah jernih sekeliling cakram kertas.

Luas daerah terang ini menjadi ukuran kekuatan daya kerja desinfektan.


BAB VIII

ANTIBIOTIKA

Antibiotika adalah :

Senyawa kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme atau senyawa sejenis

yang seluruhnya atau sebagian diproduksi secara sintesis kimia yang dalam

konsentrasi rendah dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lainnya.

Persyaratan antibiotika :

1. Dapat merusak atau menghambat mikroorganisme patogen tanpa

merusak tuan rumah.

2. Mikroorganisme yang peka terhadapnya tidak menjadi resisten.

3. Tidak menimbulkan alergi dan efek samping yang tidak diinginkan jika

digunakan secara berkesinambungan dengan dosis tinggi.

4. Harus tetap aktif dalam plasma, cairan tubuh atau eksudat.

5. Larut dalam air dan stabil serta tingkat membunuh atau menghambat

pertumbuhan mikroorganisme cepat tercapai dan dapat dipertahankan

untuk waktu yang diperpanjang.

Mekanisme kerja antibiotika :

1. Inhibitor dinding sel

2. Inhibitor membran sel

3. Inhibitor fungsi ADN

4. Inhibitor terhadap sintesis protein


I. Inhibitor Dinding Sel

Dinding sel yang kaku melindungi membran sitoplasma terhadap pengaruh

tekanan osmotik.

Zat yang merusak dinding sel atau mencegah sintesis polimer dinding pada sel

yang tumbuh akan mengembangkan sel yang peka terhadap osmosis dan akan

mati.

a. Antibiotika -laktam

1. Penicillin

Dapat menimbulkan reaksi hipersensitif pada kelompok kecil manusia.

Nukleus penicillin Asam-6-aminopenisilinat yang merupakan persyaratan

struktur bagi aktivitas biologis. Efektif terhadap bakteri Gram-positif dan

Gram-negatif.

Kekurangan penicillin :

1. Dapat diinaktivasi oleh pH asam dari cairan lambung.

2. Dirusak oleh penisilinase, yaitu enzim bakteri yang memecah cincin -

laktam.

3. Penicillin yang banyak digunakan adalah yang resisten terhadap

penisilinase, antara lain metisilina, nafsilina, kloksasilina, dikloklasilina,

oksasilina.

2. Sefalosporina

Dihasilkan oleh jamur Cephalosporium acremonium.


Efektif terhadap Gram-positif dan Gram-negatif, mempunyai daya kerja

hampir sama dengan penicillin semisintetik.

b. Sikloserina

Antibiotika spektrum luas hanya digunakan terhadap penyakit TBC.

c. Fosfomisina

Dihasilkan oleh Streptomyces fradiae, merupakan antibiotika spektrum luas

sebagai inhibitor terhadap sintesis peptidoglikan dan kegiatan enzim.

d. Vankomisin

Antibiotika spektrum sempit, dihasilkan oleh Streptomyces orientalis. Efektif

terhadap banyak spesies dan Gram-positif, bekerja dengan menghambat

biosintesis peptidoglikan.

II. Inhibitor Membran Sel

Membran sel mempunyai peranan penting di dalam sel, yaitu merupakan

pembatas osmotik terhadap difusi bebas antara lingkungan dalam dan luar.

Membran sel berdaya terhadap konsentrasi metabolit dan nutrien di dalam sel

dan merupakan bagian untuk pernapasan dan beberapa kegiatan biosintesis.

Beberapa jenis antibiotika menunjukkan kemampuan menurunkan satu atau

lebih dari fungsi membran di atas dan hal tersebut mengakibatkan keburukan

bagi kehidupan sel.


a. Polimiksina

1. Terdiri atas polimiksina A,B,C,D dan E.

2. Polimiksina B yang banyak digunakan sebagai obat.

3. Antibiotika ini mengikat permukaan luar dari membran sel serta

mengubah struktur dan kandungan osmosis dari sel.

4. Dihasilkan oleh Bacillus polymixa.

5. Efektif terhadap Gram-positif dan Gram-negatif.

b. Antibiotika poliena

Merupakan antibiotika antifungal, yaitu :

1. Nistatin; dihasilkan oleh Streptomyces noursei; tidak digunakan dalam

bentuk injeksi karena toksik. Digunakan di kulit untuk

menyembuhkan penyakit karena Candida.

2. Amfoterisina; umumnya digunakan amfoterisina-B yang dihasilkan oleh

Streptomyces niveus, digunakan terhadap penyakit yang diakibatkan

oleh fungi.

III. Inhibitor Fungsi ADN

Fungsi ADN yaitu duplikasi dan replikasi (sandi genetik).

Beberapa jenis antibiotika secara khas dapat mengganggu struktur dan fungsi

ADN, tetapi sedikit yang digunakan sebagai obat karena toksisitasnya.


Tiap bahan yang dapat mengganggu struktur dan fungsi ADN, maka mampu

menimbulkan efek yang mendalam dalam semua fase pertumbuhan dan

mikroorganisme yang bersangkutan.

Novobiosina

Efektif terhadap Gram-positif, dihasilkan oleh Streptomyces niveus, yang

memiliki daya kerja menghambat replikasi DNA.

IV. Inhibitor Terhadap Sintesis Protein

Sintesis protein merupakan hasil akhir dari 2 proses, yaitu :

1. Transkripsi : sintesis RNA yang tergantung pada DNA.

2. Translasi : Sintesis protein yang tergantung pada RNA.

Antibiotika yang menghambat salah satu dari proses di bawah ini, berarti

menghambat sintesis protein.

a. Inhibitor dari transkripsi

1. Aktinomisin; dihasilkan oleh Streptomyces, efektif menghambat sintesis

ADN dan ARN, bersifat toksik.

2. Rifampin; merupakan derivat semisintetik dari Streptomyces mediterranei,

yang paling berguna dari kelompok ini adalah rifampisin. Efektif terhadap

Gram-positif dan Mycobacterium seperti penyebab penyakit TBC dan lepra.

Rifampisin menghambat sintesis protein secara selektif menginaktivasi

polimerase ADN.


b. Inhibitor dari translasi

1. Streptomisin

Dihasilkan oleh Streptomyces griseus, efektif terhadap Gram-negatif dan M.

tuberculosis.

Streptomisin digunakan terhadap mikroorganisme yang tidak mempan

terhadap penicillin.

2. Tetrasiklin

Merupakan antibiotika spektrum luas, efektif terhadap Gram-positif dan Gram-

negatif, mikoplasma, riketsia dan klamidia.

Kelompok tetrasiklin :

1. Oksitetrasiklin

2. Khlortetrasiklin

3. Dimetilkhlortetrasiklin

4. Doksisiklin

5. Minosiklin

Daya kerja tetrasiklin lebih luas dibandingkan penicillin, streptomisin dan

kloramfenikol.

Tetrasiklin menghambat hanya mikroorganisme yang berkembang biak secara

cepat dan bersifat bakteriostatik.

Penggunaan tetrasiklin terutama terhadap mikroorganisme yang resisten

terhadap ampicillin dan sefalosporina.


3. Nitrofuran

Misal : Nitrofurantoin, efektif terhadap infeksi saluran genitourinaria pada

penderita yang tidak tahan terhadap sulfonamida.

4. Kloramfenikol

Dihasilkan oleh Streptomyces venezuelae, bersifat bakteriostatik terhadap

Gram-positif dan Gram-negatif, riketsia dan klamidia.

Menghambat pertumbuhan bakteri dengan mengganggu sintesis protein.

5. Eritromisin

Bersifat bakteriostatik dan dalam kadar tinggi sebagai bakterisida.

Dihasilkan oleh Streptomyces erytherus.

Efektif untuk infeksi pneumonia, atau diberikan pada penderita yang alergi

terhadap penicillin dan yang menderita infeksi akibat streptococcus dan

pneumococcus.

6. Linkomisin dan klindamisin

Dihasilkan oleh Streptomyces linkolensis.

Klindamisin adalah derivat khloro dari linkomisin yang dibuat secara

semisintesis. Spektrum kerjanya sama dengan eritromisin walaupun secara

kimia tidak ada hubungannya. Efektif terhadap streptococcus, pneumococcus

dan staphylococcus.


7. Griseofulvin

Dihasilkan oleh Penicillium griseofulvum, merupakan fungistatik dan

mengganggu proses tubulin menjadi mikrotubula griseofulvin mengikat

protein di dalam perakitan tubulina. Jadi proses sel yang terkandung pada

fungsi mikrotubula seperti pergerakan kromosom selama mitosis akan

terhambat oleh griseofulvin.


BAB IX

UJI SENSITIVITAS

1. Desinfektan

Daya kerja antimikroba (desinfektan) bahan kimia seringkali disetarakan dengan

fenol.

Kemampuan bahan kimia dibandingkan dengan fenol disebut koefisien fenol.

Koefisien fenol adalah angka yang menunjukkan ratio/perbandingan dari

pengenceran tertinggi desinfektan yang diuji dengan pengenceran tertinggi dari

fenol yang dapat membunuh mikroorganisme penguji dalam 10 menit, tetapi tidak

bisa membunuh dalam 5 menit.

Bahan kimia yang memiliki koefisien fenol lebih dari 1, mempunyai daya kerja

antimikroba yang lebih baik dibandingkan dengan fenol.

Macam-macam desinfektan antara lain Lysol, Creolin, Denol, Dettol, SOS dll.

Bila larutan desinfektan uji dengan pengenceran 1 : 250 dapat membunuh populasi

S. aureus, sedangkan hasil yang sama ditunjukkan oleh fenol pada pengenceran 1 :

60, maka koefisien fenol sebagai desinfektan uji adalah 250/60 atau 4.2. Hasil ini

menunjukkan bahwa desinfektan uji 4.2 kali lebih efektif dibandingkan fenol

dalam membunuh S. aureus secara in vitro.


Rumus :

Koefisien fenol (KF) = (a/b + c/d)/2

Ket :

a Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 5.

b Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 5.

c Faktor pengenceran tertinggi larutan uji desinfektan masa kontak 10.

d Faktor pengenceran tertinggi larutan baku fenol masa kontak 10.

Contoh :

Desinfektan Waktu

Pengenceran

1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100 1/110 1/120 1/130 1/140

Fenol 5

10

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-(b)

-

+

-(d)

+

+

Lysol 5

10

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-(a)

-

+

-(c)


Kf = (a/b + c/d)/2

= (130/120 + 140/130)/2

= 1.080

Ket :

Kf > 1 : bahan antimikroba/desinfektan efektif

Kf < 1 : bahan antimikroba/desinfektan kurang efektif

Cara kerja :

1. Baku fenol 5%

Buat pengenceran menggunakan aquadest steril (tiap tabung hanya diperlukan

5 ml fenol).

Pengenceran dibuat dengan 2 bagian waktu, yaitu 5 dan 10 tiap bagian

waktu terdiri dari 10 tabung pengenceran.

2. Inokulasi bakteri uji untuk fenol 5%.

Masukkan 0.5 ml biakan bakteri pada masing-masing tabung pengenceran

dimulai dari tabung pengenceran 5.

Ketika pertama kali memasukkan bakteri uji pada tabung pengenceran yang

pertama, waktu dicatat sebagai 0 (nol) menit. Interval waktu antar tabung

adalah 30 detik.

Perlakuan sama terhadap pengenceran 10.


3. Inokulasi pada media Nutrient Broth

5 menit setelah pengisian tabung untuk waktu 5 menit tersebut, tabung pertama

dikocok, kemudian isinya diambil satu masa ose dan diinokulasikan ke dalam

tabung pertama pada media Nutrient Broth.

Dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir untuk waktu 5.

Perlakuan sama terhadap 10 tabung pengenceran untuk waktu 10.

Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam.

Amati pertumbuhan mikroorganisme.

2. Antibiotika

Cara yang umum digunakan untuk mengetahui kekuatan antibiotika adalah uji

kepekaan (sensitivitas) antibiotika terhadap mikroorganisme patogen penyebab

penyakit. Adapun cara dibawah ini tidak terbatas pada antibiotika saja, tetapi juga

agen antimikroba lainnya.

A. Metode Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Bahan antimikroba bersifat menghambat bila digunakan dalam konsentrasi

kecil, dan mematikan mikroorganisme bila digunakan dalam konsentrasi

tinggi.

Oleh karena itu, perlu diketahui Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dan

Minimum Killing Concentration) bahan antimikroba tersebut terhadap

mikroorganisme.

Dalam uji ini diperlukan suspensi baku dari mikroorganisme patogen yang

ditumbuhkan dalam kaldu.


Suspensi baku tersebut dimasukkan dalam kaldu yang berisi berbagai

konsentrasi antibiotika.

Konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme dalam

kaldu dapat ditentukan dengan mengukur kekeruhan setelah diinkubasikan.

Tabung kaldu yang berisi konsentrasi antibiotika yang mampu menghambat

pertumbuhan mikroorganisme patogen terlihat bening, sedangkan tabung

dengan konsentrasi antibiotika yang tidak menghambat pertumbuhan

mikroorganisme patogen terlihat keruh.

Uji juga dapat menggunakan media agar-agar (lempengan).

Kekuatan antibiotika dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah

antibiotika yang mampu mematikan atau menghambat pertumbuhan

mikroorganisme patogen.

MIC merupakan petunjuk konsentrasi antibiotika yang mampu menghambat

mikroorganisme dan juga memberikan petunjuk mengenai dosis yang

diperlukan dalam pengobatan penyakit.

Dengan mengetahui MIC dan sifat cairan tubuh seperti darah dan urin, dapat

ditentukan jenis antibiotik yang ampuh untuk pengobatan, besarnya dosis yang

diperlukan.

Umumnya, batas keamanan penggunaan antiibiotika untuk pengobatan

penyakit adalah sepuluh kali dosis MIC.

MIC dapat ditentukan dengan menggunakan cairan tubuh tanpa harus

mengisolasi ataupun mengidentifkasi mikroorganisme penyebab penyakit.


Misal : darah atau cairan serebrospinal yang mengandung mikroorganisme

infeksius ditambahkan pada berbagai konsentrasi antibiotika.

Kekeruhan pada tabung setelah waktu inkubasi menunjukkan bahwa

konsentrasi antibiotika dalam tabung tidak mampu menghambat pertumbuhan

mikroorganisme. Sebaliknya, tidak adanya kekeruhan menunjukkan bahwa

mikroorganisme peka terhadap konsentrasi antibiotika dalam tabung.

B. Metode Antibiogram-Kirby-Bauer

Uji ini diperkenalkan oleh William Kirby dan Alfred Bauer pada tahun 1966.

Pada uji ini, lempengan agar ditaburi dengan mikroorganisme penguji.

Cakram kertas (disc) yang berisi berbagai antibiotika diletakkan diatas

lempengan agar tersebut.

Penghambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh antibiotika terlihat sebagai

wilayah jernih sekitar pertumbuhan mikroorganisme (zona hambat).

Luasnya wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroorganisme

terhadap antibiotika dan juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotika

dalam media.

Faktor-faktor yang mempengaruhi ukuran diameter zona hambat :

o Kekeruhan suspensi bakteri :

Kurang keruh diameter zona hambatan lebih lebar.

Lebih keruh diameter zona hambatan lebih sempit.

o Kekeruhan suspensi bakteri harus distandardisasi terlebih dahulu.


o Standar kekeruhan dibuat dari 0.5 ml 1.75% Barium Chloride Dihydrat

ditambah 1% asam sulfat.

Waktu peresapan suspensi bakteri ke dalam lempengan agar.

Setelah suspensi bakteri digoreskan pada agar dengan menggunakan lidi kapas

steril, diamkan 5-15. Pendiaman tidak boleh melebihi batas waktu yang

ditentukan karena dapat mempersempit diameter zona hambat, sensitif (S)

dilaporkan resisten (R).

Temperatur inkubasi

o Inkubasi dilakukan pada 350C.

o < 350C diameter zona hambatan lebih lebar sehingga R dilaporkan S

terjadi pada lempengan yang ditumpuk-tumpuk lebih dari 2

lempengan pada saat inkubasi lempengan yang di tengah suhunya

kurang dari 350C.

o 350C ada bakteri yang kurang subur dalam pertumbuhannya, ada pula

obat yang difusinya kurang baik.

Waktu inkubasi

16-18 jam. Kurang dari 16 jam, pertumbuhan bakteri belum sempurna

sehingga sukar dibaca atau diameter zona hambatan lebih lebar. Lebih dari 18

jam, pertumbuhan lebih sempurna sehingga diameter zona hambatan lebih

sempit.


Tebal agar-agar

Ketebalan agar-agar sekitar 4 mm.

< 4 mm difusi obat lebih cepat.

> 4 mm difusi obat lebih lambat.

Jarak antar disc obat

Jarak yang dianjurkan minimum 15 mm, untuk menghindari terjadinya zona

hambatan yang tumpang tindih. Cawan petri dengan diameter 9-10 cm,

maksimum dapat memuat 7 disc obat. Penempelan disc obat dapat

menggunakan pinset.

Potensi disc obat

Tiap jenis disc obat memiliki diameter yang sama, tetapi potensinya berbeda.

Komposisi media

Berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri, difusi obat, aktivitas obat dsb.

Gambar pengujian antibiotika


Pembacaan pengukuran diameter zona hambat

Dengan menggunakan kertas berwarna gelap atau dengan latar belakang sedikit

gelap, bisa dengan menggunakan jangka.

Diameter zona hambat yang diukur adalah daerah jernih sekitar disc obat (tidak

ada pertumbuhan bakteri), diukur dari ujung yang satu ke ujung yang lain

melalui tengah-tengah disc obat.

Hasil pengukuran diameter zona hambat dibandingkan dengan standar (resisten

(R), sensitif (S) atau intermediate (I)).


Kontrol Kualitas

o Adalah usaha yang dilakukan untuk menetralisasi faktor-faktor yang

berpengaruh terhadap diameter zona hambat.

o Memeriksa mutu media dan disc obat dengan menggunakan bakteri standar:

S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 dan P. aeruginosa ATCC

27853.


BAB X

UJI PRODUK FARMASI

1. Uji Pirogen

Pirogen adalah reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada

pemberian sediaan injeksi.

Tujuan Uji Pirogen :

Membatasi resiko reaksi demam.

Pengujian meliputi : pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan

larutan uji secara intravena dan ditujukan untuk sediaan yang dapat ditoleransi

dengan uji kelinci dengan dosis penyuntikan tidak lebih dari 10 ml per kg bobot

badan dalam jangka waktu tidak lebih dari 10 menit.

Alat dan Pengencer

Alat :

1. Alat suntik

2. Jarum

3. Alat kaca bebas pirogen

Pengencer : Sesuai monografi

Misal : apabila digunakan injeksi Natrium Klorida sebagai pengencer, gunakan

injeksi yang mengandung larutan Natrium Klorida P 0.9 %.


Rekaman suhu

Termometer yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian skala 0.10C dan

telah diuji bahwa pembacaan suhu maksimum tercapai 5 menit.

Cara :

Masukkan alat pengukur suhu ke dalam anus kelinci dengan kedalaman tidak

kurang dari 7.5 cm.

Hewan Uji

1. Kelinci dewasa yang sehat

2. Tempatkan satu ekor dalam satu kandang dengan suhu 20-230C dan bebas dari

gangguan yang menimbulkan kegelisahan.

3. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen adaptasikan

tidak lebih dari 7 hari dengan uji pendahuluan.

4. Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu

48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila

menunjukkan kenaikan suhu maksimum 0.600C atau lebih, atau digunakan

untuk sediaan yang mengandung pirogen.

Prosedur :

Pengujian dalam ruang terpisah dengan kondisi lingkungan yang sama dengan

ruang pemeliharaan, bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan.

Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian.

Minum dibolehkan setiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian.


Tidak lebih 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan suhu. Suhu

awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39.80C.

Beda suhu setiap kelinci tidak boleh lebih dari 10.

Kecuali dinyatakan lain, suntikan 10 ml/kg BB melalui vena tepi telinga 3 ekor

kelinci dan penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit.

Semua larutan harus bebas dari kontaminasi, dengan cara menghangatkan pada

suhu 370 2 sebelum penyuntikan.

Penafsiran Hasil :

1. Setiap penurunan suhu dianggap nol, sediaan memenuhi syarat apabila tak

seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0.50 atau lebih.

2. Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan 0.50 atau lebih lanjutkan

pengujian menggunakan 5 ekor kelinci. Jika

Documents

TA-HAYATI