Fény- és fluoreszcens mikroszkópia

Szuperrezolúciós mikroszkópia

Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány

• fénymikroszkópos „szuperrezolúció”: x, y, z febontás egyaránt ~50-100 nm-

es nagyságrendben (3-10 x növelés)

elméleti lehetőségek a felbontás növelésére:

1. l csökkentése - gerjesztés elektronnyalábbal

• TEM, SEM (transmission/scanning electron microscopy)

• „hagyományos” fénymikroszkópia: l és NA

által limitált felbontás

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/

introduction.html

Resolutionx,y = λ / 2[η • sin(α)] (~180-200 nm)

Resolutionz = 2λ / [η • sin(α)]2 (~500-800 nm)

Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány

2. nagy felbontású minta-scannelés (scanning probe /

tunelling microscopy)

• AFM (atomic force microscopy)

3. PSF méretének módosítása („far field”)

4. egyedi molekula detekció és lokalizáció („far field”)

• z sík: 4Pi / I5M (2 objektív lencse)

• near-field scanning optical microscopy (NSOM v. SNOM)

2-5 nm (z);

20 nm (xy)

• PALM (photoactivated localization microscopy )

• STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)

• FPALM (fluorescence photoactivation localization microscopy)

elméleti lehetőségek a felbontás növelésére (folyt.):

- a minta a gerjesztő fény l-nál közelebbi távolságon belül

vizsgált: evaneszcens hullámok detektálása

- csak felszíni detekció

• SR-SIM (superresolution structured illumination microscopy)

• STED (stimulated emission depletion)

• GSD (ground state depletion)

PSF

méretének

módosítása

(STED)

egyedi

molekula

detekció és

lokalizáció

(PALM,

STORM)

TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence

Microscopy)

• nem szuperrezolúció, de határfelszínek (ld. sejtmembrán) közeli detekcióra

(max 100-150 nm mélyen) jó

• eltérő törésmutatójú határfelszínek:

kritikus beesési szög alatt teljes

visszaverődés + evaneszcens fény az

alacsonyabb törésmutatójú közegben

közeli molekula gerjesztése

• nagy beesésszögű lézerfény:

prizmával vagy nagy NA-jú (>1.4)

objektívvel

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence

/tirf/tirfintro.html

http://www.olympusmicro.com/primer/java/tirf/reflect/index.html

TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence

Microscopy)

4Pi / I5M mikroszkópia z felbontás 3-7x növelése (nem igazán

szuperrezolúció......): ~ 100 nm

gerjesztési és detekciós

térszög növelése (1

objektívre ez max. 2p (bár

igazán csak ~1.3p, azaz

~140˚) -> 2 objektívre 4p)

I5M (incoherent-illumination imaging microscopy / image

interference microscopy): 2 egymással szemben

elhelyezett objektív, ugyanabba a síkba

fókuszálva -> inkoherens, interferencián

alapuló widefield megvilágítás, z síkok váltása

lényeg: standing wave microscopy – interferencia

a kapott kép megjelenítése csak dekonvolúciós elemzés után (PSF side lobe)

4Pi: 2 egymással szemben elhelyezett

objektív, ugyanabba a síkba

fókuszálva -> koherens megvilágítás

(lézer) és emittált fény detektálás;

konfokális pinhole

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution

/introduction.html

SR-SIM (superresolution structured illumination) mikroszkópia

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/supersim.html

• Köhler-féle megvilágítás helyett térben változó intenzitású, szinuszoid

megvilágítási mintázat + image rekonstrukció algoritmusokkal

• polarizációs/diffrakciós rácsmintázatban gerjesztés, objektív hátsó

fókuszsíkjában interferencia -> rácsmintázat forgatása

• CCD kamera, több kép alapján matematikai számítás (~Apotome; I5M)

• interferencia alapján PSF méretcsökkenése: ~2-3x x-y (~100 nm) és z (~300

nm) felbontás-növelés

• gyors számítás, de élő

sejtes mérésekre igen

limitáltan használható

SR-SIM (superresolution structured illumination) mikroszkópia

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/supersim.html

• Köhler-féle megvilágítás helyett térben változó intenzitású, szinuszoid

megvilágítási mintázat + image rekonstrukció algoritmusokkal

RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions

A diffrakciós határ áttörése

• reverzibilis fotoswitching a fluoreszkáló

„on” és a sötét „off” állapot között:

- STED: S0 / S1 singlet gerjesztési állapot

- GSD: S1 singlet és sötét triplet állapot

- reverzibilisen fotokonvertálható molekulák

(Cy5, kindling, Dronpa): PALM, STORM

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution

/introduction.html

• az adott gerjesztési állapot valószínűsége fordított

exponenciális arányban áll a gerjesztési intenzitással

• szaturációs intenzitás: az a gerjesztési intenzitás,

aminél a fotoswitching (adott valószínűséggel)

állapotváltás lezajlik – az adott állapot életidejével

fordítottan arányos

• ha a gerjesztési > szaturációs intenzitás -> fotoswitching reakció

• hosszú (gerjesztési) életidő -> jobban variálható gerjesztési /

szaturációs intenzitások

RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions

A diffrakciós határ áttörése

• a gerjesztő, ill. a depléciós megvilágítás intenzitása eltér:

- STED: az S1 -> S0 „kikapcsoláshoz” igen nagy energia kell

- GSD / fotokonverzió: az S1 -> T „kikapcsoláshoz” v. a metastabil

sötét állapot „bekapcsolásához” sokkal kevesebb energia is elég!

• egyedi molekula detekció (PALM, STORM): kisebb energia,

sztochasztikus aktiváció, nagyobb FOW

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution

/introduction.html

• nem könnyű megfelelő fluorokrómokat kiválasztani: nagy intenzitás –

erős bleaching

STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/stedconcept/index.html

• STED lézer: fázismoduláció -> ”lyukas fánk” depléciós minta

(250 MW/cm2!) -> fluoreszcencia nélküli visszatérés az S0

állapotba -> PSF redukció a megmaradt fluorokrómoknál

• 10 – 300 psec pulzus gerjesztő / depléciós lézerek

Donut Mode for Depletion

Excitation Beam Depletion Beam

In focal point

= +

Result

ZOOM

Depletion Beam direction

Direction of emission of photons depleted

Emission of excited photons

Reception of photons through the pinhole

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/steddepletion/index.html

STED depléciós lézer

STEDBand

Detection

Excitation

STED wavelenght should not

excite the fluorophore

Picosecond Pulsed LaserPulsed Laser 10-200 picoseconds

STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

feltételek:

• a fluorochróm a depléciós

hullámhosszon ne gerjesztődjön

• fotostabilitás mindkét

hullámhosszon

• igen ritka Triplet-átmenet

• gyenge photobleaching (legyen

reverzibilis!)

• piko/femtoszekundum pulse

lézerek

Pyridine 2Pyridine 2

30-70 nm (x-y) és ~40-50 nm (z)

felbontás (~10x növekedés)

a felbontás a depléciós lézer

intenzitásának (I) és a szaturációs

intenzitás (Is) négyzetgyökétől is

függ!

d= l/(2NA√𝐼/𝐼𝑠)

STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

x-y mellett már Z síkban is alkalmazható a depléció: STED 3x

nagy előny: pont-szkennelés (mint a

konfokális mikroszkópiánál) – élő

preparátumon is használható

DE: toxikus hatás, technikai kihívások

Examples… 40nm beads

Confocal STED

Actin microfilaments of dendritic spines in culture

CONFOCAL STED

Olivier thoumine and ph Legros.

Examples… neurons

Examples… Chromosomes

Bernard de Massy et julien Cau UPR 1142 CNRS Institut de Génétique humaine, équipe Méiose et

recombinaison, Montpellier et BIC

Immunomarquage

de la protéine Sycp3

sur spermatocytes

de souris au stade

pachytène

Berning et al., Science 2012

STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

már 2, vagy akár 3 fluorokrómra is

alkalmazható

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superres

olution/stedfundamentals/indexflash.html

PALM (photoactivated localization microscopy)

• egyedi molekulák lokalizációja nm-es felbontással, ha

- elegendő foton gyűjthető

- ~200 nm-es körzetben nincs más

emittáló molekula

• hagyományos widefield mikroszkópokon is alkalmazható, EM-CCD

kamerával (single foton detekció)

• átfedő PSF-ek is elkülöníthetőek, ha az egyik szignál kioltható

• több cikluson át: sztochasztikus és kis arányú gerjesztés (alacsony

gerjesztési lézer intenzitás) -> képrögzítés -> aktivált fluorochrómok

photobleachelése; élő sejten nem alkalmazható

• a jó SNR-hez nagy

kontrasztú, fotoaktiválható

molekulák kellenek

- ritka molekulák (<100/mm2)

- kis hányad fluoreszkál

• gyakran TIRF

mikroszkópiával

kombinálva, vastag

prepiken nem optimális

PALM (photoactivated localization microscopy)

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/practicalaspects.html

Technique à très haute résolution microscopie

PALM:

Photoactivation Localization Microscopy

7000 Molecules

wavelength

Photoconversion

before after

Absorption Emission

Activation

Activation

Bleach

Molecules Off (inactive)

Single Molecules On

Acquire

Single Molecules On

Acquire

Molecules Off

Bleach

15 Molecules

Reconstruction Localisation

Molecules Off

35 Molecules

Reconstruction

100 Molecules

Reconstruction Localisation

PALM (photoactivated localization microscopy)

PALM (photoactivated localization microscopy)

• fluorochrómok mérete

és sejten belüli

penetrációja korlátozó

tényező -> ált.

membrán-fehérjék

extracelluláris

nyomonkövetése

• szintetikus festékek (Alexa, Atto, Cy)

jelölésre jók, de fotoaktivációjuk élő

sejtekre toxikus: főleg fotoaktiválható

fehérjék használata

• PALM-hoz hasonlóan egyedi molekula

gerjesztés -> egyedi lokalizáció; image

összerakása sorozatos aktivációk után

STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)

https://www.microscopyu.com/techniques/su

per-resolution/single-molecule-super-

resolution-imaging

• 20-30 nm xy, 50-75 nm z felbontás

• elsősorban szintetikus festékek

használatán alapszik

Name

(Acronym)

Ex

(nm)

Em

(nm)

EC

(x 10-3) QY N Photons

Cy3B 559 570 130.0 0.67 1400

Cy3.5 581 596 150.0 0.67 5000

Cy5 649 664 250.0 0.28 4000

Cy5.5 675 694 190.0 0.23 6000

Cy7 747 767 200.0 0.28 1000

Alexa Fluor 488 495 519 71.0 0.92 1200

Alexa Fluor 568 578 603 91.3 0.69 2800

Alexa Fluor 647 650 665 240.0 0.33 6000

Alexa Fluor 750 749 775 240.0 0.12 450

ATTO 488 501 523 90.0 0.80 1300

ATTO 520 516 538 110.0 0.90 1200

ATTO 565 563 592 120.0 0.90 20000

ATTO 647 645 669 120.0 0.20 1500

ATTO 647N 644 669 150.0 0.65 3000

ATTO 680 680 700 125.0 0.3 1500

ATTO 740 740 764 120.0 0.1 1000

TAMRA 546 575 90.4 0.2 5000

Dyomics 654 654 675 220.0 NA 3600

DyLight 750 752 778 220.0 NA 700

IRDye 800 CW 778 794 240.0 NA 3000

Rhodamine B 530 620 105.0 0.65 750

C-Rhodamine 545 575 90.0 0.90 1000

legyen fényes és jó kontrasztú -> foton

yield legyen nagy

aktív/inaktív forma között legyen nagy

spektrális shift

megbízható fotoswitching, hőstabil,

ismert kinetika és alacsony „fáradás”

STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)

• eredetileg Cy3 – Cy5 fluorokrómra kifejlesztve: cyanine switch

https://www.microscopyu.com/techniques/super-resolution/single-molecule-super-resolution-imaging

Cy5: reverzibilis fluoreszcens/sötét állapot között váltás: vörös (pl.

633 nm) gerjesztésre emisszió és sötét állapotba lépés; zöld fényre

(pl. 532 nm) fluoreszcens állapotba való visszatérés, Cy3-tól függően

Cy5 igen fotostabil, több száz aktivációs ciklus

• egyedi fluorokrómra is OK: pl.

Alexa 647-nél a 657nm-es lézer

gerjeszt és a sötés-világos-sötét

átmenetet is kiváltja; 10-30%-ban

fluoreszcens állapotban

• két színű, ill. 3D image készítés is

lehetséges

http://www.microscopyu.com/articles/sup

erresolution/stormintro.html

dSTORM (direct stochastic optical reconstruction

microscopy)

• gyakorlatilag azonos elv, más

technikai megvalósítás / gyártó

http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/superresoluti

on/introduction.html

PALMIRA (PALM with

independently running

acquisition)

STED és STORM összehasonlítás

http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/stedvsstorm/index.html

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/steddepletion/index.html

STED depléciós lézer