-
SVEUČILIŠTE U SPLITU
MEDICINSKI FAKULTET
VICKO GLUNČIĆ
ODREDNICE RANOG USTROJA MOŽDANIH POLJA U
MARGINALNOJ ZONI EMBRIONALNE MOŽDANE KORE
DOKTORSKA DISERTACIJA
SPLIT, 2005.
1
-
SVEUČILIŠTE U SPLITU
MEDICINSKI FAKULTET
VICKO GLUNČIĆ
ODREDNICE RANOG USTROJA MOŽDANIH POLJA U
MARGINALNOJ ZONI EMBRIONALNE MOŽDANE KORE
DOKTORSKA DISERTACIJA
SPLIT, 2005.
2
-
Ova doktorska disertacija predana je na ocjenu
Povjerenstvu za magisterije i doktorate
Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu
radi stjecanja znanstvenog stupnja
doktora znanosti iz područja biomedicine i zdravstva,
polje temeljne medicinske znanosti, grana neuroznanost.
3
-
Doktorska disertacija izrađena je pri odjelu za neurobiologiju
Medicinskog
fakulteta Sveučilišta Yale, New Haven, SAD. U radu je analiziran
materijal te
korištena oprema i sredstva projekta "Neurogenetski procesi u
fetalnom mozgu"
(voditelj projekta: prof. dr. sc. Paško Rakić).
Mentor rada bio je: prof. dr. sc. Zoran Ðogaš, dr. med.
4
-
Voditelju projekta, prof. dr. sc. Pašku Rakiću i mentoru prof.
dr. sc.
Zoranu Ðogašu zahvaljujem na pomoći i savjetima tijekom izrade
ovog
rada. Također zahvaljujem na korisnim savjetima kolegama dr. sc.
Tariku
Haydaru, dr. sc. Skirmantasu Janusonisu te dr. sc. Genu Angu s
kojima
sam surađivao na ovom projektu.
Svojim roditeljima zahvaljujem na potpori i razumijevanju.
Yale University, New Haven, USA, 25.5.2005.
Vaš Vicko
5
-
SADRŽAJ:
Značenje
kratica…………………………………………........................................9
1. UVOD…………………………………………………………………….……..…10
1.1. Stanični ustroj embrionalne moždane
kore…………..………….............................14
1.2. Razvoj slojevitog i stupićastog ustroja embrionalne moždane
kore……......……...14
1.3. Vremenski i prostorni obrazac nastanka neurona te različiti
obrasci
migracije neurona u embrionalnoj moždanoj
kori………………………………....16
1.4. Marginalna zona embrionalne moždane
kore………………………………..….....18
1.5. Osnovne postavke konfokalne i multifotonske laserske
mikroskopije.....................21
1.6. Na koji se način tangencijalno migrirajući neuroni pravilno
razmještaju
unutar određenoga kortikalnog polja i određenog sloja unutar
istog polja
embrionalne moždane
kore?.....................................................................................23
1.6.1. Koja je uloga marginalne zone i Cajal-Retziusovih stanica
u procesima
razmještanja tangencijalno migrirajućih interneurona u
embrionalnoj
moždanoj
kori?.........................................................................................................24
1.6.2. Koja je uloga ranih serotoninergičkih aksonskih
projekcija u embrionalnoj
moždanoj kori u nadzoru razmještaja tangencijalno
migrirajućih
interneurona?............................................................................................................25
2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŽIVANJA……………………………………..26
3. TVORIVA I POSTUPCI
………………..………………….................................28 3.1.
Tvoriva..……………………..…………..…………………………………………28
3.2. Postupci………………….…………………………………………………….…...28
3.2.1. Injiciranje trudnih ženki miša
5-metoksitriptaminom………....……......….…....…28
3.2.2. Imunohistokemijski
postupci……………...…………………..…………….….….28
3.2.2.1.Imunohistokemijsko bojenje stanica anti-Reelin i
anti-serotoninergičkim
protutijelima…………..…………...…………………………….………………....28
3.2.2.2.Imunohistokemijsko bojenje stanica ati-Calbindin,
anti-Calretinin,
anti-Reelin, anti-Gaba i anti-Dlx
protutijelima……...………………………….….29
6
-
3.2.3. Imunohistokemijsko bojenje kombinirano s elektronskom
mikroskopijom……….29
3.2.3.1.Imunohistokemijsko bojenje serotoninergičkih
aksona….………………………...30
3.2.3.2.Imunohistokemijsko bojenje Cajal-Retzius-ovih
stanica………………..………....30
3.2.4. Bojenje histoloških rezova po
Nisslu……………………………………………....31
3.2.5. In vivo produžena multifotonska mikroskopija živih
eksplantata
embrionalnog mozga u realnom vremenu
….……………………………...……....31
3.2.6. In vivo/in utero produžena multifotonska mikroskopija
mikrokiruški
atraumatski izloženoga embrionalnog mozga u
realnom vremenu
......................................................................………...………….32
3.2.7. Western Blotting…………………………………………………………………....33
3.2.8. Mikroskopska analiza
tkiva……………………..…………..…..…….…………....34
3.2.8.1.Integrirani računalno-mikroskopski sustav za konfokalnu
i multifotonsku
mikroskopiju Laser Scanning Microscope 510 (LSM
510)......................................34
3.2.8.2.Konfokalna mikroskopija fiksiranih rezova i eksplantata
tkiva…………................35
3.2.8.3.Multifotonska mikroskopija živih eksplantata
tkiva………………….....................35
3.3. Statistička obrada rezultata……………………………………………………...…36
4. REZULTATI………………………………………………………………………37 4.1. Dinamika
stvaranja i obrazac područne raspodjele tangencijalno
migrirajućih
interneurona u marginalnoj zoni embrionalne moždane
kore………………...........40
4.2. Struktura i stanični sastav marginalne zone embrionalne
moždane kore………......40
4.3. Tangencijalno migrirajući interneuroni i Cajal-Retziusove
stanice
u marginalnoj zoni embrionalne moždane kore
………….………………………..43
4.3.1. Prostorni obrazac usmjerenja Cajal-Retziusovih stanica u
marginalnoj zoni
embrionalne moždane kore………………….………………………………....…..43
4.3.2. Obrasci tangencijalne migracije interneurona u
marginalnoj zoni
dorzalne embrionalne moždane kore…..……………………...…………………....46
4.3.3. Obrasci tangencijalne migracije interneurona u
marginalnoj zoni rostralne i
ventro-medijalne embrionalne moždane kore……..…………………………….…47
4.3.4. Sažeti opisi filmskih mikroskopskih prikaza analiziranih
obrazaca
7
-
tangencijalne migracije interneurona ……………………………………..…….…51
4.4. Uloga ranih sertoninergičkih aksonskih projekcija u
marginalnoj zoni
u razvoju stupićastog ustroja embrionalne moždane
kore………………...…….…53
5. RASPRAVA…………………………...…………………………………………..66
5.1. Razmještanje tangencijalno migrirajućih interneurona u
polja i slojeve.....….........68
5.2. Uloga ranih serotoninergičkih aksonskih projekcija u
razvoju stupićastog
ustroja embrionalne moždane kore……….………………………………………..74
6. ZAKLJUČAK……………………………...…………………………….………..78
7. SAŽETAK…………………………………………………………………………80
8. SAŽETAK NA ENGLESKOM (SUMMARY)………………………………….81
9. PRIVITAK
1.............................................................……………………………...82
9.1. Osnovne teorijske postavke multifotonske
mikroskopije.........................................82
9.1.1. Monofotonska
flouorescencija..................................................................................82
9.1.2. Multifotonska
fluorescencija.....................................................................................82
9.1.3. Prostorna lokalizacija
fluorescencije.........................................................................83
9.2. Klasična flourescentna
mikroskopija…………………...…….................................83
9.3. Konfokalna
mikroskopija..........................................................................................85
9.4. Multifotonska
mikroskopija......................................................................................87
9.4.1. Tehnički prikaz korištenog multifotonskog
mikroskopa..........................................89
9.4.1.1.Konfokalni laserski skenirajući mikroskop LSM
510…………………………......89
9.4.1.2.Ultrabrzi pulsirajući laser"Mira Model
900"............................................................90
10. REFERENCIJE………………………………………………………..……...….93
11. ŽIVOTOPIS……………………………………………………...……...….……109
8
-
Značenje kratica
5-MT - 5-metoksitriptamin
5-HT - 5 hidroksitriptamin
CP - kortikalna ploča
CR - Cajal-Retzius-ove stanice
DAB - diaminobenzidine tetrahydrochloride
E - embrionalni dan
GB - ganglijski brežuljak
IZ - intermedijalna zona
IC - infracrveno
MZ - marginalna zona
P - postnatalni dan
PBS - fosfatni pufer u fiziološkoj otopini
PMMRT - prolongirana multifotonska mikroskopija u realnom
vremenu
PP - pleksiformni sloj
SP - subkortikalna ploča
SVZ - subventrikularna zona
UV- ultraljubičasti
VS - vidljivi spektar
VZ - ventrikularna zona
9
-
1. UVOD
Tijekom embrionalnog razvoja kontinuirana proliferacija
neuroepitelnih stanica koje
čine stijenku rostralnog dijela neuralne cijevi te njihova
susljedna migracija iz unutarnje
zametne zone prema površini dovode do oblikovanja moždanih
mjehurića koji su osnova
budućega mozga i moždane kore (10,23,134-136,143). Konačni
stadij staničnog,
laminarnog (slojevitog), kolumnarnog (stupićastog) i arealnog
(područnog) ustroja
moždane kore biva postignut prije rođenja u obrascu neurogeneze
iznutra prema vani, gdje
ranije stvoreni neuroni oblikuju dublje slojeve embrionalne
moždane kore, dok oni kasnije
nastali oblikuju površinske slojeve
(4,23,67,69,79,90-92,131-138). Većina neurona
moždane kore nastaje proliferacijom stanica u ventrikularnoj
zoni (VZ) moždane kore
dorzalnog telencefalona (23,69,103,134-138). Ti neuroni potom
radijalno migriraju duž
radijalnih glija stanica u kortikalnu ploču (CP) stvarajući
radijalne ontogenetske kolumne
embrionalne moždane kore, koje su osnova funkcionalnih kolumni
odrasle moždane kore
(12,14,23,67,69,108,131-138,142,159). Prema danas općenito
prihvaćenoj teoriji radijalne
jedinice prof. Paška Rakića sa Sveučilišta Yale, stupićasti
ustroj moždane kore nastaje tako
što postmitotički neuroni, rođeni u jednom poliklonu zametnih
stanica u VZ, odnosno zoni
proliferacije uz stijenke fetalne moždane komore, sukcesivno
migriraju prema pijalnoj
ovojnici duž istog radijalnog glijalnog vodiča i u CP oblikuju
jednu radijalnu, odnosno
ontogenetsku kolumnu (134,137,138). Tako se “protomapa” mozaika
proliferacijskih
jedinica preslikava u “protomapu” moždane kore (134,135). Ukupna
površina moždane
kore određena je ukupnim brojem proliferacijskih jedinica i iz
njih nastalih radijalnih
ontogenetskih kolumni, dok je ukupna debljina moždane kore u
svakoj pojedinoj točki
površine određena ukupnim brojem neurona u jednoj ontogenetskoj
kolumni (23,67,69,
134-136).
Kako u evoluciji, tako i tijekom ontogeneze, broj
proliferacijskih jedinica povećava
se tzv. simetričnim diobama u kojima se zametna stanica podijeli
na dvije zametne stanice
koje se dalje dijele (23,69,103,134). Razdoblje neurogeneze
(stvaranja neurona moždane
kore) započinje pojavom prvih asimetričkih dioba u VZ, a traje
sve dok traju takve
asimetrične diobe (134). Naime, asimetričnom diobom zametna
stanica podijeli se na jednu
10
-
zametnu stanicu koja se dalje dijeli i na jedan postmitotički
neuron koji potom migrira duž
radijalne glija stanice i sudjeluje u oblikovanju ontogenetskih
kolumni (134-137). Iz
navedenog proizlazi da se pojava novog kortikalnog polja tijekom
evolucije, odnosno
ukupni broj ontogenetskih kolumni unutar jednog kortikalnog
polja, tijekom ontogeneze,
određuje samo u razdoblju koje prethodi početku neurogeneze dok
traju isključivo
simetrične diobe. Nakon početka neurogeneze očekuje se da
asimetričnim diobama
zametnih stanica ne nastaju nove ontogenetske kolumne, već samo
novi neuroni unutar iste
proliferacijske jedinice, tj. iste ontogenetske kolumne. Prema
tome, relativna veličina
pojedinog kortikalnog polja te ukupni broj kortikalnih stupića
određen je relativnom
brojnošću ciklusa simetričnih dioba matičnih stanica u okviru
proliferacijske mape tijekom
razdoblja koje prethodi početku neurogeneze (134,135). U rezus
majmuna i čovjeka to
razdoblje obuhvaća prvih 40-43 dana embrionalnog života (134),
dok u miša obuhvaća
prvih 11 dana embrionalnog života (23). Tijekom razdoblja
neurogeneze, trajanje pojedinog
ciklusa asimetričnih mitotičkih dioba je varijabilno i općenito
kraće na početku, a bitno
dulje pri kraju neurogeneze (69). Na temelju iznesenoga logično
se nameće zaključak da je
konačni broj neurona u ontogenetskoj kolumni jednog kortikalnog
polja, odnosno u
jediničnom volumenu odraslog korteksa, određen ukupnim brojem
ciklusa asimetričnih
dioba, tj. ukupnim trajanjem neurogeneze tijekom razvoja
dotičnog kortikalnog polja.
Budući da su radijalne ontogenetske kolumne osnova
strukturno-funkcionalnih kolumni
(stupića baze 25x30 µm kroz debljinu moždane kore, koji odgovara
najmanjoj
funkcionalnoj kolumni u elektrofiziološkim istraživanjima)
odraslog mozga, danas je
općenito prihvaćeno stajalište da je moždana kora sisavaca u
funkcionalno-morfološkom
smislu sastavljena od niza usporednih i uglavnom identičnih
strukturno-funkcionalnih
kolumni (12,14,53,63,67,69,108,134-138,142,159). Stoga, u skladu
s tradicionalnom
teorijom o temeljnoj uniformnosti ustrojstva moždane kore
sisavaca, razlike između vrsta
tumače se kao odraz razlika u brojnosti tih kolumni i njihovih
neuronskih veza
(12,14,69,134,135). Položaj različitih generacija i vrsta
neurona unutar kolumnarne
strukture osnova je kasnijeg normalnog funkcioniranja neuralnih
krugova i buduće
laminarne organizacije odrasle moždane kore
(23,95,116,134,135).
11
-
Pojedine funkcionalne kolumne odrasle moždane kore sastoje se od
ekscitacijskih
projekcijskih piramidnih neurona i inhibicijskih interneurona
(4,12,14,63,67,108,134,159).
Piramidne stanice koje nastaju u VZ i koje radijalnom migracijom
stižu u CP uglavnom su
ravnomjerno smještene unutar kolumni različitih kortikalnih
polja (23,43,67,69,108,
134,159). Nasuprot tome, inhibicijski interneuroni pokazuju
značajne razlike u brojnosti,
slojevnoj raspodjeli, te njihovoj samoj građi između stupića
različitih kortikalnih polja
(1,4,43,59,62,110,113,141,142,159).
Štoviše, niz istraživanja pokazalo je da, za razliku od
piramidnih stanica, većina
interneurona moždane kore glodavaca nastaje u području
ganglijskog brežuljka (GB), u
ventralnom telencefalonu (razvojna osnova budućih bazalnih
ganglija), te da
tangencijalnom migracijom stiže u dorzalnu moždanu koru
(2-4,9,10,27,30,66,74,84,87,
88,92,109,113,120,121,160,161,172,173). Najnovije studije
pokazale su da značajan
postotak interneurona u embrionalnoj moždanoj kori glodavaca
također nastaje i u području
oflaktornog režnja te interhemisferalne ploče, a u primata i u
području dorzalne VZ
(3,4,79,80,120,173). Iste su studije pokazale da se
tangencijalna migracija interneurona k
dorzalnoj moždanoj kori odvija kroz više različitih laminarnih
odjeljaka embrionalne
moždane kore, posebice kroz subventrikularnu zonu (SVZ),
intermedijalnu zonu (IZ) te
marginalnu zonu (MZ). Nakon što tangencijalnom migracijom dođu u
određeno kortikalno
polje, ti se interneuroni moraju dodatno smjestiti unutar
određenog sloja određenog
kortikalnog stupića
(2-4,27,30,66,87,88,108,109,160,161,172,173). Iako je otkriven
niz
mehanizama koji nadziru radijalnu migraciju, obrasci i mehanizmi
tangencijalne migracije
interneurona još uvijek nisu dovoljno razjašnjeni. Stoga se
pitanje, na koji se način
tangencijalno i radijalno migrirajući neuroni međusobno
usklađeno razmještaju unutar
kortikalnih stupića nameće kao jedno od temeljnih pitanja u
razvojnoj neurobiologiji
(2,4,65,134-136,177).
Ispravni razmještaj interneurona u kortikalnim stupićima ključan
je za normalno
funkcioniranje moždane kore u cjelini. Novije su studije
definitivno pokazale da mehanizmi
smještanja i međusobne integracije tangencijalno i radijalno
migrirajućih neurona u CP
embrionalne moždane kore moraju biti vrlo precizni budući da se
i vrlo mali poremećaji u
razvoju kortikalne kolumnarne organizacije mogu kasnije izraziti
kao značajni neurološki
12
-
poremećaji zbog poremećene uspostave lokalnih neuronskih krugova
i kolumnarnih ulazno-
izlaznih veza (4,7,12,14-21,65,141,147,164). Razumijevanje tih
mehanizama ključno je za
razumijevanje razvoja stupićastog ustroja moždane kore te za
istraživanje razvoja lokalnih
neuronskih krugova i njihovog povezivanja u veće funkcionalne
cjeline, te predstavlja
glavni predmet istraživanja ove disertacije.
Zbog svog položaja na površini embrionalne moždane kore i
činjenice da značajan
broj tangencijalno migrirajućih interneurona migrira kroz nju,
MZ je idealan model za
studije tangencijalne migracije multifotonskom mikroskopijom
(4,9,97,98,139,
146,153,154,176). Pored toga, MZ sadrži Cajal Retzius-ove (CR)
stanice koje luče relin,
ključnu molekulu u razvoju stupićastog ustroja embrionalne
moždane kore (29,34,41,42,44-
48,53,57,85,86,93,111,114-116). Također, treba istaknuti da je
pokazano da rane
serotoninergičke projekcije koje specifično urastaju u MZ
tijekom kasnog stadija
neurogeneze (65,81,118,122,152,168), imaju važnu ulogu u
sazrijevanju embrionalne
moždane kore (5,6,11,25,26,40,49,68,71,77,126,170,171). Budući
da je niz studija ukazao
da CR stanice i relin imaju važnu ulogu u radijalnoj i
tangencijalnoj migraciji neurona, a da
neurotransmiter serotonin ima važnu ulogu u regulaciji procesa
proliferacije i apoptoze
zametnih neuroepitelnih stanica te kasnijem sazrijevanju
embrionalne moždane kore,
interakcije između ranih serotoninergičkih aksonskih projekcija
i CR stanica jedan su od
mogućih mehanizama regulacije usklađene laminarne i arealne
integracije tangencijalno i
radijalno migrirajućih neurona.
Stoga smo istražili ulogu MZ u razvoju slojevitog i stupićastog
ustroja embrionalne
moždane kore. Razumijevanje tih mehanizama iznimno je važno za
razumijevanje
etiopatogeneze niza psihijatrijskih bolesti, poput autizma,
disleksije i shizofrenije, u kojih
su već ranije pokazani poremećaji u serotoninergičkom sustavu,
ekspresiji relina te
distribuciji interneurona u moždanoj kori, nedavno nadopunjeni
karakterističnim
patološkim nalazima stupićastog ustroja moždane kore
(7,14-21,25,26,42,44-
48,65,141,144,147,170).
13
-
1.1. Stanični ustroj embrionalne moždane kore
Moždana se kora razvija od rostralnog dijela neuralne cijevi
čije stijenke čine
neuroepitelne zametne stanice. Njihova kontinuirana
proliferacija dovodi do oblikovanja
moždanih mjehurića koji su osnova budućeg mozga
(10,23,134-136,143). Radijalni položaj
i usmjerenje neuroepitelnih stanica osnova su histogeneze
moždanih mjehurića. Taj rani
radijalni ustroj biva kasnije postupno promijenjen zbog
stvaranja novih neurona i glija
stanica te formiranja aferentnih i eferentnih veza pri nastanku
horizontalnih slojeva
(4,10,12,14,53,67,95,103,108,114-116,131-138).
Daljnom diferencijacijom u svim poljima moždane kore formiraju
se piramidne i
nepiramidne stanice u približno istom broju. Te dvije populacije
neurona pokazuju
karakteristična morfološka, funkcionalna i neurokemijska
svojstva (1,4,10,23,28,52,59,62,
97,103,104,110,120,121,128,135,139,141,145,154,161). Piramidne
stanice, koje su
definirane svojim oblikom i karakterističnim dendritičkim
razgranjenjem, projekcijski su
neuroni moždane kore koji koriste ekscitacijsku aminokiselinu
glutamat kao
neurotransmiter. Nepiramidne stanice, tj. interneuroni moždane
kore, heterogena su skupina
stanica, kako morfološki, tako i glede molekularnih obilježja,
no sa zajedničkom osobinom
da sadrže i koriste inhibicijski neurotransmiter GABA te jedan
ili više neuropeptida. Te
dvije populacije stanica razlikuju se i glede mjesta njihova
nastanka, što je posebice
izraženo u glodavaca u kojih piramidalni neuroni nastaju u
dorzalnoj VZ, dok se većina
interneurona stvara u području ganglijskog brežuljka,
olfaktornog režnja te
interhemisferalne ploče
(1-4,9,10,28,30,62,74,79,80,84,90-93,97,103,104,120,121,135,
136,145,161).
1.2. Razvoj slojevitog i stupićastog ustroja embrionalne moždane
kore
Rano tijekom neurogeneze postmitotički neuroni migriraju iz VZ
prema površini
moždanih mjehurića i tamo oblikuju primordijalni pleksiformni
(mrežasti) sloj (PP).
Kasnije stvoreni neuroni radijalno migriraju u PP i oblikuju
novi sloj unutar njega, tj. CP,
podijelivši tako PP na površinsku MZ i zonu neposredno ispod CP,
tzv. subkortikalnu ploču
(“subplate”, SP). Neuroni CP organiziraju se kasnije tijekom
razvoja u II-VI. sloj moždane
kore u obrascu iznutra prema vani sukladno sekvencijskom nizu
stvaranja novih stanica
14
-
(kasnije nastale stanice oblikuju površnije slojeve). Ti procesi
pokazuju značajne razlike
između različitih polja moždane kore kako glede vremena nastanka
novih stanica koje će
činiti pojedini sloj, tako i u ukupnom vremenu stvaranja tih
slojeva (120,121,132-138,161).
Nešto kasnije SP biva razdvojena od VZ formiranjem
intermedijarne zone (IZ), tj. sloja koji
sadrži rane aferentne i eferentne projekcije moždane kore, a od
kojeg nastaje buduća bijela
tvar mozga. Paralelno s oblikovanjem CP nastaje i novi sloj
između VZ i IZ, tzv.
subventrikularna zona (SVZ) koju čine proliferirajuće stanice
koje uglavnom stvaraju glija
stanice. Tijekom kasne gestacije SVZ se značajno širi budući da
u ranom postnatalnom
periodu VZ postupno nestaje (120,113-137). Slika 1.1 prikazuje
shematski prikaz slijeda
stvaranja slojeva embrionalne moždane kore.
Slika 1.1. Shematski je prikazan slijed stvaranja slojeva
embrionalne moždane kore
(VZ-ventrikularna zona, PP-pleksiformni sloj, IZ-intermedijalna
zona, MZ-marginalna
zona, CP-kortikalna ploča, SP-subkortikalna ploča,
SVZ-subventrikularna zona).
Sukladno proširenom shvaćanju o temeljnoj uniformnosti ustroja
moždane kore
sisavaca, u funkcionalnom i morfološkom smislu moždana je kora
građena od okomitih
15
-
stupića neurona slične građe, tj. kolumni, ali različitih
ulazno-izlaznih veza, pa se razlike
funkcionalnog ustrojstva različitih kortikalnih polja tumače
razlikama u brojnosti tih
kolumni, intrakolumnarnom rasporedu različitih vrsta neurona te
njihovim neuralnim
vezama (12,14,23,53,63,67,103,108,114,134-136,142,159).
Kortikalni stupić, kao jedinični
kolumnarni volumen, zamišljen je kao ekvivalent najmanje
elektrofiziološki definirane
kolumne, a sastoji se od stupića neurona koji seže okomito kroz
sve neokortikalne slojeve
ispod pijalne površine veličine 25x30 μm
(12,14,53,63,67,108,142, 159).
1.3. Vremenski i prostorni obrazac nastanka neurona te različiti
obrasci migracije
neurona u embrionalnoj moždanoj kori
Procesi koji vode nastanku prolazne laminacije embrionalne
moždane kore odvijaju
se zbog radijalne migracije neurona koja počinje kad prva
generacija postmitotičkih stanica
napušta VZ da bi oblikovala PP, na površini buduće moždane
stijenke (10,120,131-139).
Nakon toga piramidne stanice nastaju u VZ embrionalne moždane
kore te radijalno
migriraju ka konačnom smještaju u CP. Proliferacija neurona u
VZ, odnosno razdoblje
asimetričnih dioba, završava kod miša oko 17. embrionalnog dana
(E17), dok radijalna
migracija završava u ranom postnatalnom periodu (23,69,134-136).
Radijalna migracija
neurona stvorenih u VZ k svojim odredištima u različitim
regijama mozga u razvoju, ovisna
je o radijalnim glija stanicama koje služe kao radijalni vodiči
neuralne migracije. Novije
studije pomoću postupka retroviralnog označavanja pojedinih
skupina stanica te
označavanja vremena njihova nastanka bromdeoksiuridinom (BrdU)
dokazale su da
piramidne stanice zadržavaju prostorni odnos sa svojim klonalnim
zametnim stanicama u
VZ. Preciznije rečeno, sve stanice koje potječu od jedne zametne
stanice u VZ zadržavaju
se unutar približno istog kolumnarnog volumena kroz moždanu
stijenku (104,134-136).
Takav odnos može biti postignut samo procesom radijalne
migracije.
Nasuprot tome, tako označene nepiramidne stanice nisu pokazale
kolumnarni
prostorni odnos sa svojim klonalnim zametnim stanicama, čime je
pokazano da je njihova
relativna udaljenost u odnosu na stanice iz kojih su nastale
posljedica neradijalne, odnosno
tangencijalne migracije (62,84,87,88,92,104,120,145,161).
Kasniji su radovi jasno pokazali
da je tangencijalna migracija zapravo migracija stanica
paralelna s površinom moždane
16
-
kore koja se odvija kroz prolazne slojeve embrionalnog mozga.
Tangencijalno migrirajuće
stanice budući su interneuroni i pojedine vrste glija stanica
koje većinom nastaju u području
ganglijskog brežuljka (GB). One su osnova budućih bazalnih
ganglija i glavni izvor
interneurona buduće moždane kore. Intenzivna proliferacija
interneurona u području GB te
njihova tangencijalna migracija u kortikalnu ploču kod miševa
započinje tijekom stadija
E11 i završava tijekom stadija E19
(3,4,27,30,62,66,65,74,84,87,88,109,113,120,160,161,
172,173,177).
Proces konačnog smještaja stanica unutar pojedinih kortikalnih
kolumni odvija se
procesom somalne translokacije, tj. gibanjem staničnog tijela za
svojim vodećim staničnim
nastavkom ka konačnom odredištu u CP (4,120,173,177). Različiti
obrasci migracije
neurona prikazani su na slici 1.2.
Slika 1.2. Prikazan je shematski prikaz radijalne i
tangencijalne migracije te migracije
somalnom translokacijom u koronalnom rezu hemisfere embrionalne
moždane kore (GB-
ganglijski brežuljak, EMK-embrionalna moždana kora).
GB
EMK
Somalna translokacija
Radijalna glija stanica Radijalna migracija
Tangencijalna migracija
17
-
1.4. Marginalna zona embrionalne moždane kore
MZ moždane kore najraniji je sloj prolazne laminacije
embrionalne moždane kore
koji ima specifična strukturna i funkcionalna obilježja. MZ ima
najvišu koncentraciju
dendritičkih završetaka i sinapsi tijekom razvoja moždane kore.
Pored CR stanica, MZ
sadrži i subpijalne zrnate stanice te značajni broj
tangencijalno migrirajućih GABAergičkih
interneurona (4,9,28,65,97,98,139,146,153,154,176). Za razliku
od CR stanica, za koje je
karakteristično široko aksonalno razgranjenje, ostale stanice MZ
pokazuju lokalno
ograničeno aksonalno razgranjenje
(51,61,82,83,96-98,130,146).
CR stanice glavna su stanična populacija MZ te najranije
stvorene stanice moždane
kore u neurogenezi (4,9,74,93,96-98,114,139,176). Već su
najranije studije razvoja mozga
opisale CR stanice kao zasebnu skupinu neurona međusobno okomite
orijentacije na
površini moždane kore te pretpostavile njihovu važnu ulogu u
razvoju mozga
(4,43,61,96,140). CR stanice multipolarni su neuroni s više
horizontalnih dendrita koji se
pružaju od tijela stanice i imaju dugački akson koji daje niz
kolaterala prije nego što
postane relativno debelo vlakno na granici MZ i budućeg sloja II
moždane kore (slika 1.3).
Terminalni aksoni CR stanica projiciraju se u svim smjerovima,
međusobno se križaju te
imaju brojne kolaterale čineći kompleksnu mrežu čitavom
debljinom MZ, a posebice u
njenom površinskom dijelu, neposredno ispod pijalne ovojnice.
Stanična tijela CR stanica
uglavnom se nalaze u površinskom sloju MZ, a budući da broj CR
stanica u MZ ostaje
konstantan, tijekom daljnjeg razvoja moždanih hemisfera dolazi
do smanjenja njihove
numeričke gustoće u moždanoj kori
(9,65,90,91,93,97,98,130,139,140,154). CR stanice
imaju inhibicijsku ulogu i njihova domena su terminalni
dendritički završetci piramidnih
stanica moždane kore u MZ, neovisno o njihovoj lokalizaciji,
položaju ili funkcionalnoj
ulozi. Aksonske kolaterale pojedinih CR stanica pokrivaju
relativno veliko područje i
uspostavljaju kontakt s dendritičkim završetcima svih piramidnih
stanica koji dopiru u to
područje. Da bi uspostavili kontakt, kako s novopristiglim
neuronima, tako i s naglo
rastućim dendritičkim razgranjenjem već ranije pristiglih
neurona, dolazi do progresivnog
povećanja funkcionalnog područja pojedinih CR stanica unutar MZ
i CP. Horizontalno
širenje tog područja odgovara povećanju broja piramidnih stanica
s kojima pojedina CR
stanica uspostavlja kontakt. U čovjeka prilikom rođenja,
pojedina CR stanica pokriva
18
-
područje MZ veličine do nekoliko stotina μm u promjeru
(51,61,82,83,96-98,101,130,146,
153). CR stanice su složene i u neurokemijskom smislu, budući da
je niz
imunohistokemijskih studija pokazao da one tijekom neurogeneze
prolazno sadrže više
različitih neurotransmitera i receptora
(35,38,51,76,82,93,96-98,112,130). Posebice je
važna uloga CR stanica u razvoju mozga. CR stanice tijekom
neurogeneze luče relin, koji je
važna molekula za razvoj laminarnog i kolumnarnog ustroja
moždane kore. Pokazano je da
je relin ključna molekula u nadzoru radijalne migracije neurona.
Također, više studija je
ukazalo da CR stanice prolazno imaju različite receptore, što je
jedan od mogućih
mehanizama kojim različite aksonske projekcije i
neurotransmiteri u MZ i CP mogu utjecati
na oslobađanje relina, a time i na razvoj embrionalne moždane
kore (29,34,38,41,42,44-48,
51,55,65,74,93,111,112,114-116,130,150).
Relativno rano u neurogenezi MZ prima prve aksonalne
(serotoninergičke i
katekolaminergičke) projekcije iz moždanog debla u embrionalnu
moždanu koru, a krajem
neurogeneze i dio talamokortikalnih projekcija koje se
horizontalno granaju i šire u
relativno velikom radijusu u pripadajućem moždanom polju
(97,98,153,154,176). U stadiju
konačnog sazrijevanja CP u ranom postnatalnom periodu, MZ sadrži
završetke svih
aferentnih vlakana koja dolaze u moždanu koru. Iako su najnovije
studije pokazale da rane
katekolaminergičke projekcije imaju važnu ulogu u razvoju i
regulaciji broja CR stanica,
funkcionalno značenje ranih serotoninergičkih aksonskih
projekcija, koje specifično
urastaju u MZ u kasnom stadiju neurogeneze, još nije u
potpunosti razjašnjeno
(64,65,73,76,112, 122,130,168-170,176). Budući da
neurotransmiter serotonin ima važnu
ulogu u regulaciji procesa proliferacije i apoptoze stanica u
embrionalnoj moždanoj kori,
kao i u njenom ustroju i dozrijevanju, te da rane
serotoninergičke projekcije specifično
urastaju u MZ, nekoliko studija upućuje da interakcije između CR
stanica i ranih
serotoninergičkih projekcija mogu imati važnu nadzornu ulogu u
razvoju stupićastog
ustroja moždane kore (42,65,93, 130,150,168,170).
19
-
Slika 1.3. Shematski je prikazan niz rekonstrukcija CR stanica
na temelju preparata
moždane kore po Golgiju (Retzius, 1893; Cajal, 1899). Vide se
specifična dendritička i
aksonska obilježja CR stanica iz perpendikularne (Meyer, 1993,
a-c) te tangencijalne
perspektive (Meyer, 1993, d). Presjeci CR stanica okomiti na
moždanu koru uvijek
pokazuju samo jedan vertikalni profil svake stanice. Različiti
ortogonalni presjeci
omogućuju razumijevanje trodimenzijskog aksonskog i dendritičkog
razgranjenja (96-
98,140).
20
-
1.5. Osnovne postavke konfokalne i multifotonske laserske
mikroskopije
U ovom istraživanju koristili smo konfokalnu lasersku i
multifotonsku mikroskopiju
kako bismo analizirali obrasce tangencijalne migracije u MZ u
fiksiranim rezovima te živim
tangencijalnim eksplantatima tkiva embrionalne moždane kore.
Uporaba prolongirane
multifotonske mikroskopije u realnom vremenu (PMMRT) omogućila
nam je dobivanje
filmskih mikroskopskih prikaza opaženih procesa unutar struktura
živog tkiva koje
klasičnim metodama fluorescentne i laserske fluorescentne
mikroskopije nije moguće dobiti
(4,24,37,78,109,117,157,158,165,178). Rezultati dobiveni
analizom tih prikaza bili su
ključni za ekperimentalnu provjeru postavljenih hipoteza.
Naime, klasična fluorescentna mikroskopija nije u stanju
razlučiti strukture unutar
relativno debelih histoloških rezova, odnosno eksplantata tkiva,
zbog fluorescentne emisije
tkiva izvan optičkog fokusa. Da bi se riješio taj problem,
razvijen je konfokalni mikroskop
koji se temelji na klasičnom fluorescentnom mikroskopu kojem su
pridodani mali otvori na
putu fluorescentne emisije, čime se postiže detekcija iz
područja same točke optičkog
fokusa te blokira gotovo sva fluorescencija emitirana iz
područja izvan fokusa. Konfokalni
laserski mikroskop kao izvor svjetla koristi konstantnu lasersku
zraku koja skenira preparat
u x-y smjeru, a slika se rekonstruira na temelju pobuđene
fluorescencije i digitalne
rekonstrukcije skeniranih struktura (179). Izradom više takvih
optičkih sekcija kroz
debljinu histološkog reza, moguće je dobiti trodimenzionalnu
rekonstrukciju mikroskopskih
struktura u rezu. No, potreba za analiziranjem živih stanica
ukazala je na dva problema koja
se javljaju u konfokalnoj mikroskopiji tih stanica. Prvi je brzo
iscrpljenje fluorescentnih
molekula zbog relativno visoke energije lasera koja je potrebna
da bi se proizveo
odgovarajući signal te stoga opetovanim skeniranjem
fluorescentni signal postaje slabiji.
Drugi je problem što ekscitacija fluorescentnih molekula
relativno visokom energijom
dovodi do stvaranja toksičnih slobodnih radikala koji uzrokuju
daljnja oštećenja živih
stanica (37).
Kako bi se riješli ti problemi mikroskopije živih stanica
klasičnim fluorescentnim i
laserskim konfokalnim mikroskopom, razvijen je multifotonski
laserski mikroskop. On se
temelji na multifotonskom učinku koji se zasniva na činjenici da
se fluorofora ekscitira, ne
jednim fotonom valne duljine iz područja vidljiva svjetla (što
je slučaj s konfokalnim
21
-
laserskim mikroskopom), već s pomoću dvaju fotona niže energije,
odnosno veće valne
duljine iz infracrvenog područja koji se apsorbiraju gotovo
istodobno (≤1 fs) (24,37).
Fluorescentne molekule u analiziranom preparatu, odnosno
eksplantatu tkiva, pobuđuju se
titanium-safirskim (Ti:Sa) laserom koji je u stanju stvarati
vrlo kratke (
-
1.6. Na koji se način tangencijalno migrirajući neuroni pravilno
razmještaju
unutar određenoga kortikalnog polja i određenog sloja unutar
istog polja embrionalne
moždane kore?
Prostorne razlike u izražaju gena i pokusi na neurogenezi u
embrijima pokazali su
da je temeljna regionalizacija embrionalne moždane kore
uspostavljena već prije negoli
započne tangencijalna migracija interneurona nastalih u GB.
Smatra se da su regionalne i
citoarhiktektonske varijacije unutar stijenke buduće moždane
kore posljedica razlika
između zametnih stanica u VZ
(8,13,39,60,92,105,106,128,134,135,138,148,156).
Kako je već rečeno, prostorni odnos između mjesta gdje su
neuroni nastali u
dorzalnoj VZ i njihovog konačnog odredišta u CP zadržan je zbog
radijalne migracije
neurona duž radijalnih glijalnih stanica, čime se u konačnici
preslikava i genetski određen
raspored moždanih polja iz VZ u moždanu koru (134-136). No, još
uvijek ostaje nejasno na
koji način se tangencijalno migrirajući interneuroni nastali u
području GB smještaju unutar
određenoga kortikalnog polja i određenog sloja istog polja
dorzalne embrionalne moždane
kore, te na koji se način tangencijalno i radijalno migrirajući
neuroni međusobno usklađuju.
Odgovori na ta pitanja u žarištu su ove studije i posebice su
važni s obzirom na to da su
novija istraživanja konačno pokazala da je pravilni i usklađeni
smještaj radijalno i
tangencijalno migrirajućih neurona ključan za normalno odvijanje
razvoja moždanih polja u
embrionalnoj moždanoj kori te za kasniji normalni razvoj i
funkcioniranje neuralnih
krugova moždane kore (4,134-138,14-21,65,141,147).
Na molekularnoj razini već su otkrivene pojedine regulacijske
molekule u
procesima kojima neuroni napuštaju GB te ulaze u odgovarajuća
polja dorzalne moždane
kore. Pokazano je da interneuroni migriraju kroz intermedijalnu
zonu vođeni adhezivnom
molekulom TAG-1 koja je nazočna na kortikofugalnim vlaknima
radijalnih glijalnih
stanica, dok u procesu usmjeravanja tangencijalno migrirajućih
interneurona iz područja
GB važnu ulogu imaju pojedine aksonske molekule kao što su Slit,
Semaforini te HGF/SF
(1-4,36,54,80,85,89,100,107,127,145,174,177). Već prije
spomenuti relin također ima
važnu ulogu u prostornom rasporedu tangencijalno migrirajućih
interneurona (29,34,35,38,
41,42,44-48,51,55,57,85,86,111,112,114-116).
23
-
Budući da različita moždana polja obilježava različita
kolumnarna raspodjela
interneurona te da sadržavaju različite pripadajuće
interneurone, logično je pretpostaviti da
različiti stanični i molekularni mehanizmi reguliraju njihov
konačno različiti smještaj
unutar CP. Stoga se kao prvi korak u istraživanju tih procesa
nameće analiza obrazaca
tangencijalne migracije interneurona i njihove integracije u
CP.
1.6.1. Koja je uloga marginalne zone i Cajal-Retziusovih stanica
u procesima
razmještaja tangencijalno migrirajućih interneurona u
embrionalnoj moždanoj kori?
MZ sadržava CR stanice koje luče relin te specifično prima rane
serotoninergičke i
katekolaminergičke projekcije tijekom neurogeneze. Stoga,
imajući u vidu da su relin i
serotonin ključne molekule u razvoju stupićastog ustroja
embrionalne moždane kore,
posebice smo se usredotočili na ulogu CR stanica u
tangencijalnoj migraciji interneurona i
njihovom konačnom razmještanju u CP, te na ulogu interakcija
između CR stanica i ranih
serotoninergičkih aksonskih projekcija u nadzoru tih procesa
(4,5,25,26,29,33,41,42,44-
49,51,55,57,71,85,86,93,111,112,116,122,130,150,170,171).
Hipoteza o mreži CR stanica u površnom sloju MZ, sukladno kojoj
tangencijalno
migrirajući interneuroni u MZ pronalaze svoje konačno odredište
u embrionalnoj moždanoj
kori, vrlo je slična mehanizmu radijalne migracije neurona iz VZ
duž radijalnih glija stanica
u moždanu koru (65,130,136,137,176). Mehanizmi vođenja radijalno
migrirajućih neurona
radijalnim glija stanicama, odnosno tangencijalno migrirajućih
interneurona mrežom koju
čine CR stanice predstavljali bi mogući evolucijski mehanizam
kojim se višestruko
smanjuje potreba za velikom količinom genetske informacije koju
bi trebala imati svaka
stanica u migraciji kako bi se “našla na svojoj pravoj adresi”
(134-136).
Stoga bi radijalni oblik i distribucija radijalnih glija stanica
kroz čitavu debljinu
buduće moždane kore te tangencijalna mreža CR stanica
predstavljali prolaznu osnovu za
migraciju neurona i konačno oblikovanje laminarnog i kolumnarnog
ustroja embrionalne
moždane kore. Te dvije mreže zajedno osiguravaju trodimenzijsku
informaciju za smještaj
stanica nastalih u VZ i GB te njihovu ispravnu integraciju u CP
embrionalne moždane kore
(4,135,136).
24
-
1.6.2. Koja je uloga ranih serotoninergičkih aksonskih
projekcija u embrionalnoj
moždanoj kori u nadzoru razmještaja tangencijalno migrirajućih
interneurona?
Budući da rane serotoninergičke projekcije specifično urastaju u
MZ te da serotonin
ima važnu ulogu u dozrijevanju CP, više je studija ukazalo na
mogućnost da rane
serotoninergičke projekcije uspostavljaju funkcionalne veze s CR
stanicama koje imaju
ulogu u razvoju embrionalne moždane kore (65,130). Niz studija
već je ranije pokazao da
embrionalna moždana kora prolazno pokazuju intenzivni izražaj
serotoninergičkih 1A
(5HT1A) receptora, a CR stanice pokazuju elektrofiziološku
aktivnost, tj. hiperpolarizaciju
kad se izlože serotoninu
(6,11,33,71-73,75,76,82,83,101,130,168). U skladu s hipotezom o
direkcijskoj mreži CR stanica u površnom sloju MZ, te
interakcije predstavljale bi jedan od
mogućih mehanizama regulacije usklađenog razmještanja radijalno
i tangencijalno
migrirajućih neurona u CP. Ta hipoteza posebice je došla do
izražaja nakon što su najnovije
studije pokazale poremećaje kortikalne kolumnarne organizacije u
psihijatrijskih bolesti u
kojima koegzistiraju poremećaji serotoninergičkog sustava i
ekspresije relina (17,18,20,44-
48,170).
Budući da serotoninergične projekcije urastaju u moždanu koru te
uspostavljaju
funkcionalne veze s CR stanicama u relativno kasnom stadiju
neurogeneze, logično je bilo
pretpostaviti da se poremećaji u serotoninergičkom sustavu mogu
iskazati kao poremećaji
kolumnarnog razmještaja kasnije nastalih neurona u VZ
(4,23,65,95,114,134, 136,137).
Znajući da su morfogenetske odrednice integracije tangencijalno
migrirajućih interneurona
nazočne u CP te da kasno nastali interneuroni popunjavaju
uglavnom supragranularne
slojeve, zaključili smo da bi se poremećaji serotoninergičkog
sustava tijekom neurogeneze
stoga trebali odraziti na laminarno razmještanje tangencijalno i
radijalno migrirajućih
neurona u supragranularnim slojevima embrionalne moždane kore
(4,65,136). Mogućnost
da mreža CR stanica u MZ i uspostava funkcionalnih veza između
ranih serotoninergičkih
aksonskih projekcija i CR stanica imaju nadzornu ulogu u
tangencijalnoj migraciji
interneurona i regulaciji ekspresije relina objasnila bi
mehanizam kojim genetski
poremećaji serotoninergičkog sustava mogu uzrokovati razvojne
poremećaje stupićastog
ustroja embrionalne moždane kore (4,65,130,176).
25
-
2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŽIVANJA
U ovom istraživanju usredotočili smo se na interakcije između CR
stanica i ranih
serotoninergičkih aksonskih projekcija u MZ. Posebice je
istražena uloga tih interakcija i
CR stanica u tangencijalnoj migraciji interneurona, njihovom
razmještanju u CP te
susljednom razvoju stupićastog i slojevitog ustroja embrionalne
moždane kore
(4,65,130,139,176). Dvije su temeljnje hipoteze ove studije:
a) Međusobno okomito orijentirane CR stanice i njihovi stanični
nastavci u MZ čine
mrežu koja osigurava prostornu informaciju za arealno
razmještanje tangencijalno
migrirajućih interneurona koji iz ventralnih područja moždanih
hemisfera migriraju u
dorzalnu moždanu koru.
b) Rane serotoninergičke aksonske projekcije u MZ uspostavljaju
funkcionalne veze s CR
stanicama koje imaju nadzornu ulogu u lučenju relina.
Stoga je opći cilj ove studije proučiti obrazac ponašanja
tangencijalno migrirajućih
interneurona unutar MZ embrionalne moždane kore te istražiti
ulogu ranih
serotoninergičkih aksonskih projekcija i CR stanica u razvoju
stupićastog i slojevitog
ustroja embrionalne moždane kore.
Kako bismo eksperimentalno provjerili postavljene hipoteze,
specifični ciljevi ove
studije bili su:
a) Analizirati promjene u staničnom sastavu MZ te orijentaciju
CR stanica tijekom
tangencijalne migracije interneurona.
b) Analizirati putanje, dinamiku i usmjerenja migracije
tangencijalno migrirajućih
interneurona u MZ.
c) Koristeći PMMRT, analizirati obrasce tangencijalne migracije
interneurona u živim
eksplantatima embrionalne moždane kore.
d) Analizirati vrijeme i dinamiku urastanja ranih
serotoninergičkih aksonskih projekcija u
MZ te istražiti značajke i funkciju njihovih veza s CR
stanicama.
e) Farmakološki mijenjati razvoj serotoninergičkih projekcija
kako bi istražili njihovu
ulogu u nadzoru sekrecije relina, odnosno razvoju stupićastog
ustroja embrionalne
moždane kore.
26
-
Ova studija omogućuje razumijevanje mehanizama kako
poremećaji
serotoninergičkog sustava tijekom neurogeneze mogu rezultirati
poremećajima u razvoju
stupićastog ustroja embrionalne moždane kore. Potvrda
postavljenih hipoteza predstavljala
bi značajan doprinos neurorazvojnoj hipotezi etiopatogeneze
psihijatrijskih bolesti poput
autizma, disleksije i shizofrenije kod kojih su opaženi
poremećaji serotoninergičkog
sustava, lučenja relina i stupićastog ustroja moždane kore
(7,15,16-18,20,42,44-
48,58,65,68,141,170).
27
-
3. TVORIVA I POSTUPCI
3.1. Tvoriva
U radu smo analizirali tkivo mozga mišijih embrija te miševa u
ranom postnatalnom
periodu soja HSD:ICR (Harlan Sprague Dawley, SAD). Protokol
istraživanja,
eksperimentalni postupci i ukupni korišteni broj životinja (250)
odobreni su od
Povjerenstva za zaštitu životinja Sveučilišta Yale, engl. “Yale
University Institutional
Animal Care Use Committee (IACUC)”, pod eksperimentalnim
protokolima
IACUCF#:2000-10297 NIH (National Institute for Health) projekta
“Neurogenetski procesi
u fetalnom mozgu”.
3.2. Postupci
3.2.1. Injiciranje trudnih ženki 5-metoksitriptaminom
Razvoj serotoninergičke inervacije embrionalne moždane kore bio
je farmakološki
potisnut supkutanim injekcijama 5-hidroksitriptamina (5-MT) (1
mg/kg) u fiziološkoj
otopini trudnoj ženki miša tijekom E12-18 perioda. Kontrolna
skupina bila je injicirana
fiziološkom otopinom (65,170,171).
3.2.2. Imunohistokemijski postupci 3.2.2.1.Imunohistokemijsko
bojenje stanica anti-Relin i anti-serotoninergičkim
protutijelima
Trudnu ženku miša žrtvovali smo tijekom E17 stadija. Embrij smo
odstranili iz
uterusa, a mozak odvojili od struktura lubanje, fiksirali u 4%
formaldehidu, krioprotektirali
u 30% sukrozi te zaledili u mediju za uklapanje i zaleđivanje
OCT (Sakura Finetek, SAD).
Dobivene 40 µm debele kriostatske koronalne rezove uklopljenog
mozga ispirali smo u
PBS-u (Sigma, SAD) fosfatnom fiziološkom puferu, blokirali u
serumu te inkubirali sa
zečjim anti-serotoninergičkim protutijelima (1:200) (Protos
Biotech Corporation, SAD) i
mišjim anti-Relin protutijelima (1:100) (Riken Brain Science
Institute, Japan). Tako
tretirane rezove isprali smo u PBS-u, inkubirali u blokirajućem
serumu sa specifičnim
28
-
sekundarnim protutijelima konjugiranim s različitim
fluorescentnim fluoroforama, ponovo
isprali u PBS-u te konačno nanijeli na histološka stakalca. Iste
smo potom dehidrirali te
prije nanošenja pokrovnih stakalaca uklopili u mediju za
fluorescentnu mikroskopiju
Vectorshield (Vector Laboratories, SAD) (65).
3.2.2.2.Imunohistokemijsko bojenje stanica anti-Calbindin,
anti-Calretinin, anti-Relin,
anti-Gaba i anti-Dlx protutijelima
Trudne ženke miša žrtvovali smo tijekom E12-14 stadija te
embrije odstranili iz
uterusa. Embrionalni mozak odvojili smo od struktura lubanje te
pomoću mikrokirurškog
pribora i Stemi V10 stereodisekcijskog mikroskopa (Carl Zeiss
GmBh, Njemačka) izrezali
tangencijalni eksplantat moždane kore s kojeg smo uklonili
moždane ovojnice. Eksplantate
smo zatim označili izrezima tkiva na rostralnom i lateralnom
rubu kako bi se zadržala
orijentacija rezova tijekom mikroskopiranja.
Sukladno već opisanoj proceduri, dobivene eksplantate tkiva
fiksirali smo u 4%
formaldehidu, isprali u PBS-u i inkubirali s primarnim
anti-Calbindin (1:1000) (Chemicon,
SAD), anti-Calretinin (1:1000) (Chemicon, SAD), anti-Relin CR-50
(1:1000) (Riken Brain
Science Institute, Japan), anti-GABA (1:1000) (Sigma, SAD) te
anti-Dlx Dlx-2 (1:150)
(UCSF, SAD) protutijelima. Eksplantate smo zatim isprali u PBS-u
te inkubirali sa
specifičnim sekundarnim protutijelima konjugiranim s različitim
fluorescentnim
fluoroforama nakon čega smo ih uklopili u mediju za
fluorescentnu mikroskopiju
Vectorshield (Vector Laboratories, SAD) u komori na histološkom
stakalcu koja odiže
pokrovno stakalce i omogućava da eksplanti tkiva budu uklopljeni
bez deformacija (4).
3.2.3. Imunohistokemijsko bojenje kombinirano s elektronskom
mikroskopijom
S obzirom na visoki postotak vode u embrionalnom moždanom tkivu,
postupci
fiksacije tehnički su vrlo zahtjevni (4,64,65,70,152,169).
Opisani postupci su u potpunosti
razvijeni u laboratoriju Odjela za neurobiologiju Medicinskog
fakulteta Sveučilišta Yale, a
slike kontakata serotoninergičkih aksona i CR stanica prve su
publicirane elektronsko-
mikroskopske slike razvoja serotoninergičkih sinapsi u
embrionalnoj moždanoj kori. Za
elektronsku mikroskopiju koristili smo JEOL 1010 elektronski
mikroskop (JEOL, Japan)
(4).
29
-
3.2.3.1.Imunohistokemijsko bojenje serotoninergičkih aksona
Trudnu ženku miša žrtvovali smo tijekom E17 stadija, embrij
odstranili iz maternice
te transkardijalno perfundirali pothlađenom otopinom (4°C) 4%
formaldehida i 1,5%
glutaraldehida pomoću mikrokirurškog pribora i Stemi V10
stereodisekcijskog mikroskopa
(Carl Zeiss GmBh, Njemačka). Mozak smo potom odvojili od
struktura lubanje,
postfiksirali u istom fiksativu te uklopili u agarozni gel i
vibratomom izrezali na 50 µm
debele rezove.
Dobivene rezove isprali smo u PBS-u, tretirali 1% natrijevim
borohidratom u PBS-u
te inkubirali u 0,3% otopini H2O2. Rezove smo potom ponovo
isprali u PBS-u, blokirali u
otopini 5% kozjeg seruma, 1% kravljeg seruma, 0,1% glicina i
0,1% lizina u PBS-u te
konačno inkubirali sa zečjim antiserotoninergički m
protutijelima (1:10000) (Protos
Biotech Corporation, SAD). Iste smo zatim inkubirali s
biotiniliranim kozjim antizečjim
protutijelima u blokirajućoj otopini te ih ponovo isprali u
PBS-u. Tako tretirane rezove
razvili smo u 0,05% otopini diaminobenzidina (DAB) s 0,4% NH4Cl
i 0,016 mg/ml glukoza
oksidaze u tris puferu uz pomoć Vector ABC kita (Vector
Laboratories, SAD). Nakon
razvijanja rezove smo isprali u Tris (Sigma, SAD) puferu,
izložili 1% otopini osmijum
tetraoksida u Tris puferu te ponovo isprali. Iste smo zatim
dehidrirali kroz seriju alhohola
rastuće koncentracije, tretirali s uranil acetatom kako bi se
povećala kontrasnost DAB-a te
konačno uklopili u Durkopan (Electrom Microscopy Sciences,
SAD).
Dijelove uklopljenih rezova koji su sadržavali embrionalnu
moždanu koru te pod
svjetlosnim mikroskopom vidljiva serotonergička vlakna označena
DAB-om, izrezali smo
iz bloka dijamantnim skalpelom te izrezali na ultratanke rezove
debljine 60 nm koje smo
postavili na bakrene mrežice za elektronsku mikroskopiju
(65).
3.2.3.2.Imunohistokemijsko bojenje Cajal-Retziusovih stanica
Svježe izrezani mozak embrija miša E14 stadija inkubirali smo u
hranjivom mediju
Neurobazal (Sigma, SAD) te pomoću mikrokirurškog pribora Stemi
V10 stereodisekcijskog
mikroskopa (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) izrezali tangencijalne
eksplantate embrionalne
moždane kore s kojih smo potom uklonili moždane ovojnice.
Eksplantate smo naknadno
označili izrezima tkiva na rostralnom i lateralnom rubu kako
bismo zadržali orijentaciju
30
-
rezova tijekom mikroskopiranja te ih potom fiksirali u 2%
otopini formaldehida i 0,2%
otopini glutaraldehida.
Fiksirane eksplantate tkiva inkubirali smo s primarnim
anti-Relin protutijelima CR-
50 (1:1000) (Riken Brain Science Institute, Japan), zatim sa
sekundarnim biotiniliranim
protutijelima te konačno razvili DAB reakcijom za koju smo
koristili Vector ABC kit
(Vector Laboratories, SAD). Iste smo zatim tretirali osmijum
tetraoksidom u PBS-u,
dehidrirali u alhoholu i propilen oksidu te konačno uklopili u
Durkopan (Electrom
Microscopy Sciences, USA).
Dijelove uklopljenih blokova koji su sadržavali eksplantate
moždane kore izrezali
smo iz bloka dijamantnim skalpelom te potom izrezali na
ultratanke rezove paralelne s
površinom eksplantata debljine 60 nm, koje smo postavili na
bakrene mrežice za
elekronsku mikroskopiju. Ultratanke rezove potom smo tretirali
uranil acetatom i olovnim
citratom kako bismo povećali kontrastnost DAB-a (4).
3.2.4. Bojenje histoloških rezova po Nisslu
Sedmog postnatalnog dana (P7) žrtvovali smo miševe te ih
perfundirali 4%
formaldehidom. Mozgove smo zatim odvojili od struktura lubanje
uz pomoć Stemi V10
stereodisekcijskog mikroskopa (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) i
mikrokirurškog pribora,
fiksirali u 4% paraformaldehidu te krioprotektirali u 30%
glukozi. Iste smo zatim uklopili u
vosak te izrezali na 50 µm debele rezove. Rezove smo nanijeli na
histološka stakalca,
tretirali tioninom, dehidrirali u nizu alhohola te pokrili
pokrovnim stakalcima (65).
3.2.5. In vivo produžena multifotonska mikroskopija živih
eksplantata embrionalnog
mozga u realnom vremenu
Pomoću mikrokirurškog pribora i Stemi V10 stereo-disekcijskog
mikroskopa (Carl
Zeiss GmBh, Njemačka) odvojili smo mozak embrija od struktura
lubanje. Potom smo ga
izrezali na koronarne rezove debljine 300 μm ili izrezali
eksplantate čitave polutke. Iz
eksplantata čitave polutke mozga izrezali smo tangencijalne
eksplantate moždane kore, s
kojih smo ukolnili moždane ovojnice. Eksplantate smo označili
izrezima tkiva na
rostralnom i lateralnom rubu kako bi se zadržala orijentacija
tijekom mikroskopiranja.
31
-
Tijekom čitave mikrodisekcije tkivo je bilo inkubirano u
hranjivom mediju Neurobazal
(Sigma, SAD).
Koronalne rezove odnosno eksplantate tkiva smo zatim inkubirali
u 0,025 nM
otopini Cell Tracker Green fluorescentne boje (Molecular Probes,
Eugene, USA) za bojanje
živih stanica i tkiva u hranjivom mediju. Iste smo potom isprali
u Neurobazal (Sigma, SAD)
mediju bez seruma te ih orijentirali i uklopili u porozni medij
Matrigel (Molecular Probes,
Eugene, USA) na kružnom pokrovnom stakalcu koje smo zatim
inkubirali na 37°C. Tim
postupkom je Matrigel, koji na 20°C ima gustu tekuću
konzistenciju, poprimio poroznu
želatinoznu strukturu koja, pored toga što omogućuje difuziju
hranjivih tvari iz medija u
tkivo, dodatno fiksira tkivo za pokrovno stakalce. Pokrovno
stakalce zatim smo pričvrstili
za dno komore za mikroskopiranje s cirkulirajućim hranjivim
medijem na invertnom
mikroskopu.
Komoru za mikroskopiranje smo zatim učvrstili na postolju za
mikroskopiranje koje
održava konstantnu temperaturu od 37°C, dok u komori cirkulira
oksigenirani hranjivi
Neurobazal (Sigma, SAD) medij. Budući da se u tim uvjetima
stanice tkiva mogu održati na
životu do maksimalnih 72 sata te da je gibanje preparata izvan
optičkog fokusa mikroskopa
onemogućeno uklapanjem u Matrigel, bilo je moguće PMMRT
kontinuirano analizirati
dinamiku i trodimenzijske obrasce migracije stanica unutar živog
tkiva (4,56).
3.2.6. In vivo/in utero produžena multifotonska mikroskopija
mikrokiruški
atraumatski izloženoga embrionalnog mozga u realnom vremenu
Svi zahvati obavljeni su sukladno zahtjevima i standardima
Povjerenstva za zaštitu
životinja Sveučilišta Yale, engl. “Yale University Institutional
Animal Care Use Committee
(IACUC)”. E16 trudnu ženku miša smo anestezirali, napravili
medijalnu laparotomiju te
prikazali jedan segment maternice s pripadajućim embrijem, koji
smo zatim prosvijetlili
izvorom hladnog svjetla kako bismo prikazali položaj glave
embrija. Kako bi stabilizirali
prikazani segment maternice, fiksirali smo je atraumatskom
hvataljkom koja ne oštećuje
opskrbu krvi u zahvaćenom segmentu maternice, a čija se jedna
strana sastoji od okvira
promjera 5 mm, čiji smo položaj prilagodili dorzalnoj strani
glave embrija.
32
-
Kroz tako postavljeni okvir napravili smo rez kroz mišićni sloj
maternice i ovojnice
embrija te prikazali glavu embrija pomoću Stemi V10
stereodisekcijskog mikroskopa (Carl
Zeiss GmBh, Njemačka) i mikrokirurškog pribora. Mišićni sloj i
ovojnice embrija zatim
smo fiksirali atraumatskim šavom oko glave embrija na razini
interparijetalne kosti i donjeg
ruba frontalnih kostiju te dodatno zalijepili kirurškim
fibrinskim ljepilom. Tako je dorzalni
dio glave embrija ostao izložen, a sam embrij neoštećen u
amnionskoj tekućini. Na
izloženom dijelu glave embrija napravili smo potom kraniotomiju
veličine 3x3 mm te
postavili silikonsku komoru u fibrinsko ljepilo naneseno oko
prišivenih rubova slojeva
maternice. Komoru smo zatim napunili otopinom fluorescentne boje
Cell Tracker Green
(Molecular Probes, Eugene, USA) za bojenje živih stanica i tkiva
u hranjivom mediju, koju
smo nakon 15 minuta isprali i zamijenili fiziološkom otopinom u
koju smo uronili objektiv
mikroskopa. Tijekom zahvata pratili smo puls i oksigenaciju
životinje te pulsacije segmenta
uterine arterije koji opskrbljuje izolirani segment maternice
odnosno pripadajući embrij (4).
3.2.7. Western Blotting
Nakon što smo žrtvovali P1 miševe iz okota ženki, koje su bile
injiciranje s 5-MT te
kontrolne životinje, izrezali smo mozgove te ih homogenizirali
na ledu u puferu za
homogenizaciju tkiva (25 mM HEPES, 150 mM KCl i inhibitori
proteaza u Tris puferu).
Homogenizirano tkivo smo zatim centrifugirali, dobiveni
supernatant ponovo centrifugirali
te konačni supernatant odijelili i pohranili na -80°C. Dobivene
uzorke mozgova nakon
odleđivanja tretirali smo SDS puferom (Sigma, SAD),
merkaptoetanolom te bromfenolom
kako bi se dobili uzorci za elektroforezu koje smo prije
nanošenja na gel za SDS
elektroforezu denaturirali zagrijavanjem u vodenoj kupelji. Na
SDS gel nanijeli smo tako
dobiveni uzorak proteina te ga izložili električnom polju od 200
V. Gel smo potom isprali u
SDS puferu, a proteine prenijeli na polivinilnu membranu pomoću
električnog polja od 100
V. Proteine na polivinilnoj membrani smo zatim blokirali
otopinom mlijeka u PBS-u te
inkubirali s anti-Reelin protutijelima (1:1000) (Chemicon, SAD).
Membranu smo zatim
isprali u PBS-u, inkubirali sa sekundarnim protutijelima, ponovo
isprali u PBS-u te zatim
izložili hemiluminiscentnoj otopini (Pierce, SAD). Linije relina
u gelu prikazali smo
hiperfilmom (Amersham Pharmacia Biotech, Velika Britanija,) a
njihov intenzitet i gustoću
33
-
očitali pomoću GAA 100 računala integriranog s kamerom i komorom
za očitavanje SDS
gelova (Kodak, Japan).
Za analizu krvi žrtvovali smo P1 miševe iz istih okota, a krv
smo uzeli u EDTA tube
na ledu. Krv smo potom centrifugirali, odijeljeni supernatant
ponovo centrifugirali i
konačni supernatat pohranili na -80°C. Tako dobivene uzorke krvi
razrijedili smo puferom
za homogenizaciju tkiva te tretirali SDS puferom (Sigma, SAD),
merkaptoetanolom te
bromfenolom kako bi se dobili uzorci za elektroforezu, koje smo
analizirali istim
postupkom kao uzorke mozgova (65,44-48).
3.2.8. Mikroskopska analiza tkiva
Osnovne teorijske postavke konfokalne fluorescentne i
multifotonske mikroskopije
te detaljan tehnički opis korištenih sustava opisani su u
Privitku 1.
3.2.8.1.Integrirani računalno-mikroskopski sustav za konfokalnu
i multifotonsku
mikroskopiju Laser Scanning Microscope 510 (LSM510), (Carl Zeiss
GmBh,
Njemačka).
Za konfokalnu lasersku i multifotonsku fluorescentnu
mikroskopiju koristili smo
integrirani računalno-mikroskopski sustav LSM 510 (Carl Zeiss
GmBh, Njemačka). On se
odlikuje inovativnim dizajnom koji integrira i koristi najkraće
putove svjetla, najvišu
preciznost optike te najviši stupanj radne stabilnosti i
programske potpore. On se sastoji iz
šest dijelova:
1. Konfokalnog Zeiss Axiovert 100SP (Carl Zeiss GmBh, Njemačka)
mikroskopa;
2. LSM UV laserskog modula koji daje kontinuiranu lasersku zraku
u UV spektru
svjetlosti (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) za konfokalnu lasersku
mikroskopiju. Osnovu
ovog modula čini argonski laser;
3. LSM VS laserskog modula daje kontinuiranu lasersku zraku u
vidljivom spektru
svjetlosti (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) za konfokalnu lasersku
mikroskopiju. Osnovu
ovog modula čine dva helij-neonska lasera i jedan
argon-kriptonski laser.
4. Laserskog modula za ultrabrzu pulsirajuću lasersku emisiju,
tj. Laser Mira Model 900-F
Laser (Coherent, SAD). Ovaj sustav sastoji se od triju lasera,
tj. dvaju koja služe kao
izvori i pojačala svjetla za treći, ultrabrzi titanium-safirski
oscilirajući laser;
34
-
5. LSM kontrolnog modula za skeniranje pobuđene fluorescencije
(Carl Zeiss GmBh,
Njemačka);
6. PC računala s programskom podrškom za sustav.
Tako dizajnirani sustav omogućava njegovu uporabu za standardnu
konfokalnu
lasersku skenirajuću mikroskopiju te multifotonsku mikroskopiju.
Za konfokalnu lasersku
mikroskopiju rabe se laserski moduli u UV i vidljivom spektru
svjetlosti koji daju
kontinuiranu zraku, dok se za multifotonsku mikroskopiju rabi
ultrabrzi pulsni laser u
infracrvenom spektru svjetlosti.
3.2.8.2.Konfokalna mikroskopija fiksiranih rezova i eksplantata
tkiva
Imunohistokemijski obojane eksplantate i rezove tkiva uklopili
smo u medij za
fluorescentnu mikroskopiju Vectorshield (Vector Laboratories,
SAD) na histološkim
stakalcima te analizirali pomoću LSM 510 (Carl Zeiss GmBh,
Njemačka) integriranog
računalno mikroskopskog sustava, pri čemu smo rabili imerzijske
vodene 40x i 60x Plan-
NeoFluar objektive (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) te standardni 10x
NeoFluar objektiv
(Carl Zeiss GmBh, Njemačka).
3.2.8.3.Multifotonska mikroskopija živih eksplantata tkiva
Živi eksplantati tkiva obojani fluorescentnom Cell Tracker Green
bojom (Molecular
Probes, Eugene, USA) analizirani su s pomoću LSM 510 (Carl Zeiss
GmBh, Njemačka)
integriranog računalno mikroskopskog sustava. Uklapanjem u
porozni gel na pokrovnom
stakalcu onemogućeno je pomicanje eksplantata tkiva tijekom
mikroskopiranja tako da su
nizovi optičkih sekcija uzeti u istom volumenu tkiva, odnosno
nizu optičkih ravnina fokusa
mikroskopa.
Kako bi se izbjegla oštećenja stanica u analiziranom živom tkivu
za ekscitaciju
fluorescentnih molekula, rabili smo minimalnu snagu ultrabrze
pulsirajuće laserske emisije
potrebne za postizanje zadovoljavajuće rezolucije. Također,
rabili smo konstantni protok
oksigeniranog hranjivog medija u komori za mikroskopiranje. Za
sve mikroskopske analize
živog tkiva s PMMRT rabili smo imerzijski uljni 25x
Plan-NeoFluar objektiv (Carl Zeiss
GmBh, Njemačka). Valna duljina eksitacije fluorescentne Cell
Tracker Green boje
(Molecular Probes, Eugene, USA) ultrabrzim pulsirajućim laserom
bila je 800 nm. U
analizi koronalnih rezova mozga analizirali smo nizove od 20
optičkih sekcija debljine 2
35
-
µm, 50-100 µm u dubini tkiva, dok smo u eksplantata moždane kore
analizirali 5-10
optičkih sekcija debljine 2 µm kroz debljinu čitave MZ. Nizovi
optičkih sekcija skenirani
su svakih 4-25 minuta tijekom razdoblja od 6 do 24 sata
(4,56).
3.3. Statistička obrada rezultata Kvantitativni podaci glede
dinamike proučavanih procesa analizirani su računalnim
programom “LSM Control” (Carl Zeiss GmBh, Njemačka) koji
upravlja integriranim
računalno-mikroskopskim sustavom LSM 510. Za pohranu tako
dobivenih podataka te za
deskriptivno-statističku obradu korišten je računalni program
“Excel” (Microsoft, SAD). Za
statističke analize rasporeda usmjerenja stanica korišten je
računalni program“Statistica
6.0” (StatSoft, SAD).
36
-
4. REZULTATI
4.1. Dinamika stvaranja i obrazac područne raspodjele
tangencijalno migrirajućih
interneurona u marginalnoj zoni embrionalne moždane kore
Da bismo prikazali obrasce arealne raspodjele tangencijalno
migrirajućih
interneurona u MZ, analizirali smo prostorni raspored kalbindin
pozitivnih stanica u
imunohistokemijski bojanim eksplantatima polutki embrionalnog
mozga tijekom E11-14
razdoblja, kada nastaje većina interneurona u području GB
(4,62,145,154). Anti-Relin CR-
50 protutijela bila su korištena kako bi se prikazale CR stanice
u MZ. Analizom niza
konfokalnih mikroskopskih slika na malom povećanju (10x) i
fokusom unutar MZ
rekonstruirane su slike migracije interneurona u MZ čitave
polutke. Pokazali smo da se u
navedenom razdoblju interneuroni raspoređuju u embrionalnoj
moždanoj kori u tri različita
smjera, koji su specifični obzirom na vrijeme i mjesto njihova
nastanka.
Preciznije, dva smjera (vala) tangencijalno migrirajućih
interneurona javljaju se
relativno rano u vrijeme kada se MZ moždane kore počinje
oblikovati i kada se sastoji
samo od tankog sloja relin pozitivnih stanica. Tijekom E11.5
stadija prvi interneuroni
pojavljuju se u moždanim mjehurićima. Prvi smjer (val) nastaje u
području kaudalnog i
medijalnog GB, te se prvi tangencijalno migrirajući interneuroni
pojavljuju
posterolateralno u ventralnom području moždanih mjehurića.
Stanice unutar tog smjera
(vala) interneurona migriraju u lateralno-medijalnom smjeru, a
kasnije i rostralno. Većina
stanica u području ruba medijalno orijentiranog vala usmjerenog
prema područjima
nepopunjenim interneuronima ima vodeći stanični nastavak
orijentiran u smjeru migracije.
Interneuroni u lateralnim područjima, koje je val tangencijalno
migrajućih interneurona
već zahvatio, imaju vodeći stanični izdanak dominantno
orijentiran u ventro-dorzalnim i
medio-lateralnim okomitim smjerovima. Drugi smjer (val)
interneurona stvara se približno
u isto vrijeme u rostralnom dijelu mozga (koji odgovara budućem
olfaktornom režnju
moždane kore u glodavaca) i migrira u kaudalnom smjeru. Neuroni
koji čine ovaj smjer
pojavljuju se u području moždanih polutki istovremeno s
neuronima iz prvog smjera te oba
zadržavaju dominantne smjernice migracije bez međusobnog
miješanja ili interakcija. Do
kraja razdoblja E12, prvi smjer tangencijalnih neurona širi se
medijalno prema središnjoj
37
-
fisuri te rostralno prema području olfaktornog režnja, dok drugi
smjer u potpunosti pokriva
buduću olfaktornu moždanu koru. Treći smjer interneurona stvara
se u interhemisferalnoj
ploči te se počinje pojavljivati tijekom E13 stadija u području
dorzalnog olfaktornog
režnja, a stanice u njemu migriraju u posteriornom smjeru.
Opisani procesi prikazani su na
slici 4.1.
38
-
Slika 4.1. Prikazana je raspodjela tangencijalno migrirajućih
interneurona nastalih u
ventralnim područjima moždanih hemisfera. Kalbindin pozitivne
(crveno) i CR-50
pozitivne stanice (plavo) u MZ prikazane su u eksplantima
moždanih polutki tijekom
različitih stadija. Dva smjera tangencijalno migrirajućih
interneurona pojavljuju se tijekom
E11.5 stadija (A). Prvi smjer sadržava interneurone koji
migriraju u kaudalno-rostralnom i
latero-medijalnom smjeru. Drugi smjer sadržava interneurone koji
migriraju u rostro-
kaudalnom smjeru u području budućih ventralnih područja moždane
kore i olfaktornog
režnja. Tijekom E12 (B) te E12.5 stadija (D) ova dva smjera
neurona šire se i prekrivaju
lateralna i kaudalna područja budućih moždanih hemisfera.
Uokvirena regija na slici (B)
prikazana je na većem povećanju na slici (C). Pojedini smjer
tangencijalno migrirajućih
interneurona sastoji se od dvije komponente (C): rubnog vala
interneurona orijentiranih u
dominantnom smjeru te od interneurona u područjima koje je
pojedini tok interneurona već
zahvatio i u kojima se interneuroni orijentiraju u različitim
smjerovima (područje ispod
isprekidane linije). Treći smjer interneurona, koji migriraju u
rostro-kaudalnom smjeru,
pojavljuje se u području dorzalnog olfaktornog režnja tijekom
E13 stadija (E). Embrionalna
moždana kora miša soja Reeler, tj. genetskog mutanta na relin
(rl/rl), sadržava sve smjerove
interneurona koji se ponašaju identično kao kod divljeg fenotipa
(F). C, kaudalno; D/M,
dorzomedijalno; R, rostralno, V/L ventrolateralno.
39
-
4.2. Struktura i stanični sastav marginalne zone embrionalne
moždane kore
Početkom E14 stadija, MZ embrionalne moždane kore značajno se
proširuje i
podijeli na površinski (približno 1-8 μm od pijalne površine) i
duboki sloj (približno 8-20
μm od pijalne površine). Na površini koronarnog reza nalazimo
karakteristične velike CR
stanice s tangencijalno orijentiranim staničnim nastavcima
(93,96,130). Ispod njih, u
području relativno niske stanične gustoće, unutar MZ nalazimo
značajno manje,
tangencijalno orijentirane bipolarne stanice koje morfološki
odgovaraju migrirajućim
interneuronima (slika 1C) (4,65,139,154). Područje visoke
stanične gustoće neposredno
ispod tih stanica predstavlja površinski dio CP (slika 1C)
(4,65).
Kako bismo istražili međusobni odnos CR stanica i tangencijalno
migrirajućih
interneurona, imunohistokemijskim metodama analizirali smo
stanični sastav MZ
embrionalne moždane kore E15 stadija u kojem se odvija
najintenzivnija faza tangencijalne
migracije interneurona. Tangencijalni eksplantati E15 moždane
kore trostruko su bojani
Cell Tracker Green (CTG) fluorescentnom bojom (zeleno) i
imunohistokemijski anti-Relin
(CR-50) protutijelima (plavo), GABA, Kalretinin, Kalbindin i
DLX-2 protutijelima
(crveno) (slika 4.2). Analiza tangencijalnih konfokalnih
optičkih rezova pokazala je da CR
stanice specifično čine površinski sloj s obzirom na to da
pokazuju imounohistokemijsku
reaktivnost na relin, odnosno CR-50, GABA i kalretinin
protutijela (slika 1D-G). Suprotno
tome, dublji sloj ne sadržava stanična tijela CR stanica, već
samo pojedine stanične
nastavke i pretežno se sastoji od tangencijalno migrirajućih
interneurona koji su
imunohistokemijski pozitivni na GABA-u, Kalbindin i Dlx-2
protutijela (slika 1H-K), a
koja su karakteristična za interneurone rođene u području
GB.
40
-
Slika 4.2. Prikazani su tangencijalni eksplantati embrionalne
moždane kore E15 stadija
trostruko bojani Cell Tracker Green (CTG) fluorescentnom bojom
(zeleno) i
imunohistokemijski anti-Relin (CR-50) protutijelima (plavo),
GABA, Kalretinin, Kalbindin
i DLX-2 protutijelima (crveno). MZ E15 stadija podijeljena je na
površinski sloj, koji sadrži
CR stanice, i duboki, koji pretežno sadrži tangencijalno
migrirajuće interneurone.
Elektronska mikroskopija tangencijalnih rezova kroz MZ pokazuje
relativno velike CR
stanice (A) s međusobno karakteristično okomito orijentiranim
somama i staničnim
nastavcima. Manje stanice, koje iskazuju karakterističnu
morfologiju migrirajućih
interneurona (B), položene su dublje u MZ. Koronalni polutanki
rez imunohistokemijski
obojan na relin (smeđe) te diferencijalno obojan toluidinom
(plavo) (C) pokazuje opisanu
slojevitost. Crvene strelice označavaju tangencijalno
orijentirane migrirajuće interneurone u
dubljem sloju. Slike D-K prikazuju tangencijalne konfokalne
optičke rezove tkiva kroz
površinske (1-8 μm) i duboke (8-20 μm) slojeve MZ. Vrhovi
strelica u slikama D-G
pokazuju dvostruka bojenja karkteristična za CR stanice, dok
pune strelice pokazuje
dvostruka bojenja karakteristična za tangencijalno migrirajuće
interneurone. Vrhovi strelica
u slikama H-K pokazuju dvostruka bojenja karakteristična za
tangencijalno migrirajuće
interneurone. Veličina mjerila u (A,B,D i H) je 10 μm te 15 μm u
(E,F,I i J).
41
-
Slika 4.2.
42
-
4.3. Tangencijalno migrirajući interneuroni i Cajal-Retziusove
stanice u
marginalnoj zoni embrionalne moždane kore
Iako je pravilna organizacija mreže CR stanica u MZ embrionalne
moždane kore
uočena već u najranijim studijima razvoja moždane kore, tek su
novije studije sugerirale da
pravilna prostorna organizacija CR stanica uspostavlja mrežu
koja osigurava prostornu
informaciju za tangencijalno migrirajuće interneurone
(64,140,4,176). Značajan postotak
interneurona rođenih u području GB tangencijalno migrira prema
dorzalnoj moždanoj kori
kroz duboki sloj embrionalne MZ neposredno ispod mreže CR
stanica. Stoga smo prvo
analizirali prostorni obrazac orijentacije najranije nastalih
relin pozitivnih CR neurona u
površinskom sloju MZ embrionalne moždane kore
(64,140,4,176).
4.3.1. Prostorni obrazac usmjerenja Cajal-Retziusovih stanica u
marginalnoj zoni
embrionalne moždane kore
Analizirali smo koronalne rezove i tangencijalne eksplantate
dorzalne i ventralne
moždane kore tkiva mozga već zahvaćene valom tangencijalno
migrirajućih interneurona
E15 stadija koji odgovara vremenski najintenzivnijem razdoblju
tangencijalne migracije u
embrionalnoj moždanoj kori.
Analizirajući elektronskom mikroskopijom eksplantate moždane
kore glede obrasca
međusobne orijentacije CR stanica i njihovih nastavaka u nizu
tangencijalnih ultratankih
rezova MZ, uočili smo karkteristični međusobno okomiti obrazac
orijentacije susjednih CR
stanica i njihovih nastavaka (slika 4.3. A). Da bismo istražili
orijentaciju CR stanica i
njihovih nastavaka, analizirali smo eksplantate dorzalne moždane
kore u kojima smo
prethodno označili rostralni i lateralni smjer. U tako označenim
eksplantatima
imunohistokemijski smo obojali relin pozitivne stanice te potom
u ultratankim
tangencijalnim rezovima istih elektronskom mikroskopijom
analizirali prostornu
orijentaciju CR stanica. Na dobivenim slikama CR stanice
orijentirane u mediolateralnom
smjeru označili smo pseudocrveno, a pseudoplavo stanice
orijentirane u rostrokaudalnom
smjeru (slika 4.3. B). Na 100 analiziranih histoloških rezova
(po 10 iz 10 različitih
životinje, po dvije iz pet različitih okota) u prosjeku 21%
stanica bile su orijentirane u
lateralnom, 9% u medijalnom, 22% u rostralnom i 20% u kaudalnom
smjeru (slika 4.3. C i
43
-
D). 17% CR stanica nije pokazalo usmjerenje duž ±20 stupnjeva od
navedene četiri
dominantne orijentacije stanica. Dakle, 84% CR stanica pokazalo
je međusobno okomita
usmjerenja duž četiri dominantna smjera koja se poklapaju s
usmjerenjima polova
hemisfera.
Opažena raspodjela stanica u četiri međusobno okomita smjera,
tj. 350°-10°, 80°-
100°, 170°-190° i 260°-280°, koja se poklapaju s rostralnim,
kaudalnim, medijalnim i
lateralnim polom hemisfera, te raspodjele stanica u ostalim
smjerovima usporedili smo sa
slučajnom raspodjelom stanica. Rezultati statističke analize
(N=4885, hi-kvadrat=33,327,
p
-
Slika 4.3. Prikazani su stanični nastavci i some CR stanica
grupirani duž međusobno
okomita osi tvoreći tako površinsku mrežu. Tangencijalna
projekcija MZ nakon
imunohistokemijskog bojanja na CR-50 relin protutijela (A) i
(B). Većina relin pozitivnih
stanica, obojenih DAB-om u (A) i potom pseudobojanih u (B),
grupirane su duž dviju
okomitih osi, odnosno u četiri različite smjernice čija je
orijentacija približno okomita, a što
je prikazano u grafovima raspodjele stanica duž 0°-360° kutnih
usmjerenja (C, D). Stanice
pseudobojane plavo grupiraju se u usmjerenjima 350°-10° te
80°-100°, dok se stanice
pseudobojane crveno grupiraju u usmjerenjima 170°-190° te
260°-280°. Veličina mjerila na
slici A je 50 μm i 20 μm na slici B. L, lateralno; M, medijalno,
R, rostralno; C, kaudalno.
45
-
4.3.2. Obrasci tangencijalne migracije interneurona u
marginalnoj zoni dorzalne
embrionalne moždane kore
Dakle, CR stanice u MZ embrionalne moždane kore razmještene su u
međusobno
okomitim smjerovima paralelno s površinom mozga stvarajući
karakterističnu mrežu u
površnom sloju MZ. Kako bismo eksperimentalno provjerili
hipotezu da ona osigurava
prostornu informaciju tangencijalno migrirajućim interneuronima,
istražili smo da li se
smjerovi tangencijalno migrirajućih interneurona u dubokom sloju
MZ embrionalne
moždane kore tijekom njihovog arealnog smještanja poklapaju s
usmjerenjima CR stanica u
površinskom sloju MZ. S obzirom na to da je tangencijalna
migracija interneurona
dinamičan proces, analizirali smo obrazac i smjer tangencijalno
migrirajućih interneurona u
MZ u živim eksplantatima tkiva. U tu svrhu upotrijebili smo
PMMRT u živim
eksplantatima dorzalne embrionalne moždane kore te eksplantatima
čitavih polutki
embrionalnog mozga već zahvaćenih valom tangencijalno
migrirajućih interneurona
tijekom E15 stadija.
U analiziranim živim koronarnim eksplantatima embrionalnog mozga
pokazali smo
da se migracija neurona ne odvija samo u lateralno-medijalnom
smjeru, u skladu s
ventralnim položajem njihovog nastaka, već i u suprotnom smjeru,
što nije bilo opaženo u
ranijim statičnim analizama fluorescentnom i elektronskom
mikroskopijom. Budući da smo
tako pokazali da tangencijalno migrirajući interneuroni in vivo
mogu migrirati u više
smjerova, analizirali smo potom žive tangencijalne eksplantate
embrionalne moždane kore
E15 stadija. Takav pristup omogućio nam je PMMRT optičkih rezova
MZ paralelnih s
površinom embrionalne moždane kore te analizu obrazaca migracije
većeg broja
interneurona.
Analiza filmskih mikroskopskih prikaza PMMRT eksplantata živog
tkiva pokazala
je da stanice ne migriraju samo u lateralno medijalnom smjeru,
već i u rostro kaudalnom.
Točnije, kvantifikacija filmskih mikroskopskih prikaza PMMRT 5
eksplanata dorzalne
moždane kore iz 5 različitih embrija iz različitih trudnih ženki
miša pokazala je da se
tangencijalna migracija interneurona u ravnini MZ odvija
relativno sporo (prosječna brzina
gibanja stanica v=3,7±0,4 µm/hr [srednja vrijednost±SD]; ukupan
broj analiziranih stanica
N=64) u svim smjerovima u odnosu na polove budućih moždanih
polutki. Daljnja analiza
46
-
usmjerenja tangencijalno migrirajućih interneurona u istim
prikazima pokazala je
grupiranje stanica u četiri dominantna međusobno okomita
usmjerenja (ukupni broj
analiziranih stanica na temelju slučajnog odabira 25 stanica iz
pojedinog eksplanta N=125),
a što je prikazano na slikama 4.4.G. i 4.4.I. Slično CR
stanicama u površnom sloju MZ,
kada smo dobivenu raspodjelu usmjerenja tangencijalno
migrirajućih interneurona
usporedili s raspodjelom koju bismo očekivali kod slučajne
raspodjele, rezultati statističke
analize (N=125; hi-kvadrat=13,335; p
-
stanice u tim područjima migriraju značajno brže (prosječna
brzina gibanja stanica
v=57,3±7,6 µm/hr [srednja vrijednost ± SD]; ukupan broj
analiziranih stanica N=46). Na
istom materijalu pokazali smo da se glede smjera migracije
interneuroni statistički značajno
grupiraju u medijalnom i kaudalnom smjeru (hi-kvadrat=12,945;
p
-
Slika 4.4. Prikazana je multifotonska mikroskopija MZ
embrionalne moždane kore u
mozgu živog embrija metodom in vivo in utero (A), eksplantatu
polutke embrionalnog
mozga (B), tangencijalnim eksplantatima (C) i koronarnim
rezovima (D). E-G su slike
dobivene konfokalnom multifotonskom mikroskopijom stanica MZ
označenih Cell-Tracker
Green fluorescentnom bojom u embrionalnoj moždanoj kori E16
živog embrija (E), te
živim tkivima eksplantata polutki E14 stadija (F) i eksplantata
moždane kore E15 stadija
(G). Analiza orijentacije i usmjerenja interneurona u vodećem
valu tangencijalno
migrirajućih interneurona u eksplantatu čitave polutke (H) te
eksplantatu dorzalne moždane
kore (I). Suprotno interneuronima u vodećem valu migracije, koji
su dominantno
orijentirani u medijalnom i kaudalnom smjeru, interneuroni u
eksplantatu dorzalne
moždane kore, koja je već zahvaćena valom tangencijalno
migrirajućih interneurona,
pokazuju usmjerenja duž sve četiri dominantne međusobno okomite
osi koje odgovaraju
usmjerenjima polova polutki.
49
-
Slika 4.4.
50
-
Iako su rezultati ove studije deskriptivno opisali fenomen da
tangencijalno
migrirajući interneuroni u MZ embrionalne moždane kore slijede
smjernice prethodno
oblikovane mreže CR stanica, oni su također pokazali da relin
nije ključna molekula za
odvijanje početnih dviju faza tangencijalne migracije
interneurona budući da procesi
tangencijalne migracije u MZ embrionalne moždane kore miša
Relera, tj. gentskog mutanta
na relin, ne odstupaju od onih opaženih u divljeg tipa. To je u
suprotnosti s procesima
radijalne migracije i razvoja kortikalne kolumnarne organizacije
koji su izravno ovisni o
relinu (41,65,85,93,114-116,137,138). Također CR stanice u
površinskom sloju MZ i
tangencijalno migrirajući interneuroni u MZ ne ostvaruju
neposredni kontakt kao što je to
slučaj između radijalnih glija stanica i radijalno migrirajućih
neurona (131,132,136,137).
Time smo pokazali da su molekularni i morfogenetski mehanizmi
vođenja tangencijalne
migracije interneurona različiti od mehanizama radijalne
migracije.
4.3.4. Sažeti opisi filmskih mikroskopskih prikaza analiziranih
obrazaca
tangencijalne migracije interneurona
Ovoj studiji priloženi su filmski mikroskopski prikazi PMMRT
živih koronarnih
rezova odnosno eksplantata tkiva embrionalnog mozga koji se
nalaze na priloženom
kompaktnom disku (4). Filmski mikroskopski prikazi mogu se
analizirati u Windows
programskom sučelju koristeći program "Quick Time Player" u
verziji 5.0 ili novijoj.
Navedeni program sastavni je dio programskog sučelja Windows
2000 (Microsoft, USA).
Budući da svaki filmski mikroskopski prikaz analizira veliki
broj stanica i njihovih
pripadajućih gibanja, te da se radi o relativno većim
programskim zapisima, preporuča se
da se prije njihove analize na računalu njihovi programski
zapisi presnime na disk računala
te zatim analiziraju.
Priloženi su sljedeći filmski mikroskopski prikazi:
1. Tangencijalna migracija i pozicioniranje u CP
Ukupno vrijeme mikroskopije: 9,7h
Vremenski interval skeniranja vertikalne osi tkiva: 5 min
Bojenje: CellTracker Green
Preparat: živi koronalni rez mozga E14 embrija
51
-
Debljina skenirane osi tkiva: 20 μm.
U sredini prikaza koronalnog reza mogu se vidjeti dvije stanice
u različim fazama
njihove migracije. Prva stanica najprije migrira tangencijalno a
zatim zaranja u CP.
Druga stanica, koja se pojavljuje u MZ iznad prve stanice,
nastavlja migrirati
tangencijalno prema desnoj strani prikaza slijedeći svoj vodeći
nastavak (4).
2. Brza inicijalna faza tangecijalne migracije
Ukupno vrijeme mikroskopije: 4,1 h
Vremenski interval skeniranja vertikalne osi tkiva: 20 min
Bojenje: "CellTracker Green"
Preparat: živi eksplantat hemisphere mozga E15 embrija
Debljina skenirane osi tkiva: 20 μm.
Prikazana je tangencijalna projekcija moždane površine na malom
povećanju (10x)
kojim je omogućena bolja prostorna perspektiva površine mozga. U
MZ eksplantata
moždane hemisfere prikazan je niz stanica tijekom početne brze
faze migracije
stanica unutra smjernice iz područja budućeg dorzalnog
olfaktornog režnja kaudalno
duž lateralne površine moždanog mjehurića, tj. smjernica br. 3
na slici 4.1. Te
tangenc
