E. Ralf Schönbrunner1, Reina Karunaratne1, Jerry Boonyaratanakornkit1, Alana Benn1 Mona Shahbazian1, Martina Behrens2 & Sven‐Erik Behrens21AcroMetrix Corporation, Benicia, California, 94510 USA and 2Martin‐Luther‐University Halle‐Wittenberg, Institute of Biotechnology, 06120 Halle/Saale Saxony‐Anhalt, Germany

www.acrometrix.com

SynTura™ Technology : A NEW PLATFORM TO GENERATERNA VIRAL STANDARDS

Abstract

BVDV and HCV are the closest related Flaviviridae viruses. Therefore, BVDV is ideal  to generate HCV surrogate material. BVDV can be cultured to very high titers and exogenous sequences can be inserted.

The entire 341 bp 5’NTR of HCV 1b was stably inserted into BVDV, creating SynTura™ HCV.  The entire 5’NTR is required to form the correct secondary structure. SynTura™ HCV was found replicate in culture at the same growth rate of wild‐type BVDV. 

Titers as high as 2E8 IU/ml were grown for SynTura™ HCV, and then further concentrated up to 1.5E10 IU/ml by ultra‐centrifugation and tangential flow filtration (TFF) .  

Beta‐propiolactone inactivation conditions were optimized to achieve highest PCR efficiency combined with complete inactivation, verified by infectivity testing. 

Experiment 1: Confirmation that SynTura HCV is a RNA virus

SynTura™ HCV was tested to determine if the HCV signal generated from real‐time PCR was from a true RNA vial source vs. a DNA contamination from the cloning process. SynTura™ HCV samples and natural HCV (control) were extracted manually using a QIAamp Virus MinElute Kit (QIAGEN). Lab developed real‐time PCR was conducted using the TaqMan One‐Step RT‐PCR Master Mix Reagents (Applied BioSystems) on the ABI 7300.  Two separate master mixes were prepared, onewith the reverse transcriptase (RT) included and one without the RT included. 

Both the SynTura™ HCV and natural HCV showed no amplification in the absence of RT confirming that the SynTura™ HCV construct consisted of RNA viral material. 

Experiment 2: Confirmation that SynTura™ HCV is intact virus

To confirm that SynTura™ HCV consisted of intact virus a RNase digest was conducted. BothSynTura™ HCV and natural HCV samples were split into two sets of aliquots. One set  was digested with RNase If (New England Biolabs) and the other set had no treatment done. Both sets of samples were then extracted and amplified as previously described in Exp 1 . 

Both the SynTura™ HCV and  natural HCV samples were not significantly affected by the RNase digest, indicating that SynTura™ HCV is protected (intact) similar to natural HCV . To confirm that the RNase digest was working, we extracted RNA from natural HCV and followed the same digest, extraction, and amplification conditions and found no HCV signal detectable when amplified by real‐time PCR.  

Sample No Treatment (Ct) Rnase Digest (Ct)SynTura HCV 34.9 34.8Natural HCV 38.1 37.7HCV RNA 38.1 no signal

Sample Ct with RT Ct without RTSynTura HCV 26.6 no signalNatural HCV 33.1 no signal

Experiment 3: TMA testing

To verify compatibility of the beta‐propiolactone inactivation method with TMA testing, five replicates of active and inactive SynTura™ HCV samples were tested in the Procleix® Ultrio® TMA assay  at two different levels .

Both the 1E2 IU/ml and 1E3 IU/ml SynTura™ HCV materials tested positive and reactive for HCV. The S/CO ratios for active and inactive samples were approximately equal at each level, indicating that the beta‐propiolactone inactivation process does not interfere with TMA testing.

Sample Active / Inactive (β-PL) Titer Replicates Invalid/valid (IC) Interpretation Avg S/COActive 1E+02 n=5 valid reactive 5.65

Inactive 1E+02 n=5 valid reactive 5.83Active 1E+03 n=5 valid reactive 9.07

Inactive 1E+03 n=5 valid reactive 8.73

SynTura HCV

Experiment 4: Performance Evaluation of OptiQuant‐S HCV Quantification Panel

To check for linearity and precision three replicates of the OptiQuant‐S HCV panel, with members at 1E2, 5E2, 5E3, 5E4, 5E5, 5E6, and 2.5E7 IU/ml,  were extracted using the Qiagen QIAcube with the Qiagen QIAamp MinElute Virus Spin Kit and tested in a real‐time PCR HCV assay. A linear regression analysis of Expected Titer versus Ct values was performed. The slope was ‐3.3 with a coefficient of determination (R²) of 0.99 indicating good linearity and precision. The standard deviation ranged between 0.06‐0.40.

OptiQuant-S HCV Quantification Panel

y = -3.3352x + 41.247R2 = 0.9983

0

10

20

30

40

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Expected Titer (IU/ml)

Ct

Background:  The ideal quality control material for external positive controls, internal controls, and quantification standards consists of an intact virus that closely resembles the target analyte suspended in a matrix based on that of clinical specimens. Many viruses, particularly those such as HCV that cannot be grown in culture or those that have rare genotypes, are difficult to obtain at high titers and in large quantities. New HCV real‐time assays with expanded linear ranges are being introduced into the market place, creating the need for new standards that span the dynamic range, critical for validation and verification. Objective: The goal for AcroMetrix was to develop a technology that would allow the generation of a stable and safe control that closely resembles naturally occurring HCV and can be produced at high titers as well as used on multiple molecular nucleic acid testing (NAT) systems as a diagnostic tool. Methods: SynTura™ was developed by AcroMetrix as a second generation viral RNA quality control material closely related to HCV. A recombinant form of the Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) Pestivirus was constructed in which additional sequence elements can be stably inserted into the genome, thus providing a starting point for quality controls for most viral RNA assays. As a first model we generated a version in which the 341 bp 5’NTR of HCV 1b was inserted. Real‐time PCR was used in several experiments to fully characterize SynTura™ HCV. These experiments include inactivation and infectivity studies, accelerated stability studies, and concentration studies. From this material, the OptiQuant®‐S HCV Quantification Panel (AcroMetrix Catalog No. 95‐0350) was developed and consists of serial dilutions of SynTura™ HCV at 1E2, 5E2, 5E3, 5E4, 5E5, 5E6, and 2.5E7 IU/ml. Following ISO 17511:2003, the assigned values are traceable to the WHO 2nd International Standard for HCV RNA. The OptiQuant‐S HCV Quantification Panel was tested for linearity and precision in a HCV real‐time PCR assay.Results: Chimeric BVDV with sequence insertions in the viral RNA genome were shown to be stable in replication and capable of forming infectious, RNase resistant virus particles.  SynTura™ HCV was cultured to 2.03E+08 IU/mL and was concentrated to 1.54eE+10 IU/mL. SynTura™ HCV was characterized as intact RNA virus protected from degradation in human plasma and could be completely inactivated using ß‐Propiolactone. SynTura HCV tested on the Procleix® Ultrio® TMA assay produced valid and reactive results down to 100 IU/ml. A plot of log concentration versus observed Ct values of the OptiQuant‐S HCV Quantification Panel resulted in a slope of ‐3.3 and R² > 0.99 on a real‐time HCV assay indicating linearity and precision. Stability and other properties of SynTura™ HCV are very similar to HCV. Conclusions: SynTura™ is a means of providing a high titer, safe, stable, highly reproducible quality control that closely resembles native HCV. SynTura™ is a useful platform for the development of positive external controls, Quantitation Standards (QS), Internal Controls (IC) and calibrators. 

Conclusion

HCV and BVDV are both Flaviviridae, making SynTura ™HCV an ideal model system for HCV quality control materials

The NAT target region of HCV (5’ NTR) was stably inserted in BVDV to  generate the first SynTura™ model, SynTura™ HCV

SynTura™ HCV consists of intact RNA virus, that is safe to handle, can be grown to high titers, concentrated,   and is stable in normal  human plasma

SynTura™ HCV works in several HCV NAT assays including , TMA testing and quantitative real‐time PCR

The first SynTura™ panel, the OptiQuant®‐S HCV Quantification Panel was developed and is traceable to the WHO 2nd International Std for HCV RNA, following ISO:17511

Using SynTura ™ Technology, a second generation vector was developed to include a multi‐cloning site  in which various viral RNA sequences can be inserted

SynTura™ Technology is useful to generate positive viral RNA controls, calibrators, quantitation standards (QS), and internal 

controls (IC)

Introduction

The SynTura™ project was initiated to provide Internal Controls (IC) and Quantification Standards (QS) that behave like the target they intend to control as well as calibrators and controls that behave like patient samples to give meaningful results. For effective validation and verifications of assays, standards should test the limits of the assay.  HCV is difficult to culture and source at titers above 1E7 IU/ml. However, commercial HCV assays have dynamic ranges well above 1E7 IU/ml, creating a need for a new technology that can produce a meaningful standard for HCV.  

HCV consists of a single stranded RNA genome surrounded by a protein coat and further encased by a lipid envelope of cellularorigin.  HCV belongs to the Hepacivirus genus of the Flaviviridae family of viruses. 

Target Region of most NAT assays

HCV genome vs. BVDV genome

Results

Development

BVDV Plasmid(BVDV in blue)

Insert desired Sequence (red)

Make RNA Transcripts

Transfect Cell Line

Grow transfectedCell in culture

Viral Particles

Infected Cells produce Virus

DNA RNA

A second generation vector with a multi‐cloning site was developed using SynTura ™ Technology. This vector is the foundation of a whole new platform where various RNA viral sequences  can be inserted. 

Generation of SynTura HCV

Secondary Structure of HCV 5’NTR insert

Flaviviridae Classification

•Yellow fever virus, •West Nile virus •Dengue virus •St. Louis encephalitis virus •Tick‐borne encephalitis virus •Japanese encephalitis virus•Classical swine fever virus (CSFV)•Border disease virus (BDV) •Bovine Viral Diarrhea Virus 1 & 2 (BVDV) 

Hepacivirus •Hepatitis C virus (HCV)

Flaviviridae

Flavivirus

Pestivirus

The Best Theoretical Alternative to Real HCVSimilar virus to HCVEasy to cultureGrows to high titersNon‐infectious to humansDetectable in HCV assays

After 3 passages • Zero mutations in all 5 clones•Zero mutations in 1 clone•Two point mutations in BVDV in 2 clones •Two point mutations in HCV insert in 2 clones 

5 clonesAfter 7 passages

Partial Sequencing

Indicates similar rates of mutations between HCV insert and BVDV

SynTura ™Multiple Cloning Site Vector

RNA viral sequences inserted

restriction sites

StableBVDV plasmid

BVDV

HCV