Syphilis Total Ab 1 pločica - 96 72530 5 pločica - 480 72531 KOMPLETI ZA KVALITATIVNO OTKRIVANJE PROTUTIJELA NA BAKTERIJU TREPONEMA PALLIDUM U LJUDSKOM SERUMU ILI PLAZMI TEHNIKOM IMUNOENZIMSKIH TESTOVA

883679 - 2014/11

[HR] 1

SADRŽAJ

1. NAMJENA ................................................................................................ 2 2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA ........................................................... 2 3. NAČELA POSTUPKA ............................................................................... 2 4. REAGENSI ............................................................................................... 3 5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA ............................................................. 4 6. UZORCI ................................................................................................... 5 7. POSTUPAK .............................................................................................. 6 8. OGRANIČENJE TESTA ............................................................................ 8 9. KARAKTERISTIKE IZVEDBE .................................................................... 9 10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE. ............................................................. 1 2

[HR] 2

1. NAMJENA

Ovi kompleti namijenjeni su za uporabu od strane prikladno obučenog i kvalificiranog osoblja u svrhu kvalitativnog otkrivanja protutijela na bakteriju Treponema pallidum u ljudskom serumu i plazmi. Ovaj se proizvod može upotrebljavati za probir davatelja krvi te služiti kao pomoć u dijagnosticiranju bolesnika kod kojih se sumnja na infekciju sifilisom.

2. SAŽETAK I OBJAŠNJENJE TESTA

Sifilis je kronična infekcija koja se razvija kroz određene faze: primarnu, sekundarnu, tercijarnu i kvartarnu. U ovim fazama nastaju različiti klinički simptomi. Obično se prvo javljaju čirevi poznati kao tvrdi čankiri, zatim sifilisni osip, nakon čega slijede duga razdoblja mirovanja. Ako se infekcija ne liječi, s vremenom može uzrokovati kardiovaskularne probleme i neurosifilis. Infekciju uzrokuje spiroheta Treponema pallidum. Infekcija se obično prenosi spolnim putem, ali se može prenijeti i transfuzijom zaražene krvi. Također se javlja intrauterina infekcija. Pokazalo se gotovo nemogućim kultivirati organizam u umjetnim medijima, te dijagnosticiranje infekcije obično ovisi o utvrđivanju prisutnosti protutijela u krvi, koja se pojavljuju nedugo nakon početne infekcije i mogu ostati prisutna godinama. Testovi na sifilis dijele se u četiri kategorije: izravan mikroskopski pregled, treponemski testovi na protutijela, netreponemski testovi na protutijela te izravni testovi na antigene. Zbog dugih razdoblja mirovanja i nespecifične prirode netreponemskih testova, metode kojima se otkrivaju specifična antitreponemska protutijela u uzorcima krvi postala su sve popularnija za probir. U takve metode spada test Syphilis Total Ab.

3. NAČELA POSTUPKA

Syphilis Total Ab upotrebljava tri rekombinantna antigena u tzv. "sendvič" testu. Antigeni će otkriti protutijela IgG, IgM i IgA specifična za bakteriju T. pallidum, što omogućuje da se testom otkriju protutijela tijekom svih faza infekcije. Jažice su obložene mješavinom rekombinantnih antigena bakterije T. paliidum 15Kd, 17Kd i 47Kd. Specifična protutijela u uzorcima seruma ili plazme vežu se na ove antigene, kao i s istim antigenima konjugiranim na peroksidazu iz hrena, kada se konjugat doda u jažicu u kojem je inkubiran uzorak. Nakon uklanjanja nereaktivnog materijala pranjem, prisutnost vezanog enzima, koja ukazuje na prisutnost specifičnih protutijela u uzroku, otkriva se promjenom boje u mješavini supstrata i kromogena. Intenzitet boje uspoređuje se s onim u kontrolnim jažicama da bi se utvrdila prisutnost ili odsutnost specifičnih protutijela.

[HR] 3

4. REAGENSI

4.1. Opis

Identifikacija na oznaci

Opis Prezentacija/priprema

72530 Prezentacija/priprema

72531

R1

Microplate

Mikrotitarska pločica 12 traka s 8 jažica na svakoj, obložene rekombinantnim antigenima (rAg) za bakteriju T. pallidum Specifični ID broj = 97

1 pločica Spremno za uporabu

5 pločica Spremno za uporabu

R2

Concentrated Washing Solution

(20X)

Koncentrat sredstva za ispiranje (20x) Tris NaCl pufer pH 7,4 Konzervans: ProClin™ 300 (0,04%)

1 bočica 70 ml

Treba razrijediti

1 bočica 235 ml

Treba razrijediti

R3 Negative control

Negativna kontrola Tris pufer koji sadrži BSA (Bovine Serum Albumine – goveđi serumski albumin) Konzervans: ProClin™ 300 (0,1%)

1 bočica 2,1 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 2,1 ml

Spremno za uporabu

R4 Positive control

Pozitivna kontrola (ljudska) Ljudski serum koji sadrži protutijela na bakteriju T.pallidum, negativan na HIV1/2, HBs Ag i HCV, razrijeđen u Tris puferu koji sadrži BSA (goveđi serumski albumin) Konzervans: ProClin™ 300 (0,1%)

1 bočica 1,6 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 1,6 ml

Spremno za uporabu

R6 Conjugate

Konjugat Rekombinantni antigeni (rAg) za T.pallidum/peroksidaza Konzervans: ProClin™ 300 (0,05%)

1 bočica 8 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 30 ml

Spremno za uporabu

R8 Substrate

buffer

Pufer supstrata Limunska kiselina i otopina natrij-acetata, pH 4,0, sadrži H2O2 (0,015%) i DMSO (4%)

1 bočica 60 ml

Treba rekonstituirati

1 bočica 60 ml

Treba rekonstituirati

R9 Chromogen: TMB solution

(11X)

Kromogen: TMB otopina (ružičasta) Otopina sadrži 3.3’, 5.5’ tetrametilbenzidina (TMB).

1 bočica 5 ml

Treba razrijediti

1 bočica 5 ml

Treba razrijediti

R10 Stopping solution

Otopina za zaustavljanje Otopina sumporne kiseline (H2SO4 1N)

1 bočica 28 ml

Spremno za uporabu

1 bočica 28 ml

Spremno za uporabu

[HR] 4

4.2. Skladištenje i rukovanje Komplet treba čuvati na temperaturi od +2-8°C. Svaki pojedini dio kompleta koji se čuva na temperaturi od +2-8°C može se koristiti sve do isteka roka trajanja naznačenog na pakiranju (osim ako nije drukčije naznačeno). Nakon otvaranja i uz odsutnost kontaminacije, reagensi R3, R4, R6, R8, R9 i R10 koji su se čuvali na temperaturi od +2-8°C mogu se koristiti do isteka roka trajanja naznačenog na etiketi.

Identifikacija Čuvanje

R1 Nakon otvaranja vakuumske zatvorene vrećice, trake mikrojažica čuvane na temperaturi od +2-8°C mogu se koristiti mjesec dana u izvornoj vrećici koja je pažljivo zatvorena.

R2 Razrijeđena otopina za ispiranje može se čuvati 2 tjedna na temperaturi od +2-30°C. Koncentrirana otopina za ispiranje (R2) može se čuvati na temperaturi od +2-30°C.

R8+R9 Nakon rekonstitucije reagens čuvan u tami može se koristiti 6 sati na sobnoj temperaturi (18-30°C).

5. UPOZORENJA I MJERE OPREZA Za in vitro dijagnostiku. Za profesionalnu zdravstvenu uporabu.

5.1. Zdravstvene i sigurnosne mjere: Ovim testnim kompletom treba rukovati samo kvalificirano osoblje koje je upoznato s laboratorijskim procedurama i s njima povezanim potencijalnim rizicima. Nosite odgovarajuću zaštitnu odjeću, rukavice, zaštitu za oči/lice te rukujte na odgovarajući način, uz potrebnu primjenu dobre laboratorijske prakse.

Testni komplet sadrži sastojke ljudske krvi. Materijali ljudskog porijekla korišteni u pripremi reagensa testirani su te je utvrđeno da ne reagiraju s površinskim antigenom virusa hepatitisa B (HBs Ag), protutijelima na virus humane imunodeficijencije (HIV-1 i HIV-2) te protutijelima na virus hepatitisa C (HCV). Niti jedna poznata metoda testiranja ne može ponuditi potpunu sigurnost kad je riječ o nepostojanju infektivnih agensa. Zato se svi derivati ljudske krvi, reagensi i ljudski uzorci trebaju tretirati kao da mogu prenijeti zarazne bolesti, uz pridržavanje preporučenih univerzalnih mjera opreza za patogene koji se prenose putem krvi, definiranih od strane lokalnih, regionalnih i nacionalnih organa vlasti.

Proliveni biološki materijali: Proliveni ljudski polazni materijal treba se tretirati kao potencijalno zarazan.

Prolivene sadržaje koji ne sadrže kiseline treba odmah dekontaminirati, uključujući i mjesto na kojem su proliveni, kao i kontaminiranu površinu i opremu, odgovarajućim kemijskim dezinficijensom koji je učinkovit protiv potencijalnih biološki opasnih tvari ovisno o vrsti prolivenih uzoraka (obično 1:10 razrijeđeni kućni izbjeljivač, 70-80% etanol ili izopropanol, jodofor [kao npr. 0,5% Wescodyne™ Plus itd.) te dobro osušiti brisanjem.

Prolivene sadržaje koji sadrže kiseline treba adekvatno apsorbirati (obrisati) ili neutralizirati, područje treba isprati vodom i osušiti brisanjem; materijali korišteni za apsorbiranje prolivenog sadržaja mogu trebati zbrinjavanje kao biološki opasan otpad. Tada područje treba dekontaminirati nekim od kemijskih dezinficijensa.

NAPOMENA: Ne stavljajte otopinu koja sadrži izbjeljivač u autoklav! Sve uzorke i materijale korištene prilikom izvođenja testa zbrinite na odgovarajući način kao da sadrže infektivni agens. Laboratorijskim, kemijskim ili biološki opasnim otpadom mora se rukovati i zbrinuti ga u skladu s lokalnim, regionalnim i nacionalnim zakonima.

Za preporuke o rizicima i mjerama opreza povezanim s nekim kemijskim spojevima u ovom testnom kompletu, molimo pogledajte piktogram(e) na naljepnicama te dostavljene informacije na kraju uputa za uporabu.

Sigurnosno-tehnički list dostupan je na www.bio-rad.com.

[HR] 5

5.2. Mjere opreza povezane s postupkom

5.2.1. Priprema

Pouzdanost rezultata ovisi o ispravnoj primjeni sljedeće dobre laboratorijske prakse: • Ne koristite reagense kojima je istekao rok trajanja. • Ne miješajte i ne povezujte reagense iz različitih lotova u okviru serije testiranja. • Prije uporabe pričekajte 30 minuta da se reagensi stabiliziraju na sobnoj temperaturi (18-30°C). • Naziv testa, kao i specifični identifikacijski broj testa, napisan je na okviru svake mikrotitarske pločice. Ovaj specifični identifikacijski broj nalazi se i na svakoj traci. Syphilis Total Ab: Specifični ID broj = 97 Potvrdite specifični identifikacijski broj prije uporabe. Ako identifikacijski broj nedostaje ili se razlikuje od broja koji odgovara testu koji se koristi, tada traku ne bi trebalo koristiti. NAPOMENA: Za otopinu za ispiranje (R2, identifikacijska oznaka: 20X zelene boje), pufer supstrata peroksidaze (R8, identifikacijska oznaka: TMB pufer, plave boje), kromogen (R9, identifikacijska oznaka: TMB 11X, ljubičaste boje) i otopinu za zaustavljanje (R10, identifikacijska oznaka: 1N, crvene boje) moguće je koristiti druge lotove od onih sadržanih u kompletu, ako da se isti lot koristi u okviru određenog testiranja. Ovi reagensi mogu se koristiti s drugim proizvodima naše tvrtke. Za detaljne informacije obratite se našoj tehničkoj službi. • Pažljivo rekonstituirajte reagens izbjegavajući bilo koji oblik kontaminacije. • Koristite posude od stakla koje su dobro oprane i isprane deioniziranom vodom ili, poželjno, materijal za jednokratnu uporabu. • Ne dozvolite mikrotitarskoj pločici da se osuši u vremenu između kraja pranja i raspodjele reagensa. • Enzimska reakcija jako je osjetljiva na metalne ione. Stoga, ne dozvolite metalnim elementima da dođu u kontakt s različitim konjugatima ili otopinama supstrata. • Razvojna otopina (pufer supstrata + kromogen) mora biti ružičaste boje. Promjena ružičaste boje unutar nekoliko minuta nakon rekonstitucije znači da se reagens ne smije koristiti te se mora zamijeniti. Priprema razvojne otopine može se učiniti u čistoj jednokratnoj plastičnoj posudi ili staklenom spremniku koji prvo treba oprati s pomoću 1N HCl te dobro isprati destiliranom vodom i osušiti. Ovaj reagens mora se čuvati u tami. • Nikad ne koristite isti spremnik za raspodjelu konjugata i za razvojnu otopinu.

5.2.2. Obrada

• Ne mijenjajte postupak testa. • Ne obavljajte testiranje u prisustvu reaktivnih para (kiselinskih, alkalnih, aldehidskih para) ili prašine koja može izmijeniti enzimsku aktivnost konjugata. • Koristite novi nastavak za raspodjelu svakog uzorka. • Dobro ispiranje ključni je korak u ovom postupku, stoga se pridržavajte preporučenog broja ciklusa ispiranja i vodite računa da su sve jažice potpuno ispunjene i zatim potpuno ispražnjene. Neispravno ispiranje može rezultirati netočnim rezultatima. • Pažljivo slijedite opisan postupak ispiranja kako bi dobili najbolju izvedbu testa. Kod nekih instrumenata bit će potrebno optimizirati proceduru ispiranja (povećati broj ciklusa ispiranja i/ili obujam pufera za pranje u svakom ciklusu) radi postizanja prihvatljive razine OD pozadine za negativne uzroke. • Za prilagodbe i posebne postupke obratite se našoj tvrtki.

6. UZORCI

Prikupite krvne uzorke prema trenutačnoj praksi. Testiranje se treba izvršiti s nerazrijeđenim serumom ili plazmom (prikupljenom na EDTA-i, natrijevu citratu, natrijevu heparinu ili ACD-u) Uzorci koji sadrže agregate moraju se pročistiti centrifugiranjem prije testiranja. Uzorci se trebaju čuvati na temperaturi od +2-8°C ako će se testiranje izvršiti unutar 7 dana ili na temperaturi od -20°C tijekom duljeg razdoblja. Nemojte ponoviti više od 5 ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Uzorci koji su toplinski tretirani na temperaturi od 56°C tijekom pola sata mogu se upotrijebiti.

[HR] 6

Uzorci koji sadrže do 120 g/l albumina, 200 mg/l bilirubina, 33 g/l trioleina ili 2 g/l hemoglobina ne utječu na rezultate. Ne preporučuje se koristiti hiperlipidemične i hiperhemolizirane serume ili plazmu. Uzorke je potrebno odmrznuti i dobro promiješati prije testiranja. Ako se uzorke treba otpremiti, treba ih zapakirati u skladu s propisima važećim za prijevoz etioloških agensa te se preporučuje prevoziti ih zamrznute.

7. POSTUPAK

7.1. Potrebni materijal koji nije dostavljen

• Destilirana voda. • Natrijev hipoklorit (izbjeljivač za primjenu u kućanstvima) i natrijev bikarbonat. • Upijajući papir. • Rukavice za jednokratnu uporabu. • Zaštitne naočale. • Epruvete za jednokratnu uporabu. • Automatske ili poluautomatske, podesive ili prethodno podešene pipete ili višestruke pipete za

mjerenje i pipetiranje 50 μl, 1 ml i 10 ml. • Graduirani cilindri kapaciteta 100 ml i 1 L. Automatski, poluautomatski ili ručni sustav za ispiranje mikrotitarskih pločica (*). • Inkubator za mikrotitarske pločice, termostatski podešen na temperaturu od 37°C ±1°C (*). • Spremnik za biološki opasan otpad. • Čitač mikrotitarske pločice s filterima od 450 nm, 490 nm i 620-700 nm (*). (*) Posavjetujte se s nama vezano za detaljne informacije o opremi koju preporučuje naš tehnički odjel.

7.2. Priprema reagensa

7.2.1. Reagensi spremni za uporabu

Reagens 1 (R1): Mikrotitarska pločica Svaki okvir koji sadrži 12 traka umotan je u zatvorenu vrećicu od folije. Razrežite vrećicu pomoću škara ili skalpela i to 0,5 do 1 cm iznad ruba vakuumiranja. Otvorite vrećicu i izvadite okvir. Nekorištene trake vratite natrag u vrećicu. Pažljivo zatvorite vrećicu i vratite je natrag na čuvanje pri temperaturi od +2-8°C. Reagens 3 (R3): Negativna kontrola Reagens 4 (R4): Pozitivna kontrola Reagens 6 (R6): Konjugat Homogenizirati okretanjem prije uporabe. Reagens 10 (R10): Otopina za zaustavljanje

7.2.2. Reagensi za rekonstituciju

Reagens 2 (R2): Koncentrat sredstva za ispiranje (20x) Razrijedite 1:20 u destiliranoj vodi za dobivanje otopine spremne za ispiranje. Pripremite 800 ml za jednu pločicu s 12 traka. Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9): Enzimska razvojna otopina Razrijedite 1:11 kromogena (R9) u puferu supstrata (npr. 1 ml reagensa R9 + 10 ml reagensa R8), s tim da je 10 ml neophodno i dovoljno za tretiranje 12 traka. Homogenizirajte.

7.3. Postupak analize

Strogo se pridržavajte postupka. Koristite pozitivne i negativne kontrolne serume za svaki test radi potvrđivanja kvalitete testa. Slijedite sljedeću dobru laboratorijsku praksu:

[HR] 7

1) Pažljivo utvrdite raspodjelu uzoraka i plan identifikacije. 2) Pripremite razrijeđenu otopinu za ispiranje R2 3) Izvadite iz zaštićenog pakiranja podržni okvir i potreban broj traka (R1). Neiskorištene trake

vratite natrag u pakiranje. Zatvorite pakiranje i pohranite ga pri temperaturi od +2-8°C. 4) Raspodjelite u jažice prema sljedećem rasporedu (preporučena raspodjela po pločici):

• 50 μl negativne kontrole (R3) u A1, B1, C1 • 50 μl pozitivne kontrole (R4) u D1, E1 • 50 µl nerazrijeđenog uzorka u svaku jažicu, F1, G1 itd. • 50 μl konjugata (R6) u svaku jažicu

Ovisno o korištenom sustavu, moguće je izmijeniti položaj kontrola ili redoslijed raspodjele. Homogenizirajte reakcijsku mješavinu s barem 3 aspiracije ili s treskalicom mikrotitarske pločice tijekom 5 sekundi. NAPOMENA: Raspodjela uzoraka i kontrola može se vizualno kontrolirati u ovom koraku rada, uočava se razlika u boji između prazne jažice i jažice s uzorkom. Raspodijelite konjugat unutar 5 minuta nakon raspodjele uzorka. Jasno se uočava razlika u boji između prazne jažice i pune jažice koja sadrži crvenu otopinu konjugata (R6) (pogledajte § 7.7)

5) Kada je moguće, prekrijte pločicu novom adhezivnom folijom. 6) Inkubirajte mikrotitarsku pločicu od 30 do 35 minuta pri temperaturi od 37°C ± 1°C. 7) Ako je potrebno, uklonite adhezivnu foliju. Aspirirajte sadržaj svih jažica u spremnik za tekući

otpad i u svaku jažicu dodajte minimalno 370 µl otopine za ispiranje. Aspirirajte ponovo i ponovite ispiranje najmanje 4 puta (ukupno 5 ciklusa ispiranja). Preostali volumen mora biti manji od 10 μl (ako je potrebno, osušite trake okretanjem naopako na upijajući papir). Ako imate automatsku perilicu, slijedite isti ciklus rada.

NAPOMENA: Prijeđite na korak ispiranja unutar 20 minuta.

8) Pripremite razvojnu otopinu (reagens R8 + R9). 9) Brzo pipetirajte 50 μl pripremljene razvojne otopine (R8+R9), svježe pripremljene prije

uporabe, u svaku jažicu. Pustite da se reakcija razvije u mraku u vremenu od 25 do 35 minuta na sobnoj temperaturi (18-30°C). Tijekom ove inkubacije ne koristite adhezivnu foliju.

NAPOMENA: Raspoređivanje razvojne otopine, koja je ružičaste boje, može se vizualno kontrolirati u ovom koraku rada. Jasno se uočava razlika u boji između prazne jažice i pune jažice koja sadrži ružičastu otopinu supstrata. (Pogledajte § 7.7). 10) Dodajte 50 μl otopine za zaustavljanje (R10) koristeći isti redoslijed i istu brzinu raspodjele kao

i za otopinu supstrata. Homogenizirajte reakcijsku mješavinu. NAPOMENA: Raspodjela bezbojne otopine za zaustavljanje može se vizualno kontrolirati u ovoj fazi rukovanja. Boja supstrata, ružičasta (za negativne uzorke) ili plava (za pozitivne uzorke), blijedi u jažicama, koje postaju bezbojne (za negativne uzorke) ili žute (za pozitivne uzorke) nakon dodavanja otopine za zaustavljanje. 11) Pažljivo obrišite dno svake pločice. Pričekajte barem 4 minute nakon dodavanja otopine za

zaustavljanje te unutar 30 minuta od zaustavljanja reakcije očitajte optičku gustoću pri 450/620-690 nm pomoću čitača pločice.

12) Provjerite slaganje između spektrofotometrijskog i vizualnog očitavanja, u skladu s pločicom i raspodjelom uzoraka te planom identifikacije.

7.4. Kontrola kvalitete Koristite negativnu (R3) i pozitivnu (R4) kontrolu za svako testiranje radi potvrde rezultata testa. (Pogledajte §7.5).

[HR] 8

7.5. Kriteriji za validaciju testa

Ovaj je test potvrđen ako se poštuju uvjeti u nastavku:

1) Za negativnu kontrolu R3: OD R3 ≤ 0,080

Ako je jedna kontrolna vrijednost veća od ove vrijednosti, zanemarite je i nastavite s izračunom služeći se dvjema preostalim vrijednostima negativne kontrole.

2) Za pozitivnu kontrolu R4: OD R4 ≥ 0,700

7.6. Izračun/interpretacija rezultata

Granična vrijednost (cut-off) određuje se pomoću negativne kontrole R3: Izračunajte srednju izmjerenu vrijednost apsorpcije za negativnu kontrolu R3 te graničnu vrijednost (Cut-Off Value – COV) na sljedeći način: COV = srednja vrijednost OD R3 + 0,100 Uzorci s OD-om manjim od COV-a smatraju se negativnima prema testu Syphilis Total Ab. Rezultati koji su neposredno ispod granične vrijednosti (COV -10% < OD < COV) trebaju se tumačiti s oprezom. Preporučuje se ponovno dvostruko testiranje odgovarajućih uzoraka kada to dozvoljavaju sustav i laboratorijske procedure. Uzorci s OD-om koji je veći ili jednak COV-u smatraju se pozitivnima prema testu Syphilis Total Ab te se moraju ponovno dvostruko testirati prije konačnog tumačenja. Ponovno testirani uzorci, kada je bar jedan uzorak iznad COV-a, smatraju se pozitivnima i trebaju se dodatno istražiti. Kada su oba uzorka ispod granične vrijednosti, ti se uzorci smatraju negativnima. U slučaju jako slabe optičke gustoće testiranih uzoraka (negativan OD) i kada je prisustvo uzoraka te reagensa kontrolirano, rezultati se mogu tumačiti kao negativni. Preporučuje se slijediti trenutačne nacionalne preporuke i algoritme za potvrdu pozitivnih uzoraka.

7.7. Spektrofotometrijska verifikacija uzorka i pipetiranje konjugata (opcija)

Uzorci i kontrole Prisutnost uzoraka i kontrola u jažici moguće je provjeriti automatskim očitanjem pri 450/620 nm. Jažica s dodanim uzorkom imat će OD između 0,050 i 1,100. Konjugat Konjugat je crvene boje. Prisutnost konjugata u jažicama moguće je kontrolirati automatskim očitanjem pri 450/620 nm. Jažica s uzorkom i konjugatom imat će OD ≥1,200. Verifikacija pipetiranjem razvojne otopine Moguće je potvrditi prisutnost ružičaste razvojne otopine u jažici automatskim očitanjem pri 492 nm. Jažica s razvojnom otopinom mora imati optičku gustoću >0,100 (niža vrijednost OD ukazuje na lošu raspodjelu razvojne otopine).

8. OGRANIČENJE TESTA

Kao i kod svih seroloških testova na sifilis, rezultati dobiveni testom Syphilis Total Ab EIA moraju se tumačiti u skladu s bolesnikovim kliničkim simptomima, povijesti bolesti i drugim laboratorijskim nalazima, kako bi se uspostavila cjelovita klinička dijagnoza. Ne postoji jedinstven test ili konačan referentni standard za svaku fazu bolesti. Dijagnosticiranje sifilisa stoga uvelike ovisi o serološkom testiranju te su potrebni rezultati dobiveni kako netreponemskim, tako i treponemskim metodama.

[HR] 9

Niti jedan dijagnostički test ne pruža apsolutnu sigurnost da uzorak ne sadrži nisku razinu protutijela na T. pallium, kao što su prisutna u vrlo ranoj fazi infekcije. Stoga negativan rezultat u bilo kojem trenutku ne isključuje mogućnost izloženosti infekciji sifilisom. Svaka ELISA tehnika može rezultirati lažno pozitivnim reakcijama. Preporučuje se provjeriti specifičnost reakcije svakog uzorka koji je bio ponovljeno pozitivan, u skladu s kriterijima interpretacije za komplet Syphilis Total Ab, primjenom odgovarajuće metode: Hemaglutinacijski test za Treponema

pallidum. Svi rezultati treponemskog testa obično ostaju reaktivni nakon treponemske infekcije te se stoga ne bi trebali koristiti za procjenu odgovora na liječenje. Zbog postojanosti reaktivnosti, općenito tijekom bolesnikova života, treponemski testovi nisu korisni za utvrđivanje relapsa ili ponovne infekcije kod bolesnika koji je imao reaktivan rezultat. U tom slučaju preporučuje se uporaba drugih testova: Syphilis IgM EIA, RPR i TPHA. Spektrofotometrijska metoda za provjeru dodavanja uzorka, konjugata i razvojne otopine ne omogućuje provjeru točnosti raspodijeljenog volumena uzoraka i konjugata. Tom se metodom dokazuje samo prisutnost uzorka i konjugata. Učestalost pogreške kod ove metode usko je povezana s točnošću korištenog sustava (kumulativni koeficijent varijacije iznad 10% raspodjele i očitavanja značajno smanjuje kvalitetu ovog koraka).

9. KARAKTERISTIKE IZVEDBE

9.1. Mjerenje preciznosti

Ponovljivost i srednja preciznost utvrđeni su uporabom uzoraka s različitom koncentracijom protutijela na sifilis. Uzorci su testirani 30 puta tijekom iste serije testova radi utvrđivanja ponovljivosti. Uzorci su također dvostruko testirani provedbom 2 testa dnevno tijekom 20 dana. Izračunate su srednje vrijednosti omjera, standardne devijacije i koeficijenti varijacije (CV).

9.1.1. Ponovljivost:

Uzorci N Srednja

vrijednost omjera

Standardna devijacija

CV %

Nisko negativni 30 0,14 0,014 9,5%

Visoko negativni 30 0,68 0,051 7,5%

Nisko negativni prema Syphilis ab

30 1,90 0,070 3,7%

Pozitivni prema Syphilis ab

30 3,76 0,130 3,5%

Koeficijenti varijacije (CV) dobiveni od pozitivnih uzoraka manji su od 10%.

[HR] 10

9.1.2. Srednja preciznost

Uzorci N Srednja

vrijednost omjera

Unutar testa (intra-assay)

Između testova / operater

Između dana Ukupna reproducibilnost

SD CV % SD CV % SD CV % SD CV %

Nisko negativni 80 0,15 0,035 22,5% 0,023 14,7% 0,017 10,9% 0,045 29,0%

Visoko negativni 80 0,74 0,038 5,1% 0,074 10,0% 0,006 0,8% 0,084 11,2% Nisko pozitivni Syphilis ab 80 2,30 0,112 4,9% 0,312 13,5% 0,099 4,3% 0,346 15,0%

Pozitivni Syphilis ab 80 4,13 0,180 4,3% 0,543 13,1% 0,195 4,7% 0,604 14,6%

Koeficijenti varijacije (CV) dobiveni od pozitivnih uzoraka manji su od ili jednaki 15%.

9.2. Kliničke performanse Kliničke performanse testa Syphilis Total Ab utvrđene su testiranjem uzoraka iz prospektivnih i retrospektivnih studija: Prospektivna studija:

- 5195 uzoraka nasumičnih davatelja krvi; - 460 uzoraka bolesnika kod kojih se sumnjalo na infekciju sifilisom

Retrospektivna studija: - 350 pozitivnih uzoraka bolesnika sa spolno prenosivom bolesti.

Studije su provedene u 2 centra za darivanje krvi, klinici za spolno prenosive bolesti i na lokaciji tvrtke Bio-Rad.

9.2.1. Dijagnostička specifičnost Ova studija vršila se na uzorcima seruma i EDTA plazme prikupljenim u 2 banke krvi od nasumično odabranih davatelja u Francuskoj. Također je provedena studija specifičnosti na uzorcima pacijenata. Svi su rezultati uspoređeni s onima dobivenim pomoću drugih testova na sifilis s oznakom CE. Tablica 1: Test specifičnosti (IR = Inicijalna reaktivnost; RR = Ponovljena reaktivnost)

Populacija Lokacije Vrsta uzorka Ukupan

broj uzoraka

Inicijalna reaktivnost

(IR)

Ponovljena reaktivnost

(RR)

Specifičnost RR-a (%) 95% CI (%)

Davatelji krvi #1 + #2

Serum SST 3127 2 2* 3125/3125

Plazma EDTA K2 2068 2 2* 2066/2066

Ukupno 5195 4 4* 100% 5191/5191

99,93% - 100%

Bolesnici #3 Serum 351 1 1 99,72% 350/351

98,42 – 100%

*Ponovljeno reaktivni uzorci koji su bili pozitivni na drugi imunoenzimski test na sifilis s oznakom CE isključeni su iz izračuna dijagnostičke specifičnosti

[HR] 11

9.2.2. Dijagnostička osjetljivost Retrospektivna studija: Studija je provedena na 350 zamrznutih uzoraka, od čega su 2 uzorka bila negativna, a 348 ih je bilo pozitivno na imunoenzimske testove na sifilis s oznakom CE. Među ovih 348 pozitivnih uzoraka bilo je 7 uzoraka bolesnika u ranoj fazi infekcije. Svih 348 uzoraka bilo je pozitivno na test tvrtke Bio-Rad Syphilis Total Ab. Prospektivna studija: Ukupno 460 svježih uzoraka evaluirano je pomoću testa tvrtke Bio-Rad Syphilis Total Ab i uspoređeno s testovima na sifilis s oznakom CE. 348 uzoraka bilo je negativno na test tvrtke Bio-Rad i referentne testove (dva uzorka pokazala su se lažno pozitivnima na referentni imunoenzimski test) 109 uzoraka bilo je pozitivno na oba testa. 3 uzorka pokazala su proturječne rezultate (nakon ponovnog testiranja s pomoću testa tvrtke Bio-Rad):

• 1 uzorak bio je pozitivan na test tvrtke Bio-Rad i visoko negativan na referentne testove. Ovaj uzorak s niskom razinom infekcije sifilisom imao je graničnu vrijednost na oba imunoenzimska testa:

• 1 uzorak bio je pozitivan na referentne testove i negativan na test tvrtke Bio-Rad (1 bolesnik bez znakova)

• 1 uzorak bio je pozitivan na referentne testove, negativan na inicijalnu reaktivnost (IR) i pozitivan na ponovno testiranje testom Bio-Rad,

Retrospektivne i prospektivne studije: Globalna dijagnostička osjetljivost iznosi 99,56% (457/459) s intervalom pouzdanosti od 95% [98,44% - 99,95%]. Klinička osjetljivost Klinička osjetljivost također je istražena na 3 komercijalna panela i 1 serokonverzijskom panelu. Test tvrtke Bio-Rad Syphilis Total Ab uspoređen je s testom na sifilis s oznakom CE. Otkrivanje svakog uzorka u panelima bilo je jednako u testu Bio-Rad i referentnom testu na sifilis.

9.3. Analitička osjetljivost Analitička osjetljivost procijenjena je s pomoću 2 standarda Nacionalnog instituta za biološke standarde i kontrolu (NIBSC) te je izračunata na graničnoj vrijednosti uporabom regresije:

1. Granica otkrivanja protutijela IgG/IgM evaluirana je na 3 lota testa Syphilis Total Ab i procijenjena na 0,53 mIU/ml s intervalom pouzdanosti od 95% [0,10 mIU/ml – 1,30 mIU/ml] uporabom standarda IgM/IgG Svjetske zdravstvene organizacije (SZO) (kod NIBSC: 05/132).

2. Granica otkrivanja protutijela IgG evaluirana je na 1 lotu testa Syphilis Total Ab i procijenjena na 0,11 mIU/ml s intervalom pouzdanosti od 95% [0,02 mIU/ml – 0,27 mIU/ml] uporabom standarda IgG SZO-a (kod NIBSC: 05/122).

9.4. Analitička specifičnost/studija križne reaktivnosti Testom Syphilis Total Ab testirano je ukupno 125 potencijalno interferirajućih uzoraka, koji sadrže protutijela na patogene koji mogu uzrokovati zarazne bolesti (Lyme bolest, toksoplazmoza, EBV, leptospiroza, SLE (lupus), protutijela na hepatitis A, protutijela na hepatitis B, protutijela na hepatitis C, HTLV I/II i HIV), uzorci bolesnika iz rizične skupine (trudnice, žene koje su rodile više puta) ili uzorci bolesnika s poremećajima imunološkog sustava (reumatoidni faktori) Od 125 testiranih uzoraka, 1 uzorak bio je ponovljeno pozitivan na test Syphilis Total Ab. Pozitivnost ovog uzorka provjerena je drugim imunoenzimskim testom na sifilis s oznakom CE i konfirmacijskim testovima. Specifičnost opažena kod ove ciljane populacije iznosi 100% (124/124) s intervalom pouzdanosti od 95% [97,1% - 100,0%].

[HR] 12

9.5. Prozonski učinak Postojanje mogućeg prozonskog učinka (tzv. hook efekta) proučavana je testiranjem 6 uzoraka pozitivnih na sifilis s visokim titrom, primjenom različitih razrjeđenja. Ujednačenost rezultata kod nerazrijeđenih i razrijeđenih uzoraka ukazuje na odsustvo prozonskog učinka na testiranim uzorcima.

10. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1–21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525–7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187–209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300–309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, ‘It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis’, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6.

[HR] 13

[HR] 14

[HR] 15

[HR] 16

[HR] 17

Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11

www.bio-rad.com 883679