SVEUČILIŠTE U RIJECI - bib.irb.hrbib.irb.hr/datoteka/904775.Tamara_Zic_diplomski_rad.pdf · SVEUČILIŠTE U RIJECI ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU Diplomski sveučilišni studij Istraživanje

SVEUČILIŠTE U RIJECI

ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU

Diplomski sveučilišni studij

Istraživanje i razvoj lijekova

Tamara Žic

Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u

timeless cirkadijalnih mutanata Drosophile

Diplomski rad

Rijeka, 2016. godina

SVEUČILIŠTE U RIJECI

ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU

Diplomski sveučilišni studij

Istraživanje i razvoj lijekova

Tamara Žic

Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u

timeless cirkadijalnih mutanata Drosophile

Diplomski rad

Rijeka, 2016. godina

Mentor rada: Dr.sc. Rozi Andretić-Waldowski

Diplomski rad obranjen je dana ______________________

pred povjerenstvom:

1. Izv. Prof. Dr. sc. Sandra Kraljević Pavelić

2. Doc. Dr.sc Karlo Wittine

3. Doc. Dr. sc. Rozi Andretić-Waldowski

Rad ima 58 stranica, 11 slika, 11 tablica i 50 literaturnih navoda

Sažetak

Ciklusi svjetla i mraka utječu na cirkadijalne gene koji su bitni za kontrolu

homeostaze te su važan faktor koji utječu na fizičke i bihevioralne promjene u 24

satnom periodu. Geni koji reguliraju cirkadijalni ritam bitni su za regulaciju

metabolizma i imaju veliki utjecaj na mehanizme starenja. Starenje je kompleksan

proces kojega opisuju velike promjene u organizmu kao što su smanjenje funkcija

stanica, veća podložnost bolestima i na kraju smrt. Jedna od teorija starenja

povezuje starenje s nakupljanjem oksidacijskog oštećenja, a oksidativne promjene

povezane su s regulacijom cirkadijalnih gena. Oksidacijski stres u obliku reaktivnih

kisikovih vrsta utječe na oštećenje proteina, lipida i DNK koje onda dovodi do

starenja. Pokazano je da mutacije u cirkadijalnom genu period (per) mogu dovesti

do ubrzanog starenja, stoga smo testirali da li mutacija u tim01 genu,

dimerizacijskom partneru per gena, kod Drosophile melanogaster dovodi do

ubrzanih procesa starenja. Ispitali smo kako dodatak polifenola, kvercetina i

tirosola, u prehranu ima utjecaj na procese starenja kod wt i tim01 mušica.

Mjerili smo bihevioralne fenotipove: negativnu geotaksiju, količinu aktivnosti i

spavanja, otpornost na strest izgladnjivanja, isušivanja, dužinu životnog vijeka,

prosječnu težinu. Ova mjerenja korelirali smo s biokemijskim parametrima:

aktivnošću katalaze i superoksid dismutaze, AGE akumulacijom, količinom mono-

di-tri glicerida i reduktivnih šećera. Ispitivanja su provedena na oba spola.

Dobiveni rezultati pokazali su da polifenoli imaju pozitivne utjecaje na dužinu

života te su isto tako pospješili motoričku sposobnost okomitog penjanja koje

starenjem opada. Polifenoli su se također pokazali uspješnim prilikom fizioloških

stresova gdje su tretirane mušice u usporedbi s netretiranim duže preživjele bez

hrane i vode. Starenjem dolazi do akumulacije AGE produkata koje smo zabilježili

u wt mušica dok kod tim mušica nisu uočene. Polifenoli nisu pokazali veća

smanjenja u AGE nakupljanju kod wt i tim mušica. Polifenoli su smanjili aktivnost

katalaze i kod wt i tim mušica oba spola, dok je njihovo djelovanje na superoksid

dismutazu bilo spolno, starosno i genotipno specifično. Polifenoli nisu pokazali

značajne utjecaje na količinu aktivnosti i spavanja, prosječnu težinu, ukupnu

količinu mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera.

Dobiveni rezultati pokazuju da polifenoli djeluju na mehanizme starenja, ali nije

potpuno jasno na koji način. Jedno objašnjenje naših rezultata je da polifenoli

djeluju na smanjivanju razine reaktivnih kisikovih vrsta te tako dovode do

smanjenja oksidativnog oštećenja. Ne znamo da li je taj ujecaj direktan

(antioksidativna aktivnost polifenola) ili indirektan preko djelovanja na aktivnosti

endogenih antioksidativnih enzima. Daljnja istraživanja trebala bi razjasniti

interakciju polifenola s cirkadijalnim genima i procesom starenja.

Ključne riječi: cirkadijalni geni, Drosophila melanogaster, starenje, polifenoli

Title: Effect of tyrosol and quercetin on ageing and redox state in Drosophila

circadian mutant timeless

Summary

Light-dark cycle have effects on circadian genes which regulate homeostasis

regulation and physical and behavioral changes during 24 hour period. Circadian

genes regulate circadian rhythmicity, metabolism and influence mechanisms on

aging. Aging is a complex that involves changes in organism: reduction in the

function of cells, larger susceptibility for disease and eventually death. One aging

theory connects aging with accumulation of oxidative damages, which are usually

connected with circadian genes regulation. Process of aging is associated with

oxidative stress as a result of reactive oxygen species damaging proteins, lipids

and DNA. It has been shown that mutations in circadian period (per) gene can lead

to accelerated aging, therefore we tested whether mutation in tim01 gene,

dimerisation partner of per gene product, has effects on accelerated aging of

Drosophila melanogaster. We tested if addition of polyphenols, quercetin and

tyrosol, in the food have effects on aging of wt and tim01 flies.

We measured behavioral phenotypes: negative geotaxis, amount of activity and

sleep, resistance to starvation and dehydration stress, longevity and average

weight. This measurments were correlated with biochemical measurments:

catalase and superoxide dismutase activity, AGE accumulation, mono-di-tri-

glycerides and reductive sugars quantity. Tests were conducted on both sexes.

Results showed positive effects of polyphenols on longevity and they improved

motor skills of horizontal climbing which normally decreases with aging.

Polyphenols also showed positive effect to physiological stress (starvation and

dehydration) where treated flies lived longer compared to not treated flies.

Accumulation of AGE products were shown in wt flies but not in tim01 flies.

Polyphenols did not affect AGE accumulation in wt and tim flies. Polyphenols

decreased catalase activity of wt and tim flies of both genders, while their effect

on superoxide dismutase were gender, age and genotype specific. Polyphenols

showed no significant effects on total amount of activity and sleep, average weight,

amount of mono-di-tri-glycerides and reductive sugars.

Results showed that polyphenols have effects on aging mechanism, but it is not

yet clear in which way. One explanation of our results is that polyphenols decrease

levels of reactive oxygen species and in that way they decrease oxidative damages.

We don't know if that influence is direct (antioxidant activity of polyphenols) or

indirect through action on endogenous antioxidant enzymes. Further research

should clarify interactions of polyphenols with circadian genes and aging process.

Key words: circadian genes, Drosophila melanogaster, aging, polyphenols

Sadržaj

1. Uvod .................................................................................................. 1

1.1. Teorije starenja .............................................................................. 1

1.2. Utjecaj cirkadijalnih ritmova kod Drosophile melanogaster na metabolizam

starenja .............................................................................................. 2

1.3. Mehanizmi oksidacijskog stresa kod starenja ....................................... 5

1.4. Utjecaj polifenola na usporavanje procesa starenja .............................. 6

1.4.1. Istraživanja s kvercetinom .......................................................... 8

1.4.2. Istraživanja s tirosolom .............................................................. 8

1.5. Testovi za mjerenje starenja kod Drosophile melanogaster .................... 9

2. Cilj rada ............................................................................................11

3. Materijali i metode ..............................................................................12

3.1. Kemijske komponente i njihove koncentracije ....................................12

3.2. Soj Drosophile i uzgoj ....................................................................12

3.3. Eksperiment aktivnosti i spavanja ....................................................12

3.4. Eksperimenti izgladnjivanja i isušivanja .............................................13

3.5. Eksperiment negativne geotaksije ....................................................13

3.6. Eksperiment preživljenja .................................................................14

3.7. AGE eksperiment ...........................................................................14

3.8. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti katalaze ............................14

3.9. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti superoksid dismutaze ..........14

3.10. Eksperiment mjerenja šećera .........................................................15

3.11. Eksperiment mjerenja lipida ..........................................................15

3.12. Statistička obrada rezultata ...........................................................16

4. Rezultati ............................................................................................17

4.1. Utjecaj tirosola i kvercetina na dužinu preživljenja mušica s tim mutacijom

........................................................................................................17

4.2. Utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju divljeg tipa (wt) i tim mušica .19

4.3. Polifenolni utjecaj na ukupnu aktivnost tim mušica ..............................22

4.4. Utjecaj polifenola na količinu spavanja kod tim mušica ........................24

4.5. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa izgladnjivanja .............26

4.6. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa isušivanja ..................29

4.7. Utjecaj polifenola na stvaranje AGE produkata kod wt i tim mušica ........31

4.8. Utjeca polifenola na katalaznu aktivnost kod wt i tim mušica ................34

4.9. Utjecaj polifenola na postotak inhibicije superoksid dismutaze kod wt i tim

mušica ...............................................................................................37

4.10. Utjecaj polifenola na prosječnu težinu, mono-di-tri gliceride i reduktivne

šećere ................................................................................................40

4.11. Tablica sa statističkim značajnostima ..............................................43

5. Rasprava ...........................................................................................45

6. Zaključak ..........................................................................................51

7. Literatura ..........................................................................................52

8. Životopis ...........................................................................................56

1

1. Uvod

1.1. Teorije starenja

U toku povijesti ljudi su uvijek sanjali o mogućnosti liječenja bolesti i starosti,

potrazi za otkrićem „eliksira mladosti“ (1). Ovaj san nikada nije postao stvarnost

zbog teškoća u razumijevanju procesa povezanih sa starenjem. Do danas ne

postoje intervencije koje mogu usporiti, zaustaviti ili obrnuti procese starenja kod

ljudi. Starenje je kompleksan proces koji se događa zbog usporavanja ili izmjena

u tjelesnim procesima te dovodi do smanjene funkcionalnosti stanica, većoj

podložnosti bolestima i u konačnici smrti organizma (2). Mnoga istraživanja se

bave proučavanjem i otkrivanjem mehanizama odgovornih za starenje. Cilj takvih

istraživanja bi bila identifikacija potencijalnih meta na koje bi se moglo utjecati i

tako usporiti procese starenja. U ovom diplomskom radu proučavani su cirkadijalni

geni i njihov utjecaj na starenje te korištenje polifenola u suzbijanju mehanizama

starenja.

Starenje je popraćeno s razvitkom mnogih bolesti: rak, dijabetes, pretilost,

kardiovaskularne bolesti te degeneracija tkiva (3). To je kompleksan i

multifaktorijalan proces koji uključuje dereguliranu ishranu, disfunkciju

mitohondrija, starenje stanica, iscrpljivanje matičnih stanica, narušavanje

unutarstanične komunikacije te gubitak homeostaze u regulacijskim i fiziološkim

procesima.

Značajne teorije starenja kao što su teorija slobodnih radikala, imunološka, upalna

i mitohondrijska teorija se baziraju na jednom specifičnom uzroku starenja (1).

One omogućavaju korisne i važne uvide za razumijevanje fizioloških promjena u

toku starenja no sve više ih zamjenjuju teorije bazirane na multifaktorijalnosti koje

smatraju da nekoliko procesa sudjeluje i dolazi u interakcije prilikom starenja.

Karakteristika starenja je povećano oštećenje stanica i njihova nefunkcionalnost

(4). Jedan od primjera je bolest progerija (Hutchinson-Gilfordov sindrom) kod koje

zbog nedostatka mehanizma potrebnog za popravak DNK dolazi do ubrzanog

starenja. Progerija može nastati i kao rezultat promjene jednog gena. Mutacije u

određenim genima mogu dovesti do veće otpornosti na stres i smanjenog

nakupljanja različitih oštećenja što u konačnici dovodi do produženog životnog

vijeka. Jedan od primjera je mutacija u genu koji kodira protein p66shc bitan za

odgovor na oksidativni stres (5). Mutacija je kod miševa dovela do produžetka

2

života i omogućila zaštitu od bolesti koje se javljaju starenjem te je kod in-vitro

kultiviranih stanica povećala otpornost na apoptozu.

1.2. Utjecaj cirkadijalnih ritmova kod Drosophile melanogaster na

metabolizam starenja

Model organizam s kojim možemo proučavati brojna neurobiološka stanja i različita

kompleksna ponašanja zbog njene dobre genetičke podloge je vinska mušica,

Drosophila melanogaster (6). Brzi životni ciklus, maleni broj kromosoma i mali

genom su neke od prednosti koje su ju učinile centralnim organizmom za

proučavanje genetike razvoja i ponašanja kod životinja i ljudi (7). Genom vinske

mušice obuhvaća 5% veličine ljudskog genoma te sadrži samo 4 kromosoma,

naspram ljudi koji imaju 23 kromosoma.

Drosophila se često koristi za proučavanje molekularne osnove cirkadijalnih

ritmova i načina na koji oni utječu na metabolizam i starenje. Cirkadijalni ritmovi

su bitni za održavanje homeostaze na molekularnom, bihevioralnom i fiziološkom

nivou (2). To su fizičke, psihičke i bihevioralne ritmične promjene u aktivnosti koje

prate 24 satni ciklus. Cirkadijalni ritmovi su jasno izraženi kod mladih individua

dok se starenjem njihova amplituda smanjuje (8). Novija istraživanja ukazuju na

važnost gena koji reguliraju cirkadijalni ritam u regulaciji metabolizma, a time i

brzinu starenja.

Srž cirkadijalnog sata sastoji se od molekularne povratne petlje u kojoj je

transkripcijska aktivacija cirkadijalnih gena inhibirana proteinima koji su kodirani

istim tim genima (9). Kod Drosophile je poznato 7 gena koji utječu na funkciju

centralnog sata, a ovo istraživanje se bavilo problematikom timeless (tim) gena.

Ispitivane su razlike između divljeg soja Drosophila Canton S i cirkadijalnog

mutanta tim01. U ovom istraživanju odabran je timeless mutant zato što on isto

kao i per0 mutant pokazuje kompletan gubitak cirkadijalnog ritma, ali je tim gen

odvojen i zaseban od per gena (10). Također, važna značajka timeless mutacije je

blokada cirkadijalnog ciklusa PER proteina unutar stanice. Detaljan opis

cirkadijalnog sata opisuje se u nastavku teksta.

Mehanizam cirkadijalnog sata je kompleksan i sastoji se od velikog broja gena i

proteina. Proteini koje kodiraju Clock (Clk) i cycle (cyc) geni (CLK i CYC proteini)

pripadaju obitelji bHLH-PAS transkripcijskih faktora (9). CLK-CYC heterodimer

veže se na specifičnu sekvencu unutar promotorske regije period (per), timeless

3

(tim) i vrille (vri) gena te aktivira njihovu transkripciju. Citoplazmatsko nakupljanje

i translokacija unutar jezgre PERIOD (PER) i TIMELESS (TIM) proteina je aktivno

izbrisana zbog funkcije double-time (dbt) i shaggy (sgg) gena koji kodiraju protein

kinaze (DBT i SGG). Kao rezultat toga CLK i CYC mogu nastaviti s aktivacijom

transkripcije per i tim gena dok se PER i TIM represorski proteini nakupljaju u

citoplazmi. Nakon što PER i TIM uđu u jezgru dolazi do inhibicije transkripcije zbog

vezanja PER-TIM heterodimera na CLK-CYC dimer. Ovo gašenje traje sve dok PER

i TIM proteini nisu degradirani. Starenje utječe upravo na funkciju gore navedenih

kinaznih aktivnosti no sam proces na koji način još nije razjašnjen.

Slika 1. Clock proteini i clock geni u cirkadijalnom satu. Siva kućica pokazuje jezgru,

a sve oko nje je citoplazma (11). PER fosforilacija ovisi o DBT. Fosforilirani PER je usmjeren

za degradaciju. TIM koji se nalazi u citoplazmi skupa s PER-om tvori heterodimer

(najvjerojatnije zbog stabilizacije). PER i TIM ulaze u jezgru skupa s DBT. SGG fosforilira

TIM kako bi olakšao translokaciju TIM-a u jezgru. Jezgreni PER i TIM dovode do represije

aktivnosti CLK i CYC. Kada se smanji nivo PER i TIM-a gasi se represija što dovodi do

stvaranja novog ciklusa transkripcije iz E-box. Transkripcija Clk gena je indirektno pozitivno

regulirana pomoću PER i TIM dok je za negativnu regulaciju odgovoran VRI transkripcijski

faktor.

Cirkadijalni sustav vinske mušice, kao i ostalih organizama, sastoji se od

centralnog i perifernog sata (12). Centralni sat sastoji se od neurona koji

4

kontroliraju ritmove aktivnosti i spavanja, dok je mnoštvo perifernih satova u

senzornim neuronima, glia stanicama, masnom tkivu, abdomenu i sekretornoj

sluznici. Periferni sat može funkcionirati neovisno o centralnom satu, ali u tom

slučaju jačina perioda u konstantnim uvjetima postepeno slabi. Periferni ritmovi

su pod utjecajem centralnog sata, a na njih utječe i ritam unosa hrane i fizičke

aktivnosti. Sve je više dokaza da je za efikasno funkcioniranje važno da periodična

aktivnost perifernih i centralnog sata bude usklađena.

Periferni satovi se mogu nalaziti i u glavi te je jedna studija ispitivala bihevioralno

ponašanje vinskih mušica ovisno o ekspresiji cirkadijalnih gena u perifernim

satovima (13). Cirkadijalni geni per i tim i njihovi proteini pokazali su umanjenu

oscilaciju u perifernim satovima glava starijih mušica u usporedbi s mladim

mušicama. Ova ista studija je pokazala da ne dolazi do promjena u centralnom

satu starenjem (postoji snažan PER signal). Druga studija je pokazala

kontradiktornosti te njihovi rezultati dovode do smanjene oscilacije PER i TIM

proteina u centralnom satu starijih mušica (14).

Dijetalna restrikcija je smanjen unos hrane u organizam (ispod ad libitum razine)

bez pothranjenosti (15). Dijetalna restrikcija (eng. Dietary restriction, DR) je

produžila prosječni i maksimalni životni vijek u svim testiranim organizmima, kao

što su npr. kvasci, crvi, mušice i glodavci. Jedno od istraživanja je pokazalo da je

DR kod miševa dovela do odgode razvoja kroničnih bolesti te da je produžila njihov

životni vijek (16). Za miševe na DR zabilježena je povećana ekspresija gena za

oksidaciju masnih kiselina, naspram ad libitum hranjenih kontrola kod kojih je bila

povećana ekspresija gena za sintezu masnih kiselina.

Metabolički i signalni putevi odgovorni za životni vijek su pod utjecajem endogenog

cirkadijalnog sata (17). Dijetalna restrikcija povećava amplitudu ciklusa većine

cirkadijalnih gena uključujući i tim gena u perifernim tkivima kod vinske mušice.

Masenom spektrometrijom pokazano je da tim ima ulogu u nastanku triglicerida

srednjeg lanca i da njegova prekomjerna ekspresija u perifernim tkivima

produžava životni vijek. Ova saznanja pokazuju važnu ulogu specifičnih

cirkadijalnih gena u metabolizmu masti i starenja prilikom manipulacije količine

nutrijenata.

Mutacije u cirkadijalnim genima imaju negativne posljedice na različite biološke

procese i dovode do skraćenog životnog vijeka (18). Kod miševa kojima je

5

nedostajao clock gen BMAL1 (homolog CYC proteina koji se nalazi kod mušica)

pokazano je nekoliko simptoma starenja (sarkopenija, katarakta, atrofija organa

te mnogi drugi) (19). Slično, u mušica s mutacijom u per genu dolazi do smanjenog

životnog vijeka, ubrzanog pada funkcionalnosti i povećane neuronalne

degeneracije tijekom starenja te ubrzana akumulacija oksidativnog oštećenja (20).

1.3. Mehanizmi oksidacijskog stresa kod starenja

Oksidacijski stres i cirkadijalna regulacija su usko povezani. Tako je pokazano da

ovisno o dobu dana kada je induciran oksidativni stres, administracijom vodikovog

peroksida (H2O2), ovisila je smrtnost mušica (21). Opažen je dnevni ritam

smrtnosti s maksimalnom smrtnošću u kasnoj fazi svjetla i minimalnoj u kasnoj

fazi mraka. Veća smrtnost tijekom dana se događala zbog većeg nakupljanja

proteinskih karbonila koji su nusprodukti proteinske oksidacije (2). U per mutanata

gdje je cirkadijalni ritam narušen povećana je osjetljivost na H2O2 u usporedbi s

kontrolom (21).

Jedna od teorija starenja objašnjava interakcije među procesima glikozilacije,

oštećenja stanica zbog slobodnih kisikovih radikala, razine glukoze u organizmu i

djelovanje šaperon proteina (22). Prema njoj glukoza može postati štetna u vrlo

stabilnim konformacijama koje imaju destruktivno djelovanje u metabolizmu (23).

U procesu neenzimske glikozilacije slobodna glukoza prolazi procese pretvorbe

gdje u konačnici iz glukoze nastaju najstabilniji oblici tzv. AGE (engl. Advanced

Glycosylation Endproducts). Ovi proizvodi glikozilacije stvaraju unakrsne

poveznice s proteinima, lipidima ili DNK te umanjuju njihovu funkcionalnost. To je

spontani proces koji ovisi o koncentraciji glukoze u krvi, tkivima i citosolu. Proces

je progresivan, nepovratan i dovodi do cjelokupnih oštećenja. AGE produkti su

biomarkeri starenja te postoji način njihovog mjerenja kojega smo mi primijenili u

našim eksperimentima.

Učestalo istraživani mehanizmi oštećenja stanica proizlaze iz reakcija nastalih zbog

slobodnih kisikovih radikala (eng. ROS, Reactive Oxidative Species) (22). Disanje

i korištenje kisika kod aerobnih organizama ima svoje štetnosti. Djelomična

redukcija molekule kisika tijekom oksidativne fosforilacije u mitohondriju stvara 3

glavna tipa ROS-a: superoksidni anion (O2•-), vodikov peroksid (H2O2) te

hidroksilni radikal (•OH). Smatra se da su najdestruktivniji za mitohondrijske

membrane vodikov peroksid i njegov radikal (•OH). ROS dovode do oštećenja

6

makromolekula kao što su DNK, lipidi i proteini te tako remete funkcije stanice

(24). Nakupljanje ROS-a povećava se tijekom starenja te je jedan od bitnih faktora

koji utječe na starenje i skraćuje životni vijek. ROS-ovi se iz organizma eliminiraju

pomoću superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze dok

se oštećeni proteini mogu popraviti pomoću molekularnih šaperona kao što su

proteini toplinskoga šoka (engl. Heathshock protein).

Organizmi se protiv starenja povezanog s oksidativnim stresom bore na dva načina

(25). Prvi je proizvodnja endogenih antioksidativnih enzima kao što su superoksid

dismutaza, katalaza te glutation peroksidaza. Drugi način su egzogeni

antioksidansi npr. vitamini E i C. SOD katalizira dismutaciju superoksidnog aniona

u vodikov peroksid i molekulu kisika, a CAT potom razgrađuje molekulu H2O2 na

molekulu vode i molekulu kisika. SOD je prisutna u mitohondrijskom i

citoplazmatskom obliku kod Drosophile te ju kodiraju dva različita gena Sod1 i

Sod2 (26).

Mnogobrojna istraživanja o utjecaju ROS-a na starenje nisu uvijek u suglasju o

utjecaju antioksidativnih enzima. Jedan od načina za testiranje teorije starenja pod

utjecajem slobodnih radikala je taj da se povećaju razine SOD i CAT. Kod vinske

mušice je pokazano da ako se istovremeno poveća njihova ekspresija može doći

do produženog životnog vijeka, smanjenog nakupljanja oksidativnih oštećenja te

do ubrzanih metaboličkih procesa (27). Drugo istraživanje je pokazalo da su

organizmi s mutacijom u SOD genu podložniji oksidativnom stresu (28). Nedavna

ispitivanja sojeva mutanata Drosophila melanogaster koji su imali smanjeni izražaj

SOD pokazala su da te mušice imaju skraćen životni vijek te da su bile infertilne i

podložnije utjecaju parakvata (29).

1.4. Utjecaj polifenola na usporavanje procesa starenja

Dijetalni dodaci koji sadrže nutrijente ili biljne ekstrakte mogu produžiti životni

vijek te djeluju kao egzogeni antioksidansi (30). Ekstrakti iz biljaka (npr. ekstrakti

iz rodiole, kurkume i jabuke) pokazali su da pozitivno utječu na produljenje života

kod vinskih mušica tako da su doveli do smanjenog oksidativnog oštećenja. Jedno

od istraživanja kod kojeg je došlo do smanjenja oksidativnog oštećenja kod vinske

mušice je bilo prilikom primjene nektarine (31). Pokazali su da je kod skupine s

dodatkom 4% nektarine došlo do značajnog smanjenja 4-HNE proteina,

7

biomarkera lipidne oksidacije, u odnosu na skupinu koja je primala regularnu

hranu.

Pretpostavlja se da su polifenoli jedne od značajnih komponenta odgovorne za

pozitivne učinke mediteranske prehrane. To su komponente koje se mogu naći u

voću, povrću, žitaricama i napitcima (32). Oni su sekundarni metaboliti biljaka i

njihov pozitivni učinak je vidljiv u zaštiti od ultraljubičastog zračenja ili zaštiti od

različitih patogena. Epidemiološke studije su pokazale da se dugotrajna

konzumacija hrane bogate s polifenolima može povezati kao zaštitni faktor od

razvoja raka, kardiovaskularnih bolesti, dijabetesa, osteoporoze i

neurodegenerativnih bolesti (33).

Jedan od polifenola čiji je utjecaj na usporavanje starenja opsežno istraživan u

različitim organizmima je resveratrol. Njegova meta je sirtuin koji spada u klasu

nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) deacetilaza (34). Identificirano je 7 sirtuina

kod sisavaca, a najpoznatiji je SIRT-1 za kojega se smatra da utječe na zdravlje i

produženje životnog vijeka. Metabolički putevi pod regulacijom sirtuina su

glukoneogeneza i glikoliza u jetri, metabolizam masti te preživljavanje stanica.

Ovisno o uvjetima, sirtuini aktiviraju ili suprimiraju transkripcijske faktore iz

skupine forkhead O (FOXO). FOXO skupina potom aktivira ili suprimira specifične

gene koji mogu dovesti do smanjenja apoptoze, povećanja antioksidativnih

enzima, DNA zaštite, različitih protuupalnih procesa te u konačnici pokreću

mehanizme koji promoviraju zaštitu stanice i cjelokupnog organizma (34). Prvi

pozitivni učinci zabilježeni su na životnom vijeku Saccharomyces cereviseae kod

kojega je resveratrol povećao prosječni životni vijek za 70% u usporedbi s

netretiranom skupinom (35). Nakon njega pokazano je da resveratrol može

produžiti prosječni životni vijek približno za 20% kod organizama kao što su

Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans (36). Kod nematoda i vinske

mušice resveratrol je imao učinak na proteine Sir2 i SIR-2.1 koji su homologi SIRT-

1 u sisavaca.

Kod Drosophile vrlo pozitivne učinke pokazali su polifenoli iz jabuke (25).

Istraživao se utjecaj jabučnih polifenola na životni vijek vinskih mušica te njihova

interakcija s proteinima koji su prethodno bili povezani s utjecajem starenja, kao

što su: superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), gen methuselah (MTH),

Rpn11 i podjedinice III i VIb citokrom c oksidaze. Ekstrakt jabučnih polifenola koji

je sadržavao: florentin, proantocijanidin, epikatehin, katehin, ruin i druge

8

proanticijanidine i fenole produžio je životni vijek za 10%. Eksperimentalni testovi

u kojima se koristio parakvat i H2O2 pokazali su da su jabučni polifenoli produžili

vrijeme preživljenja samo za divlje tipove mušica soja Oregon R dok kod mutanata

SODn108 i Catn1 kojima je gen za SOD i CAT izbačen nije došlo do produženog

preživljenja što upućuje na interakciju polifenola s genima za SOD i CAT. Jabučni

polifenoli su pozitivni utjecali na preživljenje i sposobnost okomitog penjanja u

mušica koje su bile kronično izložene parakvatu. Pozitivni učinci jabučnih polifenola

se povezuju s njihovim djelovanjem na proteine koji su povezani sa starenjem.

1.4.1. Istraživanja s kvercetinom

Kvercetin je jedan od poznatijih flavonola u prehrani te je bio tema mnogih in vitro

istraživanja. U istraživanju sa stanicama Saccharomyces cereviseae kvercetin je

pokazao veću otpornost stanica na H2O2 (37). Smanjile su se razine ROS-a,

smanjena je oksidacija glutationa te je kvercetin spriječio karbonilaciju proteina i

peroksidaciju lipida.

Pošto kvercetin ima antioksidativne učinke smatralo se da bi mogao imati i

neuroprotektivne učinke. Jedna od studija istraživala je da li kvercetin može

povećati nivo paraoksonaze 2 (PON2), enzima bitnog za zaštitu od

neurotoksičnosti uzrokovane oksidativnim stresom (38). Istraživanje je pokazalo

da kvercetin povećava ekspresiju PON2 enzima u mišjim astrocitima striatuma (te

stanice su odabrane zbog svoje najveće ekspresije PON2 u regijama mozga) te u

neuronima striatuma.

Pozitivan učinak kvercetina pokazan je i u model organizmu Caenorhabditis

elegans (39). Kvercetin je reducirao akumulaciju lipofusicna (pigment starenja) za

40% te je produžio životni vijek za 15%. Kvercetin je također smanjio akumulaciju

ROS-a pod uvjetima toplinskog stresa za 25-35%. U našem istraživanju kvercetin

je kod vinske mušice također pokazao pozitivne učinke na produžetak životnog

vijeka.

1.4.2. Istraživanja s tirosolom

Ekstra djevičansko maslinovo ulje je centralni sastojak u Mediteranskoj prehrani

(40). Svoje pozitivne efekte na zdravlje duguje različitim antioksidansima,

posebice polifenolima koji se nalaze u njemu. Za tirosol i hidroksitirosol se smatra

da najviše pridonose okusu, stabilnosti i nutricionalnoj važnosti ulja. Pokazano je

9

da tirosol značajno povećava maksimalno preživljenje s 18.67 na 20.68 dana kod

nematoda Caenorhabditis elegans (41). Otpornost na oksidativni stres mjerena je

tako da su nematodi bili izloženi parakvatu. U eksperimentu je pokazano da

tretman s tirosolom značajno povećava preživljenje u prisutnosti 4mM parakvata.

Test somatskih mutacija i rekombinacija (eng. SMART, Somatic Mutation and

Recombination Test) na Drosophili melanogaster je pokazao antigenotoksičnu

aktivnost tirosola na DNA oksidativno oštećenje generirano vodikovim peroksidom

(42). Pokazano je da tirosol pri većoj koncentraciji značajno smanjuje stopu

genotoksičnosti te inhibicijsku stopu vodikovog peroksida blizu 66% u usporedbi

kontrolama. U našem istraživanju ispitali smo dodatnim testovima pozitivne učinke

tirosola. Također smo koristili i cirkadijalne mutante pri testiranju.

U našim istraživanjima na vinskim mušicama korišteni su kvercetin i tirosol jer su

do sada pokazali pozitivne učinke na druge model organizme. Naše istraživanje je

temeljitije ispitalo učinke ovih polifenola pomoću nekoliko bihevioralnih i

biokemijskih testova koji do sada nisu bili rađeni.

1.5. Testovi za mjerenje starenja kod Drosophile melanogaster

Postoji nekoliko metoda pomoću kojih se istražuje starenje korištenjem vinske

mušice kao model organizma (43). Te metode mogu biti različita fiziološka,

biokemijska i bihevioralna testiranja. Fiziološki testovi se baziraju na mjerenju

otpornosti mušica na različite stresove (npr. oksidativni stresovi, izgladnjivanje,

isušivanje). Otpornost na oksidativni stres se najčešće mjeri tako da se mušice

hrane s parakvatom, spojem koji dovodi do nastanka različitih reaktivnih kisikovih

vrsta. Test izgladnjivanja se izvodi tako da se mjeri preživljenje mušica koje

primaju samo vodu. Mjerenje otpornosti na izgladnjivanje je procjena mogućnosti

mušica da se nose s manjkom energije (pojava koja se javlja u stvarnim okolišnim

uvjetima). Životni vijek i odgovor na stres su usko povezani te se smatra da su

dugo živuće populacije puno otpornije na stresove.

Najbolji indikatori starenja su testovi koji mjere fizičku sposobnost organizma,

najčešće lokomotorna aktivnost koja starenjem pada (43). Kod Drosophile

negativna geotaksija je jedan od testova s kojim je moguće vrlo brzo i jednostavno

dobiti rezultat o sposobnosti okomitog penjanja mušica. Pokazano je da starenjem

brzina njihove sposobnosti za penjanjem opada (44).

10

Druga visokoprotočna metoda za mjerenje aktivnosti u Drosophile je korištenje

uređaja Drosophila Activity Monitoring System (DAMS) (43). Aktivnost se u ovim

monitorima mjeri kao frekvencija koja je zabilježena svaki put kada mušica pređe

preko infracrvene zrake koja prolazi preko sredine staklenog štapića u kojemu se

nalazi mušica. Ovakvi podaci se potom mogu koristiti za analiziranje širokog

raspona ponašanja kao što su obrasci spavanja i promijene u lokomotornoj

aktivnosti kao posljedica endogenih i egzogenih promjena.

11

2. Cilj rada

Cilj ovog istraživanja je ispitivanje utjecaja polifenola, kvercetina i tirosola, na

mehanizme starenja kod Drosophile i cirkadijalnog mutanta tim01. Polifenoli su

antioksidativne molekule koje se nalaze pretežito u mediteranskoj prehrani te

imaju pozitivne učinke u eliminaciji slobodnih radikala koji utječu na starenje.

Istraživanje se temeljilo na utjecaju polifenola na bihevioralne karakteristike

starenja kao što su lokomotorna aktivnost, spavanje, negativna geotaksija,

otpornost na izgladnjivanje, isušivanje, prosječna težina te dužina preživljenja.

Kako bi bihevioralne rezultate interpretirali u kontekstu biokemijskih mjerili smo:

aktivnost katalaze, aktivnost superoksid dismutaze, ukupnu količinu mono-di-tri

glicerida i reduktivnih šećera te akumulaciju AGE produkta. Cilj ovog istraživanja

bi bio vidjeti da li polifenoli imaju djelovanja na usporavanje mehanizma starenja,

kao npr. povećanje lokomotorne aktivnosti, povećana otpornost na stresove,

povećane aktivnosti antioksidativnih enzima te smanjeno nakupljanje spojeva koji

dovode do oštećenja stanica u organizmu. Također jedan od ciljeva bi bilo veće

razumijevanje u kojim procesima i na koji način djeluju cirkadijalni geni u

procesima starenja te da li polifenoli imaju utjecaja na njih, odnosno na koji način

polifenoli djeluju na organizam u prisutnosti i nedostatku tim01 gena.

12

3. Materijali i metode

3.1. Kemijske komponente i njihove koncentracije

Koristio se stock otopine tirosola koncentracije 1 mM te kvercetina koncentracije

0,1 M. Mušice su tretirane s koncentracijama tirosola 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 µM,

dok su koncentracije kvercetina bile 4,8 mM, 3,2 mM i 0,6 mM. Navedene kemijske

komponente dodavane su u tim koncentracijama u 10 ml obične hrane (voda,

kvasac, agar, šećer, melasa te propionska i nipaginska kiselina koje su sprječavale

nastanak gljivica i plijesni) kroz 2, 4 i 6 tjedna. Kontrolna skupina mušica hranjena

je na običnoj hrani. Mušicama je svaka 2-3 dana mijenjana hrana.

3.2. Soj Drosophile i uzgoj

Korišten je soj Drosophile melanogaster s mutacijom u genu – timeless01, muškog

i ženskog spola. Usporedba je bila s wild type (wt) mušicama Drosophile

melanogaster, iz prethodnih eksperimenata. Mušice su se čuvale u inkubatoru pri

temperaturi od 26°C te vlažnosti 60-70 %.

3.3. Eksperiment aktivnosti i spavanja

Za mjerenje lokomotorne aktivnosti koristio se DAMS (eng. Drosophila Activity

Monitor System). Sistem se sastoji od monitora povezanih s računalom. Svaki

monitor prima 32 mušice. Po jedna mušica se nalazila u staklenom štapiću koji je

s jedne strane imao hranu obloženu voskom, a s druge strane spužvasti čep.

Monitori s muhama su stavljeni u inkubator s izmjenom svjetla i mraka svakih 12

sati tijekom 5 dana. U svakom monitoru nalazi se infracrvena zraka koja prolazi

kroz sredinu štapića. Broj prelazaka preko infracrvene zrake zabilježen je kao

signal u računalu u periodu od 5 minuta. Dobiveni podaci analizirani su u Actogram

J i Excel programu. Dobiveni su podaci o ukupnoj količini aktivnosti (broj prelazaka

tube u jedinici vremena) te ukupnoj dužini spavanja u jedinici vremena. Spavanje

je definirano kao 0 prelazaka tube u 5 minutnim epizodama.

13

Slika 1. Drosophila Activity Monitoring System (DAMS).

Slika preuzeta s: http://www.trikinetics.com/Downloads/Catalog1105.pdf

3.4. Eksperimenti izgladnjivanja i isušivanja

Eksperiment izgladnjivanja proveden je tako da se po jedna mušica nalazila u

staklenom štapiću na kojemu se s jedne strane nalazio 1% agar, a s druge strane

komadić spužvice. Za eksperiment isušivanja po jedna mušica nalazila se u

praznom staklenom štapiću sa spužvastim čepovima. Stakleni štapići nalazili su se

u DAMS monitorima i aktivnost je praćena dok sve mušice nisu umrle. Analizom

podataka utvrđeno je: maksimalno vrijeme preživljenja i broj sati u kojem je 50%

mušica ostalo živo.

3.5. Eksperiment negativne geotaksije

Eksperimentom se mjeri motorička sposobnost penjanja uz okomite stijenke. Dan

prije izvođenja eksperimenta mušice su sortirane pod narkozom u 5 tuba s po 10

mušica. U svakoj tubi nalazilo se 2-3 ml hrane (s ili bez dodatka polifenola). Na

dan izvođenja eksperimenta mušice su iz tuba s hranom prebačene u tube bez

hrane te ih se ostavilo 20-ak minuta na miru da se prilagode. Tube su se potom

stavljale u drveni okvir koji prima 5 tuba. Eksperiment je trajao 5 minuta za svaku

skupinu mušica. Eksperiment se izvodio tako da se lupilo drveni stalak 3 puta o

površinu kako bi sve mušice pale na dno tube i nakon 5 sekundi tube su se slikale

pomoću digitalne kamere spojene na računalo. Nakon 55 sekundi postupak je

ponovljen. Proces se ponavljao 5 puta (jedno mjerenje svaku minutu, 5 vrijednosti

za svaku tubu). Analizom fotografskih zapisa prebrojio se broj mušica koje su

prešle polovicu tube (visina od 3 cm označena na tubi). Za svaku tubu dobivena

je srednja vrijednost na osnovu 5 ponavljanja o broju mušica koje su prešle sredinu

tube, a izražena je u postotcima.

14

3.6. Eksperiment preživljenja

Mušice su za potrebe eksperimenta čuvane u bocama s po 10 ml hrane (regularna

i hrana s dodatkom polifenola). Za svaku testiranu skupinu bilo je 50 mušica.

Mušice su se čuvale u inkubatoru. Svaka 2-3 dana mijenjana im je hrana.

Eksperiment se pratio dok sve mušice nisu umrle.

3.7. AGE eksperiment

Pet mušica je homogenizirano u 450 µl PBS-a koji je sadržavao 10 mM

EDTANa2x2H2O. Dodano je 100 µL tripsina i uzorci su stavljeni 24 sata u inkubator

na 37°C . Nakon inkubacije uzorci su centrifugirani 20 minuta na 14000 rpm i 4°C.

Za svaki uzorak pipetirani su triplikati po 150 µl u pločicu s 48 jažica. Mjerena je

fluorescencija na uređaju infinite 200Pro pri ekscitacijskoj valnoj duljini od 365 nm

i emisijskoj 440 nm. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u programu

Tecan i-control.

3.8. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti katalaze

Enzimski ekstrakti pripremljeni su homogeniziranjem 5 mušica u 800 µl

homogenizacijske otopine koja se sastojala od 0.05 M fosfatnog pufera (pH 6.9)

te 0,1% Triton X-100. Uzorci su centrifugirani 20 min na 14000 rpm i 4°C.

Supernatant je razrijeđen s homogenizacijskom otopinom u omjeru 1:2. U

mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je 450 µl substratne otopine koja je

sadržavala 0.05 M fosfatni pufer (pH 6.9) i 15 mM H2O2. Rekcije su mjerene nakon

dodavanja 10, 15, 20 i 25 µl pripremljenih uzoraka. Mjereno je smanjenje optičke

gustoće pri 240 nm tokom 5 minuta na uređaju infinite 2000Pro. Podaci o

izmjerenim vrijednostima dobiveni su u programu Tecan i-control.

3.9. Eksperiment mjerenja enzimske aktivnosti superoksid dismutaze

Enzimski ekstrakti pripremljeni su na isti način kao u testu enzimske aktivnosti

katalaze. U mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je 450 µl reakcijske otopine

koja je sadržavala 20 mM fosfatni pufer (pH 10), 0.8 mM TEMED, 0.8 mM EDTA i

0.5 mM kvercetina. Reakcije su mjerene nakon dodavanja 10, 15, 20 i 25 µl

pripremljenih uzoraka. Mjerena je promjena u optičkoj gustoći pri valnoj duljini od

406 nm na uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni

su u programu Tecan i-control.

15

3.10. Eksperiment mjerenja šećera

Jedna mušica homogenizirana je u 50 µl PBS-a i 450 µl otopine kloroforma i

metanola u omjeru 1:2. Uzorci su centrifugirani 20 min pri 14000 rpm i 4°C.

Pipetirano je 200 µl supernatanta, 10 µl 25 N HCl i 600 µl Benedictovog reagensa

te kuhano 20 min. Osim uzoraka pripremljene su i kalibracijske otopine sa stockom

glukoze u 0,1 mg/ml.

Kalibracijske otopine:

C1= 0 µg/ml = 600 µL Benedicta + 100 µL HCl

C2= 5 µg/ml = 565 µl Benedicta + 100 µl HCL + 35 µl glukoze

C3= 10 µg/ml = 530 µl Benedicta + 100 µL HCl + 70 µL glukoze

C4= 15 µg/ml = 495 µl Benedicta + 100 µl HCl + 105 µl glukoze

C5= 20 µg/ml = 460 µL Benedicta + 100 µL HCl + 140 µl glukoze

Uzorci i kalibracijske otopine centrifugirani su 20 min pri 14000 rpm i 14 °C. U

mikrotitarsku pločicu s 48 jažica pipetirano je u triplikatu 150 µl od uzoraka i 150

µl kalibracijske otopine. Mjerena je apsorbancija pri valnoj duljini 735 nm na

uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u

programu Tecan i-control.

3.11. Eksperiment mjerenja lipida

Za ovaj eksperiment korišteni su isti uzorci koji su bili pripremljeni i za mjerenje

šećera. U staklene epruvetice pipetirano je 200 µL uzorka i 50 µL 20% NaOH te je

kuhano 20 minuta. Potom je pipetirano 600 µL destilirane vode i ostavljeno da se

ohladi. Paralelno su pripremljene i kalibracijske otopine sa stock otopinom 400 mM

glicerola.

Kalibracijske otopine:

C1= 0 mM = 800 µl H2O + 50 µL NaOH

C2= 5 mM = 789 µL H2O + 50 µL NaOH + 10,6 µl glicerola

C3= 10 mM = 779 µL H2O + 50 µl NaOH + 21 µL glicerola

C4= 50 mM = 694 µl H2O + 50 µL NaOH + 106 µL glicerola

C5= 100 mM= 587 µL H2O + 50 µl NaOH + 213 µL glicerola

16

Uzorci i kalibracijske otopine centrifugirani su 20 min pri 14000 rpm i 14 °C.

Pipetirani su u mikrotitarsku pločicu s 48 jažica triplikati po 150 µl od uzoraka i

150 µl kalibracijskih otopina. Mjerena je apsorbancija pri valnoj duljini 230 nm na

uređaju infinite 2000Pro. Podaci o izmjerenim vrijednostima dobiveni su u

programu Tecan i-control.

3.12. Statistička obrada rezultata

Rezultati su statistički obrađeni u programu Statistica 64 verzija 12. Zavisna

varijabla bilo je mjerenje od interesa (aktivnost, spavanje, negativna geotaksija,

izgladnjivanje, isušivanje, preživljenje, enzimatske reakcije) dok su nezavisne

varijable bile: spol, starost, genotip i koncentracije polifenola. Kao statistički

značajne vrijednosti prihvaćene su one čiji je p bio manji od 0,05.

17

4. Rezultati

4.1. Utjecaj tirosola i kvercetina na dužinu preživljenja mušica s tim

mutacijom

Kako bi ispitali da li polifenoli imaju utjecaj na maksimalno preživljenje mjerili smo

dužinu preživljenja mušica tretiranih s tirosolom (TYR) i kvercetinom (QUE) u

usporedbi s mušicama hranjenih na običnoj hrani. Na osnovu prethodnih rezultata

naša hipoteza bila je da će TYR i QUE utjecati na dužinu života (45,46).

Pokazano je da nisu sve koncentracije QUE i TYR imale pozitivan učinak te je

uočena razlika u djelovanju koncentracija polifenola među spolovima. Najveći

pozitivan utjecaj na produljenje životnog vijeka kod tim mužjaka imale su

koncentracije od QUE 3,2 mM te TYR 17,6 µM (Slika 1. a, b). Kod tim ženki samo

je TYR 12,45 µM produžio životni vijek (Slika 1. d). Muške mušice tretirane s QUE

koncentracije 3,2 mM te TYR koncentracije 17,6 µM preživjele su 84 dana u

usporedbi s kontrolnom skupinom čije je preživljenje bilo 60 dana. Smanjeno

preživljenje kod mužjaka uočeno je kod koncentracije od QUE 4,8 mM (Slika 1. a,

b). Maksimalno preživljenje ženskih mušica tretiranih s TYR 12,45 µM je bilo 84

dana nasuprot kontrole čije je maksimalno preživljenje bilo 71 dan. Kod ženki

koncentracije QUE 3,2 i 4,8 mM te TYR 7,6 i 17,6 µM skratile su životni vijek (Slika

1. c, d). Statističkom obradom podataka, korištenjem generalnog linearnog

modela, pokazano je da ne postoji statistički značajna razlika između spolova za

QUE (F (1, 3)=0.04, p=0.862, SE=3.31) i TYR (F (1, 3)=0.00, p=1, SE=5.22).

Također ne postoji statistička značajnost među koncentracijama QUE (F (3,

3)=1,45, p=0.384, SE=5.73) i TYR (F (3, 3)=0.34, p=0.799, SE=9.05). Ovi

rezultati upućuju na zaključak da postoji optimalna doza koja pozitivno utječe na

produljenje života kod Drosophile. Produljenje preživljenja QUE i TYR je spolno

ovisno te je tako kod ženki samo jedna koncentracija TYR izazvala produljenje

životnog vijeka. Interesantno, ženke pokazuju veću osjetljivost na negativne

efekte polifenola radi kojih dolazi do skraćenja životnog vijeka. U budućnosti će

biti potrebno ispitati dodatne koncentracije kako bi se ustanovio optimalni

odgovor.

18

Dužina

preživljenja

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.04 0.862 3.31 1 0.00 1 5.22

Koncentracija 3 1.45 0.384 5.73 3 0.34 0.799 9.05

Tablica 1. Statistička analiza generalnim linearnim modelom

1. a

1. b

0%

25%

50%

75%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

pre

živ

ljenje

(%

)

Dani

tim01 mužjaci, kvercetin

Kontrola

QUE 0,6 mM

QUE 3,2 mM

QUE 4,8 mM

0%

25%

50%

75%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80

pre

živ

ljenje

(%

)

Dani

tim01 mužjaci, tirosol

Kontrola

TYR 7,6 µM

TYR 12,45 µM

TYR 17,6 µM

19

1. c

1. d

Slika 1. Spolno specifičan utjecaj QUE i TYR na preživljenje Drosophile. U

eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) i ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan

kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6

µM, 12,45 µM i 17,6 µM (n=50 za svaku skupinu). Kontrolna skupina primala je običnu

hranu (n=50). Svaka 2-3 dana mušice su prebačene na podlogu sa svježom hranom.

4.2. Utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju divljeg tipa (wt) i tim

mušica

Negativna geotaksija je motorička sposobnost penjanja mušica uz okomitu

stijenku tubice, a mjeri se testom koji mjeri brzinu penjanja u ograničenom

vremenskom periodu. Sposobnost penjanja slabi kod starih mušica i koristi se kao

indikator funkcionalnosti motoričkog sistema. Sposobnost penjanja je u korelaciji

0%

25%

50%

75%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

pre

živ

ljenje

(%

)

Dani

tim01 ženke, kvercetin

Kontrola

QUE 0,6 mM

QUE 3,2 mM

QUE 4,8 mM

0%

25%

50%

75%

100%

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

pre

živ

ljenje

(%

)

Dani

tim01 ženke, tirosol

Kontrola

TYR 7,6 µM

TYR 12,45 µM

TYR 17,6 µM

20

s neurodegenerativnim promjenama i starenjem. U ovim testovima željeli smo

vidjeti da li polifenoli usporavaju slabljenje negativne geotaksije kao posljedice

starenja.

Starenjem opada penjanje kod wt i tim mušica oba spola te su polifenoli pokazali

pozitivan učinak, no ne i značajan. Rezultati pokazuju da kod wt i tim mužjaka

starenjem dolazi do opadanja sposobnosti okomitog penjanja kod kontrolnih

skupina, dok tretman s tirosolom i kvercetinom taj proces usporava (Slika 2. a, b).

Kod kontrola ženki također dolazi do opadanja sposobnosti penjanja starenjem,

dok su veći pozitivni efekt uočeni za tretman kvercetinom u odnosu na tirosol (Slika

2. c, d). Statistička analiza, generalni linearni model, je pokazala statistički

značajnu razliku u negativnoj geotaksiji među starosti za QUE (F (2, 28)=33.49,

p>0,001, SE=2.13) i TYR (F (2, 28)=33.49, p>0,001, SE=1.4), odnosno

sposobnosti za penjanjem opadaju od 2. do 6. tjedna starosti. Statističkom

analizom, generalnim linearnim modelom, utvrđeno je da postoji statistički

značajna razlika među spolom za mušice tretirane TYR (F (1, 28)= 6.42, p=0.017,

SE=1.51) dok za tretirane s QUE ne postoji statistički značajna razlika (F (1,

28)=0.58, p=0.453, SE=1.84). Pokazano je da se muške mušice tretirane s

tirosolom bolje penju u odnosu na ženke, dok za tretirane s kvercetinom to nije

slučaj. Generalnim linearnim modelom utvrđeno je da postoji statistički značajna

razlika genotipova za QUE (F (1, 28)=6.05, p=0.02, SE=1.84) i TYR (F (1,

28)=4.58, p=0.04, SE=1.51), odnosno pokazano je da je tretman bolje utjecao

na tim te su one imale veću sposobnost penjanja u odnosu na wt. Generalni linearni

model nije pokazao statistički značajne razlike za negativnu geotaksiju među

koncentracijama QUE (F (3, 28)= 2.18, p=0.113, SE=2.61) i TYR (F(3, 28)=2.00,

p=0.136, SE=2.13), odnosno koncentracije nisu imale značajan utjecaj na

sposobnost penjanja. Pozitivan učinak polifenola se uočava kod 6 tjedna starih

mužjaka i ženki što bi se moglo objasniti da polifenoli bolje djeluju u eliminaciji

ROS-ova koji se nakupljaju starenjem. U rezultatima maksimalnog preživljenja

smo pokazali da su koncentracije QUE i TYR spolno ovisne što se primjećuje i kod

negativne geotaksije jer koncentracije tirosola imaju manje efekte kod ženki nego

kod mužjaka.

QUE TYR

21

Negativna

geotaksija

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.58 0.453 1.84 1 6.42 0.017 1.51

Koncentracija 3 2.18 0.113 2.61 3 2.00 0.136 2.13

Genotip 1 6.05 0.020 1.84 1 4.58 0.040 1.51

Starost 2 33.49 >0.001 2.13 2 33.49 >0.001 1.74


2. a

2. b

2. c

0

10

20

30

40

50

60

70

wt tim01 wt tim01 wt tim01 wt tim01

5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjedna

% m

ušic

a iznad c

rte (

3 c

m,

5sek)

Negativna geotaksija - mužjaci QUE

Ctrl QUE 0,6 mM QUE 3,2 mM QUE 4,8 mM

0

10

20

30

40

50

60

70

% m

ušic

a iznad c

rte (

3 c

m,

5sek)

Negativna geotaksija - mužjaci TYR

Ctrl TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM TYR 17,6 µM

22

2. d

Slika 2. Pozitivan utjecaj polifenola na negativnu geotaksiju. U eksperimentu su

korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)

koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i

17,6 µM (n=50 za svaku skupinu). Kontrolna skupina primala je običnu hranu (n=50).

Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Svaki eksperiment je imao 5

ponavljanja. Rezultati su dobiveni kao prosječna vrijednost broja mušica koje su se popele

preko polovice tubice (3 cm u 5 sekundi).

4.3. Polifenolni utjecaj na ukupnu aktivnost tim mušica

Starenjem dolazi do opadanja lokomotorne aktivnosti. Kako bi vidjeli da li polifenoli

imaju učinak na usporavanje indikatora starenja, pratili smo pomoću DAMS-a

aktivnost tim mušica tretiranih kvercetinom i tirosolom te smo ih uspoređivali s

0

10

20

30

40

50

60

tim01 tim01 tim01 tim01


% m

ušic

a iznad c

rte (

3 c

m, 5

sek)

Negativna geotaksija - ženke QUE


0

10

20

30

40

50

60



% m

ušic

a iznad c

rte (

3 c

m, 5

sek)

Negativna geotaksija - ženke TYR


23

netretiranim kontrolnim skupinama. Željeli smo ustanoviti hoće li polifenoli

povećati lokomotorne aktivnosti kod starijih mušica u odnosnu na kontrolne

skupine.

Rezultati pokazuju da starenjem opada lokomotorna aktivnost kod mužjaka i ženki

te je efekt polifenola uočen kod 6 tjedna starih mušica. Statistička obrada

rezultata, generalnim linearnim modelom, pokazala je da postoji statistička

značajnost za ukupnu aktivnost među spolovima kod mušica tretiranih QUE (F (1,

17)=31.97, p>0.001, SE=27.15) i TYR (F (1, 17)=27.64, p>0.001, SE=27.91),

odnosno pokazano je da su ženke aktivnije od mužjaka. Statistička značajnost

utvrđena je generalnim linearnim modelom za ukupnu aktivnost i kod starosti za

QUE (F (2, 17)=64.85, p>0.001, SE=38.40) i TYR (F (2, 17)=40.23, p>0.001,

SE=39.47), odnosno pokazano je da se aktivnost smanjuje od 2. do 6. tjedna

starenja. Između koncentracija QUE (F (3,17)=1.45, p=0.263, SE=47.03) i TYR

(F (3, 17)=2.10, p=0.138, SE=4.34) nije zabilježena statistička značajnost

generalnim linearnim modelom. Uočen je spolno ovisan efekt te su tako oba

polifenola pokazala povećanje ukupne lokomotorne aktivnosti kod mužjaka, dok je

kod ženki samo tirosol povećao ukupnu lokomotornu aktivnost. Kako je do

najvećeg pozitivnog djelovanja polifenola došlo kod 6 tjedna starih mušica,

možemo pretpostaviti da polifenoli sudjeluju u mehanizmima ubrzavanja

metabolizma te eliminaciji ROS-a koji se nakuplja starenjem.

Ukupna

aktivnost

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 31.97 >0.001 27.15 1 27.64 >0.001 27.91

Koncentracija 3 1.45 0.263 47.03 3 2.10 0.138 48.34

Starost 2 64.85 >0.001 38.40 2 40.23 >0.001 39.47


3. a

24

3. b

Slika 3. Pozitivan utjecaj polifenola na aktivnost kod 6 tjedna starih tim01 mušica.

U eksperimentu su korišteni tim01 mužjaci i ženke kojima je u hranu bio dodan kvercetin

(QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45

µM i 17,6 µM (n=16 za svaku skupinu). Kontrola je primala običnu hranu (n=16). Mjerenja

su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Eksperiment se provodio 5 dana u DAMS-u, a

podaci o aktivnosti prikupljani su u 5 minutnim epizodama. Rezultati prikazuju ukupnu

aktivnost mušica u 24 sata (ukupan broj prelazaka tube u 5 min tijekom 24 sata, prosjek

za 5 dana).

4.4. Utjecaj polifenola na količinu spavanja kod tim mušica

Starenjem dolazi do fragmentacije spavanja kod sisavaca i mušica, no podaci o

utjecaju starenja na ukupnu količinu spavanja nisu u suglasnosti. Iz podataka o

aktivnosti, derivirali smo podatak o ukupnoj količini spavanja tijekom 24 sata.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž tim01 M tim01 Ž


Ukupna a

ktivnost

kro

z 2

4 h

Ukupna aktivnost - mužjaci i ženke QUE


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600



Ukupna a

ktivnost

kro

z 2

4 h

Ukupna aktivnost - mužjaci i ženke TYR


25

Interesiralo nas je da li starenje utječe na promjenu količine spavanja kod

netretiranih mušica te da li polifenoli mijenjaju taj utjecaj.

Rezultati pokazuju postupni porast količine spavanja starenjem (kontrole mužjaka

i ženki), dok TYR smanjuje količinu spavanja kod 6 tjedna starih mužjaka (Slika 4.

b). Također primijećena je spolna razlika u količini spavanja, što potvrđuje nalaze

iz literature. Vrlo velika razlika u količini spavanja primijećena je u 2. tjednu, ali

nije moguće sa sigurnošću reći da li je to posljedica starenja ili artefakta u našem

mjerenju. Generalni linearni model pokazuje da postoji statistička značajna razlika

u spolu kod mušica tretiranih s QUE (F (1, 17)=15.82, p>0.001, SE=48.53) i TYR

(F (1, 17)=13.84, p=0.002, SE=32.75), odnosno kao i u prethodnim rezultatima

mužjaci i ženke se razlikuju u odgovor na polifenole te je tako pokazano da ženke

manje spavaju u usporedbi s mužjacima. Statistički značajna razlika u ukupnoj

količini spavanja je viđena generalnim linearnim modelom kod starenja za skupine

tretirane s QUE (F (2, 17)=3.67, p=0.05, SE=68.63) i TYR (F (2, 17)= 5.74,

p=0.012, SE=46.32), odnosno za oba polifenola viđeno je da količina spavanja

raste od 2. do 6. tjedna. Ne postoji statistički značajna razlika generalnim

linearnim modelom između koncentracija QUE (F (3, 17)=0.31, p=0.814,

SE=84.05) i TYR (F (3, 17)=0.73, p=0.548, SE=56.37). Rezultati pokazuju da

mužjaci spavaju više od ženki, stoga je zanimljiv rezultat kod 6 tjedna starih

mužjaka gdje je tirosol smanjio količinu spavanja na razinu količine spavanja ženki

(Slika 4. a, b). Ovaj rezultat pokazuje da su polifenoli aktivno djelovali kod

mužjaka, dok kod ženki nisu.

Ukupna

količina

spavanja

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 15.82 >0.001 48.53 1 13.84 0.002 32.75

Koncentracija 3 0.31 0.814 84.05 3 0.73 0.548 56.37

Starost 2 3.67 0.050 68.63 2 5.74 0.012 46.32


4. a

26

4. b

Slika 4. Tirosol smanjuje ukupnu količinu spavanja kod 6 tjedna starih mužjaka.

U eksperimentu su korišteni mužjaci i ženke kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)


17,6 (n=16 za svaku skupinu). Kontrola je primala običnu hranu (n=16). Mjerenja su

rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Odustvo kretanja mušica u periodu od 5 minuta

kroz 24 sata je zabilježeno kao spavanje. Eksperiment se provodio 5 dana u DAMS-u

4.5. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa izgladnjivanja

Izgladnjivanje je jedan od načina za izazivanje stresa čime se može zaključiti o

otpornosti, odnosno fiziološkom statusu organizma, pa bi starije mušice trebale

biti manje otporne na stres. U ovom eksperimentu mušice su bile opskrbljene samo

s vodom. Rezultati ovih ispitivanja trebali bi nam pokazati da li polifenoli utječu na

otpornost fiziološkom stresu, odnosno da li mušice tretirane s polifenolom duže

žive u odnosu na kontrole (netretirane). Na slici 5, radi preglednosti prikazana je

0

200

400

600

800

1000

1200



Ukupna k

oličin

a s

pavanja

kro

z

24 h

Ukupna količina spavanja - mužjaci i ženke QUE


0

200

400

600

800

1000

1200



Ukupna k

oličin

a s

pavanja

kro

z

24 h

Ukupna količina spavanja - mužjaci i ženke TYR


27

samo jedna koncentracija QUE i TYR. Radi eksperimentalne pogreške nedostaju

rezultati za kontrolu 6 tjedna starih mužjaka.

Rezultati pokazuju da starenjem dolazi do smanjivanja otpornosti na stres

izgladnjivanja (maksimalno preživljenje 2 tjedna ženke=48 sati, maksimalno

preživljenje 6 tjedna ženke=19 sati). Kod netretiranih mušica uočljiva je spolna

razlika u preživljenju u svim starosnim grupama koja se može djelomično objasniti

većom tjelesnom masom ženki. Kao i u prethodnim eksperimentima neke

koncentracije QUE i TYR nisu imale pozitivne učinke i ponovno je vidljiva razlika u

djelovanju polifenola među spolovima. Kod mužjaka tirosol ima pozitivnije učinke

u odnosu na kvercetin. Kod ženki kvercetin i tirosol imaju podjednake učinke. Kod

ženki pozitivni učinci su zabilježeni tek kod 6 tjedna starih mušica, dok su kod

mužjaka uočene već kod 2 tjedna starih. Statistička analiza, generalni linearni

model, je pokazala statističku značajnost kod spola za mušice tretirane QUE (F (1,

17)=6.55, p=0.02, SE=1.32) dok za TYR ne postoji statistička značajnost (F (1,

17)=1.71, p=0.208, SE=1.81), odnosno koncentracije QUE su bolje djelovale kod

ženki i omogućile duže preživljenje. Generalni linearni model je pokazao da postoji

statistički značajna razlika kod starosti za QUE (F (2, 17)=48.32, p>0.001,

SE=1.87) i TYR (F (2, 17)=19.76, p>0.001, SE=2.57), što znači da se preživljenje

smanjuje od 2. tjedna do 6. tjedna. Generalnim linearnim modelom ne postoji

statistička značajnost među koncentracijama QUE (F (3, 17)=0.34, p=0.800,

SE=2.28) i TYR (F (3, 17)=0.37, p=0.775, SE=3.14). Ovi rezultati upućuju na

zaključak da postoji razlika između spola u djelovanju QUE i TYR jer nisu iste

koncentracije djelotvorne kod mužjaka i ženki. Spolno specifičan odgovor pokazan

je i u dobi kada polifenoli imaju najveći učinak. Kako bi potvrdili ove rezultate,

proveli smo naredni eksperiment o utjecaju polifenola na preživljavanje prilikom

stresa isušivanja.

Izgladnjivanje

maksimalno

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 6.55 0.020 1.32 1 1.71 0.208 1.81

Koncentracija 3 0.34 0.800 2.28 3 0.37 0.775 3.14

28

Starost 2 48.23 >0.001 1.87 2 19.76 >0.001 2.57


tim01, MUŽJACI

IZGLADNJIVANJE

tim01, ŽENKE

IZGLADNJIVANJE

2 t

jedna s

tare

4 t

jedna s

tare

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50 60

% ž

ivih

mušic

a

Sati

Kontrola QUE 0,6 mM TYR 7,6 µM

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50%

živ

ih m

ušic

aSati

Kontrola QUE 3,2 mM TYR 12,45 uM

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50 60

% ž

ivih

mušic

a

SatiKontrola QUE 3,2 mM TYR 17,6 µM

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50

% ž

ivih

mušic

a

Sati


29

6 t

jedna s

tare

Slika 5. Spolna ovisnost između koncetracija polifenola prilikom stresa

izgladnjivanja . U eksperimentu su korišteni mužjaci (lijevi stupac) i ženke (desni stupac)

kojima je u hranu dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol

(TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=16). Kontrola je primala običnu hranu

(n=16). Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Aktivnost mušica praćena

je u DAMS-u do uginuća.

4.6. Učinak polifenola kod tim mušica prilikom stresa isušivanja

Isušivanje je test koji ispituje kako se mušice nose sa stresom u toku starenja. U

ovom testu mušica nije opskrbljena s vodom i hranom. Na slici 6 prikazani su

podaci samo za kontrolu te po jednu koncentraciju QUE i TYR radi preglednosti.

Radi eksperimentalne pogreške nedostaju rezultati za kontrolu 6 tjedna starih

mužjaka. Na temelju prethodnih rezultata dobivenih iz eksperimenta

izgladnjivanjem naša hipoteza je bila da će dobiveni rezultati u ovom eksperimentu

biti slični.

Kod netretiranih mušica rezultati pokazuju da starenje ima manji utjecaj na

preživljenje isušivanjem, nego prethodno izgladnjivanjem. Unatoč razlikama u

tjelesnoj masi između mužjaka i ženki, kod netretiranih mušica ne postoji značajna

razlika među spolovima ili kao posljedica starenja. Međutim, kao i u prethodnim

rezultatima i uočili smo spolnu razliku djelovanja polifenola koja je bila

najizraženija kod 4 tjedna starih ženki gdje je zabilježen pozitivan učinak

koncentracije QUE 4,8 mM. Kod 6 tjedna starih ženki zabilježen je negativni utjecaj

koncentracija QUE i TYR. Statistička analiza, generalni linearni model, pokazuje

značajnu razliku kod starosti za QUE (F (2, 17)=6.34, p=0.009, SE=1.39) i TYR (F

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50 60

% ž

ivih

mušic

a

Sati

Kontrola QUE 0,6 mM TYR 12,45 uM

0%

50%

100%

0 10 20 30 40 50

% ž

ivih

mušic

a

Sati


30

(2, 17)=10.18, p=0.001, SE=1.31), odnosno za oba polifenola je vidljivo

smanjenje preživljenja od 2. tjedna do 6. tjedna starenja. Generalnim linearnim

modelom ne postoji statistički značajna razlika za spol kod koncentracija QUE (F

(1, 17)=0.72, p=0.409, SE=0.99) i TYR (F (1, 17)=1.60, p=0.223, SE=0.92) niti

između koncentracija QUE (F (3, 17)=0.48, p=0.700, SE=1.17) i TYR (F (3,

17)=1.12, p=0.367, SE=1.6). Ovi rezultati ukazuju na to da postoje koncentracije

kvercetina i tirosola koje imaju pozitivne učinke i omogućuju Drosophili da bude

duže otporna na fiziološki stres.

Isušivanje

maksimalno

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.72 0.409 0.99 1 1.60 0.223 0.92

Koncentracija 3 0.48 0.700 1.17 3 1.12 0.367 1.60

Starost 2 6.34 0.009 1.39 2 10.18 0.001 1.31


tim01, MUŽJACI ISUŠIVANJE tim01, ŽENKE ISUŠIVANJE

2 t

jedna s

tare

0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mušic

a

Sati


0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mušic

a

Sati


31

4 t

jedna s

tare

6 t

jedna s

tare

Slika 6. Spolna ovisnost na otpornost stresa isušivanja ovisna je o polifenolima.

U eksperimentu su korišteni mužjaci (lijevi stupac) i ženke (desni stupac) kojima je u hranu

dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR)

koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=16). Kontrola je primala običnu hranu (n=16).

Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Eksperiment je izvođen u DAMS-u i

praćen je dok sve mušice nisu uginule.

4.7. Utjecaj polifenola na stvaranje AGE produkata kod wt i tim mušica

AGE je engleska skraćenica za Advanced Glycosylation Endproducts, a to su

produkti nastali biokemijskim procesima iz glukoze. Oni se mogu vezati na

proteine, DNK ili lipide te tako dovesti do njihove nefunkcionalnosti koji onda

utječu na procese starenja. Ovim eksperimentom željeli smo ustanoviti da li

polifenoli utječu na mehanizam nastanka AGE-a i da li s njima možemo usporiti

0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mu

šica

Sati


0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mušic

a

Sati


0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mušic

a

Sati


0%

50%

100%

0 10 20 30

% ž

ivih

mušic

a

Sati

Kontrola QUE 0,6 mM

TYR 7,6 µM TYR 12,45 µM

32

procese starenja. Naša hipoteza bi bila da promjena u nastanku AGE produkata

kod mušica tretiranih s polifenolima u odnosu na kontrolu (netretirane) objašnjava

da postoji interakcija polifenola s nastankom AGE produkata.

Starenjem je vidljiv blagi porast nastanka AGE produkata kod wt mužjaka te je

statistička analiza t-testom pokazala da postoji statistički značajna razlika između

4 tjedna starih kontrola i 6 tjedna. Kod tim mužjaka i ženki nije zabilježena

promjena u nastanku AGE produkata starenjem. Generalnim linearnim modelom

pokazana je značajna razlika u nastanku AGE produkata između wt i tim mužjaka

za QUE (F (1, 28)=4.92, p=0.035, SE=0.06) i TYR (F (1, 28)=10.07, p=0.004,

SE=0.06), odnosno pokazano je da kod wt mušica nastaje više AGE produkata.

Rezultati pokazuju da su kvercetin i tirosol smanjili nastanak AGE produkta kod wt

6 tjedna starih mužjaka. Kod 4 tjedna starih tim mužjaka zabilježen je negativan

učinak kvercetina (Slika 7. a, b). Iako neke koncentracije imaju blagi učinak

generalnim linearnim modelom one nisu statistički značajne niti za QUE (F

(3,28)=1.45, p=0.250, SE=0.008) niti za TYR (F (3, 28)=2.91, p=0.052,

SE=0.08), dakle pokazano je da pojedina koncentracija nema značajnog učinka na

smanjenje ukupnog nastanka AGE produkata. Generalnim linearnim modelom

utvrđeno je da ne postoji statistički značajna razlika među spolovima za QUE (F

(1, 28)=0.84, p=0.368, SE=0.06) i TYR (F (1, 28)=0.82, p=0.372, SE=0.06), ne

postoji razlika u nastanku AGE produkata između mužjaka i ženki. Iz rezultata

možemo zaključiti da nastanak AGE produkata raste starenjem kod wt mušica, ali

ne i kod tim. Vidimo da neke koncentracije QUE i TYR imaju pozitivne efekte na

smanjenje količine AGE produkata kod wt dok kod tim mušica nemaju efekte ili su

ti efekti negativni (dovode do povećanja). Kod ženki koncentracije QUE i TYR

uglavnom nisu imale efekte jer količina nastalog AGE ionako nije rasla starenjem,

a zabilježeno je da su neke koncentracije možda i pogoršale, tj. povećale nastanak

AGE produkata.

AGE produkti

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.84 0.368 0.06 1 0.82 0.372 0.06

Koncentracija 3 1.45 0.250 0.08 3 2.91 0.052 0.08

Starost 2 1.55 0.230 0.07 2 2.19 0.131 0.07

33

Genotip 1 4.92 0.035 0.06 1 10.07 0.004 0.06


7.a

7.b

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5



Rela

tivni in

tezitet fluore

scencije

AGE - mužjaci QUE


0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5



Rela

tivni in

tezitet fluore

scencije

AGE - mužjaci TYR


34

7.c

7.d

Slika 7. Polifenoli utječu na smanjivanje AGE produkata kod wt, ali ne tim mušica.

U eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan

kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosolom (TYR) koncentracija

7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=5). Kontrola je primala običnu hranu (n=5). Mjerenja su

rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Iz ekstrakta 5 mušica za pojedini uzorak mjerila

se fluorescencija (ekscitacija 365 nm te emisija 440 nm). Tretirana i netretirana skupina

sveukupno je obuhvaćala 8 uzoraka, te je svaki od tih uzoraka mjeren u triplikatu. Grafovi

prikazuju vrijednosti relativnog inteziteta fluorescencije.

4.8. Utjecaj polifenola na katalaznu aktivnost kod wt i tim mušica

Katalaza je bitan enzim koji razlaže molekulu H2O2 na molekulu H20 i O2. Njena

aktivnost starenjem prati oblik zvona, aktivnost raste za 50% prva tri tjedna u

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6



Rela

tivni in

tezitet fluore

scencije

AGE - ženke QUE


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6



Rela

tivni in

tezitet fluore

scencije

AGE - ženke TYR


35

usporedbi s mladim mušicama, a u kasnijoj životnoj dobi dolazi do naglog pada

(47). Nivo aktivnosti katalaze jako starih mušica je sličan onome kod jako mladih

mušica. Mi smo testirali da li polifenoli nadopunjuju aktivnost katalaze te tako

usporavaju starenje. Naša hipoteza bi bila da promjena u aktivnosti CAT kod

mušica tretiranih s polifenolima u odnosu na kontrolu (netretirane) objašnjava da

postoji interakcija polifenola s aktivnošću katalaze.

Na temelju literaturnog podatka o aktivnosti katalaze, možemo vidjeti da kontrola

wt prati literaturne rezultate. Kod wt kontrola vidljiva je slična aktivnost katalaze

kod 5 dana starih mušica i 6 tjedna starih mušica. Kod tim mužjaka i ženki

zabilježen je porast u aktivnosti katalaze starenjem. Iako se na grafovima mogu

uočiti razlike među starosnim skupinama, one nisu generalnim linearnim modelom

statistički značajne za QUE (F (2, 28)=0.30, p=0.741, SE=0.05) i TYR (F (2,

28)=1.47, p=0.235, SE=0.04), odnosno pokazano je da ne postoji statistički

značajna razlika između aktivnosti katalaze za 2 tjedna i 6 tjedna starosti.

Statistička analiza t-testom dala je iste rezultate, ne postoji statistički značajna

razlika među starosti. Statističkom analizom, generalnim linearnim modelom,

pokazano je da postoji statistički značajna razlika između koncentracija QUE (F (3,

28)=10.58, p>0.001, SE=0.06) i TYR (F (3, 28)= 8.22, p>0.001, SE=0.06),

odnosno koncentracije QUE i TYR značajno su smanjile aktivnost katalaze u

usporedbi s kontrolom. Kod tim mužjaka i ženki 6 tjedna starih vidljivo je da su

sve koncentracije QUE i TYR smanjile aktivnost katalaze. Za wt mušice starih 6

tjedna ne postoji jasan odgovor polifenola na aktivnost katalaze jer su neke

koncentracije QUE i TYR dovele do smanjenja dok su neke povećale aktivnost

katalaze. Iako promjene u aktivnosti katalaze uslijed starenja nisu bile u

očekivanom smjeru, utjecaj polifenola na aktivnost katalaze je vidljiv. Polifenoli su

doveli do smanjenja aktivnosti katalaze. Da bi ispitali utjecaj polifenola na ostale

enzime koji sudjeluju u eliminaciji ROS-a u idućem eksperimentu mjeren je

postotak inhibicije SOD.

Aktivnost

CAT

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.42 0.524 0.05 1 1.47 0.235 0.04

Koncentracija 3 10.58 >0.001 0.06 3 8.22 >0.001 0.06

36

Starost 2 0.30 0.741 0.05 2 0.68 0.513 0.05

Genotip 1 0.92 0.346 0.05 1 0.00 0.993 0.04


8. a

8. b

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4



Pro

mje

na O

D240/m

inuta

/0,1

mg

Aktivnost katalaze - mužjaci QUE


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4



Pro

mje

na O

D240/m

inuta

/0,1

mg

Aktivnost katalaze - mužjaci TYR


37

8. c

8. d

Slika 8. Utjecaj polifenola na smanjenje aktivnosti katalaze. U eksperimentu su

korišteni mužjaci (a i b) te ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE)


17,6 (n=5). Netretirana skupina primala je običnu hranu (n=5). Mjerenja su rađena za

mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Rezultati pokazuju smanjenje optičke gustoće pri valnoj

duljini od 240 nm u vremenskom periodu od 5 minuta. Katalazna aktivnost se prikazuje

kao promjena u optičkoj gustoći pri valnoj duljini od 240 nm (OD240) po minuti po jednom

mikrogramu dobivenog ekstrakta cijele mušice.

4.9. Utjecaj polifenola na postotak inhibicije superoksid dismutaze kod wt

i tim mušica

Jedan od bitnih antioksidativnih enzima je superoksid dismutaza (SOD). Ona je

zaslužna za dismutaciju superoksidnog aniona u vodikov peroksid i molekulu

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6



Pro

mje

na O

D240/m

inuta

/0,1

mg

Aktivnost katalaze - ženke QUE


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6


5 dana stare 2 tjedna 4 tjedna 6 tjednaPro

mje

na O

D240/m

inuta

/0,1

mg

Aktivnost katalaze - ženke TYR


38

kisika. U prijašnjim radovima pokazano je kako aktivnost SOD starenjem raste

(47). Iz rezultata o utjecaju polifenola na aktivnosti katalaze, postavlja se pitanje

na koji način polifenol utječu na SOD. Naša hipoteza bi bila da promjena aktivnosti

SOD kod tretiranih u odnosu na netretirane znači da postoji interakcija polifenola

s aktivnošću SOD.

Literaturni rezultati pokazali su da starenjem dolazi do porasta aktivnosti SOD što

se može vidjeti i na rezultatima kontrola za wt. Kod tim mužjaka i ženki taj trend

za kontrole nije jasno uočen. Generalnim linearnim modelom pokazano da ne

postoji statistički značajna razlika između starosti za QUE (F (2, 28)=2.68,

p=0.086, SE=0.97) i TYR (F (2, 28)=0.93, p=0.406, SE=0.88), odnosno iako je

vidljiv trend rasta aktivnosti katalaze kod wt mušica on nije statistički značajan te

se ne mijenja značajno od 2. tjedna do 6. tjedna starosti. Kod 6 tjedna starih wt

mušica uočena je značajna razlika u aktivnosti SOD između kontrola i mušica

tretiranih QUE te je t-testom utvrđeno da je koncentracija QUE 4,8 mM značajno

smanjila aktivnost SOD u usporedbi s kontrolom. Kod 6 tjedna starih tim mužjaka

uočena je razlika u aktivnosti SOD između kontrola i mušica tretiranih QUE. Iako

t-testom nije potvrđena značajnost pri djelovanju QUE kod 6 tjedna starih tim

mužjaka, vidi se da su oni jako povećali aktivnost u usporedbi s kontrolom. Kod

ženki isto uočavamo veće promjene pod utjecajem QUE, ali nisu značajne. Možemo

vidjeti da TYR nije pokazao značajne efekte na wt i tim mužjake te tim ženke.

Generalnim linearnim modelom pokazano je da postoji statistički značajna razlika

između genotipa za QUE (F (1,28)=4.78, p=0.037, SE=0.84) dok za TYR nije

zabilježena statistički značajna razlika (F (1, 28)=0.158, p=0.703, SE=0.76) što

se i uočava kod 6 tjedna starih mušica. T-testom je također potvrđena statistički

značajna razlika u djelovanju kvercetina između 6 tjedna starih wt i tim mušica. Iz

rezultata možemo zaključiti da se starenjem aktivnost SOD ne mijenja značajno,

ali kvercetin pokazuje različite efekte na 6 tjedna starim mužjacima wt i tim

mušica. Tirosol nije pokazao značajnije efekte. Također možemo vidjeti da je

kvercetin slične efekte pokazao između tim mužjaka i ženki.

Aktivnost

SOD

QUE TYR

Stupnjevi

slobode F p SE

Stupnjevi

slobode F P SE

Spol 1 0.92 0.345 0.84 1 0.28 0.603 0.76

Koncentracija 3 1.13 0.353 1.19 3 0.36 0.783 1.07

39

Starost 2 2.68 0.086 0.97 2 0.93 0.406 0.88

Genotip 1 4.79 0.037 0.84 1 0.15 0.703 0.76


9. a

9. b

0

2

4

6

8

10

12

14

16



% inhib

icije/0

,1 m

g

% inhibicije SOD - mužjaci QUE


0

2

4

6

8

10

12

14

16



% inhib

icije/0

,1 m

g

% inhibicije SOD - mužjaci TYR


40

9. c

9. d

Slika 9. Utjecaj QUE ovisi o genotipu. U eksperimentu su korišteni mužjaci (a i b) te

ženke (c i d) kojima je u hranu bio dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM

i 4,8 mM te tirosol (TYR) koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 (n=5). Kontrola je primala

običnu hranu (n=5). Mjerenja su rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. Promjena u

optičkoj gustoći pri valnoj duljini od 406 nm mjerena je tokom 10 minuta i potom

uspoređena s kontrolom (mjerenje rađeno prije dodatka ekstrakta mušica). Aktivnost SOD

se mjerila kao postotak inhibicije oksidacije kvercetina. Rezultati su bili linearno ovisni o

vremenu i količini ekstrakta.

4.10. Utjecaj polifenola na prosječnu težinu, mono-di-tri gliceride i

reduktivne šećere

Da bi ustanovili da li polifenoli utječu na promjenu tjelesne mase te stoga mušice

duže žive i više su otporne na stres, proveli smo mjerenja: prosječne težine,

0

5

10

15

20



% inhib

icije/0

,1 m

g

% inhibicije SOD - ženke QUE


0

5

10

15

20



% inhib

icije/0

,1 m

g

% inhibicije SOD - ženke TYR


41

ukupne količine mono-di-tri glicerida i ukupne količine reduktivnih šećera. Razlog

tome bi bio da zbog veće količine lipida koji su izvor energije, kao i šećera koji

imaju sposobnost navlačenja molekula vode na sebe mušica može duže preživjeti.

Ovim eksperimentima željeli smo vidjeti da li tretirane mušice s polifenolima

pokazuju veće vrijednosti prosječne težine, količine mono-di-tri glicerida te

reduktivnih šećera u odnosu na kontrole.

Potvrdili smo statističkom analizom, generalnim linearnim modelom, da postoji

statistički značajna razlika između spola, odnosno pokazano je da mužjaci imaju

manju prosječnu težinu u usporedbi sa ženkama (QUE (F (1, 28)=34.35, p>0.001,

SE=0.03) i TYR (F (1, 28)=12.91, p=0.001, SE=0.04)). Generalnim linearnim

modelom pokazana je statistički značajna razlika u starosti kod mušica tretiranih

s kvercetinom, odnosno pokazano je smanjenje prosječne težine u rasponu od 2.

tjedna do 6. tjedna (QUE (F (2, 28)=5.01, p=0.014, SE=0.03), za TYR nije

pokazana statistička značajnost (F (2, 28)=1.71, p=0.199, SE=0.04)). Generalnim

linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika u količini mono-di-tri

glicerida starenjem, odnosno pokazano je da 6 tjedna stare mušice imaju manju

količinu mono-di-tri glicerida u usporedbi s 2 tjedna starim mušicama (QUE (F (2,

17)=48.88, p>0.001, SE=0.00) i TYR (F (2, 17)=64.51, p>0.001, SE=0.00)).

Generalni linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika u količini

reduktivnih šećera starenjem, odnosno rezultati su pokazali da mušice stare 2

tjedna imaju veću količinu šećera u usporedbi s onim starim 6 tjedna (QUE (F (2,

17)=7.07, p=0.006, SE=6.09) i TYR (F (2, 17)=5.23, p=0.017, SE=5.17)).

Generalnim linearnim modelom pokazana je statistički značajna razlika između

spola za mušice tretirane kvercetinom, mužjaci su pokazali veću količinu

reduktivnih šećera u usporedbi sa ženkama (QUE (F (1, 17)=7.65, p=0.013,

SE=4.31), za TYR ne postoji statistička značajnost (F (1, 17)=0.00, p=0.986,

SE=3.65)). Sve mjerene vrijednosti pokazuju razlike među spolom i starosti. Za

spol je očigledno da mužjaci imaju manju prosječnu težinu jer su naočigled manji.

Rezultati pokazuju prvotnu teoriju da starenjem sve ove vrijednosti opadaju. Ovi

rezultati pokazuju da polifenoli nemaju značajnog utjecaja na promjenu prosječne

težine, ukupne količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera, što bi nas uputilo

na zaključak da pozitivni efekti dobiveni za produženje života i sposobnosti

penjanja nisu zbog fizički jačih i otpornijih mušica, nego zato što su polifenoli doveli

do promjena u metabolizmu mušica što ih je u konačnici učinilo otpornijima.

42

10. a

10. b

Tablica 10. a) QUE i b) TYR nemaju značajni utjecaj na prosječnu težinu, mono-

di-tri gliceride i reduktivne šećere. U eksperimentu su korišteni mužjaci i ženke kojima

je hranu bio dodan kvercetin (QUE) koncentracija 0,6 mM, 3,2 mM i 4,8 mM te tirosol (TYR)

koncentracija 7,6 µM, 12,45 µM i 17,6 µM. Kontrola je primala običnu hranu. Mjerenja su

rađena za mušice starosti 2, 4 i 6 tjedna. U eksperimentu mjerenja prosječne težine

korišteno je 11 mušica, a za mono-di-tri gliceride i reduktivne šećere korišten je ekstrakt

43

1 mušice. Prosječna težina i mono-di-tri gliceridi su mjereni prikazana je u miligramima

(mg), dok je količina reduktivnih šećera u mikrogramima (µg).

Tablica 10. c) Statistička analiza generalnim linearnim modelom

4.11. Tablica sa statističkim značajnostima

Generalni linearni model je statistička analiza koji se bazira na ANOVA postupku u

kojemu se izračunavanje statističkih značajnosti vrši pomoću najmanje regresije

kvadrata (eng. Least squares regression) te se pomoću ove analize opisuje

statistički odnos između jednog ili više prediktora (kategoričke varijable) za jednu

kontinuiranu varijablu. Za statistički značajne vrijednosti uzimamo podatke pri

kojima je srednja vrijednost jedne kategoričke varijable izvan 95% intervala druge

kategoričke varijable. Tablica prikazuje statističke značajnosti za sva rađena

mjerenja. U tablici nedostaju podaci za genotip koje će se nadopuniti uz pomoć

narednih eksperimenata na wt mušicama. Možemo vidjeti da se najveća statistička

povezanost odnosi na starenje što upućuje na to da naša mjerenja najviše ovise o

starosti mušica. Najmanja količina statističke značajnosti vidljiva je za

koncentracije. Koncentracije nisu bile značajne u većini slučajeva zato što se

njihove dobivene vrijednosti unutar skupina nisu značajno razlikovale. Tablica je

prikazana zbog preglednijeg i bržeg snalaženja među statističkim podacima.

44

Tablica 11. Statistička značajnost eksperimenata najviše ovisi o starosti. Prikaz

statističke analize podataka korištenjem generalnog linearnog modela. Oznaka plusa

prikazuje statistički značajne podatke, dok minus označava podatke koji nisu statistički

značajni.

45

5. Rasprava

Do sada su samo postojala istraživanja utjecaja kvercetina i tirosola na produženje

maksimalnog životnog vijeka kod drugih organizma kao što je Caenorhabditis

elegans (39,41). Naše istraživanje je prvo istraživanje koje ispituje utjecaje

kvercetina i tirosola kod cirkadijalnog mutanta, u ovom slučaju tim01 mutanta. Tim

mutanta smo koristili jer je u prijašnjim ispitivanjima pokazano da cirkadijalni per

mutanti brže stare, stoga smo željeli ispitati na koji način se ponašaju mušice s

tim mutacijom pošto je tim gen dimerizacijski partner per gena. U našim

rezultatima polifenoli, kvercetin i tirosol, pokazali su djelotvorne učinke na

produljenje dužine života kod mužjaka i ženki Drosophila melanogaster s timeless

mutacijom. Učinci su viđeni kod mužjaka pri koncentraciji QUE 3,2 mM i TYR 17,6

µM, a kod ženki pri koncentraciji TYR 12,45 µM (Slika 1. a-d). Rezultati su pokazali

da su mehanizmi djelovanja koncentracija polifenola na produženje života

uvjetovani spolnim razlikama jer vidimo da su različite koncentracije imale učinke

kod mužjaka i ženki. Naši rezultati su pokazali da polifenoli imaju pozitivan utjecaj

na mehanizme starenja te vjerojatno dolaze u doticaj s genima odgovornim za

starenje. Daljnjim ispitivanjima trebala bi se specificirati optimalna doza za

preživljenje jer kao što su rezultati pokazali nisu sve doze imale pozitivne učinke.

Slična istraživanja koja su provedena s resveratrolom i jabučnim polifenolima

također su pokazala pozitivne učinke na produljenje dužine životnog vijeka kod

Drosophile melanogaster (25,36).

Negativna geotaksija je eksperiment kojim se može mjeriti motorička sposobnost

okomitog penjanja Drosophile uz stijenku tube. Ovaj test daje direktnu povezanost

neurodegeneracije te smanjenje lokomotorne aktivnosti mušice kao indikatore

starenja. Naši rezultati pokazuju smanjenje postotka okomitog penjanja starenjem

kod wt i tim01 mušica. Rezultati su pokazali da tim01 mušice imaju veću sposobnost

penjanja u odnosu na wt. Pokazali smo da tirosolom tretirani mužjaci imaju veću

sposobnost penjanja u odnosu na ženke. Jedno od istraživanja testiralo je

neuroprotektivnu mogućnost kvercetina te su pokazali u mišjim stanicama da

kvercetin utječe na povećanje PON2 enzima koji je bitan za zaštitu od

neurotoksičnosti koja je uzorkovana oksidativnim stresom (38). Na osnovu

proteklih istraživanja mi smo pretpostavili da se starenjem povećava

neurodegeneracija koja se može vidjeti u obliku smanjene sposobnosti penjanja

te smo isto tako pretpostavili da polifenoli mogu imati blagotvorne učinke na njeno

46

smanjenje. Naši rezultati su pokazali povećanje sposobnosti okomitog penjanja

tretmanom s tirosolom i kvercetinom. Mi smo u našim istraživanju ispitivali utjecaj

kvercetina i tirosola na smanjenje neurodegeneracije i to smo pratili testom

negativne geotaksije. Pokazali smo da mušice tretirane s kvercetinom i tirosolom

imaju veću sposobnost okomitog penjanja u odnosu na netretirane mušice. U

jednom istraživanju pokazano je da su čisti polifenoli poput galne kiseline,

kumarinske kiseline, kafeinske kiseline, epikatehina i drugih doveli do oporavka i

poboljšane sposobnosti penjanja kod mušica koje su tretirane s parakvatom (48).

Mušice tretirane parakvatom model su za Parkinsonovu bolest,

neurodegenerativna bolest koju karakterizira degeneracija dopaminergičkih

neurona, smanjenje dopaminskog neurotransmitera i povećani nivo i nakupljanje

željeza u organizmu. U ovom istraživanju su osim polifenola koristili i lijek koji se

koristi kod pacijenata koji boluju od te neurodegenerativne bolesti. Lijek se sastoji

od 3 aktivne supstance koje su bitne u metabolizmu dopamina: levodopa,

carbidopa i entcapone, a oni su u istraživanju pokazali da su polifenoli bolje

povratili sposobnost penjanja u usporedbi s lijekom. Zanimljivost je da su ove tri

komponente lijeka strukturalno slične polifenolima. Ovim istraživanjem su dali

naslutiti da polifenoli imaju utjecaj na metabolizam dopamina, no ovakva saznanja

trebala bi se temeljitije ispitati. Za polifenole pretpostavljamo da su bili aktivni u

odstranjivanju ROS-ova koji se nakupljaju u organizmu i koji su odgovorni za

starenje ili su doveli do poticanja aktivacija egzogenih antioksidansa te će u

budućnosti biti od interesa ispitati da li kvercetin i tirosol djeluju na dopamin kod

tim01 mušica.

Starenjem dolazi do opadanja lokomotorne aktivnosti, te do povećane

fragmentacije spavanja. Za mušice se zna da postoji razlika u njihovoj aktivnosti i

spavanju između spola (49). Ženke su vjerojatno aktivnije zbog njihove potrage

za hranom i mjesta za lijeganje jaja, dok mužjaci mogu više vremena provoditi u

očuvanju energije (50). U našim rezultatima jasno je vidljiva razlika između spola

te smo pokazali da ženke imaju veću ukupnu aktivnost i manju ukupnu količinu

spavanja (Slika 3 i 4). Jedno od istraživanja je smatralo da zbog starenja dolazi

do povećanja oksidativnog stresa koje onda utječe na cikluse aktivnosti/spavanja

(49). Njihova teorija je da je ekspresija cirkadijalnih gena pod efektima parakvata

i starenja što onda upućuje da su mehanizmi odgovorni za aktivnost i spavanje

jednaki kod starenja i oksidativnog stresa. U našim istraživanjima koristili smo

47

polifenole kvercetin i tirosol te rezultati nisu pokazali značajno povećanje

aktivnost/smanjenje količine spavanja kod tretirane i netretirane skupine. Jedine

veće razlike prikazane su kod 6 tjedna starih mušica kod kojih je tirosol povećao

aktivnost te smanjio ukupnu količinu spavanja što pokazuje da polifenoli imaju

određene efekte.

Masno tkivo ima veliku ulogu u život mušica. Njegova funkcija je skladištenje i

otpuštanje energije ovisno o potrebama mušica. Metabolizam lipida je esencijalan

za rast i razmnožavanje te osigurava energiju tijekom dužih perioda izgladnjivanja.

Dok lipidi mogu utjecati na rezultate izgladnjivanja, količina šećera u tkivima može

utjecati na rezultate isušivanja zato što šećeri imaju puno hidroksilnih grupa i onda

se voda s lakoćom veže na njih. Stoga bi veće količine lipida i šećera kao i težina

imale važan utjecaj na preživljavanje mušica prilikom izlaganja fiziološkom stresu.

U našim rezultatima vidimo da su netretirane ženke preživjele 11 dana više u

usporedbi s mužjacima (Slika 1. a-d). U rezultatima je isto tako viđena spolna

razlika u preživljenju prilikom izgladnjivanja i isušivanja (Slika 5 i 6). Isto tako u

našim rezultatima pokazano je da ženke imaju veću tjelesnu masu u usporedbi s

mužjacima, dok se količina mono-di-tri glicerida ne mijenja (Tablica 10. a i b). U

našem istraživanju pokazano je da netretirane muške i ženske mušice starenjem

slabije podnose stresove izgladnjivanja i isušivanja (Slika 5 i 6) te isto tako dolazi

do smanjenja prosječne težine te količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera

(Tablica 10. a, b). U slučaju da u našem istraživanju vidimo da su polifenoli imali

utjecaje na fizičke mogućnosti mušica i tako omogućili duže preživljenje to bi vidjeli

porastom mase tretiranih mušica kao i količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih

šećera. Mi smo pokazali da polifenoli imaju pozitivne učinke na preživljenje kod

izgladnjivanja i isušivanja, no nismo pokazali povezanost između preživljenja pod

utjecajem stresova te težine i količine mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera

kod mušica koje su tretirane s polifenolima. Iz ovih rezultata zaključujemo da

polifenoli nisu imali utjecaj na povećanje prosječne težine, ukupne količine mono-

di-tri glicerida i reduktivnih šećera što bi značilo da mušicama nije bilo potrebno

da budu fizički jače kako bi uspjele preživjeti. Pozitivni učinci polifenola na

preživljenje ukazuju na to da su polifenoli došli u interakciju na drugačiji način,

vjerojatno procesima u smanjenju nakupljanja oksidativnih oštećenja koji su bitan

faktor u procesima starenja.

48

Jedan od biomarkera starenja koji se može mjeriti je AGE, produkti nastali iz

glukoze koji dolaze u interakciju s DNK, lipidima i proteinima te dovode do njihovog

oštećenja. Naši rezultati su pokazali da kod mušica divljeg tipa dolazi do porasta

AGE-a prilikom starenja dok kod muških i ženskih tim mušica to nije slučaj. Ovi

rezultati mogli bi ukazivati da cirkadijalni sat te u ovom slučaju timeless gen ima

efekt za nakupljanje AGE-a i za njegov nastanak. Možemo napraviti korelaciju

između AGE akumulacije i testa negativne geotaksije gdje vidimo da je AGE

akumulacija kod 4 i 6 tjedna starih mužjaka bila manja kod tim mušica u odnosu

na wt, dok je njihova sposobnost penjanja bila veća u odnosu na wt. Na ovom

primjeru mogli bi reći da je AGE dobar biomarker starosti no trebale bi se provesti

i daljnje usporedbe. Točan mehanizam na koji način tim gen utječe nije poznat te

bi se trebala napraviti daljnja ispitivanja. Također naši rezultati su pokazali da je

korištenje polifenola dovelo do smanjenje nastanka AGE produkta kod wt mušica,

dok kod tim mušica taj efekt nije zabilježen. Jedan od zaključaka bi mogao biti da

polifenoli i tim gen djeluju na slične procese, odnosno možda zbog mutacije u tim

genu dolazi do sprječavanja akumulacije AGE produkata i onda polifenoli nemaju

ulogu u njihovom smanjenju. Ove zaključke trebalo bi detaljnije ispitati i

nadopuniti s podacima koji nedostaju.

U našem istraživanju željeli smo vidjeti da li kvercetin i tirosol imaju pozitivne

učinke u smanjenju oksidativnog oštećenja te da li na neki način nadopunjuju

uloge SOD i CAT kod Drosophile melanogaster. U literaturi se navodi da aktivnost

katalaze starenjem raste kroz 3 tjedna do nekih 50% u usporedbi s mladim

mušicama i nakon toga dolazi do naglog pada aktivnosti katalaze (47). Također je

u istoj studiji pokazano da jako mlade mušice i jako stare mušice imaju približne

vrijednosti aktivnosti katalaze. Rezultati iz literature rađeni su na mužjacima tipa

Oregon R. Naši rezultati za Canton S wt potvrđuju rezultate iz literature te se može

vidjeti da aktivnost katalaze raste starenjem od 5 dana starih do 4. tjedna starosti

kada dolazi do pada aktivnost. Aktivnost katalaze se smanjivala do 6. tjedna

starosti kada su vrijednosti bile slične kao kod 5 dana starih mušica (Slika 8. a, b).

Znači, naši rezultati su u potpunosti potvrdili promjene u aktivnosti katalaze

tijekom starenja. Naše novo otkriće je da aktivnost katalaze kod tim mutanta raste

kroz periode starenja te se razlikuje od aktivnosti katalaze wt mušica (Slika 8. a-

d). Postoji mogućnost da cirkadijalni gen timeless je povezan s mehanizmima

bitnim za normalnu aktivnost katalaze te njegov nedostatak dovodi do povećanja

49

aktivnosti kada bi se ona u usporedbi s wt trebala smanjivati. Ovi rezultati ukazuju

da tim mutanti ne pokazuju normalne procese starenja. Za ženke nemamo

literaturne podatke te ne možemo usporediti dobivene rezultate. Ono što možemo

vidjeti kod tim ženki je da kao i kod mužjaka aktivnost katalaze raste starenjem.

Našim istraživanjem pokazali smo da kvercetin i tirosol dovode do smanjenja

aktivnosti katalaze kod wt i tim mušica u usporedbi s netretiranim mušicama. Zbog

pokazanih promjena možemo vidjeti da polifenoli dolaze u interakciju s katalazom,

ali još ne možemo tvrditi koji je točan mehanizam njihovih djelovanja.

Literaturni podaci za SOD pokazali su da starenjem aktivnost SOD linearno raste

(47). U literaturi je pokazano da se aktivnost SOD kod starih mušica poveća za

50% uspoređujući s mladim mušicama. U našim rezultatima možemo vidjeti kod

wt mušica da SOD aktivnost raste od jako mladih prema jako starim mušicama i

da se aktivnost povećala za 50% i više, čime smo u potpunosti potvrdili literaturne

navode. Kod tim mužjaka je viđen porast aktivnosti SOD do 4 tjedna starosti, no

onda vidimo značajan pad u vrijednosti kod 6 tjedna starih mušica u usporedbi s

wt gdje je u toj starosnoj dobi najveća aktivnost SOD. Iz dobivenih rezultata

možemo zaključiti da timeless gen ima utjecaj na mehanizme antioksidativnih

enzima, ali još ne znamo točan mehanizam njegovog djelovanja. Starenjem dolazi

do povećanja oksidativnog stresa i stoga kod wt mušica aktivnost SOD raste jer je

veća potreba organizma za njenim djelovanjem. Kod tim mušica vidimo drugačiji

slučaj te dolazi do smanjenja SOD aktivnosti što bi moglo ukazati da je oksidativni

stres puno izraženiji i da dovodi do oštećenja SOD enzima i zato se njegova

aktivnost smanjuje. Naši rezultati su pokazali veliku razliku u djelovanju polifenola

kod 6 tjedna starih mušica te je tako kod 6 tjedna starih wt mužjaka kvercetin

doveo do smanjenja aktivnosti SOD, dok je kod tim mužjaka porasla aktivnosti

SOD. Ove razlike nas navode na zaključke da polifenoli imaju doticaje s aktivnosti

SOD i da ta aktivnost ovisi o cirkadijalnom satu, a u ovom slučaju specifično da

ovisi i o tim genu. Mogli bi reći da polifenoli nemaju potrebu za povećanjem

aktivnost SOD kod 6 tjedna starih wt mušica jer je endogena aktivnost SOD

dovoljno jaka, dok je kod tim mušica ona jako oslabila i zato polifenoli pokazuju

veliko povećanje aktivnosti SOD.

Naši rezultati su pokazali da starenjem dolazi do smanjene sposobnosti penjanja

te povećane AGE akumulacije. U ovom slučaju AGE nakupljanje možemo povezati

s lokomotornom aktivnošću što bi značilo da je AGE možda bitan u procesima koji

50

su bitni za kontrolu motorike. Također smo vidjeli da se AGE akumulacija ne

mijenja kod tim mušica, ali je njihova sposobnost penjanja bolja u odnosu na wt

kod kojega AGE akumulacija raste. Također smo pokazali da polifenoli povećavaju

sposobnost penjanja kod wt i smanjuju akumulaciju AGE produkata, dok kod tim

mušica vidimo samo njihov utjecaj na sposobnost penjanja. Rezultati su se

razlikovali između wt i tim mušica što nam pokazuje da je tim gen važan za

normalne mehanizme starenja. Također pokazali smo jasne razlike između spola,

npr. u aktivnost i spavanju te težini koji su bili očekivani te smo tako potvrdili razne

literaturne nalaze o spolnim razlikama. Ono što smo isto pokazali je da polifenoli

različito djeluju između spola jer nisu iste koncentracije pokazale iste rezultate.

Polifenoli su doveli do povećanja aktivnosti superoksid dismutaze koja je možda

utjecala na mehanizme polifenola koji su potom omogućili duže preživljenje te

povećanu sposobnost penjanja. Pokazali smo više značajnijih utjecaja polifenola

na bihevioralne rezultate, a manje biokemijske što bi značilo da su polifenoli

blagotvorni u svome djelovanju, ali još ne znamo preko kojih mehanizama.

Polifenoli su možda imali antioksidativna djelovanja jer iako je preživljenje poraslo

mi nismo pokazali korelaciju s fizički jačim mušicama (veća prosječna težina i veća

količina mono-di-tri glicerida i reduktivnih šećera).

51

6. Zaključak

Naše istraživanje je po prvi puta opisalo razlike između wt i tim mušica. Pokazali

smo da tim mušice imaju veću sposobnost penjanja nego wt mušice, što bi nam

pokazalo da su zabilježeni manje progresivni mehanizmi starenja. Isto tako

sposobnost penjanja smo korelirali s AGE akumulacijom, biokemijskim markerom

starenja. Pokazali smo da kod tim mušica ne dolazi do porasta AGE produkata

starenjem, dok kod wt mušica akumulacija raste starenjem. Zaključujemo da AGE

produkti imaju doticaja s mehanizmima motorike koji slabe starenjem te da je tim

gen mogao biti bitan faktor u kontroli tih mehanizama. Jedan od faktora starenja

je i nakupljanje oksidativnog oštećenja koje se možda događa zbog smanjenog

djelovanja antioksidativnih enzima. U našim rezultatima smo pokazali da je

aktivnost katalaze i superoksid dismutaze kod wt mušica u suglasju s literaturnim

rezultatima dok kod tim mušica nije. Možemo zaključiti da je tim gen važan faktor

kod antioksidativnih enzima i da njegova mutacija dovodi do razlika u djelovanju

katalaze i superoksid dismutaze.

Naše istraživanje je prvi puta pokazalo utjecaj kvercetina i tirosola kod tim mušica

u usporedbi s wt mušicama. Pokazali smo da polifenoli produžuju dužinu života

kod tim mušica te bi te rezultate valjalo usporediti s divljim tipom da se uoči

razlika. Polifenoli su povećali sposobnost penjanja kod wt i tim mušica što bi moglo

ukazivati na njihovu neuroprotektivnu ulogu te isto tako njihovu antioksidativnu

ulogu u odstranjivanju ROS-a. Polifenoli su osim moguće neuroprotektivne uloge

imali ulogu u smanjenju štetnih produkata koja se akumuliraju starenjem te su

tako uspješno smanjili AGE akumulaciju kod wt mušica dok kod tim nisu. Zaključak

bi bio da je možda mutacija u tim genu onemogućila nakupljanje AGE produkata

starenjem. Polifenoli su pokazali svoje djelovanje na endogene antioksidativne

enzime katalazu i superoksid dismutazu jer se vide promjene u njihovim

aktivnostima. Za sada još ne možemo tvrditi da li su polifenoli djelovali na

mehanizme starenja svojim antioksidativnim djelovanjem ili poticanjem endogenih

enzima stoga bi daljnja ispitivanja trebala ići u smjeru razjašnjenja točnih

mehanizama njihovog djelovanja.

52

7. Literatura

1. Tosato M, Zamboni V, Ferrini A, Cesari M. The aging process and potential interventions to extend life expectancy. Clin Interv Aging. 2007;2(3):401.

2. Wilking M, Ndiaye M, Mukhtar H, Ahmad N. Circadian Rhythm Connections to

Oxidative Stress: Implications for Human Health. Antioxid Redox Signal.

2013 Jul 10;19(2):192–208.

3. He Y, Jasper H. Studying aging in Drosophila. Methods. 2014

Jun;68(1):129–33.

4. Rodríguez-Rodero S, Fernández-Morera JL, Menéndez-Torre E, Calvanese V, Fernández AF, Fraga MF. Aging Genetics and Aging. Aging Dis. 2011 Apr

28;2(3):186–95.

5. Trinei M, Berniakovich I, Beltrami E, Migliaccio E, Fassina A, Pelicci P, et al. P66Shc signals to age. Aging. 2009;1(6):503–510.

6. O’Kane CJ. Drosophila as a Model Organism for the Study of

Neuropsychiatric Disorders. In: Hagan JJ, editor. Molecular and Functional

Models in Neuropsychiatry [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2011 [cited 2016 Jul 6]. p. 37–60. Available from:

http://link.springer.com/10.1007/7854_2010_110

7. Genetic Portrait Chapters A-E [Internet]. [cited 2016 Jul 6]. Available from: http://highered.mheducation.com/sites/007352526x/student_view0/genetic

_portrait_chapters_a-e.html

8. Rakshit K, Krishnan N, Guzik EM, Pyza, E, Giebultowicz JM. Effects of Aging on the Molecular Circadian Oscillations in Drosophila. Chronobiol Int. 2012

Feb;29(1):5–14.

9. Stanewsky R. Genetic analysis of the circadian system inDrosophila

melanogaster and mammals. J Neurobiol. 2003 Jan;54(1):111–47.

10. Clark WR, Grunstein M. Are We Hardwired?: The Role of Genes in Human

Behavior. Oxford University Press; 2004. 333 p.

11. Shirasu N, Shimohigashi Y, Tominaga Y, Shimohigashi M. Molecular Cogs of the Insect Circadian Clock. Zoolog Sci. 2003 Aug;20(8):947–55.

12. Giebultowicz JM, Long DM. Aging and circadian rhythms. Curr Opin Insect

Sci. 2015 Feb;7:82–6.

13. Luo W, Chen W-F, Yue Z, Chen D, Sowcik M, Sehgal A, et al. Old flies have a

robust central oscillator but weaker behavioral rhythms that can be

improved by genetic and environmental manipulations: Circadian clocks in

aging Drosophila. Aging Cell. 2012 Jun;11(3):428–38.

14. Umezaki Y, Yoshii T, Kawaguchi T, Helfrich-Forster C, Tomioka K. Pigment-

Dispersing Factor Is Involved in Age-Dependent Rhythm Changes in

Drosophila melanogaster. J Biol Rhythms. 2012 Dec 1;27(6):423–32.

53

15. Bishop NA, Guarente L. Genetic links between diet and lifespan: shared

mechanisms from yeast to humans. Nat Rev Genet. 2007 Nov;8(11):835–

44.

16. Bruss MD, Khambatta CF, Ruby MA, Aggarwal I, Hellerstein MK. Calorie

restriction increases fatty acid synthesis and whole body fat oxidation rates.

AJP Endocrinol Metab. 2010 Jan 1;298(1):E108–16.

17. Katewa SD, Akagi K, Bose N, Rakshit K, Camarella T, Zheng X, et al.

Peripheral Circadian Clocks Mediate Dietary Restriction-Dependent Changes

in Lifespan and Fat Metabolism in Drosophila. Cell Metab. 2016

Jan;23(1):143–54.

18. Klichko VI, Chow ES, Kotwica-Rolinska J, Orr WC, Giebultowicz JM, Radyuk

SN. Aging alters circadian regulation of redox in Drosophila. Front Genet

[Internet]. 2015 Mar 9 [cited 2016 Jul 6];6. Available from: http://www.frontiersin.org/Genetics_of_Aging/10.3389/fgene.2015.00083/a

bstract

19. Kondratov RV. Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core componentof the circadian clock. Genes Dev. 2006 Jul

15;20(14):1868–73.

20. Krishnan N, Rakshit K, Chow ES, Wentzell JS, Kretzschmar D, Giebultowicz

JM. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 2012 Mar;45(3):1129–35.

21. Krishnan N, Davis AJ, Giebultowicz JM. Circadian regulation of response to

oxidative stress in Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Sep;374(2):299–303.

22. Luckinbill LS, Foley P. The role of metabolism in aging. J Am Aging Assoc.

2000;23(2):85–93.

23. Cerami A. Hypothesis. J Am Geriatr Soc. 1985;33(9):626–634.

24. Hirano Y, Kuriyama Y, Miyashita T, Horiuchi J, Saitoe M. Reactive oxygen

species are not involved in the onset of age-related memory impairment in

Drosophila. Genes Brain Behav. 2012 Feb;11(1):79–86.

25. Peng C, Chan HYE, Huang Y, Yu H, Chen Z-Y. Apple Polyphenols Extend the

Mean Lifespan of Drosophila melanogaster. J Agric Food Chem. 2011 Mar

9;59(5):2097–106.

26. Muller FL, Lustgarten MS, Jang Y, Richardson A, Van Remmen H. Trends in

oxidative aging theories. Free Radic Biol Med. 2007 Aug 15;43(4):477–503.

27. Sohal RS, Agarwal A, Agarwal S, Orr WC. Simultaneous Overexpression of

Copper- and Zinc-containing Superoxide Dismutase and Catalase Retards Age-related Oxidative Damage and Increases Metabolic Potential in

Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 1995 Jun 30;270(26):15671–4.

54

28. Reveillaud I, Niedzwiecki A, Bensch KG, Fleming JE. Expression of bovine

superoxide dismutase in Drosophila melanogaster augments resistance of

oxidative stress. Mol Cell Biol. 1991;11(2):632–640.

29. Phillips JP, Campbell SD, Michaud D, Charbonneau M, Hilliker AJ. Null

mutation of copper/zinc superoxide dismutase in Drosophila confers

hypersensitivity to paraquat and reduced longevity. Proc Natl Acad Sci. 1989;86(8):2761–2765.

30. Lin W-S, Chen J-Y, Wang J-C, Chen L-Y, Lin C-H, Hsieh T-R, et al. The anti-

aging effects of Ludwigia octovalvis on Drosophila melanogaster and SAMP8

mice. AGE. 2014 Apr;36(2):689–703.

31. Boyd O, Weng P, Sun X, Alberico T, Laslo M, Obenland DM, et al. Nectarine

promotes longevity in Drosophila melanogaster. Free Radic Biol Med. 2011

Jun;50(11):1669–78.

32. Pandey KB, Rizvi SI. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human

health and disease. Oxid Med Cell Longev. 2009;2(5):270–8.

33. Graf BA, Milbury PE, Blumberg JB. Flavonols, flavones, flavanones, and human health: epidemiological evidence. J Med Food. 2005;8(3):281–290.

34. Markus MA, Morris BJ. Resveratrol in prevention and treatment of common

clinical conditions of aging. Clin Interv Aging. 2008 Jun;3(2):331–9.

35. Stelter P, Ulrich HD. Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation. Nature. 2003 Sep

11;425(6954):188–91.

36. Wood JG, Rogina B, Lavu S, Howitz K, Helfand SL, Tatar M, et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature.

2004;430(7000):686–689.

37. Belinha I, Amorim MA, Rodrigues P, de Freitas V, Moradas-Ferreira P, Mateus N, et al. Quercetin Increases Oxidative Stress Resistance and Longevity in

Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem. 2007 Mar;55(6):2446–51.

38. Costa LG, Tait L, de Laat R, Dao K, Giordano G, Pellacani C, et al. Modulation

of Paraoxonase 2 (PON2) in Mouse Brain by the Polyphenol Quercetin: A Mechanism of Neuroprotection? Neurochem Res. 2013 Sep;38(9):1809–18.

39. Kampkötter A, Timpel C, Zurawski RF, Ruhl S, Chovolou Y, Proksch P, et al.

Increase of stress resistance and lifespan of Caenorhabditis elegans by quercetin. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2008

Feb;149(2):314–23.

40. Bendini A, Cerretani L, Carrasco-Pancorbo A, Gómez-Caravaca AM, Segura-

Carretero A, Fernández-Gutiérrez A, et al. Phenolic molecules in virgin olive oils: a survey of their sensory properties, health effects, antioxidant activity

and analytical methods. An overview of the last decade Alessandra.

Molecules. 2007;12(8):1679–1719.

55

41. Cañuelo A, Gilbert-López B, Pacheco-Liñán P, Martínez-Lara E, Siles E,

Miranda-Vizuete A. Tyrosol, a main phenol present in extra virgin olive oil,

increases lifespan and stress resistance in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 2012 Aug;133(8):563–74.

42. Anter J, Tasset I, Demyda-Peyrás S, Ranchal I, Moreno-Millán M, Romero-

Jimenez M, et al. Evaluation of potential antigenotoxic, cytotoxic and proapoptotic effects of the olive oil by-product “alperujo”, hydroxytyrosol,

tyrosol and verbascoside. Mutat Res Toxicol Environ Mutagen. 2014

Sep;772:25–33.

43. Sun Y, Yolitz J, Wang C, Spangler E, Zhan M, Zou S. Aging Studies in Drosophila Melanogaster. In: Tollefsbol TO, editor. Biological Aging

[Internet]. Totowa, NJ: Humana Press; 2013 [cited 2016 Aug 23]. p. 77–93.

Available from: http://link.springer.com/10.1007/978-1-62703-556-9_7

44. Gargano J, Martin I, Bhandari P, Grotewiel M. Rapid iterative negative

geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline

in. Exp Gerontol. 2005 May;40(5):386–95.

45. Dokić, Helija. Ispitivanje utjecaja polifenola iz lišća masline (Olea europea)

na starenje i otpornost na stres kod Drosophile melanogaster. [Rijeka]:

Sveučilište u Rijeci, Odjel za biotehnologiju; 2014.

46. Bolonja, Ana. Utjecaj polifenola iz lišće masline na psihofizičke sposobnosti kod Drosophile melanogaster. [Rijeka]: Sveučilište u Rijeci, Odjel za

biotehnologiju; 2015.

47. Sohal RS, Arnold L, Orr WC. Effect of age on superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase, inorganic peroxides, TBA-reactive material,

GSH/GSSG, NADPH/NADP+ and NADH/NAD+ in Drosophila melanogaster.

Mech Ageing Dev. 1990 Dec;56(3):223–35.

48. Jimenez-Del-Rio M, Guzman-Martinez C, Velez-Pardo C. The Effects of

Polyphenols on Survival and Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Exposed to Iron and Paraquat. Neurochem Res. 2010 Feb;35(2):227–38.

49. Koh K, Evans JM, Hendricks JC, Sehgal A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep: wake cycles. Proc Natl Acad Sci.

2006;103(37):13843–13847.

50. Isaac RE, Li C, Leedale AE, Shirras AD. Drosophila male sex peptide inhibits siesta sleep and promotes locomotor activity in the post-mated female. Proc

R Soc B Biol Sci. 2010 Jan 7;277(1678):65–70.

56

8. Životopis

OSOBNE INFORMACIJE Žic Tamara

Brtuni 13, 51216 Viškovo (Hrvatska)

+385 91 944 9119

[email protected]

Spol Žensko | Datum rođenja 08 siječnja 1993 | Državljanstvo hrvatsko

OBRAZOVANJE I OSPOSOBLJAVANJE

RADNO ISKUSTVO

2014–danas

Odjel za biotehnologiju, Diplomski sveučilišni studij "Istraživanje i razvoj lijekova" Radmile Matejčić 2, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr

2011–2014 Viša stručna sprema, Sveučilišna prvostupnica

Biotehnologije i istraživanja lijekova

Odjel za biotehnologiju, preddiplomski studij Biotehnologija i istraživanje lijekova Radmile Matejčić 2, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr

2007–2011 Srednja stručna sprema

Gimnazija Andrije Mohorovičića Frana Kurelca 1, 51000 Rijeka (Hrvatska) www.gimnazija-amohorovicica-ri.skole.hr

2015–danas Diplomski rad

Mentorica: Dr.sc. Rozi Andretić-Waldowski Radmile Matejčić 2, 51 000 Rijeka Rijeka (Hrvatska) www.biotech.uniri.hr

Laboratorij za genetiku ponašanja

Odjel za biotehnologiju

Utjecaj tirosola i kvercetina na indikatore starenja i redoks statusa u timeless cikadijalnih mutanata Drosophile

Djelatnost ili sektor Odgoj I Obrazovanje

07/07/2014–18/07/2014

Stručna praksa

Jadran Galenski Laboratorij Pulac 4a, 51 000 Rijeka Rijeka (Hrvatska) www.jgl.hr

Mentori: Sanja Vukoja; Ivana Poropat

pisanje dnevnika rada

rad u laboratoriju (pripremanje otopina, korištenje vage-mjerenje)

rad na odjelu istraživanja i preformulacija

kratka istraživanja-pretraživanje baza podataka

http://www.biotech.uniri.hr/#_blank


http://www.gimnazija-amohorovicica-ri.skole.hr/#_blank


http://www.jgl.hr/#_blank

57

OSOBNE VJEŠTINE

DODATNE INFORMACIJE

korištenje Farmakopeja (EU, USA)

Djelatnost ili sektor Stručna, Znanstvena I Tehnička Djelatnost

Materinski jezik hrvatski

Ostali jezici RAZUMIJEVANJE GOVOR PISANJE

Slušanje Čitanje Govorna interakcija Govorna produkcija

engleski C1 C1 C1 C1 C1

njemački A2 A2 A2 A2 A2

Stupnjevi: A1 i A2: Početnik - B1 i B2: Samostalni korisnik - C1 i C2: Iskusni korisnik

Zajednički europski referentni okvir za jezike

Komunikacijske vještine

Sezonski posao kao prodavač na štandu omogućio mi je usvajanje dobrih komunikacijskih vještina s kupcima.

Nekoliko godina u debati naučilo me kako jasno i argumentirano iznositi svoje stavove.

Svakodnevni seminari u sklopu kolegija na fakultetu naučili su me kako kontrolirati tremu i pričati ispred veće skupine ljudi.

Organizacijske / rukovoditeljske vještine

Case Study Competition koji je bio u organizaciji JGL omogućio mi je dobre organizacijske vještine jer sam bila voditelj tima

Volontiranje na Europskim sveučilišnim igrama 2016. omogućilo mi je razvitak organizacijskih vještina te upravljanjem veće grupe ljudi jer sam bila attache-domaćin ekipe

Digitalna kompetencija

SAMOPROCJENA

Obrada informacija Komunikacija Stvaranje sadržaja

Sigurnost Rješavanje problema

Iskusni korisnik Iskusni korisnik Samostalni

korisnik Samostalni

korisnik Samostalni

korisnik

Informacijsko-komunikacijske tehnologije - tablica za samoprocjenu

Vozačka dozvola B

Priznanja i nagrade Stipendist Općine Viškovo 2011/12, 2012/13, 2015/2016 godine

Završila preddiplomski studij s pohvalom- CUM LAUDE

Konferencije Aktivni sudionik na poster sekciji 14-tog simpozija, Translation of basic immunology and neuroscience tools to therapies, održanog u Rijeci u srpnju 2016. godine

Ime postera: "Influence of polyphenol supplemented food on behavior and physiology of aged Drosophila melanogaster"

Autori: Ana Filošević, Tamara Žic, Franka Rigo, Rozi Andretić Waldowski

http://europass.cedefop.europa.eu/hr/resources/european-language-levels-cefr

http://europass.cedefop.europa.eu/hr/resources/digital-competences

58

Pasivni sudionik na 6. Studentskom kongresu neuroznanosti - NeuRi 2016. održanom u Rijeci i Rabu od 22. do 24. travnja 2016. godine

Volonterstva Pomoć kod postave i rada Hiše eksperimentov, rad s djecom - Općina Viškovo, rujan 2016. godine

Attaché, domaćin ekipe, na Europskim sveučilišnim igrama - Rijeka i Zagreb, srpanj 2016. godine

Projekti Sudjelovanje u aktivnostima 13. i 14. Festivala znanosti

Student mentor 2014. - 2016. godine

Članstva Članica Udruge studenata biotehnologije Sveučilišta u Rijeci od 2014. godine

Documents

SVEUČILIŠTE U RIJECI - bib.irb.hrbib.irb.hr/datoteka/904775.Tamara_Zic_diplomski_rad.pdf · SVEUČILIŠTE U RIJECI ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU Diplomski sveučilišni studij Istraživanje