T kleto~no zreewe, aktivacija i diferencijacija

Karakteristikata po koja se razlikuva prepoznavaweto na protivgenot od stranana pove}eto T kletki i prepoznavaweto na protivgenot od strana na B kletkite eGTK spregnuvaweto. Vo pove}eto slu~ai, i zreeweto na roditelskite(progenitorni) T kletki vo timusot i aktivacijata na zrelite T kletki voperiferijata e pod vlijanie na vklu~uvaweto na GTK molekulite. Potencijalnataprotivgena raznovidnost na T-kleto~nata populacija e namalena pri zreeweto nizproces na selekcija koj dozvoluva da sozreat samo GTK-spregnati i nereaktivni konb T K j f } Tsebe T kletki. Krajnite fazi od zreeweto na pove}eto T kletki prodol`uvaat vo

dve razli~ni razvojni pateki, koi sozdavaat funkcionalno razli~ni subpopulaciiKD4 i KD8 koi prika`uvaat klasa 2 i klasa 1 GTK spregnuvawe, soodvetno.Aktivacijata na zrelite periferni T kletki zapo~nuva so me|udejstvoto na T-kleto~niot receptor (TKR) so protivgeniot peptid koj e prika`an vovdlabnatinata od GTK molekulata. Iako specifi~nosta na ova me|udejstvo eupravuvano od TKR, negoviot nizok afinitet bara vklu~uvawe na koreceptorite idrugi pomaga~ki membranski molekuli koi ja zajaknuvaat vrskata TKR-protivgen-GTK A j f jGTK i go prenesuvaat aktivira~kiot signal. Aktivacijata vodi kon proliferacijai diferencijacija na T-kletkite vo razli~ni tipovi na efektorni kletki ipamte~ki T kletki. Bidej}i pove}eto timociti i periferni T kletki prika`uvaatalfa-beta T-kleto~en receptor za razlika od gama-delta TKR, site referenci za T-kleto~niot receptor vo ova poglavje se odnesuvaat na alfa-beta receptorot, osvenako ne e poinaku navedeno.

1

(slika 10-1 Razvoj na T kletkite od krvni mati~ni kletki na stromalni kletki od koskenata srcevina koi prika`uvaat Zabecligand.

T-kleto~no zreewe i timusot

Roditelskite T-kletki zapo~nuvaat da migriraat vo timusot od ranite mesta na hematopoezata okolu 11-tiot den od bremenosta kajgluvcite i vo osmata ili devetata nedela od bremenosta kaj lu|eto. Na na~in koj e sli~en na B-kleto~noto zreewe vo koskenatasrcevina, zreeweto na T-kletkite vklu~uva preureduvawe na TKR genite od zarodi{nata linija i prika`uvawe na razli~nimembranski obele`uva~i. Vo timusot, razvojnite T-kletki, poznati kako timociti, proliferiraat i se diferenciraat prekurazvojni pateki koi sozdavaat funkcionalno razli~ni subpopulacii na zreli T kletki.Kako {to e prika`ano vo poglavje 2, timusot zazema centralna uloga vo T-kleto~nata biologija. Pokraj toa {to e glaven izvor nasite T kletki, toa e mesto kade T kletkite se vidoizmenuvaaat i se oblikuvaat vo efektorno primarno T kleto~no razli~ie prekuposeben par na selektivni procesi. Eden od niv, pozitivnata selekcija, dozvoluva opstanok samo na onie T kletki ~ii {to TKR esposoben za prepoznavawe na sopstvenite GTK molekuli. Spored toa, toj e odgovoren za sozdavaweto na sopstveno GTK-spregnato T-

D j j Tkleto~no razli~ie. Drugiot proces na selekcija, negativnata selekcija, gi otstranuva T kletkite koi reagiraat premnogu silno sosopstvenite GTK molekuli ili so sopstvenite GTK plus sopstveni peptidi. Negativnata selekcija e mnogu va`en faktor zasozdavaweto na prvi~no samotolerantno T-kleto~no razli~ie.Razvojot na T kletkite zapo~nuva so pristignuvaweto na mal broj limfoidni prethodnici koi migriraat od krvta vo timusot, kade{to proliferiraat, se diferenciraat i pretrpuvaat selektivni procesi koi rezultiraat do razvoj na zreli T kletki. Do neodmna,se veruva{e deka neo{tetenata struktura na timusot e neophoden uslov za da nastane ovoj razvoen proces. Vo ranite godini, invitro eksperimentite za razvojot na T kletkite bea ograni~eni na kultura na fetalen timusen organ, kade {to bea kultivirani invitro delovi od fetalen timus. Ova e sprotivno na B-kleto~niot razvoj, koj mo`e da bide povtoren in vitro so upotreba namati~ni kletki od koskenata srcevina koi porasnale na stromalni kletki vo prisustvo na soodvetni citokini. Vo golemotootkritie od 2002 godina, J. C. Zuniga-Pfluker i kolegite poka`aa deka T kletkite mo`at da se pottiknat na razvoj vo otsustvo natimusni delovi koga mati~nite kletki od koskenata srcevina se kultiviraat na stromalna kleto~na linija koja prika`uva ligandza T-kleto~niot membranski receptor Zabec. Vo retrospektiva, baraweto da bidat prisutni signalni pateki koi se posreduvani odZabec (Notch) za in vitro razvoj na T-kletkite e uka`ano od strana na pove}e linii na dokazi, vklu~uvaj}i go naodot deka ranite Tkletki koi imaat otstranet (nokautiran) Zabec 1 gen ne sozreale. (Zabec 1 e eden od ~etirite ~lenovi na familijata Zabec). Kako{to e prika`ano na slika 10-1, rastot na krvnite mati~ni kletki (KMK) na stromalni kletki koi prika`uvaat Zabec ligand go{to e prika`ano na slika 10 1, rastot na krvnite mati~ni kletki (KMK) na stromalni kletki koi prika`uvaat Zabec ligand gonaso~uva razvojot na ovie multipotentni mati~ni kletki kon T lozata. Vsu{nost, prisilnoto prika`uvawe na Zabec na KMK kaj`ivotnite rezultira so T limfociti, no ne i B limfociti. Ovoj rezultat ni ka`uva deka prika`uvaweto na eden protein, Zabec,mo`e da go smeni pravecot na potencijalnata B kletka vo kletka od T lozata i cvrsto go vospostavuva Zabec kako klu~en proteinvo specificiraweto na T lozata.

2

(slika 10-2 Razvoj na T kletkite kaj gluvciteT-kleto~nite prethodnici pristignuvaat vo timusot od koskenata srcevina preku krvotekot, pretrpuvaat razvojT kleto~nite prethodnici pristignuvaat vo timusot od koskenata srcevina preku krvotekot, pretrpuvaat razvojdo zreli T kletki i se ispora~uvaat do periferijata, kade mo`e da pretrpat aktivacija-pottiknata od protivgen idiferencijacija vo efektorni kletki i pamte~ki kletki. Sekoja faza od razvojot se karakterizira sovnatrekleto~ni procesi speci~ni za odredenata faza i prika`uvawe na razli~ni povr{inski kleto~niobele`uva~i.

Kako {to e prika`ano na slika 10-2, koga predhodnicite od T-kletkite pristignuvaat vo timusot, tie ne giprika`uvaat prepoznatlivite povr{inski obele`uva~i za T kletkite kako {to se T-kleto~niot receptor, KD3kompleksot, ili koreceptorite KD4 i KD8. Vsu{nost, ovie roditelski kletki s#u{te ne gi preuredile nivniteTKR geni i ne gi prika`uvaat proteinite kako {to se RAG-1 i RAG-2, koi se potrebni za preureduvaweto. Popristignuvaweto vo timusot, prethodni~kite T kletki navleguvaat vo nadvore{nata kora i bavno proliferiraat.Vo periodot od pribli`no tri nedeli od razvojot vo timusot, diferencira~kite T kletki minuvaat niz serijafazi koi se ozna~eni so karakteristi~ni promeni vo nivniot povr{inski kleto~en fenotip. Na primer, na

| f j KD4 KD8 B j}timocitite koi se nao|aat vo ranata faza na razvojot im nedostasuvaat vidlivi KD4 i KD8. Bidej}i ovie kletki seKD4 KD8 se nare~eni dvojno-negativni (DN) kletki. Vsu{nost, DN T kletkite mo`at da se podelat vo ~etiripodgrupi (DN1-4), koi se karakteriziraat so prisustvo ili otsustvo na drugi povr{inski kleto~ni molekulipokraj KD4 i KD8, kako {to se c-Kit, receptorot za faktorot na rast na mati~nite kletki; KD44, adhezivnamolekula i KD25, alfa verigata od Il-2 receptorot. Kletkite koi navleguvaat vo timusot-DN1 kletki-sesposobni za sozdavawe na site podgrupi T-kletki i fenotipski se c-kit , KD44visoko i KD25 . [tom DN1 kletkite}e se najdat vo timusot, tie zapo~nuvaat da proliferiraat i prika`uvaat KD25 i stanuvaat c-kit , KD44nisko iKD25 . Ovie kletki se nare~eni DN2 kletki. Za vreme na kriti~nata DN2 faza od razvojot, zapo~nuvapreureduvaweto na genite za TKR gama, delta i beta verigite; sepak, lokusot alfa od TKR ne se preureduva,bidej}i podra~jeto od DNK koe gi kodira alfa genite od TKR e gusto zbien i ne e pristapen za rekombinantnatama{inerija. Kako {to kletkite napreduvaat do DN3, prika`uvaweto na c-kit i KD44 e isklu~eno, apreureduvawata na TKRgama, TKRdelta i TKRbeta prodol`uvaat. Kletkite koi se predodredeni da stanat gama-delta T-kletki (mal procent (<5%) od zrelite timociti) se dvojat na preminot me|u DN2 i DN3 i stanuvaat zreli

T f K j b jgama-delta T-kletki so mnogu malku promeni vo nivniot povr{inski fenotip. Kaj gluvcite, ovaa subopopulacijana timociti mo`e da se otkrie 14-tiot den od bremenosta, dostignuva maksimalen broj od 17 do 18-ti den, a potoaopa|a do ra|aweto (slika 10-3). Pove}eto DN2 kletki se predodredeni da dovedat do sozdavawe na alfa-beta T-kletki, a po preptpostavka na DN3 fenotipot (c-kit , KD44 , KD25 ), kletkite ja stopiraat proliferacijata, a vocitoplazmata na ovie kletki se zabele`uvaat proteinski produkti od preureduvaweto na TKRbeta.Novosintetiziranite beta verigi se spojuvaat so 33-kDa glikoprotein poznat kako pre-T alfa veriga i sepovrzuva so KD3 grupata za da formira kompleks nare~en pre-T-kleto~en receptor ili pre-TKR (slika 10-4).Zabele{ka, proteinite Zabec igraat vitalna uloga vo ovaa faza od razvojot na T-kletkite: kletkite koi neprika`uvaat Zabec ne sozrevaat po ovaa faza.

3

(slika 10-3 Vremenski period za pojavuvawe na gama-delta i alfa-beta timocitite za vreme naembrionalniot razvoj na gluvcite. Grafikonot go poka`uva procentot na KD3 kletki vo timusot koir r j u c r f u r c D use dvojno negativni (KD4 8 ) i poseduvaat gama-delta T-kleto~en receptor (crna boja) ili se dvojnopozitivni (KD4 8 ) i poseduvaat alfa beta T-kleto~en receptor (sina boja).

Sozdavaweto na pre-TKR ja aktivira signalno-prenesuva~kata pateka koja ima odreden broj naposledici:Poka`uva deka kletkata napravila produktivno preureduvawe na TKR beta verigata i ja signaliziranejzinata ponatamo{na proliferacija i zreewe.Popre~uva ponatamo{no gensko preureduvawe na TKR beta verigata, {to doveduva do alelskoisklu£uvaweisklu£uvawe.Ja pravi kletkata popustliva za preureduvawe na TKR alfa verigata.Pottiknuva razvoen napredok do KD4 8 dvojno-pozitivnata sostojba.

Po zavr{uvawe na preureduvaweto na beta verigata, DN3 kletkite brzo napreduvaat do DN4, nivotona KD25 opa|a i se prika`uvaat dvata koreceptori KD4 i KD8. Ovaa dvojno-pozitivna (DP) faza eperiod na brza proliferacija. Sepak, vo ovoj period s# u{te se nema slu~eno gensko preureduvawe naTKR alfa verigata. Genskoto preureduvawe na alfa verigata ne po~nuva se dodeka dvojno-pozitivnitetimociti ne zaprat so proliferacijata i dodeka ne se zgolemi nivoto na proteinot RAG-2.Proliferativnata faza koja prethodi na genskoto preureduvawe na alfa verigata ja zgolemuvaraznovidnosta na T-kleto~noto razli~ie so sozdavawe klonovi na kletki so edine~no preureduvawer d r d d r ur duna TKR beta verigata. Sekoja kletka od ovoj klon mo`e da preuredi razli~en gen za alfa verigata,pritoa sozdavaj}i porazli~na populacija otkolku ako originalnata kletka pretpela preureduvawe nalokusite i za alfa i za beta verigata pred da proliferirala. Kaj gluvcite, genite za TKR alfaverigata ne se prika`uvaat do 16 ili 17 den od bremenosta; dvojno-pozitivnite kletki koiprika`uvaat KD3 i alfa-beta T-kleto~en receptor po~nuvaat da se pojavuvaat na 17-ot den ipostignuvaat maksimalni nivoa okolu vremeto na ra|awe (vidi slika 10-3). Poseduvaweto na celosenTKR im ovozmo`uva na DP timocitite da gi pretrpat strogite pravila od pozitivnata i negativnataselekcija.

4

(slika 10-4 Struktura i aktivnost na pre-T-kleto~niot receptor (pre-TKR).Vrzuvaweto na ligandite, koi doprva treba da se identifikuvaat, za pre-TKR sozdava intrakleto~ni signali koi pottiknuvaat mno{tvo procesi.

Razvojot na T kletkite e skap proces za doma}inot. Proceneto e deka 98% odsite timociti ne sozrevaat- tie umiraat vo timusot so apoptoza bidej}i neuspevaat da napravat uspe{no preureduvawe na genite za TKR ili bidej}i neuspevaat da ja pre`iveat selekcijata vo timusot Dvojno pozitivniteuspevaat da ja pre`iveat selekcijata vo timusot. Dvojno pozitivnitetimociti koi prika`uvaat alfa beta TKR-KD3 kompleks i ja pre`ivuvaattimusnata selekcija se razvivaat vo nezreli edine~no-pozitivni KD4+

timociti ili edine~no-pozitivni KD8+ timociti. Ovie edine~no pozitivnikletki podle`at na dopolnitelna negativna selekcija i migriraat odkorteksot vo medulata, kade {to pominuvaat od timusot vo cirkulatorniotsistem.

5

(slika 10-5 Eksperimentalen prikaz deka timusot za zreewe gi selektira samo onie T kletki ~ii {to T-kleto~ni receptori prepoznavaat protivgen koje prika`an na celnite kletki so haplotip na timusot. Na timektomiziranite i smrtonosno ozra~eni (A h B) F1 gluvci im e presaden soj B timus i seobnoveni so (A h B) F1 kletki od koskena srcevina. Po infekcijata so LHMV, analizirana e sposobnosta na CTL kletkite za ubivawe na Cr- obele`ani( ) 1 d rc f c j , r C u Crcelni kletki od soj A ili soj B zarazeni so LHMV. Samo celnite kletki od soj B bea lizirani, {to uka`uva na faktot deka H-2 presadeniot timus giselektiral za zreewe samo onie T kletki koi mo`at da prepoznaat protivgen povrzan so H-2 GTK molekuli.

Selekcija na T-kleto~noto razli~ie vo timusotSlu~ajnite genski preureduvawata na TKR vo DNKzarodi{nata linija vo kombinacija so raznovidnosta pri povrzuvaweto mo`e da sozdade ogromno TKRrazli~ie, so proceneta potencijalna raznovidnost koja nadminuva 10 za alfa-beta receptorot i 10 za gama-delta receptorot. Genskite produkti koi sekodirani od strana na preuredeni TKR geni nemaat nasleden afinitet kon nadvore{en protivgen plus sopstvena-GTK molekula; teoretski tie treba dase sposobni za prepoznavawe rastvorliv protivgen (sopstven ili tu|), sopstveni GTK molekuli, ili protivgen plus nesopstvena-GTK molekula. I pokrajtoa, najspecifi~nata osobina na zrelite T kletki e deka tie prepoznavaat samo nadvore{en protivgen koj e kombiniran so sopstvena-GTK molekula.Kako {to zabele`avme, timocitite podle`at na dva procesi na selekcija vo timusot:

Pozitivna selekcija za timocitite koi poseduvaat receptori sposobni za vrzuvawe so sopstvenite-GTK molekuli, {to doveduva do GTK spregnuvawe.Kletkite koi ne uspevaat da ja pominat pozitivnata selekcija se eliminiraat vo timusot so apoptoza.Negativna selekcija koja gi otstranuva timocitite koi imaat visoko afinitetni receptori samo kon sopstvenite-GTK molekuli ili sopstvenprotivgen prezentiran od strana na sopstven GTK {to doveduva do samo-tolerancijaprotivgen prezentiran od strana na sopstven GTK, {to doveduva do samo tolerancija.

Dvata procesi se neophodni za sozdavawe na zreli T kletki koi se sopstveno-GTK spregnati i samo-tolerantni. Kako {to zabele`avme prethodno, okolu98% ili pove}e od site timociti umiraat vo timusot so apoptoza. Masata na ovaa visoka stapka na smrt ja reflektira otstranuvaweto na timocititekoi ne uspeale da ja pominat pozitivnata selekcija bidej}i nivnite receptori ne prepoznavaat specifi~no sopstveni-GTK molekuli. Ovie kletki neprimaat stimulacija za rast i umiraat vo proces poznat kako smrt od zapostavenost.Prviot dokaz za ulogata na timusot vo selekcijata na T-kleto~noto razli~ie dojde od eksperimentite so himeri~ni gluvci od strana na R.M.Zinkernagel i negovite kolegi (slika 10-5). Ovie istra`uva~i vo timektomizirani i ozra~eni F1 gluvci (A h B) implantiraa timus B soj, a potoa gorekonstruiraa imuniot sistem na `ivotnite so intravenozna infuzija na F1 kletki od koskena srcevina. Timusniot presadok bil ozra~en predpresaduvaweto za da se osigura deka ne sodr`i zreli T kletki. Pri takov eksperimentalen sistem, roditelskite T-kletki od presadokot (A h B) F1koskena srcevina sozrevaat vo timusot koj prika`uva samo B-haplotip GTK molekuli na negovite stromalni kletki. Dali sega ovie (A h B) F1 T kletki}e bidat GTK spregnati za haplotipot na timusot? Za da se odgovori na ova pra{awe, himernite gluvci se zarazeni so limfocitniot horiomeningitisenvirus (LHMV), a potoa e testirana sposobnosta na T-kletkite od slezinata da ubivaat zarazeni so LHMV celni kletki od soj A ili soj B gluvci. Kako{to e prika`ano na slika 10-5, koga Tct kletki od himerniot glu{ec se testiraa na VLHM zarazeni celni kletki od soj A ili soj B gluvci, tie giliziraa LHMV zarazenite celni kletki od sojot B gluvci. Ovie gluvci go imaat istiot GTK haplotip, B, kako i tranplantiraniot timus. Ottuka, GTKhaplotipot na timusot kade {to se razvivaat T kletkite go odreduva nivnoto GTK spregnuvawe.Timusnite stromalni kletki vklu~uvaj}i gi epitelnite kletki makrofagite i steblestite kletki igraat zna~ajni ulogi vo pozitivnata i negativnataTimusnite stromalni kletki, vklu~uvaj}i gi epitelnite kletki, makrofagite i steblestite kletki, igraat zna~ajni ulogi vo pozitivnata i negativnataselekcija. Ovie kletki prika`uvaat klasa 1 GTK molekuli i isto taka mo`at da prika`at visoki nivoa na klasa 2 GTK molekuli. Me|udejstvoto nanezrelite timociti koi prika`uvaat TKR-KD3 kompleks so populaciite na timusni stromalni kletki doveduva do pozitivna i negativna selekcija somehanizmi koi se pod intenzivno istra`uvawe. Prvo, }e gi razgledame detalite na sekoj proces na selekcija, a potoa }e razgledame odredenieksperimenti koi ovozmo`uvaat uvid vo rabotata na ovie procesi.

6

(slika 10-6 Pozitivna i negativna selekecija na timocitite vo timusot. Timusnoto selektirawe vklu~uvatimusni stromalni kletki (epitelni kletki, steblesti kletki i makrofagi) i rezultira so zreli T kletki koi se

GTKi sopstveno GTK spregnati i samo-tolerantni.

Pozitivnata selekcija obezbeduva GTK spregnuvawePozitivnata selekcija se slu~uva vo kortikalnoto podra~je na timusot i vklu~uva me|udejstvo na nezrelitetimociti so kortikalnite epitelni kletki (slika 10-6). Postojat dokazi deka T-kleto~nite receptori natimocitite te`neat da se grupiraat so GTK molekulite na kortikalnite kletki vo oblastite na kontakt kletkaso kletka. Odredeni istra`uva~i predlo`ile deka ovie me|udejstva na nezrelite timociti im ovozmo`uvaat daprimat za{titen signal koj spre~uva da do`iveat kleto~na smrt. Kletkite ~ii {to receptori ne mo`at da sevrzat za GTK molekulite nema da stapat vo me|udejstvo so timusnite epitelni kletki i posledovatelno nema da goprimat za{tititniot signal, {to vodi do nivna smrt so apoptoza.Pri pozitivnata selekcija, proteinite RAG-1, RAG-2 i TdT koi se potrebni za genskoto preureduvawe imodificirawe prodol`uvaat da bidat prika`ani (vidi slika 5-7). Spored toa, site nezreli timociti vo klonotmodificirawe prodol`uvaat da bidat prika`ani (vidi slika 5 7). Spored toa, site nezreli timociti vo klonotkoi prika`uvaat dadena beta veriga imaat mo`nost da preuredat razli~ni geni za TKR alfa verigata, a potoarezultira~kite TKR se selektiraat za prepoznavawe na sopstveniot GTK. Samo onie kletki ~ii {to alfa-betaTKR heterodimer prepoznava sopstvena GTK molekula se selektiraat za pre`ivuvawe. Spored toa, prisustvoto napove}e od edna kombinacija na alfa-beta TKR verigite pome|u ~lenovite na klonot e zna~ajno bidej}i jazgolemuva mo`nosta odredeni ~lenovi da go üpominatû testot na pozitivnata selekcija. Sekoja kletka koja }euspee da ja preuredi alfa verigata {to ovozmo`uva rezultira~kiot alfa-beta TKR da go prepoznae sopstveniotGTK }e bide po{tedena; site ~lenovi na klonot koi nema da uspeat da go napravat ova }e umrat so apoptoza za 3 do4 dena.

Negativnata selekcija obezbeduva samo-tolerancijaPopulacijata na GTK spregnati timociti koi ja pre`iveale pozitivnata selekcija vklu~uva kletki so receptorikoi imaat od nizok do visok afiniteten opseg za sopstveniot protivgen koj e prezentiran od strana nakoi imaat od nizok do visok afiniteten opseg za sopstveniot protivgen koj e prezentiran od strana nasopstvenite GTK molekuli. Timocititite so visoko afinitetni receptori se otstranuvaat pri negativnataselekcija so me|udejstvo so stromalnite kletki na timusot. Za vreme na negativnata selekcija, steblestitekletki i makrofagite koi imaat klasa 1 i klasa 2 GTK molekuli stapuvaat vo me|udejstvo so timocitite koiimaat receptori so visok afinitet za sopstven protivgen plus sopstvena GTK molekula ili samo za sopstveniGTK molekuli (vidi slika 10-6). Sepak, to~nite detali za procesot s#u{te ne se poznati. Zabele`ano e dekakletkite koi do`ivuvaat negativna selekcija, umiraat so apoptoza. Spored toa tolerancijata kon sopstveniprotivgeni, so koi se sre}avaat vo timusot, se postignuva so otstranuvawe na T kletkite koi se reaktivni konovie protivgeni.

7

Eksperimentite gi otkrija potrebnite elementi na pozitivnata inegativnata selekcija

Direktniot dokaz deka pozitivnata selekcija vo timusot bara vrzuvawe natimocitite za klasa 1 ili klasa 2 GTK molekulite doa|a odeksperimentalnite studii so gluvci so otstraneti geni (nokautiranigluvci) koi ne se sposobni za sozdavawe funkcionalni klasa 1 ili klasa 2GTK molekuli (tabela 10 1) Otkrieno e deka gluvcite so nedostatok naGTK molekuli (tabela 10-1). Otkrieno e deka gluvcite so nedostatok naklasa 1 imaat normalna raspredelba na dvojno-negativni, dvojno-pozitivni iKD4 timociti, no ne mo`at da sozdadat KD8 timociti. Gluvcite sonedostatok na klasa 2 imale dvojno negativni, dvojno-pozitivni i KD8timociti, no im nedostasuvale KD4 timociti. Ne e za iznenaduvawe deka volimfnite jazli na ovie gluvci, so nedostatok na klasa 2, nedostasuvaa KD4 Tkletki. Spored toa, otsustvoto na klasa 1 ili klasa 2 GTK molekulite jaspre~uva pozitivnata selekcija na KD8+ ili KD4+ T kletkite soodvetnospre~uva pozitivnata selekcija na KD8+ ili KD4+ T kletkite, soodvetno.

8

(slika 10-7 Efekt na haplotipot na doma}inot vrz T kleto~noto zreewe kaj gluvci koi nosat transgeni koikodiraat H-2 klasa 1 spregnat T-kleto~en receptor koj e specifi~en za influenca virusot. Prisustvoto na

TKR j Ppreuredenite TKR transgeni gi supresira drugite genski preureduvawa kaj transgeni~nite gluvci. Poradi toa,pove}eto timociti kaj transgeni~nite go prika`uvaat alfa-beta T-kleto~niot receptor kodiran od transgenot.Nezrelite dvojno-pozitivni timociti sozrevaat vo KD8 T kletki samo kaj transgeni~nite so haplotip (H-2 ) kojodgovara na GTK spregnuvaweto na TKR transgenot.

Ponatamo{nite eksperimenti so transgeni~nite gluvci ovozmo`ija dopolnitelni dokazi deka me|udejstvoto soGTK molekulite igra uloga vo pozitivnata selekcija. Vo ovie eksperimenti, preuredenite alfa beta TKR genikoi proizleguvaat od KD8 T kleto~niot klon specifi~en za protivgenot na influenca plus H-2 klasa 1 GTKmolekula bea injektirani vo oplodeni jajca od dva razli~ni soevi na gluvci, eden so haplotip H-2 i eden sohaplotip H-2 (slika 10-7). Bidej}i receptornite transgeni ve}e bea preuredeni, drugite preureduvawa na TKRgenite bea supresirani vo transgeni~nite gluvci. Poradi toa, golem procent od timocititite vo transgeni~nitegluvci prika`uvaa T-kleto~en receptor koj e kodiran od strana na transgenot. Otkrieno e deka timocitite koiprika`uvaat TKR transgen sozrevaat vo KD8 T kletki samo kaj transgeni~nite gluvci so haplotip H 2 klasa 1prika`uvaat TKR transgen sozrevaat vo KD8 T kletki samo kaj transgeni~nite gluvci so haplotip H-2 klasa 1GTK (t.e, haplotipot za koj e spregnat transgeni~niot receptor). Kaj transgeni~nite gluvci so razli~en GTKhaplotip (H-2 ), prisutni se nezreli, dvojno pozitivni timociti koi go prika`uvaat transgenot, no ovie kletkine mo`at da sozreat vo KD8 T kletki. Ovie naodi potvrdija deka me|udejstvoto pome|u T-kleto~nite receptori nanezrelite timociti i sopstvenite GTK molekuli e potrebno za pozitivna selekcija. Vo otustvo na sopstveni GTKmolekuli, kako kaj transgeni~nite gluvci H-2 , ne nastanuva pozitivna selekcija i posledovatelnoto zreewe.Dokazot za otstranuvawe na timocitite koi se reaktivni kon sopstveniot protivgen plus GTK molekula doa|a odbrojni eksperimentalni studii. Vo edna studija, zreeweto na timocitite e analizirano kaj transgeni~ni gluvcikoi imaat alfa-beta TKR transgen koj e specifi~en za klasa 1 D GTK molekula plus protivgen H-Y, mal proteinkoj e kodiran na Y hromozomot i spored toa e sopstvena molekula samo kaj gluvcite od ma{ki pol. Pri ovojeksperiment, GTK haplotipot na transgeni~niot glu{ec e H-2 , ist kako spregnuvaweto na GTK transgen-kodiraniot receptor. Spored toa, site razliki vo selekcijata na timocitite kaj transgeni~nite ma`jaci i `enki}e bidat povrzani so prisutvoto ili otsustvoto na H-Y protivgenot.Analizata na timocitite od transgeni~nite gluvci otkri deka gluvcite od `enski pol sodr`at timociti koiprika`uvaat H-Y specifi~en TKR transgen, a gluvcite od ma{ki pol ne go sodr`at (slika 10-8). So drugi zborovi,H-Y reaktivnite timociti kaj gluvcite od ma{ki pol se sopstveno reaktivni i se otstranuvaat. Sepak, kajtransgeni~nite `enki koi ne go prika`uvaat protivgenot H-Y, ovie kletki ne se sopstveno reaktivni i spored toane se otstranuvaat. Koga timocitite od ovie ma{ki transgeni~ni gluvci se kultivirani in vitro so protivgenprika`uva~ki kletki, koi go prika`uvaat H-Y protivgenot, zabele`ano e deka timocitite pretrpuvaat apoptoza,{to e zna~aen primer za negativna selekcija.

9

(slika 10-8 Eksperimentalen prikaz deka negativnata selekcija na timocitite bara i sopstven protivgen isopstven GTK. Pri ovoj eksperiment, N-2 transgeni~nite ma{ki i `enski se podgotveni da nosat TKR transgeni

f H Y D O j j FACSspecifi~ni za H-Y protivgenot plus molekulata D . Ovoj protivgen se prika`uva samo kaj ma`i. FACS analizatana timocitite od transgeni~nite poka`a deka zrelite KD8 T kletki koi go prika`uvaat transgenot se otsutni kajgluvcite od ma{ki pol, no prisutni kaj gluvcite od `enski pol, {to poka`uva deka timocitite koi se reaktivnikon sopstveniot protivgen (vo ovoj slu~aj, protivgenot H-Y kaj gluvcite od ma{ki pol) se otstraneti priselekcijata vo timusot.

Odredeni va`ni problemi za timusnata selekcija ostanuvaat nere{eniIako dosta e nau~eno za razvojnite procesi koi sozdavaat zreli KD4 i KD8 T kletki, sepak s#u{te ima misterii.Me|u niv zna~aen e paradoksot: Ako pozitivnata selekcija ovozmo`uva samo timocitite koi se reaktivni sosopstvenite GTK molekuli da pre`iveat i ako negativnata selekcija gi otstranuva timocitite koi se reaktivnikon sopstvenite GTK molekuli, toga{ na niedna T kletka nema da $ bide dozvoleno da sozree. Imaj}i predvid dekaova ne e rezultatot od razvojot na T-kletkite, jasno e deka drugi faktori rabotat za da spre~at ovie dva GTK-

GTK Tzavisni procesi da go otstranat celoto razli~ie na GTK spregnatite T-kletki.Eksperimentalniot dokaz od kultura na fetalen timusen organ (KFTO) e polezen pri re{avaweto na ovaazagatka. Vo ovoj sistem, timusnite lobusi na glu{ecot se prese~eni 16-tiot den od gestacijata i staveni vokultura. Vo toj moment, lobusite sodr`at glavno KD4 8 timociti. Bidej}i ovie nezreli, dvojno-negativnitimociti prodol`uvaat da se razvivaat vo organ-kulturata, timusnata selekcija mo`e da se prou~uva pod uslovikoi dozvoluvaat opseg na informativni eksperimenti. Posebno se upotrebuvaat gluvci kaj koi e otstranetpeptidniot transporter, TAP-1. Vo otsustvo na TAP-1, samo niski nivoa na klasa 1 GTK se prika`uvaat vrztimusnite kletki, a razvojot na KD8 timocitite e blokiran. Sepak, koga se dodavaat egzogeni peptidi vo ovieorgan-kulturi, vrz povr{inata na timusnite kletki se pojavuvaat klasa 1 GTK molekuli koi nosat peptidi i seobnovuva razvojot na KD8 T kletkite. Zna~ajno e toa {to, koga se dodava me{avina od razli~ni peptidi, stepenotna obnovuvawe na KD8 T-kletkite e pogolem otkolku koga se dodava eden peptid. Ova uka`uva deka ulogata napeptidite ne e samo da go poddr`uvaat stabilnoto prika`uvawe na GTK, tuku isto taka i samite da bidatprepoznaeni vo procesot na selekcija.r r c c jDve sprotivstaveni teorii se obiduvaat da go objasnat paradoksot na GTK zavisnata pozitivna i negativnaselekcija. Hipotezata na aviditetot tvrdi deka razlikite vo silata na signalite koi gi primaat timocititekoga pretrpuvaat pozitivna i negativna selekcija go odreduvaat rezultatot, kade {to silata na signalot ediktirana od aviditetot na me|udejstvoto TKR-GTK-peptid. Hipotezata na razli~noto signalizirawe tvrdideka rezultatite od selekcijata se diktirani od razli~ni signali namesto razli~na sila na istiot signal.

10

(slika 10-9 Ulogata na peptidite vo selekcijata. Timusite koi se `neat pred nivnite timocitni populacii da pretrpat pozitivnai negativna selekcija ovozmo`uvaat prou~uvawe na razvojot i selekcijata na edno-pozitivnite (KD4 KD8 i KD4 KD8 ) T kletki. (a)Prikaz na eksperimentalnata postapka za in vitro kultivirawe fetalen timusen organ (KFTO) (b) Razvojot i selekcijata na KD8Prikaz na eksperimentalnata postapka za in vitro kultivirawe fetalen timusen organ (KFTO). (b) Razvojot i selekcijata na KD8KD4 klasa 1 spregnati T kletki zavisi od me|udejstvoto TKR peptid-GTK 1. Gluvcite na koi im e otstranet TAP-1 ne mo`at daformiraat kompleksi peptid-GTK osven ako ne im e dodaden peptid. Gluvcite koi bea koristeni vo ovaa studija se transgeni~ni zaalfa i beta verigite na TKR koj go prepoznava dodadeniot peptid vrzan za GTK 1 molekulite kaj TKR transgeni~nite gluvci na koiim e otstranet TAP-1. So menuvawe na koncentracijata na dodadeniot peptid e otkrieno deka niskite koncentracii na peptid, koisozdavaat nizok aviditet za vrzuvawe, rezultira so pozitivna selekcija i skoro normalni nivoa na KD4 KD8 kletkite. Visokitekoncentracii na peptidot, koi sozdavaat visok aviditet za vrzuvawe so TKR, predizvikaa negativna selekcija i se pojavija mal brojKD4 KD8 T kletki.

Hipotezata za aviditetot bila testirana na gluvci na koi im e otstranet TAP-1 transgeni~ni za alfa-beta TKR koj go prepoznalkompleksot LHMV peptid-GTK. Ovie gluvci bile upotrebeni za podgotvuvawe na kulturi na fetalen timusen organ (slika 10-9).Aviditetot na me|udejstvoto TKR-GTK variralo so upotrebata na razli~ni koncentracii od peptidot. Pri niski koncentracii napeptidot, nekolku GTK molekuli se vrzuvaat za peptidot i aviditetot na me|udejstvato TKR-GTK e nizok. Kako {to rastekoncentracijata na peptidite, se zgolemuva brojot na kompleksi peptid-GTK, a isto taka se zgolemuva i aviditetot name|udejstvoto Pri ovoj eksperiment se pojavile mnogu malku KD8 kletki koga ne bil dodaden peptid no duri i niskime|udejstvoto. Pri ovoj eksperiment, se pojavile mnogu malku KD8 kletki koga ne bil dodaden peptid, no duri i niskikoncentracii na zna~ajniot peptid rezultirale so pojava na zna~aen broj na KD8 T kletki koi imaat transgeni~en TKR receptor.So zgolemuvawe na koncentracijata na peptidite do optimalno nivo se dobil najvisok broj na KD8 T kletki. Sepak, pri povisokikoncentracii na peptidot, brojot na sozdadeni KD8 T kletki se namaluval postepeno. Rezultatite od ovie eksperimentipoka`uvaat deka pozitivna i negativna selekcija mo`e da se postigne so signali sozdadeni od istata kombinacija na peptid-GTK.Nemawe signal (nema peptid) ne ja poddr`uva pozitivnata selekcija. Slab signal (nisko nivo na peptid) pottiknuva pozitivnaselekcija. Sepak, prejakiot signal (visoko nivo na peptid) doveduva do negativna selekcija.Modelot na razli~no signalizirawe ovozmo`uva alternativno objasnuvawe za odreduvaweto dali T kletkata pretrpuva pozitivnaili negativna selekcija. Ovoj model e kvalitativen namesto kvantitativen i ja naglasuva prirodata na signalot koj e dostaven odTKR namesto negovata sila. Vo sredi{teto na ovoj model e zabele{kata deka odredeni kompleksi GTK-peptid mo`at da dostavatsamo slab ili delumno aktiven signal dodeka drugi mo`at da dostavat celosen signal. Vo ovoj model, pozitivna selekcija nastanuvakoga TKR od razvojnite timociti se sretnuvaat so kompleksi GTK-peptid koi dostavuvaat slab ili parcijalen signal do nivnitereceptori, a negativnata selekcija se slu~uva koga signalot e celosen. Vo ovoj moment ne e mo`no da se odlu~i pome|u modelot naaviditet i modelot na razli~no-signalizirawe, zatoa {to i dvata imaat eksperimentalna poddr{ka. Mo`ebi vo odredeni slu~ai,eden od ovie mehanizmi raboti so celosno isklu~uvawe na drugiot. Isto taka e mo`no deka nitu eden mehanizam ne e sam odgovoren

| j } j Zza kleto~nite me|udejstva koi se slu~uvaat vo timusot i pove}e od eden mehanizam mo`e da igra zna~ajna uloga. Za kompletirawe nainformaciite za ovoj problem potrebna e ponatamo{na rabota.Razli~noto prika`uvawe na koreceptorot KD8 isto taka mo`e da vlijae vrz timusnata selekcija. Vo eksperiment kade {toprika`uvaweto na KD8 ve{ta~ki be{e poka~eno do dvata pati nad negovoto nivo, koncentracijata na zreli KD8 kletki vo timusotbe{e edna trinaesetina od koncentracijata kaj kontrolnite gluvci koi imaat normalni nivoa na KD8 vrz nivnata povr{ina. [tomme|udejstvoto na T kletkite so klasa 1 GTK molekulite e zajaknato so u~estvoto na KD8, mo`ebi zgolemenoto prika`uvawe na KD8}e go zgolemi aviditetot na timocitite za klasa 1 molekulite, po mo`nost pravej}i ja nivnata negativna selekcija poverojatna.

11

(slika 10-10 Predlo`eni modeli za ulogata na koreceptorite KD4 i KD8 pritimusnata selekcija na dvojno pozitivnite timociti koi vodat do edno pozitivnitimusnata selekcija na dvojno-pozitivnite timociti koi vodat do edno-pozitivniT kletki. Spored instruktivniot model, me|udejstvoto na eden koreceptor so GTKmolekulite na stromalnite kletki doveduva do namaluvawe na drugiot koreceptor.Spored stohasti~niot model, namaluvaweto na KD4 ili KD8 e slu~aen proces.

Drugo va`no otvoreno pra{awe za timusnata selekcija e kako dvojno-pozitivnitetimociti se naso~uvaat da stanat KD4 8 ili KD4 8 T kletki. Selekcijata na KD4 8timocitite doveduva do klasa 1 GTK-spregnati KD8 T kletki i klasa 2 spregnatiKD4 T Z bj f j jKD4+ T kletki. Za objasnuvawe na transformacijata na dvojno-pozitivniotprethodnik vo edna od dvete razli~ni edno-pozitivni lozi, predlo`eni se dvamodeli (slika 10-10). Instruktivniot model predlaga deka pove}e me|udejstvapome|u TKR, KD8 ili KD4 koreceptorite i klasa 1 ili klasa 2 GTK molekuliteim nalo`uvaat na kletkite da se diferenciraat ili vo KD8 ili KD4 edno-pozitivni kletki, soodvetno. Ovoj model predviduva deka klasa 1 GTK-specifi~niot TKR zaedno so koreceptorot KD8 }e sozdade signal koj e razli~en odsignalot koj e pottiknat od klasa 2 GTK-specifi~niot TKR zaedno sokoreceptorot KD4 Stohasti~niot model predviduva deka prika`uvaweto na KD4koreceptorot KD4. Stohasti~niot model predviduva deka prika`uvaweto na KD4ili KD8 e isklu~eno po slu~aen izbor bez da bide povrzana so specifi~nosta naTKR. Samo onie timociti ~ii {to TKR i ostanatiot koreceptor ja prepoznavaatistata klasa na GTK molekula }e sozreat. Vo momentov, ne e mo`no da se izbereedniot model pred drugiot.

12

Aktivacija na T-kletkite

Glavniot nastan vo sozdavaweto i na humoralnite i na kleto~no posreduvanite imuniodgovori e aktivacijata i klonalnata ekspanzija na T kletkite. T kleto~nata aktivacija epottiknata od me|udejstvoto na kompleksot TKR-KD3 so obraboten protivgen peptid koj evrzan ili za klasa 1 (KD8 kletkite) ili za klasa 2 ( KD4 kletkite) GTK molekuli vrzpovr{inata na protivgen prika`uva~kite kletki. Ova me|udejstvo i rezultantniteaktivira~ki signali isto taka vklu~uvaat razli~ni pomo{ni membranski molekuli vrz Tkletkata i vrz protivgen prika`uva~kata kletka. Me|udejstvoto na T kletkata soprotivgenot zapo~nuva redica na biohemiski procesi koi ja pottiknuvaat miruva~kata Tkletkata da vleze vo kleto~niot ciklus, pri {to proliferiraat i se diferenciraat vopamte~ki ili efektorni kletki Mnogu od ovie genski produkti koi se pojavuvaat pripamte~ki ili efektorni kletki. Mnogu od ovie genski produkti koi se pojavuvaat prime|udejstvoto so protivgenot mo`e da se grupiraat vo edna od trite kategorii, vo zavisnostod toa kolku rano tie mo`e da bidat otkrieni po prepoznavaweto na protivgenot (tabela 10-2):

Neposredni geni, koi se prika`uvaat polovina ~as po prepoznavaweto na protivgenot,kodiraat odreden broj na transkripciski faktori, vklu~uvaj}i gi c-Fos, c-Myc, c-Jun,NFAT i NF-kB.Rani geni, koi se prika`uvaat od 1 do 2 ~asa po prepoznavaweto na protivgenot, gi kodiraatIL-2, IL-2R (IL-2 receptor), IL-3, IL-6, IFN-gama i brojni drugi proteini., ( r c r), , , r j dru rDocni geni, prika`ani po pove}e od 2 dena od prepoznavaweto na protivgenot, kodiraatrazli~ni adhezivni molekuli.

Ovie dlaboki promeni se rezultat na signalno-prenesuva~kite pateki koi se aktiviraatpri kontakt pome|u TKR i GTK-peptid kompleksot. Pregled na del od osnovnite strategiina kleto~noto signalizirawe }e pretstavuva korisna podloga za cenewe na specifi~nitesignalni pateki koi gi koristat T kletkite.

13

(slika 10-11 Signalizirawe posreduvano od TKRPovrzuvaweto na TKR so peptid-GTK kompleksot go pottiknuva grupiraweto na signalniot kompleks. Prv ~ekor pretstavuva p56 posreduvanata fosforilacijata na ITAM na zetaverigata od TKR kompleksot, sozdavaj}i mesta za koi se prika~uva ZAP-70 i se aktivira preku fosforilacija. Serija na ZAP-70 katalizirani proteinski fosforilacii gor j r u r r u f f r j r j r r f f rovozmo`uvaat sozdavaweto na brojni signali. (Kratenki: DAG=diacilglicerol, GADS= GRb2-sli~en adaptor podolu od Shc (GRb2-like adaptor downstream of Shc), GRF= gvaninnukleotid razmenuva~ki faktor, ITAM=imunoreceptorski tirozin-baziran aktivira~ki motiv, ItK= inducibilna T-kleto~na kinaza, IF =inozitol 1,4,5 trifosfat,PAT=povrzuva~ na aktivirani T kletki, FIF =fosfoinozitol bifosfat, FLCgama=fosfolipaza C gama, SLP-76= SH sodr`e~ki leukocit-specifi~en protein od 76 kDa, ZAP-70=zeta- asociran protein od 70 kDa).

Pove}e signalni pateki se pottiknuvaat so povrzuvawe na TKRKako {to objasnivme prethodno, otkrivaweto i tolkuvaweto na signalite od okolinata se neophodni osobini na site kletki, vklu~uvaj}i gi i kletkite od imuniot sistem. Odredenizaedni~ki osobenosti se voobi~aeni za ovie zna~ajni procesi na spojuvawe. Ovie osobenosti nakuso se navedeni tuka, podetalno objasnuvawe e dadeno vo poglavje 1, posebno slika 1-6.

Prenesuvaweto na signalot zapo~nuva so me|udejstvo pome|u signalot i negoviot receptor.Mnogu pateki za prenesuvawe na signalot vklu~uvaat signal -pottiknato grupirawe na nekoi komponenti od patekata, ovie grupi koristat adaptorni proteini.Primaweto na signalot ~esto vodi do sozdavawe na üvtor glasnik” vo kletkata, molekula ili jon koj mo`e da difundira do drugite delovi na kletkata i da predizvikametaboli~ni promeni.Protein kinazite i protein fosfatazite se aktiviraat ili inhibiraat.Signalite se zasileni od enzimskata skala (kaskada).

Nastanite koi go povrzuvaat prepoznavaweto na protivgenot od strana na T-kleto~niot receptor so aktivacijata na genot otslikuvaat mnogu od ovie osobenosti. Klu~niot element prir u r r d r r c r c j u u d u rpottiknuvaweto na aktivacijata na T-kletkite pretstavuva nivnoto prepoznavawe na GTK-peptid kompleksite vrz protivgen prika`uva~kite kletki. Ovoj nastan katalizira serija navnatrekleto~ni procesi koi zapo~nuvaat na vnatre{nata povr{ina od plazminata membrana i kulminiraat vo jadroto, {to doveduva do transkripcija na genite koi go kontroliraatkleto~niot ciklus i/ili diferencijacijata na T kletkata.

Kako {to objasnivme vo poglavje 9, TKR vo najgolem del se sostoi od nadvorkleto~na ligand-vrzuva~ka edinica, vnatrekleto~na signalna edinica, KD3 kompleksot i homodimer od zetaverigi. Eksperimentite so gluvci so otstraneti geni poka`aa deka site ovie delovi se neophodni za prenesuvawe na signalot. Mo`at da se prepoznaat dve fazi pri protivgen-posreduvanoto pottiknuvawe na T-kleto~niot odgovor: po~etok i sozdavawe na signal:

Po~etok. Va`no e T-kleto~noto signalizirawe da se regulira, a aktivacijata nastanuva kako rezultat na specifi~noto vrzuvawe na protivgenot. Kaj T kletkata koja miruva, p56 ,proteinska tirozin kinaza koja e neophodna za pottiknuvawe na TKR signaliziraweto, e izlolirana od TKR kompleksot. Kinazata p56 obi~no se nao|a vo lipidnite raftovi(pregradi), membranski mikrodomeni koi se bogati so svingomielin, glikosfingolipidi i holesterol. Nevrzaniot TKR kompleks e isklu~en od ovie domeni. Koga TKR }e se povrze soGTK-peptid, TKR kompleksot se povrzuva so lipidnite raftovi, po {to sledi grupirawe so koreceptorite KD4 ili KD8 koi se vrzuvaat za nepromenlivite podra~ja na GTK molekulata(slika 10-11). Potoa tirozinskata kinaza p56 , koja e povrzana so citoplazmatskite kraevi na koreceptorite koga kletkata e vo miruva~ka sostojba, se dobli`uva do citoplazmatskitekraevi na TKR kompleksot, kade gi fosforilira imunoreceptorskite tirozin-bazirani aktivira~ki motivi (ITAM, vidi slika 9-9) od komponentnite polipeptidi na KD3.Fosforiliranite tirozini vo ITAM od zeta verigata ovozmo`uvaat mesta za prika~uvawe na druga protinska tirozin kinaza nare~ena ZAP-70 (~ekor 2 na slika 10-11) i taa stanuvaaktivna. Potoa ZAP-70 ja katalizira fosforilacijata na nekolku membranski-asocirani adaptorni molekuli, vklu~uvaj}i gi Vav-1, Sch, LAT i SLP-76 (~ekor 3), koi deluvaat kakopotpora za vklu~uvawe na posredni~kite molekuli koi se povrzani so odreden broj vnatrekleto~ni pateki za prenesuvawe na signalot. Edna od ovie pateki vklu~uva forma na enzimotfosfolipaza C (FLCgama), koja se prilepuva za adaptorna molekula, se aktivira so fosforilacija i go razlo`uva membranskiot fosfolipid za da sozdade vtori~ni glasnici. Ovaapateka isto taka doveduva do aktivirawe na transkripciskiot faktor, nuklearen faktor kapa B, ili NF-kB. Druga pateka go aktivira proteinot G.Sozadavawe pove}e vnatrekleto~ni signali. Mnogu signalni pateki se aktiviraat kako posledica na ~ekorite koi se slu~uvaat vo po~etnata faza, kako {to e prika`ano dolu desno naslika 10-11 i objasneto podolu.Karakteristika na po~etnata faza od TKR signaliziraweto pretstavuva sozdavaweto na supramolekulska struktura poznata kako imunolo{ka sinapsa, ili IS. IS, nare~en taka kakoanalogija na sinapsata pome|u nevronite, e dinami~na i visoko organizirana struktura koja se formira tamu kade {to T-kletkite stapuvaat vo kontakt so protivgen prika`uva~kitekletki. Se veruva deka navleguvaweto na TKR vo lipidnite raftovi e zna~ajna karakteristika pri sozdavaweto na IS. Centralnoto podra~je na IS e mnogu bogato so TKR/KD3kompleksi kako i so drugi intrakleto~ni signalni proteini povrzani so TKR kompleksot, dodeka nadvore{niot, prsten vo vid na krofna koj go opkru`uva centralnoto podra~je sodr`iadhezivni molekuli kako {to e LFA-1 (slika 10-11, prilog). Iako sozdavaweto na IS ne e potrebno za po~etnata faza na TKR signaliziraweto, T-kleto~nata aktivacija e poefikasnaako se formira IS.]e razgledame del od signalnite pateki koi se koristat pri aktivacijata na T-kletkite, no celiot proces e mo{ne kompleksen i ovde }e izostavime mnogu detali. Prilozite vopregledot na krajot od poglavjeto ovozmo`uvaat detalno pokrivawe na ovaa mnogu aktivna istra`uva~ka oblast.

14

(slika 10-12 Pateki za prenesuvawe na signalot povrzani so aktivacija na T-kletkite. (a) Fosfolipazata C gama (FLC gama) seaktivira so fosforilacija. Aktiviranata FLC gama ja hidrolizira fosfolipidnata komponenta na plazma membranata za dasozdade vtori~ni glasnici DAG i IF (b) Proteinskata kinaza C (PKC) e aktivirana od DAG i Ca Me|u brojnite efekti nasozdade vtori~ni glasnici, DAG i IF . (b) Proteinskata kinaza C (PKC) e aktivirana od DAG i Ca . Me|u brojnite efekti naPKC e aktivacijata na IKK, {to go fosforilira IkB, citoplazmatski protein koi se vrzuva za prepi{uva~kiot faktor NF-kB ispre~uva negovo navleguvawe vo jadroto. Fosforilacijata na IkB go osloboduva NF-kB, koj potoa se preseluva vo jadroto. (v) Cazavisno aktivirawe na kalcineurin. Kalcineurinot e Ca /kalmodulin zavisna fosfataza. IF posreduva pri osloboduvaweto naCa od endoplazmatskiot retikulum. Ca se vrzuva za proteinot kalmodulin, koj potoa se povrzuva i go aktivira Ca /kalmodulinzavisniot fosfatazen kalcineurin. Aktiviraniot kalcineurin otstranuva fosfatna grupa od NFAT, {to mu ovozmo`uva na ovojtranskriptiven faktor da se preseli vo jadroto.FLCgama se aktivira so fosforilacija i dobiva pristap do negoviot supstrat preku vrzuvawe so membrana-povrzaniotadaptorniot protein LAT vo kombinacija so inducibilnata T-kleto~na kinaza (ItK) (slika 10-12a). FLCgama go hidrolizirafosfoinozitol bifosfatot, FIF , fosfolipidna komponenta na membranata, za da sozdade inozitol 1,4,5-trifosfat (IF ) idiaciglicerol (DAG). IF predizvikuva brzo osloboduvawe na Ca od endoplazmatskiot retikulum i gi otvara Ca -ovite kanali vokleto~nata membrana (slika 10-12v). DAG ja aktivira proteinskata kinaza C, pove}efunkcionalna kinaza koja fosforilira mnogurazli~ni celi (slika 10-12b).

CCa

Kalciumoviot jon e vklu~en vo {irok spektar na procesi, vklu~uvaj}i gi vidot, kontrakcija na muskulite i mnogu drugi. Tojpretstavuva neophoden element vo mnogu T-kleto~ni reakcii, a osloboduvaweto na kalciumot od endoplazmatskiot retikulum nakrajot doveduva do fosforilacija na zna~ajniot transkriptiven faktor, NFAT, koj kulminira so transport na NFAT odcitoplazmata vo jadroto (slika 10-12v). Vo jadroto, NFAT ja poddr`uva transkripcijata na genite koi se potrebni za prika`uvawena citokinite koi go pottiknuvaat rastot na T-kletkite IL-2, IL-4 i drugi.

Protein kinaza C (PKC)

Sozdavaweto na DAG od strana na FLCgama doveduva do aktivacija na protein kinazata C (PKC). Aktivacijata vodi konprenesuvawe na PKC do lipidnite raftovi, kade {to enzimot pottiknuva serija na procesi koi vodat do aktivacija naprepi{uva~kiot faktor NF-kB (slika 10-12b).r u f r ( )

Nuklearen faktor kapa B (NF-kB)

Nuklearniot faktor kapa B e zna~aen transkriptiven faktor pottiknat od golem broj na signali kaj mnogu vidovi na kletki,vklu~uvaj}i gi i kletkite od imuniot sistem. Sepak, patekata koja vodi do aktivacija na NF-kB vo T kletkite e nova. Aktivacijatana PKC od strana na FLCgama vodi do grupirawe na membranski vrzan kompleks od proteini vo koi spa|aat KARMA1, BCL-10 iMALT1. Ovoj kompleks, {tom se soedini, ja vodi aktivacijata na pove}eproteinskiot enzim poznat kako IKK (inhibitor na kBkinazata). IKK, po redosled, go fosforilira inhibitorot na kB ili IkB (slika 10-12b). IkB obi~no se vrzuva za NF-kB,zadr`uvaj}i go vo citoplazmata, no pri fosforilacija na IkB od strana na IKK, NF-kB se osloboduva i migrira vo jadroto, kadeja aktivira transkripcijata na genite. IL-2 e zna~ajna meta na NF-kB.

15

(slika 10-13 Aktivacija na maliot G protein Ras. Signalite od T-kleto~niot receptor rezultiraat so aktivacijana Ras preku rabotata na specifi~nite gvanin nukleotid razmenuva~ki faktori (GRF) koi ja kataliziraat

GDF GTF A R jrazmenata na GDF za GTF. Aktiviraniot Ras predizvikuva serija reakcii koi rezultiraat so zgolemeno sozdavawena prepi{uva~kiot faktor Fos. Po nivnata fosforilacija, Fos i Jun dimeriziraat za da go dadatprepi{uva~kiot faktor AP-1. Zabele`ete deka site ovie pateki imaat zna~ajni efekti koi se razli~ni odspecifi~nite primeri koi se prika`ani na slikata.

Patekata na Ras/MAP kinazataRas e neophodna komponenta vo signalno-prenesuva~kite pateki koja {to se sre}ava kaj mnogu vidovi na kletki ievolutivno e za~uvana vo spektar na eukarioti od kvascite do lu|eto. Ras e mal G protein ~ija aktivacija odstrana na GTF pottiknuva serija na proteinski kinazi poznata kako mitogen-aktivirana protein kinazna (MAPkinazna) pateka. Fosforilacijata na krajniot produkt od ovaa serija, MAP kinaza (isto taka nare~ena ERK),ovozmo`uva da se aktivira Elk, transkriptiven faktor potreben za prika`uvaweto na Fos (slika 10-13).Fosforilacijata na Fos od strana na MAP kinazata mu ovozmo`uva da se povrze so Jun za da formira AP-1, koj e

f T j AP 1 j jneophoden transkriptiven faktor za T-kleto~nata aktivacija. AP-1 isto taka ja regulira i transkripcijata naIL-2.

Kolku TKR kompleksi mora da bidat povrzani za da se pottikne aktivacija na T kletkite?Pra{aweto kolku ligandi T kletkata mora da prepozne pred da nastane aktivacijata e postaveno od mnogumina. Doneodamne{nite novi informacii za edno-kleto~noto prika`uvawe, ovie presmetki se odreduvaa so indirektni ineprecizni sredstva. Mark Dejvis i kolegite od medicinskoto u~ili{te Stanford na ova pra{awe mu pristapijaso upotreba na akutno-~uvstvitelna, tehnika so mikroskopska vizualicija sostavena od dva dela. Protivgenprika`uva~kite kletki kratko bea tratirani so peptid koj sodr`i terminalno biotinska molekula. Brojot napeptidi koi se vrzani za GTK mo`e da se odredeni so dodavawe kowugat streptavidin-fikoeritrin, koj se vrzuvaza biotinot od biotiniziraniot peptid i mo`e da se pottikne da zra~i svetlina za ponatamo{no prika`uvawe. Tza biotinot od biotiniziraniot peptid i mo`e da se pottikne da zra~i svetlina za ponatamo{no prika`uvawe. Tkletkite koi se specifi~ni za biotiniziraniot peptid-GTK kompleks se polnat so fura-2, boja koja se koristi zaprika`uvawe na slobodniot vnatrekleto~en kalcium, koj }e slu`i kako pokazatel za T-kleto~nata aktivacija.Potoa T-kletkite se dodavaat na protivgen prika`uva~kite kletki. So upotreba na ovaa mnogu ~uvstvitelnatehnika, ovie istra`uva~i mo`at da odredat (1) dali T kletkata e aktivirana i (2) kolku molekuli peptid bileprisutni vo momentot na kontakt pome|u T kletkata i protivgen prika`uva~kata kletka-so drugi zborovi, kolkuTKR-GTK-biotinilirani peptidni kompleksi se formirale. Istra`uva~ite utvrdile deka samo eden peptiddoveduva do osloboduvawe na Ca i deka maksimalnoto osloboduvawe na Ca se postignuva kaj KD4 T kletkite kogase povrzani okolu 10 TKR. Sli~ni rezultati se dobieni i so KD8 T kletkite.

16

(slika 10-14 Aktivacijata na Tpo-kletka bara kostimulatoren signal ovozmo`en od strana na protivgen prika`uva~kite kletki(PPK). Me|udejstvoto na ~lenovite od B7 familijata na PPK so KD28 go dostavuva kostimulatorniot signal. Povrzuvaweto natesno povrzanata molekula CTLA 4 so B7 sozdava inhibitoren signal Site ovie molekuli sodr`at najmalku edentesno povrzanata molekula CTLA-4 so B7 sozdava inhibitoren signal. Site ovie molekuli sodr`at najmalku edenimunoglobulinoviden domen i spored toa pripa|aat na imunoglobulinskata superfamilija.

Za celosna aktivacija na T-kletkite potrebni se kostimulatorni signaliZa T kleto~nata aktivacija potrebno e dinami~no me|udejstvo na pove}e membrana povrzani molekuli koi se objasneti pogore, noovie me|udejstva ne se dovolni sami po sebe za celosna aktivacija na neiskusnite T kletki. Neiskusnite T kletki baraat pove}e odeden signal za aktivacija i posledovatelna proliferacija vo efektorni kletki:

Signal 1, po~etniot signal se sozdava so me|udejstvoto na protivgeniot peptid so TKR-KD3 kompleksot.Posledovatelniot protivgen-nespecifi~en kostimulatoren signal, signal 2, vo osnova se ostvaruva primarno od me|udejstvatopome|u KD28 od T kletkata i ~lenovi od B7 familijata na protivgen prika`uva~kata kletka (slika 10-14).

Postojat dve povrzani formi na B7: B7 1 i B7 2 Ovie molekuli se ~lenovi na imunoglobulinskata superfamilija i imaat sli~naPostojat dve povrzani formi na B7: B7-1 i B7-2. Ovie molekuli se ~lenovi na imunoglobulinskata superfamilija i imaat sli~naorganizacija na nadvorkleto~nite domeni, no zna~itelno razli~ni citoplazmatski domeni. Dvete B7 molekuli vo osnova seprika`uvaat vrz steblestite kletki i se pottiknuvaat na aktiviranite makrofagi i aktiviranite B kletki. Ligandite za B7molekulite se KD28 i CTLA-4 (isto taka poznat kako KD152), pri {to i dvete se prika`uvaat na T-kleto~nata membrana kakodisulfidno-povrzani homodimeri. Kako i B7, i tie se ~lenovi na imunoglobulinskata superfamilija (vidi slika 10-14). IakoKD28 i CTLA-4 pretstavuvaat strukturno sli~ni glikoproteini, tie se odnesuvaat antagonisti~ki. Signaliziraweto niz KD28dostavuva pozitiven kostimulatoren signal do T-kletkata, signaliziraweto niz CTLA-4 e inhibitorno i ja namaluva aktivacijatana T kletkata. KD28 e prika`an i na T kletkite koi se vo miruvawe i na aktiviranite T kletki, no vo kletkite koi miruvaatCTLA-4 e prakti~no nezabele`liv. Obi~no, povrzuvaweto na TKR go pottiknuva prika`uvaweto na CTLA-4, a CTLA-4 lesno sezabele`uva vo period od 24 ~asa po stimulacijata, so maksimalno prika`uvawe od 2 do 3 dena po stimulacijata. Iako najvisokitenivoa na CTLA-4 se poniski od nivoata na KD28, CTLA-4 so blagonaklonost s#u{te se natprevaruva za B7 molekulite bidej}i imazna~itelno povisok afinitet za tie molekuli od KD28. Interesno e toa {to, nivoto na prika`uvawe na CTLA-4 se zgolemuva odKD28-sozdadeniot kostimulatoren signal. Ova ovozmo`uva regulatorno sopirawe preku CTLA-4 koe e vo proporcija sozabrzuvaweto koe go prima preku KD28. Del od zna~eweto na CTLA-4 za regulirawe na aktivacijata i proliferacijata nalimfocitite se otkriva preku eksperimenti so gluvci kaj koi e otstranet CTLA-4. Kaj ovie gluvci T kletkite masovnoproliferiraat {to vodi do limfadenopatija (mnogu zgolemeni limfni jazli) splenomegalija (zgolemena slezina) i smrt 3 do 4proliferiraat, {to vodi do limfadenopatija (mnogu zgolemeni limfni jazli), splenomegalija (zgolemena slezina) i smrt 3 do 4nedeli po ra|aweto. Jasno e deka sozdavaweto inhibitorni signali pri povrzuvaweto na CTLA-4 e zna~ajno za homeostazata nalimfocitite.

17

(slika 10-15 Ekpreimentalen prikaz na klonalnata anergija nasproti klonalnata ekspanzija. (a, b) Se sozdavasamo signal 1 koga miruva~kite Tpo kletki se inkubiraat so glutaraldehid-fiksirani protivgen prika`uva~ki

(PPK) b PPK F b KD28 ( ) R Tkletki (PPK) ili so obi~ni PPK vo prisustvo na Fab delot od protiv-KD28. (v) Rezultantnite anergi~ni Tkletki ne mo`at da reagiraat na obi~ni PPK. (g, d) Vo prisustvo na normalni alogeni~ni PPK ili protiv-KD28,pri {to i dvata go sozdavaat kostimulatorniot signal 2, T kletkite se aktivirani od fiksiranite-PPK.

Klonalna anergija nastanuva koga kostimulatorniot signal e otsutenT-kleto~noto prepoznavawe na protivgeniot peptid-GTK kompleks ponekoga{ doveduva do sostojba nanereaktivnost nare~ena klonalna anergija, koja se bele`i so nesposobnost na kletkite da proliferiraat kakoodgovor na povrzuvaweto na peptid-GTK kompleksot. Dali sledi klonalna ekspanzija ili klonalna anergijazavisi od prisustvoto ili otsustvoto na kostimulatorniot signal (signal 2), kako {to e signalot sozdaden odme|udejstvoto na KD28 vrz T kletkite so B7 vrz protivgen prika`uva~kite kletki. Eksperimentite so kultura nakletki poka`aa deka, ako miruva~kata T kletka primi TKR-posreduvan signal (signal 1) vo otsustvo na soodvetenkostimulatoren signal, toga{ T kletkata }e stane anergi~na. Posebno, ako miruva~kite T kletki se inkubiraat

f PPK B7 ( 10 15 ) f PPK bso glutaraldehid-fiksirani PPK, koi ne prika`uvaat B7 (slika 10-15a), fiksiranite PPK se sposobni da giprika`at peptidite zaedno so klasa 2 GTK molekulite, pri toa ovozmo`uvaj}i go signalot 1, no ne mo`at da godostavat potrebniot kostimulatoren signal 2. Vo otsustvo na kostimulatorniot signal ima minimalno sozdavawena citokini, posebno na IL-2. Anergijata isto taka mo`e da bide pottiknata so inkubirawe na T kletki soobi~ni PPK vo prisustvo na Fpv delot od protiv-KD28, koj go blokira me|udejstvoto na KD28 so B7 (slika 10-15b).Dva razli~ni kontrolni eksperimenti poka`aa deka fiksiranite-PPK koi imaat soodvetni peptid-GTKkompleksi mo`at da dostavat efektiven signal posreduvan od T-kleto~nite receptori. Vo eden eksperiment, Tkletkite se inkubirani i so fiksirani-PPK koi imaat peptid-GTK kompleksi prepoznaeni od strana na TKR vrzT kletkite i obi~ni PPK, koi prika`uvaat B7 (slika 10-15g). Fiksiranite-PPK se vrzuvaat za TKR vrz Tkletkite, a B7 molekulite od povr{inata na obi~nite PPK vkrsteno se povrzuvaat so KD28 vrz T kletkite.Spored toa ovie T kletki gi primaat i dvata signali i se aktiviraat. Dodavaweto na bivalenten protiv-KD28 vome{avinata na fiskirani-PPK i T kletki isto taka ovozmo`uva efektivna kostimulacija preku vkrsteno-f r u f u c j r u rpovrzuvawe so KD28 (slika 10-15d).Postoi dobar dokaz deka i KD4 i KD8 T kletkite mo`at da se anergiziraat, no pove}eto inspituvawa naanergijata se napraveni so KD4 Tpo kletki. T kletkata mo`e da bide anergizirana na nekolku na~ini. Kakododatok na nedostatokot na kostimulatorni signali, signalot 2, pojavuvaweto na CTLA-4 na kletkata koja giprimila i signalot 1 i signalot 2 mo`e da ja blokira kostimulacijata i funkcionalno doveduva do anergija. Iakopostoeweto na anergijata e utvrdeno, preciznite biohemiski pateki koi ja reguliraat ovaa sostojba nanereaktivnost ne se dobro razbrani. Sepak, vo tekot na poslednite nekolku godini eksperimentalnite sistemikoi koristat mikroanalizi (vidi poglavje 22) identifikuvale nekolku klu~ni molekulski komponenti naanergi~nite T kletki, koi vklu~uvaat nekolku ubikvitin ligazi, koi najverojatno ni{anat vrz klu~nikomponenti od TKR signalnata pateka za degradirawe od strana na proteozomot.

18

(slika 10-16 Vkrsteno povrzuvawe na T-kleto~niot receptor i klasa 2 GTK molekulite soposredstvo na superprotivgen. Superprotivgenot se vrzuva za site TKR koi imaat posebnaposredstvo na superprotivgen. Superprotivgenot se vrzuva za site TKR koi imaat posebnaVbeta sekvenca nezavisno od nivnatata protivgenska specifi~nost. Egzogenitesuperprotivgeni se rastvorlivi izla~eni bakteriski proteini, vklu~uvaj}i razli~niegzotoksini. Endogenite superprotivgeni se membranski vgradeni proteini koi sesozdavaat od strana na odredeni virusi. Tie gi vklu~uvaat protivgenite Mls koi sekodirani od strana na gluv~e{kiot tumoren virus kaj cica~ite (TVC),

Superprotivgenite pottiknuvaat T-kleto~na aktivacija preku istovremeno povrzuvawe soTKR i GTK 2Superprotivgenite se virusni ili bakteriski proteini koi istovremeno se vrzuvaat za Vbeta

T f 2 GTKdomenot od T-kleto~niot receptor i za alfa verigata od klasa 2 GTK molekulata.Identifikuvani se i egzogeni i endogeni superprotivgeni. Vkrstenoto povrzuvawe na T-kleto~niot receptor i klasa 2 GTK molekulata od bilo koj tip na superprotivgen sozdavaaktivira~ki signal koj pottiknuva aktivacija i proliferacija na T kletkite (slika 10-16).Egzogenite superprotivgeni pretstavuvaat rastvorlivi proteini koi gi la~at bakteriite.Me|u niv se nao|aat brojni egzotoksini koi gi la~at Gram-pozitivnite bakterii, kako {tose stafilokoknite enterotoksini, toksinot na toksi~en {ok sindrom i toksinot naeksfolijativen dermatitis. Sekoj od ovie egzogeni superprotivgeni se vrzuva za posebniVbeta sekvenci od T-kleto~nite receptori (tabela 10-3) i vkrsteno go povrzuva TKR za klasa2 GTK molekula.Endogenite superprotivgeni pretstavuvaat proteini od kleto~nata membranata koi sekodirani od odredeni virusi koi gi inficiraat kletkite na cica~ite. Edna grupa, kodiranaod gluv~e{ki tumoren virus kaj cica~ite (TVC), mo`e da se soedini so DNK-ta na odredenigenetski ~isti soevi na gluvci. Po soedinuvaweto, retrovirusnite proteini seprika`uvaat vrz membranata od zarazenite kletki. Ovie virusni proteini, nare~eni malilimfocitni stimulira~ki (Mls) determinanti, se vrzuvaat za posebni Vbeta sekvenci od T-kleto~nite receptori i vkrsteno go povrzuvaat TKR za klasa 2 GTK molekula. Otkrieni se~etiri superprotivgeniMls, koi poteknuvaat od razli~ni TVC vidovi.

19

Bidej}i superprotivgenite se vrzuvaat nadvor od TKR protivgenvrzuva~kiot procep, sekoja T kletka koja prika`uva posebna Vbeta sekvenca}e se aktivira preku sodvetniot superprotivgen. Spored toa, aktivacijata epoliklonska i mo`e da vlijae vrz zna~aen procent (5% ne e nevoobi~aeno) odcelata populacija na Tpo kletki. Masovnata aktivacija koja sledi povkrstenoto povrzuvawe so superprotivgenot rezultira so prekumernosozdavawe na Tpo-kleto~ni citokini, {to vodi do sistemska toksi~nost.Trueweto so hrana predizvikano od stafilokokniot enterotoksin itoksi~niot {ok predizvikan od toksinot za toksi~niot {ok sindrom se dvaprimeri za posledicite od prekumernoto sozdavawe na citokini pottiknatiod superprotivgenite.

Superprotivgenite isto taka mo`at da vlijaat i vrz T-kleto~noto zreewe votimusot. Superprotivgenot koj e prisuten vo timusot za vreme na timusnataobrabotka }e pottikne negativna selekcija vo site timociti koi imaat TKRVbeta domen koj odgovara na specifi~nosta na superprotivgenot. Takvobeta do e oj od o ara a s ec f os a a su er ro e o . a omasovno otstranuvawe mo`e da bide predizvikano od egzogenite iendogenite superprotivgeni i se karakterizira so otsustvo na site T kletki~ii {to receptori poseduvaat Vbeta domeni koi se meta na superprotivgenot.

20

(slika 10-17 Aktivacijata na Tpo kletka i od signalot 1 i od kostimulatorniot signal 2 nagorno go regulira prika`uvaweto na IL-2 i na visoko- afinitetniot IL-2 receptor, {tovodi do vlez na T kletkata vo kleto~niot ciklus i nekolkukratna proliferacija.Del od kletkite se diferenciraat vo efektorni kletki, a drugi vo pamte~ki kletki.

Diferencijacija na T kletkiteKD4+ i KD8 T kletkite go napu{taat timusot i navleguvaat vo cirkulacijata kako kletki vo miruvawe vo G stadium od kleto~niot ciklus. Vo periferijata ima okolu dva pati pove}eKD4 T kletki vo odnos na KD8 T kletki. T kletkite koi s#u{te nemaat sretnato protivgen (neiskusni T kletki) se karakteriziraat so gust hromatin, mnogu malku citoplazma i malaprepi{uva~ka aktivnost. Neiskusnite T kletki postojano recirkuliraat pome|u krvta i limfnite sistemi. Pri recirkulacijata, neiskusnite T kletki ostanuvaat vo sekundarnitelimfoidni tkiva kako {to se limfnite jazli. Ako neiskusnata T-kletka ne sretne protivgen vo limfniot jazol, taa izleguva preku eferentnite limfni sadovi, se drenira votorakalniot duktus i povtorno i se priklu~uva na krvta. Proceneto e deka sekoja neiskusna T kletka recirkulira od krvta do limfnite jazli i nazad sekoi 12 do 24 ~asa. Bidej}i samookolu 1 na 10 neiskusni T-kletki se specifi~ni za nekoj daden protivgen, ova golema recirkulacijata gi zgolemuva {ansite neiskusnite T kletki da se sretnat so soodvetniotprotivgen.

Aktiviranite T kletki sozdavaat efektorni i pamte~ki T kletkiAko neiskusnata T kletka prepoznae protivgen-GTK kompleks na soodvetnata protivgen-prika`uva~ka kletka ili celna kletka, taa }e se aktivira, pottiknuvaj}i prvi~en odgovor.Okolu 48 ~asa po aktivacijata, neiskusnata T kletka se zgolemuva vo blast kletka i zapo~nuvaat povtoruva~ki ciklusi na kleto~na delba. Kako {to objasnivme prethodno, aktivacijatazavisi od signalot pottiknat od povrzuvaweto na TKR i kostimulatorniot signal pottiknat od KD28-B7 me|udejstvoto (vidi slika 10-16). Ovie signali pottiknuvaat vlez na T kletkatavo G stadiumot od kleto~niot ciklus i vo isto vreme, pottiknuvaat transkripcija na genot za IL-2 i za alfa verigata od visoko-afinitetniot IL-2 recepor (KD25). Osven toa,kostimulatorniot signal go zgolemuva polu`ivotot na IL-2 mRNK. Zgolemuvaweto na transkripcijata na IL-2, zaedno so stabiliziraweto na IL-2 mRNK, go zgolemuva sozdavaweto naIL-2 za 100 pati vo aktivnata T kletka. Izla~uvaweto na IL-2 i negovoto ponatamo{no vrzuvawe za visoko-afinitetniot IL-2 receptor ja pottiknuva aktiviranata neiskusna Tkletka da proliferira i da se diferencira (slika 10-17). T kletkite koi se aktivirani na ovoj na~in se delat od 2 do 3 pati dnevno vo period od 4 do 5 dena, sozdavaj}i klon odprogenitorski kletki, koi se diferenciraat vo pamte~ki i efektorni T-kleto~ni populacii.Razli~nite efektorni T kletki poseduvaat specijalizirani funkcii kako {to se sekrecija na citokini i B-kleto~na pomo{ (aktiviranite KD4 Tpo kletki) i citotoksi~no ubivaweRazli~nite efektorni T kletki poseduvaat specijalizirani funkcii kako {to se sekrecija na citokini i B kleto~na pomo{ (aktiviranite KD4 Tpo kletki) i citotoksi~no ubivawe(KD8 CTL). Sozdavaweto i aktivnosta na CTL kletkite detalno e objasneto vo poglavje 14. Efektornite kletki se sozdavaat i od neiskusnite i od pamte~kite kletki po protivgenaaktivacija. Efektornite kletki se kratko-`ivea~ki kletki, ~ii {to `ivot se dvi`i od nekolku dena do nekolku nedeli. Efektornite i neiskusnite populacii prika`uvaat razli~nimolekuli vrz kleto~nata membrana, {to pridonesuva za razli~ni modeli na recirkulacija.Kako {to e podetalno objasneto vo poglavje 12, KD4 efektornite T kletki formiraat dve subpopulacii koi se razlikuvaat po razli~nite grupi na citokini koi gi la~at. Ednapopulacija, nare~ena Tpo1 podgrupa, la~i IL-2, IFN-gama i TNF-beta. Podgrupata Tpo1 e odgovorna za klasi~nite kleto~no-posreduvani funkcii, kako {to se docen tip napreosetlivost i aktivacijata na citotoksi~nite T limfociti. Drugata podgrupa, nare~ena Tpo2 podgrupa, la~i IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10. Ovaa grupa funkcionira poefektivno kakopomaga~ na B-kleto~nata aktivacija.

Populacijata na pamte~ki T-kletki proizleguva i od neiskusnite T kletki po nivniot kontakt so protivgen i od efektornite kletki po protivgenata aktivacija i diferencijacija.Pamte~kite T kletki se sozdadeni od protivgen, vo osnova se dolgo-`ivea~ki, pasivni kletki koi reagiraat so zgolemena aktivnost na povtoren napad so istiot protivgen, sozdavaj}ivtori~en odgovor. Pro{irena populacija na pamte~ki T kletki opstojuva dolgo po opa|aweto na populacijata na efektorni T kletki. Vo osnova, pamte~kite T kletki prika`uvaatgolem broj isti povr{inski kleto~ni obele`uva~i kako i efektornite T kletki; nieden povr{inski obele`uva~ ne gi identifikuva so sigurnost kako pamte~ki kletki.Kako i neiskusnite T kletki, pove}eto pamte~ki T kletki se miruva~ki kletki vo G stadiumot od kleto~niot ciklus, no tie imaat pomalku strogi barawa za aktivacija od neiskusniteT kletki. Na primer, neiskusnite Tpo kletki se aktiviraat skoro isklu~ivo od steblestite kletki, dodeka pamte~kite Tpo kletki mo`at da bidat aktivirani od makrofagi, steblestikletki i B kletki. Se veruva deka prika`uvaweto na visoki nivoa na brojni adhezivni molekuli od strana na pamte~kite Tpo kletki im ovozmo`uva na ovie kletki da se povrzat so{irok spektar na protivgen prika`uva~ki kletki. Pamte~kite kletki isto taka prika`uvaat modeli na recirkulacija koi se razlikuvaat od onie kaj neiskusnite ili efektornite Tkletki.

KD4 KD25 subpopulacijata na T kletki negativno gi regulira imunite odgovoriKD4 KD25 subpopulacijata na T kletki negativno gi regulira imunite odgovoriVo ranite 70-ti godini od dvaesettiot vek, istra`uva~ite prvo gi opi{aa T-kleto~nite populacii koi mo`at da gi suprimiraat imunite reakcii. Ovie kletki se nare~eni supresorni Tkletki (Ts) i se veruva{e deka se KD8 T kletki. Sepak, kleto~nata i molekulskata osnova na zabele`anata supresija ostanaa nejasni, i so tekot na vremeto se javi golem somne` zapostoeweto na KD8 supresornite T kletki. Neodamne{nite istra`uvawa poka`aa deka navistina postojat T kletki koi gi supresiraat imunite reakcii. Neo~ekuvano e toa {to, seutvrdi deka ovie kletki se KD4 namesto KD8 T kletki. Vo populacijata na KD4 KD25 T kletki se nao|aat regulatorni T kletki (Treg kletki) koi mo`at da go popre~atrazmno`uvaweto na drugite T-kleto~ni populacii in vitro. Studiite na `ivotni poka`aa deka ~lenovi od KD4 KD25 populacijata go popre~uvaat razvojot na avtoimunite bolestikako {to se ekperimentalno pottiknatata vospalitelna bolest na crevata, eksperimentalen alergi~en encefalitis i avtoimun dijabetes. Supresijata od ovie regulatorni kletki eprotivgen specifi~na bidej}i zavisi od aktivacijata preku T-kleto~niot receptor. Potreben e kleto~en kontakt pome|u suprimira~kite kletki i nivnite meti. Ako regulatornitekletki se aktivirani od protivgen, no oddeleni od nivnite meti so propustliva bariera, ne nastanuva supresija. Postoeweto na regulatorni T kletki koi specifi~no gi suprimiraatimunite odgovori ima klini~ki implikacii. Otstranuvaweto ili popre~uvaweto na regulatornite T kletki po imunizacijata mo`e da gi zasili imunite reakcii na obi~nite vakcini.Vo toj pogled, nekoi lu|e tvrdat deka otstranuvaweto na T kletkite koi gi supresiraat reakciite kon tumorskite protivgeni mo`e da go olesnat razvojot na protivtumorskiotimunitet. Nasproti toa, zgolemuvaweto na suprimira~kata aktivnost na regulatornite T-kleto~ni populacii mo`e da bide polezno pri lekuvaweto na alergiski ili avtoimunibolesti. Sposobnosta da se zgolemi aktivnosta na regulatornite T-kleto~ni populacii mo`e isto taka da bide polezno pri suprimirawe na organ ili tkivno otfrlawe. Istra`uva~itekoi }e rabotat vo idnina na ovaa regulatorna kleto~na populacija }e gledaat podlaboko vo mehanizmite preku koi KD4 KD25 T-kleto~nite populacii gi reguliraat imunite reakcii.Tie isto taka }e se obiduvaat da pronajdat na~ini na koi aktivnostite na ovie populacii }e mo`e da se zgolemat za da se otstranat nesakanite imuni reakcii i da se namalat za da gipottiknat posakuvanite reakcii.

21

(slika 10-18 Razlikite vo svojstvata na profesionalnite protivgen prika`uva~ki kletki vlijaat vrznivnata sposobnost da prika`uvaat protivgen i da pottiknat T-kleto~na aktivacija. Zabele`ete dekad r u r d c j daktivacijata na efektornite i pamte~kite T kletki ne bara kostimulatorna B7 molekula.

Protivgen-prika`uva~kite kletki imaat karakteristi~ni kostimulatorni svojstva

Samo profesionalnite protivgen-prika`uva~ki kletki (steblestite kletki, makrofagite i Bkletkite) mo`at da go pretstavat protivgenot zaedno so klasa 2 GTK molekulite i da dostavatkostimulatoren signal koj e neophoden za celosna T kleto~na aktivacija {to vodi do proliferacija idiferencijacija. Osnovnite kostimulatorni molekuli koi se prika`ani vrz protivgen-prika`uva~kite kletki se glikoproteinite B7-1 (KD80) i B7-2 (KD86) (vidi slika 10-14).Profesionalnite protivgen prika`uva~ki kletki se razlikuvaat po nivnata sposobnost da prika`at

( 1 1 )protivgen i da go dostavat kostimulatorniot signal (slika 10-18).Vo osnova steblestite kletki prika`uvaat visoki nivoa na klasa 1 i klasa 2 GTK molekuli kako ivisoki nivoa na B7-1 i B7-2. Poradi ova, steblestite kletki se mnogu mo}ni aktivatori naneiskusnite, pamte~kite i efektornite T kletki. Nasproti toa, na site drugi profesionalni PPKim e potrebna aktivacija za prika`uvawe na kostimulatornite B7 molekuli vrz nivnite membrani.Spored toa, miruva~kite makrofagi ne mo`at da gi aktiviraat neiskusnite T kletki i se slabiaktivatori na pamte~kite i na efektornite T kletki. Makrofagite mo`e da se aktiviraat prekufagocitoza na bakterii ili od bakteriskite produkti kako {to se LPS ili od IFN-gama, citokinkoj se la~i od Tpo1. Aktiviranite makrofagi nagorno go reguliraat nivnoto prika`uvawe na klasa 2GTK molekulite i kostimulatornite B7 molekuli. Spored toa, aktiviranite makrofagi se zaedni~kiaktivatori na pamte~kite i efektornite T kletki, no nivnata efikasnost pri aktivacijata naneiskusnite T kletki se smeta za mininalnaneiskusnite T kletki se smeta za mininalna.B kletkite isto taka slu`at kako protivgen-prika`uva~ki kletki pri T kleto~nata aktivacija.Miruva~kite B kletki prika`uvaat klasa 2 GTK molekuli, no ne mo`at da prika`at kostimulatorniB7 molekuli. Spored toa, miruva~kite B kletki ne mo`at da aktiviraat neiskusni T kletki, iakomo`at da gi aktiviraat efektornite i pamte~kite T kleto~ni populacii. Po aktivacijata, Bkletkite nagorno go reguliraat nivnoto prika`uvawe na klasa 2 GTK molekulite i zapo~nuvaat soprika`uvawe na B7. Ovie aktivirani B kletki sega mo`at da gi aktiviraat neiskusnite T kletkikako i pamte~kite i efektornite populacii.

22

(slika 10-19 Dve pateki na apoptoza kaj T kletkite. (a) Aktiviranite periferni T kletki se pottiknati da prika`uvaat visoki nivoa na Fas i FasL. FasL ja pottiknuva trimerizacijata na Fas vo sosednata kletka. FasL istotaka mo`e da go vrze Fas od istata kletka, {to doveduva do samopottiknuva~ki smrtten signal. Trimerizacijata na Fas vodi do regrutirawe na FASD, {to po redosled vodi do razlo`uvawe na povrzanite molekuli naprokaspazata 8 za formirawe na aktivna kaspaza 8. Kaspazata 8 ja razlo`uva prokaspazata 3, sozdavaj}i aktivna kaspaza 3, {to doveduva do kleto~na smrt. Kaspazata 8 isto taka mo`e da go razlo`i Bid do skratena forma koja mo`eda ja aktivira mitohondirijalnata pateka na smrt. (b) Drugi signali, kako {to e povrzuvaweto na TKR so peptid-GTK kompleksot na PPK, rezultira so aktivacija na mitohondrijalnata pateka na smrt. Klu~na karakteristika na

b AIF ( f ) j b C | j A f 1ovaa pateka e osloboduvaweto na AIF (apoptoza inducira~ki faktor) i na citohormot c od vnatre{nata mitohondrijalna membrana vo citozolot. Cithromot c stapuva vo me|udejstvo so Apaf-1 i posledovatelno so prokaspazata9 za da go formira aktivniot apoptozom. Apoptozomot pottiknuva razlo`uvawe na prokaspazata 3, sozdavaj}i aktivna kaspaza 3, {to ja pottiknuva izvr{nata faza na apoptozata preku proteoliza na supstanciite ~ierazlo`uvawe ja obvrzuva kletkata na apoptoza. referenca

Kleto~na smrt i T-kleto~ni populaciiKleto~nata smrt e zna~ajna karakteristika na razvojot na site pove}ekleto~ni organizmi. Za vreme na fetalniot period, taa se koristi za kalapewe i oblikuvawe, so {to se otstranuvaat nepotrebnite kletki za da se ovozmo`ioblik i forma. Isto taka taa e zna~ajna karakteristika na limfocitnata homeostazata, so {to gi vra}a T i B kleto~nite populacii na nivnite soodvetni nivoa po brzoto pojavuvawe na protivgen-pottiknatata proliferacija.Apoptozata isto taka igra klu~na uloga pri otstranuvaweto na potencijalno avtoreaktivnite timociti za vreme na negativnata selekcija i pri otstranuvaweto na razvojnite T kletki koi ne mo`at da gi prepoznaat sopstvenite-GTK molekuli (ne mo`at da pretrpat pozitivna selekcija).Iako pottiknuvaweto na apoptoza vklu~uva razli~ni signali vo zavisnost od tipot na kletkata koj e vklu~en, vistinskata smrt na kletkata e visoko konzerviran proces me|u ’rbetnicite i bez’rbetnicite. Na primer, T kletkitemo`at da bidat pottiknati da umrat od dosta razli~ni signali, vkluvaj}i go povlekuvaweto na faktorot na rast, lekuvaweto so glikokortikoidi ili TKR signalizirawe. Sekoj od ovie signali koristi unikatna signalna pateka,no vo site slu~ai, vistinskata egzekucija na kletkata vklu~uva aktivacija na specijaliziranata grupa na proteazi poznati kako kaspazi. Ulogata na ovie proteazi prvo bila otkriena vo studiite na razvojno programiranatakleto~na smrt vo crvot Caenorhabditis elegans, kade {to se poka`a deka smrtta na kletkite e celosno zavisna od aktivnosta na genot koj ja kodira cisteinskata proteaza so specifi~nost za ostatocite od aspartanska kiselina.Vo momentov e poznato deka cica~ite imaat najmalku 14 cisteinski proteazi ili kaspazi i site kleto~ni umirawa imaat potreba od aktivnosta na, vo najmala raka, podgupa od ovie molekuli. Isto taka e poznato deka vo osnovasekoja kletka vo teloto sozdava kaspazni proteini, {to uka`uva na faktot deka sekoja kletka poseduva potencijal za pottiknuvawe na sopstvenata smrt.Kletkite vo normalni okolnosti se {titat od apoptoti~nata smrt preku ~uvawe na kaspazite vo neaktivna forma vo kletkata. Po primaweto na soodvetniot signal za smrt, odredeni kaspazi se aktiviraat preku proteoliti~norazlo`uvawe a potoa aktiviraat drugi kaspazi koi se na red, {to vodi do aktivacija na efektornite kaspazi. Kataliti~nata kaskada kulminira so kleto~na smrt. Iako to~no ne e poznato kako kaspaznata aktivacija direktnodoveduva do apoptoti~na smrt na kletkata, verojatno toa se slu~uva so razlo`uvawe na va`nite delovi koi se neophodni za kleto~en opstanok.T kletkite upotrebuvaat dve razli~ni pateki za aktivacija na kaspazite (slika 10-19). Kaj perifernite T kletki, protivgen stimulacijata doveduva do proliferacija na stimuliranata T kletka i sozdavawe na odreden brojcitokini, vklu~uvaj}i go IL-2. Pri aktivacijata, T kletkite go zgolemuvaat prika`uvaweto na dva klu~ni kleto~no povr{inski proteini koi se vklu~eni vo T-kleto~nata smrt, Fas i Fas ligand (FasL). Koga Fas se vrzuva zanegoviot ligand, FasL, potreben e FASD (Fas-asociran protein so smrtten domen) koj se vrzuva za Fas, po {to sledi upotreba na prokaspaza 8, neaktivna forma na kaspaza 8. Povrzuvaweto na FASD so prokaspazata 8 doveduva doproteoliti~no razlo`uvawe na prokaspazata 8 vo nejzinata aktivna forma. Potoa kaspazata 8 ja pottiknuva proteoliti~na kaskada koja vodi do kleto~na smrt.Osven vo timusot, pove}eto od TKR-posreduvanite apoptozi vo zrelite T kletki se posreduvani od Fas patekata. Povtorenata ili postojanata stimulacija na perifernite T kletki doveduva do ko-prika`uvawe na Fas i Fasligandot, sledeno so apoptoti~na smrt na kletkata. Fas/FasL posreduvanata smrt na T kletkite kako posledica od aktivacijata e nare~ena aktivaciski pottiknata kleto~na smrt (APKS) i pretstavuva glaven homeostatskid , d r / L r du r d c d c j r c r ( S) r umehanizam koj {to ja regulira goleminata na T kleto~niot bazen (pul) i gi otstranuva T kletkite koi odgovaraat na stimulacija od sopstvenite protivgeni.Zna~eweto na Fas i FasL pri otstranuvaweto na aktiviranite T kletki e naglaseno kaj lpr/lpr gluvcite, prirodna mutacija koja rezultira so nefunkcionalen Fas. Koga T kletkite kaj ovie gluvci se aktiviraat, Fas/FasLpatekata ne e vo upotreba, T kletkite prodol`uvaat da se razmno`uvaat, sozdavaj}i IL-2 i ja odr`uvaat aktiviranata sostojba. Ovie gluvci spontano razvivaat avtoimuna bolest, imaat prekumeren broj na T kletki i jasno giprika`uvaat posledicite od neuspehot za bri{ewe na aktiviranite T kletki. Isto taka e polezna i dopolnitelnata mutacija gld/gld. Na ovie gluvci im nedostasuva funckionalen FasL i prika`uvaat abnormalnosti koi sesli~ni na onie koi se nao|aat kaj lpr/lpr gluvcite. Od neodamna, otkrieni se lu|e so defekti na Fas. Kako {to se o~ekuva, ovie lica poka`uvaat osobini na avtoimuna bolest (vidi klini~ki fokus).Fas i FasL se ~lenovi od familijata na povrzani receptor/ligand kade se vklu~eni tumor nekroti~niot faktor (TNF) i negoviot ligand, TNFR (tumor nekroti~en faktor receptor). Kako Fas i FasL, membranaski vrzaniotTNFR stapuva vo me|udejstvo so TNF za da pottikne apoptoza. Isto taka sli~na na Fas/FasL pottiknata apoptoza, TNF/TNFR posreduvanata smrt e rezultat od aktivacijata na kaspazata 8 po {to sledi aktivacija na efektornitekaspazi kako {to e kaspaza 3.Osven aktivacijata na apotozata preku smrttnite receptorni proteini kako {to se Fas i TNFR, T kletkite mo`at da umrat preku drugi pateki koi ne ja aktivirat kaspazata 8. Na primer, negativnata selekcija vo timusot japottiknuva apoptoti~nata smrt na razvojnite T kletki preku signalnata pateka koja poteknuva od TKR. S#u{te celosno ne razbirame zo{to odredeni signali preku TKR pottiknuvaat pozitivna selekcija a drugi signalipottiknuvaat negativna selekcija, no znaeme deka silata na signalite igra zna~ajna uloga. Silen, negativno selektira~ki signal pottiknuva pat do apoptoza vo koj mitohondriite igraat zna~ajna uloga. Vo mitohondrijalnozavisnite apoptoti~ni pateki, citohromot c, koj obi~no se nao|a na vnatre{nata mitohondrena membrana, se izleguva vo citozolot. Citohromot c se vrzuva za protein koj e poznat kako Apaf-1 (apoptoti~en proteaznoaktivira~ki faktor 1) i pretrpuva ATP zavisna strukturna promena i oligomerizacija. Vrzuvaweto na oligomernata forma na Apaf-1 za prokaspazata 9 doveduva do nejzina transformacija vo aktivna kaspaza 9. Kompleksotcitohrom c/Apaf-1/kaspaza-9, nare~en apoptozom, proteoliti~ki ja razlo`uva prokaspazata 3, so {to sozdava aktivna kaspaza 3, koja pottiknuva serija na reakcii koi ja ubivaat kletkata (vidi slika 10-19). Na krajot,mitohondriite isto taka osloboduvaat druga molekula, AIF (apoptoza inducira~ki faktor), koja igra zna~ajna uloga vo pottiknuvaweto na kleto~na smrt.Kleto~nata smrt pottiknata od Fas/FasL e brza, so naglo aktivirawe na serija kaspazi, koja vodi do kleto~na smrt vo period od 2 do 4 ~asa. Od druga strana, TKR pottiknata negativna selekcija izgleda deka e posporedna pateka,koja bara aktivacija na nekolku procesi, vklu~uvaj}i slabeewe na mitohondrijalnata membrana, osloboduvawe na citohromot c i sozdavawe na apoptozomot pred da se vklu~at kaspazite. Spored toa, TKR posreduvanata negativnaselekcija mo`e da trae od 8 do 10 ~asa.

Zna~ajna karakteristika na mitohondrijalno pottiknata patekata na kleto~na smrt pretstavuva regulatornata uloga na ~lenovite od Bcl-2 familijata. I Bcl-2 i Bcl-IksL se nao|aat na mitohondrijalnata membrana. Ovieproteini se silni inhibitori na apoptozata i iako ne e jasno kako ja popre~uvaat kleto~nata smrt, edna teorija e deka tie na nekoj na~in go reguliraat osloboduvaweto na citohromot c od mitohondriite. Postojat najmalku 3grupi na ~lenovi na Bcl-2 familijata. ^lenovite od grupa 1 se protiv-apoptoti~ni i gi vklu~uvaat Bcl-2 i Bcl-IksL. ^lenovite od grupa 2 i grupa 3 se pro-apoptoti~ni i gi vklu~uvaat Baks i Bak vo grupa 2 i Bid i Bim vogrupata 3. Postojat jasni dokazi deka nivoata na protiv-apoptoti~nite ~lenovi na Bcl-2 familijata igraat zna~jna uloga vo reguliraweto na apoptozata kaj limfocitite. ^lenovite na Bcl-2 familijata dimeriziraat, pa~lenovite od protiv-apoptoti~nata grupa mo`at da ja kontroliraat apoptozata preku dimerizirawe so pro-apoptoti~nite ~lenovi, blokiraj}i ja nivnata aktivnost. Kako {to e ozna~eno na slika 10-19, razlo`uvaweto na Bid,~lenovite od protiv apoptoti~nata grupa mo`at da ja kontroliraat apoptozata preku dimerizirawe so pro apoptoti~nite ~lenovi, blokiraj}i ja nivnata aktivnost. Kako {to e ozna~eno na slika 10 19, razlo`uvaweto na Bid,koe e katalizirano od kaspazata 8 sozdadena od Fas patekata, mo`e da ja aktivira mitohondrijalnata pateka na smrt. Spored toa, signalite koi se pottiknati od Fas isto taka mo`at da ja vklu~at mitohondrijalnata pateka.Iako na limfocitot mo`e da mu bide signalizirano da umre na nekolku na~ini, site ovie pateki na kleto~na smrt konvergiraat kon aktivacija na kaspazite. Ovoj del od patekata na kleto~nata smrt, izvr{nata faza, e zaedni~kaskoro za site pateki na kleto~na smrt koi se poznati kaj ’rbetnicite i bez’rbetnicite, poka`uvaj}i deka apoptozata e star proces koj e za~uvan vo tekot na evolucijata.

23