Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Zvonimir Šamija

RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU

TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA

Diplomski rad

U Zagrebu, 2014.

Ovaj rad je izrađen u Kliničkoj jedinici za tipizaciju tkiva, Kliničkog zavoda za transfuzijsku

medicinu i transplantacijsku biologiju, Kliničkog bolničkog centra Zagreb, pod vodstvom prof.

dr. sc. Zorane Grubić. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno –

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistar eksperimentalne

biologije

Zahvaljujem se, prije svega, svojoj mentorici prof. dr. sc. Zorani Grubić na nesebičnoj pomoći

pri oblikovanju ideje ovog diplomskog rada, za izradu kojeg sam motivaciju dobio upravo

zahvaljujući njezinom znanstvenom i obrazovnom djelovanju. Posebno joj se zahvaljujem na

ukazanom povjerenju, velikom strpljenju i stručnim savjetima kojima me je vodila kroz izradu

ovog diplomskog rada. Također, želio bih se zahvaliti svim djelatnicima Kliničke jedinice za

tipizaciju tkiva KBC-a Zagreb na ugodnoj radnoj atmosferi, nesebičnoj pomoći i susretljivosti, a

posebno mag. biol. mol. Mariji Maskalan na strpljenju i pomoći u rješavanju svih problema i

zapreka s kojima sam se susreo tijekom istraživanja.

Posebno se zahvaljujem svojoj obitelj na bezuvjetnoj podršci tijekom proteklih godina i naravno,

veliko hvala svim prijateljima koji su bili uz mene tijekom moga studija, a zbog kojih će mi to

razdoblje ostati u nezaboravnom sjećanju.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU

TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA

Zvonimir Šamija

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

U ovom radu analizirana je raspodjela alela i haplotipova HLA kod bolesnika uključenih u

program nesrodne transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) u Hrvatskoj, s ciljem

određivanja vjerojatnosti pronalaska HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. Unutar skupine od

150 nesrodnih bolesnika, određena je raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 te

haplotipova HLA-A-B-DRB1, odnosno HLA-A-B-C-DRB1-DQB1. Aleli HLA određeni su

metodama lančane reakcije polimerazom upotrebom specifičnih DNA početnica i

oligonukleotidnih proba za alele HLA (metode: PCR-SSP i PCR-SSO). Haplotipovi HLA

bolesnika određeni su segregacijskom analizom na temelju podataka o tipizaciji HLA članova

uže obitelji. Usporedbom učestalosti alela HLA između ispitivane skupine bolesnika i zdrave

kontrole nisu utvrđene statistički značajne razlike. Najčešći aleli bili su: HLA-A*02:01 (27,7%),

B*51:01 (13,0%), C*07:01 (20,3%), DRB1*03:01 (15,3%) i DQB1*03:01 (23,3%). Od 227

različitih haplotipova HLA-A-B-DRB1, njih 197 pojavilo se samo jednom, a najzastupljeniji je

bio: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%). Analiza haplotipova HLA koja je uključila 5

lokusa potvrdila je najveću učestalost haplotipa: HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-

DQB1*02:01 što je u skladu s prethodnim istraživanjima. Neuobičajene kombinacije alela HLA-

B-C uočene kod 15 bolesnika i neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1 uočene kod 4

bolesnika te prisustvo rijetkih alela (A*29:01, B*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15 i

DRB1*11:28) pokazali su se kao otežavajući čimbenici u pronalasku HLA podudarnog

nesrodnog darivatelja.

(43 stranice, 14 slika, 15 tablica, 22 literarna navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici

Ključne riječi: HLA, transplantacija krvotvornih matičnih stanica, nesrodni darivatelj

Voditelj: Dr. sc. Zorana Grubić, izv. prof., KBC Zagreb

Ocjenitelji: Dr. sc. Nada Oršolić, prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu

Dr. sc. Silvija Černi, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu

Dr. sc. Inga Marjanović, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu

Rad prihvaćen: 28.11.2014.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Division of Biology Graduation Thesis

HLA ALLELE POLYMORPHISMS AMONG PATIENTS IN HEMATOPOIETIC STEM

CELL TRANSPLANTATION PROGRAM

Zvonimir Šamija

Rooseveltov trg, 10000 Zagreb, Croatia

The aim of the present study was to analyze the distribution of HLA alleles and haplotypes

among patients (N=150) in hematopoietic stem cell transplantation program (HSCT) in Croatia,

in order to determine the probability of finding an HLA matched unrelated donor. The

distribution of HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 alleles and HLA-A-B-DRB1/HLA-A-B-C-

DRB1-DQB1 haplotypes was investigated. HLA alleles were tested by Polymerase Chain

Reaction with specific primers or probes (PCR-SSP and PCR-SSO). HLA haplotypes were

determined by segregation analysis. Comparison of patients included in this study and healthy

controls regarding the HLA allele distribution did not reveal any statistically significant

difference. The most common alleles detected in our patient group were: HLA-A*02:01 (27.7%),

B*51:01 (13.0%), C*07:01 (20.3%), DRB1*03:01 (15.3%) and DQB1*03:01 (23.3%). Out of

227 different detected HLA-A-B-DRB1 haplotypes, 197 were observed only once and the most

frequent one was HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7.3%). Five loci haplotype analysis

confirmed the highest frequency of HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-

DQB1*02:01 haplotype, which is in concordance with the previous studies. Unusual HLA-B-C

combinations detected in 15 patients together with unusual HLA-DRB1-DQB1 combinations

detected in four patients and the presence of rare alleles (A*29:01, A*80:01, C*07:18,

DRB1*04:15, DRB1*11:15, DRB1*11:28) were shown to be limiting factors in finding an HLA

matched unrelated donor.

(43 pages, 14 figures, 15 tables, 22 references, original in: Croatian)

Thesis deposited in the Central Biological Library

Key words: HLA, hematopoietic stem cell transplatation, unrelated donor

Supervisor: Dr. Zorana Grubić, Assoc. Prof., University Hospital Centre Zagreb

Reviewers: Dr. Nada Oršolić, Prof., Faculty of Science, University of Zagreb

Dr. Silvija Černi, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb

Dr. Inga Marjanović, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb

Thesis accepted: 28.11.2014.

Sadržaj

1.0. Uvod ............................................................................................................................................... 1

1.1. Glavni sustav tkivne podudarnosti ............................................................................................... 1

1.1.1. Organizacija sustava HLA ................................................................................................... 1

1.1.2. Obilježja sustava HLA ......................................................................................................... 3

1.1.3. Raspodjela alela HLA u svijetu ............................................................................................ 6

1.1.4. Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA ............................................................ 9

1.1.4.1. Antigen-predočne molekule HLA razreda I ................................................................. 9

1.1.4.2. Antigen-predočne molekule HLA razreda II .............................................................. 10

1.2. Transplantacija krvotvornih matičnih stanica ............................................................................ 11

1.2.1 Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica ..................................... 14

2.0. Ciljevi istraživanja ..................................................................................................................... 18

3.0. Materijali i metode ..................................................................................................................... 19

3.1. Ispitanici .................................................................................................................................... 19

3.2. Izolacija DNA ........................................................................................................................... 19

3.3. Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 ..................................................... 19

3.4. Statistička analiza rezultata ....................................................................................................... 21

4.0. Rezultati ...................................................................................................................................... 22

4.1. Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima

u programu nesrodne TKMS .................................................................................................... 22

4.2. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika

u programu nesrodne TKMS ................................................................................................... 27

4.3. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika

u programu nesrodne TKMS .................................................................................................. 28

4.4. Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike

u programu nesrodne TKMS .................................................................................................. 30

5.0. Rasprava ..................................................................................................................................... 36

6.0. Zaključak .................................................................................................................................... 40

7.0. Literatura ........................................................................................................................ 41

1

1.0. Uvod

1.1. Glavni sustav tkivne podudarnosti

Geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (engl. Mayor Histocompatibility Complex -

MHC) kod ljudi se nalaze na kratkom kraku kromosoma 6 u regiji 6p21.3 (Slika 1). Više od 200

dosad otkrivenih gena tog sustava obuhvaća kromosomsku regiju od približno 4000 kilobaza. Ta

je regija najistraživaniji dio ljudskog genoma zbog činjenice da se unutar nje nalaze geni HLA

(engl. Human Leukocyte Antigens) koji imaju značajnu ulogu u transplantaciji tkiva i organa, a

također se smatraju ključnima i u nastanku pojedinih bolesti autoimune etiologije. Ključna

funkcija gena HLA očituje se, kako u imunološkoj reakciji tako i u transplantacijskom kliničkom

procesu, kroz funkciju njihovih najvažnijih produkata – molekula HLA. One su glavni dio

antigen-predočnog kompleksa na površini stanica, predočuju vlastite i strane peptidne dijelove

citotoksičnim i pomoćničkim T-limfocitima. Upravo razlikovanje vlastitih od stranih peptida,

koji se predočuju u sklopu molekula HLA, ključan je čimbenik u ishodu postupka transplantacije

tkiva i organa [1].

1.1.1. Organizacija sustava HLA

Sustav HLA dijeli se u 3 genske regije (regija HLA razreda I, razreda II i razreda III).

Regija HLA razreda I smještena je telomerno i sastoji se od dvije skupine gena – klasičnih i

neklasičnih. Skupinu klasičnih gena HLA razreda I čine geni HLA-A, -B i -C, čiji su produkti -

molekule HLA, izraženi na gotovo svim stanicama u tijelu, s pojedinim iznimkama. Geni HLA-

E, -F i -G dio su skupine neklasičnih gena HLA razreda I koja se od prve skupine u osnovi

razlikuje zbog znatno slabijeg polimorfizma, drugačije tkivne rasprostranjenosti njihovih

molekula i specifične funkcije. U ovu se skupinu ubrajaju i neki pseudogeni iako ih dio autora

izdvaja kao zasebnu podskupinu gena HLA razreda I [1].

Regija HLA razreda II smještena je bliže centromeri i podijeljena je u 6 genskih

podregija: HLA-DM, -DN, -DO, -DP, -DQ i -DR. Podregije HLA-DP, -DQ i -DR kodiraju

molekule HLA razreda II koje se izražavaju na membrani stanica (antigen-predočne molekule

HLA razreda II), dok preostale tri podregije (HLA-DM, -DN i -DO) kodiraju molekule koje nisu

prisutne na staničnoj membrani i posredno su uključene u proces funkcionalnog formiranja

antigen-predočnih molekula HLA razreda II. Molekule kodirane genskim podregijama HLA-

2

DM, -DN i -DO poglavito su važne u procesu vezanja peptidnih ulomaka s drugim molekulama

HLA i prisutne su uglavnom u citoplazmi stanica, ali ne i na njihovoj površini. Molekule HLA

razreda II (HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR) izražene su samo na membrani specijaliziranih

antigen-predočnih stanica (makrofagi, dendritičke stanice, B-limfociti), ali i na pojedinim

stanicama koje takvu funkciju mogu imati povremeno, poput nekih endotelnih stanica. Unutar

regije HLA razreda II nalaze se i geni koji su ključni za konačni ustroj molekula HLA razreda I

poput TAP1 i TAP2 (engl. Transporters Associated with antigen Processing) proteinskih pumpi

za prijenos antigenskih dijelova iz citosola u endoplazmatski retikulum, kao i skupina gena za

enzimske dijelove proteasoma koji cijepa velike proteinske antigene na manje peptidne dijelove

[2].

Unutar regije HLA razreda III (tzv. centralna regija), koja se nalazi između regije HLA

razreda I i II, smješteni su geni čiji produkti nisu direktno uključeni u procese imunološkog

prepoznavanja i aktivacije stanica specifične imunosti, ali su važni jer posredno sudjeluju u

imunološkoj reakciji. Geni unutar HLA razreda III kodiraju neke sastavnice komplementa (C2,

C4A, C4B), proteine toplinskog šoka (engl. Heat Shock Proteins - HSP), enzim 21-hidroksilazu

te neke važne citokine poput TNF-α i TNF-β (engl. Tumor Necrosis Factors) [3]. Unutar ove

regije nema niti jedan gen HLA.

Slika 1. Smještaj regije HLA na kraćem kraku kromosoma 6. (Preuzeto iz [4])

3

1.1.2. Obilježja sustava HLA

Nekoliko je osnovnih obilježja koja sustav HLA čine specifičnim i značajno određuju

njegovu osobitost. Kad je riječ o nasljeđivanju gena HLA treba naglasiti kako ono prati

Mendelove zakone nasljeđivanja, odnosno segregacije (Slika 2). Nasljeđivanje kombinacije alela

HLA, točnije haplotipova HLA, klasičan je primjer Mendelovskog načina nasljeđivanja. Po

jedan haplotip HLA nasljeđuje se od svakog roditelja pri čemu se oba izražavaju kodominantno

na staničnoj membrani, što je posljedica kodominacije na razini gena [2].

Sljedeća osobitost sustava HLA odnosi se na mogućnost rekombinacije gena HLA i

stvaranja novih haplotipova. Riječ je o procesu križnog spajanja ili crossing over-a (c.o.).

Genetička zakonitost koja definira učestalost genetičke rekombinacije kroz proces c.o.-a temelji

se na međusobnoj udaljenosti pojedinih gena. Naime, vjerojatnost c.o.-a je veća što su geni

međusobno više udaljeni i obratno. Ista zakonitost uočena je i unutar regije HLA gdje

vjerojatnost c.o.-a nije stalna i ovisi o međusobnoj udaljenosti gena HLA. Primjerice, pojava

c.o.-a nikad nije uočena između gena HLA-DQB1 i -DRB1, dok je učestalost rekombinacije

najveća između gena HLA-B i -DRB1. U načelu, stopa rekombinacije između gena HLA iznosi

oko 1%, dakle vrlo je mala i ne pridonosi (barem ne u značajnijoj mjeri) genetičkoj varijabilnosti

ovog genskog sustava [1].

Slika 2. Prikaz nasljeđivanja gena/haplotipova HLA u obitelji.

4

Možda najznačajnije obilježje sustava HLA, koje se snažno odražava na ulogu molekula

HLA u imunološkoj reakciji, a izuzetno je važno u postupku kliničke transplantacije, svakako je

velika genska raznolikost. Naime, sustav HLA najpolimorfniji je genski sustav kod čovjeka što

je posljedica nekoliko genetskih mehanizama koji uključuju gensku konverziju, točkaste

mutacije i već spomenutu rekombinaciju [2]. Do danas je utvrđeno više od 12 000 alela HLA

razreda I i II. Značajno veću raznolikost pokazuju aleli HLA razreda I s najpolimorfnijim

lokusom HLA-B (Tablica 1). Razlike među alelima HLA većinom su prisutne u egzonima koji

kodiraju α1 i α2 podjedinice α-lanca molekule HLA razreda I (egzoni 2 i 3) i u egzonu koji

kodira α1 i β1 podjedinice molekule HLA razreda II (egzon 2). Spomenute podjedinice formiraju

pukotine molekula HLA unutar kojih se vežu prerađeni peptidni dijelovi [5].

Tablica 1. Broj do sada otkrivenih alela HLA

Lokus Broj alela

HLA-A 2946

HLA-B 3693

HLA-C 2466

HLA-DPB1 472

HLA-DQB1 712

HLA-DRB 1684

(Prilagođeno prema [18])

Potrebno je naglasiti da se svakim danom otkrivaju novi aleli HLA te da njihov broj

sigurno nije konačan (Slika 3). Kao što možemo vidjeti iz Slike 3, od travnja 2013. (ukupan broj

alela HLA razreda I i II bio je oko 9550) do svibnja 2014. godine, otkriveno je oko 2500 novih

alela.

Osim polimorfizma, poligenija je još jedno obilježje koje uvjetuje antigensku razliku

među jedinkama. To se svojstvo odnosi na činjenicu da se unutar jednog haplotipa HLA nalazi

više gena HLA slične strukture i funkcije što osigurava (uz velik polimorfizam) veći broj

različitih kombinacija molekula HLA unutar jedinke, a time i veću mogućnost predočavanja

5

različitih antigena izvršnim stanicama imunološkog sustava. Ovo se obilježje, kao i velik

polimorfizam, smatra evolucijskom prilagodbom koja osigurava uspješniju borbu protiv

mikroorganizama s velikim broj različitih antigena [2].

Slika 3. Broj novootkrivenih alela HLA razreda I i II od 1987. do 2013. godine.

(Prilagođeno prema [6]).

S obzirom na velik broja alela HLA u svijetu i veći broj gena HLA koji čine jedan

fenotip, potencijalan broj mogućih fenotipova na razini populacije reda je veličine 1013

.

Međutim, stvaran broj fenotipova HLA, kako u svijetu tako i na razini pojedine populacije,

znatno je manji, prvenstveno zbog još jednog važnog obilježja sustava HLA – neravnoteže

udruživanja (engl. linkage disequilibrium - LD) [7]. Riječ je o fenomenu učestalijeg povezivanja

pojedinih alela HLA u specifične kombinacije, odnosno češće pojave pojedinih alela HLA u

haplotipovima HLA, nego što je to za očekivati na temelju pojedinačnih frekvencija tih alela.

Nekoliko je mogućih objašnjenja ovog fenomena poput djelovanja selekcijskih sila ili genetički

uvjetovanih mehanizama koji potiču specifična udruživanja alela HLA u zajednički haplotip, a

6

koji su rezultat male udaljenosti među pojedinim lokusima HLA. Međutim, niti jedno od

objašnjenja do sada nije dalo potpuni odgovor [3]. Najsnažnija neravnoteža udruživanja uočena

je između bliskih lokusa HLA (npr. HLA-B-C, HLA-DRB1-DQB1 ili HLA-DQA1-DQB1).

Međutim, postoje i cijeli haplotipovi koji pokazuju jaku neravnotežu udruživanja. Jedan od

najboljih primjera za to je haplotip: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 odnosno HLA-

A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01, s vrlo visokom učestalošću u brojnim

populacijama u svijetu [8].

1.1.3. Raspodjela alela HLA u svijetu

Populacijska istraživanja, čiji je cilj utvrditi i analizirati učestalost odnosno raspodjelu

alela HLA među različitim populacijama u svijetu, provode se kontinuirano još od početka 1990-

ih godina. Na temelju rezultata niza istraživanja na području populacijske genetike, a koja

uključuju analizu raspodjele alela HLA, napravljena je sljedeća podjela alela HLA:

a) aleli HLA s relativno visokom učestalošću u svim populacijama

b) aleli HLA uočeni u većini populacija, ali ih u nekima uopće nema ili su rijetko prisutni

c) aleli HLA specifični samo za pojedine populacije

Prema istraživanju provedenom 2014. godine najčešći alel HLA-A među europskom

populacijom je HLA-A*02:01, inače vrlo čest i u ostalim svjetskim populacijama, primjerice u

SAD-u ili Južnoj Americi (Slika 4). Ostali aleli HLA-A česti među europskom populacijom su:

HLA-A*01:01, A*03:01, A*24:02. Raspodjela alela HLA-A*01:01 i A*03:01 pokazuje

regionalne razlike s obzirom da su češći među nekim populacijama sjeverne Europe nego među

populacijama na području jugoistočne Europe. Obrnuti je slučaj s alelom HLA-A*24:02 koji je

češći na području jugoistočne Europe u odnosu na ostale europske regije. Prema istom

istraživanju najčešće skupine alela na lokusu HLA-B bile su B*35 (najčešći alel B*35:01) i B*51

(najčešći alel B*51:01), inače relativno česti i u većini populacija u svijetu (Slika 5). Raspodjela

alela B*35:01 i B*51:01 također pokazuje regionalne razlike. Naime, uočena je veća učestalost

tih alela na području jugoistočne Europe, nego u populacijama zapadne i sjeverne Europe. Alel

HLA-C*07 najčešći je alel lokusa HLA-C u Europi, ali i u mnogim svjetskim populacijama, s

7

manjom učestalošću na jugoistoku Europe u odnosu na ostale europske regije. Na lokusu HLA-

DRB1 u Europi je najčešća skupina alela DRB1*11, odnosno aleli DRB1*11:01 i DRB1*11:04

koji također pokazuju razlike u učestalosti od sjevera do juga Europe, odnosno pad učestalosti od

istoka prema zapadu Europe (Slika 6). Najčešća skupina alela lokusa HLA-DQB1, DQB1*03

prisutna je u većini populacija u svijetu s vrlo visokom učestalošću i za razliku od nekih

navedenih primjera ne pokazuje izraženije regionalne razlike u učestalosti na području Europe

[8].

Slika 4. Raspodjela alela HLA-A*02:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).

8

Slika 5. Raspodjela alela HLA-B*51:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).

Slika 6. Raspodjela alela HLA-DRB1*11:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).

9

1.1.4. Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA

Kao što je već navedeno, dvije su skupine, odnosno dva razreda molekula HLA čija je

glavna funkcija predočavanje vlastitih i stranih peptidnih dijelova izvršnim molekulama

imunološkog sustava te pokretanje imunološke reakcije s ciljem eliminacije stranog antigena.

Osnovne razlike između molekula HLA razreda I i II sadržane su u tipu antigena kojeg

predočuju, tipu stanica kojima predočuju antigen i njihovoj tkivnoj zastupljenosti.

1.1.4.1. Antigen-predočne molekule HLA razreda I

Molekule HLA razreda I građene su od dva polipeptidna lanca od kojih je teški α-lanac

kodiran genima HLA razreda I (HLA-A, -B, -C), a drugi lanac, tzv. β2-mikroglobulin kodiran je

genom na kromosomu 15. Molekula HLA razreda I građena je od četiri osnovna dijela: vanjski

dio koji veže peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski

dio (Slika 7). Stabilnu strukturu na membrani stanice molekula HLA razreda I ima u obliku

heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog peptidnog ulomka. Molekule HLA

razreda I u pukotinu mogu vezati peptide veličine 8-11 aminokiselina. Pukotina je najvažniji dio

molekule izgrađen od 180 aminokiselina stereokemijski podijeljenih u dva dijela: α1 i α2 . Upravo

je polimorfizam gena HLA, odnosno brojni alelni oblici, odgovoran za različitost stereokemijske

površine vezne pukotine, čime se osigurava vezanje velikog broja potencijalnih antigena. Dio

oko vezne pukotine, zajedno sa stranim antigenom, prepoznaje receptor T-limfocita. Treći dio α-

lanca visoko je očuvan i služi kao vezno mjesto za molekulu CD8 citotoksičnih T-limfocita. Iz

navedenog je jasno da molekule HLA razreda I (HLA-A, -B i –C) predočuju antigene CD8+

citotoksičnim T-limfocitima i to mehanizmom tzv. spregnutog prepoznavanja gdje se receptori

T-limfocita moraju određenim afinitetom vezati kako za antigenski ulomak, tako i za dijelove

molekule HLA. Molekule HLA razreda I nalaze se na gotovo svim stanicama s jezgrom i

predočuju prerađene citosolne ili endogene antigene poput virusnih peptida, peptidnih dijelova

drugih unutarstaničnih patogena, razgradnih dijelova mutiranih tumorskih proteina i sl. [2].

10

1.1.4.2. Antigen-predočne molekule HLA razreda II

Molekule HLA razreda II građene su od dva polipeptidna lanca α i β od kojih su oba

kodirana genima HLA. Teški α-lanac kodiraju A geni HLA razreda II (npr. α-lanac molekule

HLA-DP kodira gen DPA1), dok laki β-lanac kodiraju B geni (npr. β-lanac molekule HLA-DP

kodira gen HLA-DPB1). Polimorfizmu molekula HLA razreda II znatno više pridonose geni koji

kodiraju β-lanac zbog većeg broja alela, poglavito najpolimorfniji gen HLA razreda II - HLA-

DRB1. Molekule ovog razreda također se sastoje od četiri osnovna dijela: vanjski dio koji veže

peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski dio (Slika 7).

Kao i u slučaju molekula HLA razreda I, molekule HLA razreda II stabilnu strukturu na

membrani stanice imaju u obliku heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog

peptidnog ulomka. Veznu pukotinu čine dijelovi lanaca α1 i β1, s naglaskom da su u slučaju ovih

molekula krajevi pukotine otvoreni (za razliku od molekula HLA razreda I) pa se vezani peptidni

dijelovi mogu nalaziti i dijelom izvan pukotine, što u konačnici omogućuje vezanje većih peptida

građenih od 10-30 aminokiselina. Dio β-lanca, točnije β2 domenu molekule HLA razreda II

prepoznaje molekula CD4 pomagačkih T-limfocita. Dakle, u slučaju molekula HLA razreda II

antigeni se predočuju CD4+ pomagačkim T-limfocitima jednakim mehanizmom spregnutog

prepoznavanja. Molekule HLA razreda II predočuju vezikularne ili egzogene antigene mnogih

izvanstaničnih patogena i to nakon procesa fagocitoze. Nalaze se isključivo na fagocitnim

odnosno antigen-predočnim stanicama poput makrofaga, dendritičkih stanica, B-limfocita te

nekih endotelnih i epitelnih stanica [2].

11

Slika 7. Shematski prikaz građe molekula HLA razreda I i razreda II. (Prilagođeno prema [3]).

1.2. Transplantacija krvotvornih matičnih stanica

Postupak transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) uobičajena je metoda

liječenja mnogih malignih bolesti, ali i niza genetskih poremećaja koji rezultiraju patofiziološkim

promjenama u funkciji krvotvornog tkiva. Kod bolesnika sa zloćudnim tumorima krvotvornog

sustava (leukemije i limfomi), TKMS je metoda liječenja koja bolesnicima pruža dobre

mogućnosti za izlječenje i u konačnici preživljenje [9]. Tri su oblika TKMS obzirom na

genetički odnos primatelja i darivatelja: autologna, singenična i alogenična transplantacija.

Autolognom transplantacijom bolesnik prima vlastite matične stanice koje su se

prikupile prije postupka liječenja maligne bolesti te su time ostale neoštećene uslijed primjene

agresivnih metoda liječenja poput kemoterapije. Također, ovaj oblik transplantacije

podrazumijeva i korištenje matičnih stanica iz umbilikalne krvi, ukoliko je pacijentu ista i

pohranjena.

Singenična transplantacija podrazumijeva TKMS od genetički identične jedinke,

dakle jednojajčanog blizanca. Ovim se oblikom transplantacije u potpunosti mogu izbjeći

neželjeni učinci transplantacije koji su posljedica razlika u genetičkoj strukturi primatelja i

darivatelja.

12

Treći oblik TKMS je alogena ili alogenična transplantacija gdje bolesnik prima

krvotvorne matične stanice (KMS) od HLA podudarnog darivatelja. Podudarnost HLA između

primatelja i potencijalnog darivatelja jedan je od ključnih čimbenika za uspješan ishod

transplantacije. Približno 30% bolesnika pronalazi genotipski ili fenotipski HLA podudarnog

darivatelja unutar obitelji (Slika 8a i 8b). U ostalih 70% slučajeva, kada unutar obitelji nema

genotipski HLA, odnosno fenotipski HLA identičnog darivatelja, pristupa se pronalaženju

fenotipski HLA podudarnog nesrodnog darivatelja kroz postupak pretraživanja nacionalnog ili

svjetskog registra dobrovoljnih darivatelja KMS [7]. Prva alogenična TKMS u Hrvatskoj

izvedena je 1983. godine (od srodnog darivatelja), a prva alogenična TKMS od HLA

podudarnog nesrodnog darivatelja izvedena je 1991. godine u KBC-u Zagreb.

OTAC MAJKA

.

BOLESNICA BRAT SESTRA

Slika 8a. Obitelj u kojoj bolesnica ima genotipski HLA identičnog brata.

A*29

B*44

DRB1*10

A*30

B*53

DRB1*13

A*03

B*35

DRB1*04

A*24

B*57

DRB1*11

A*29

B*44

DRB1*10

A*29

B*44

DRB1*10

A*03

B*35

DRB1*04

A*03

B*35

DRB1*04

A*30

B*53

DRB1*13

A*03

B*35

DRB1*04

13

OTAC MAJKA

.

BOLESNIK SESTRA SESTRA

Slika 8b. Obitelj u kojoj bolesnik ima fenotipski HLA identičnog darivatelja (majka).

U postupku određivanja podudarnosti HLA između bolesnika i darivatelja, kriteriji

Europske skupine za TKMS (engl. European Bone Marrow Transplantation – EMBT) i

Američkog nacionalnog programa darivatelja KMS (engl. National Marrow Donor Program –

NMDP) zahtijevaju tipizaciju gena HLA-A, -B, -C i -DRB1 (podudarnost 8/8) odnosno gena

HLA-A, -B, -C, -DRB1 i DQB1 (podudarnost 10/10) na visokoj rezoluciji [9]. Naime, pojam

”visoka rezolucija” podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 4 znamenke (npr. HLA-A*02:01,

B*07:02). S druge strane, pojam ”niska rezolucija” podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 2

znamenke čime se određuje samo skupina alela (npr. HLA-A*02, B*07).

Alogenična TKMS se kao terapijska metoda primjenjuje zbog djelovanja

transplantata protiv tumora (engl. Graft versus Leukemia Effect - GvL) gdje imunokompetentne

stanice presatka prepoznaju tumorske antigene zloćudnih stanica u sklopu molekula HLA

razreda I čime se aktivira imunološka reakcija citolize zloćudnih stanica posredovana

A*01

B*08

DRB1*03

A*24

B*35

DRB1*04

A*23

B*44

DRB1*07

A*23

B*44

DRB1*07

A*01

B*08

DRB1*03

A*23

B*44

DRB1*07

A*24

B*35

DRB1*04

A*24

B*35

DRB1*04

A*23

B*44

DRB1*07

A*01

B*08

DRB1*03

14

citotoksičnim T-limfocitima. Djelotvorni učinak TKMS na bolest značajno je umanjen

neželjenim učincima, prvenstveno reakcijom presatka protiv primatelja (engl. Graft versus Host

Disease - GvHD) gdje imunokompetentne stanice iz presatka prepoznaju antigene primatelja,

slično kao u efektu GvL. Međutim, u ovom slučaju reakcija nije ograničena isključivo na

zloćudne stanice. Pojava GvDH znatno je manja u slučaju transplantacije od srodnog darivatelja.

Značajno je manja i u slučaju HLA podudarnosti 10/10 između primatelja i darivatelja.

Terapijski uspjeh dugog preživljenja nakon TKMS može se postići u približno 40% bolesnika

koji se liječe ovom terapijskom metodom. Važno je spomenuti da se uspješnost TKMS u

liječenju malignih i drugih bolesti znatno povećala unaprjeđenjem postupka određivanja

podudarnosti HLA (tipizacija na visokoj rezoluciji), ali i povećanjem broja darivatelja u

nacionalnom i svjetskom registru što značajno povećava vjerojatnost pronalaska HLA

podudarnog nesrodnog darivatelja [9].

1.2.1. Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica

Hrvatski registar dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica (engl.

Croatian Bone Marrow Donor Registry – CBMDR) nacionalni je hrvatski registar za liječenje

alogeničnom transplantacijom od nesrodnih darivatelja KMS. Njegova je osnovna zadaća

organizacija i provođenje procesa pretraživanja i pronalaženja HLA podudarnog nesrodnog

darivatelja kako u našem registru tako i u međunarodnim registrima dobrovoljnih darivatelja

KMS [10]. Hrvatski registar osnovan je 1994. godine i sve do 2007. imao je vrlo skroman broj

upisanih dobrovoljnih darivatelja. Naglo širenje započelo je 2008. godine podizanjem javne

svijesti o važnosti postojanja registra s dovoljno velikim brojem darivatelja. Registar je 2008.

godine brojao približno 9000 dobrovoljnih darivatelja KMS, a danas ima gotovo 37000 upisanih

darivatelja (Slika 9) kojima su određeni geni HLA-A, -B i -DRB1. Naš registar je dio Svjetskog

registra dobrovoljnih darivatelja (engl. Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW).

15

Slika 9. Rast broja dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica

u hrvatskom registru.

Svjetski registar dobrovoljnih darivatelja KMS (BMDW) osnovan je 1989. godine u

nizozemskom gradu Leidenu. U početku je uključivao osam nacionalnih registara s oko 150000

dobrovoljnih darivatelja. Broj nacionalnih registara i banaka krvi iz pupkovine uključenih u

BMDW rastao je iz godine u godinu (Slika 10). Danas BMDW broji preko 24 milijuna

dobrovoljnih darivatelja s uključena 74 registra iz 53 zemlje te 49 banaka krvi iz pupkovine iz 33

zemlje. Najveći udio u broju dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u imaju europske zemlje i SAD

(Slika 11). S druge strane, udio dobrovoljnih darivatelja iz azijskih zemalja, unatoč velikom

broju stanovnika, iznosi samo 14%. Broj dobrovoljnih darivatelja KMS u nacionalnim registrima

europskih zemalja uključenim u rad BMDW-a prikazan je na Slici 12. Treba spomenuti da se

Njemačka ističe kao zemlja s najvećim brojem dobrovoljnih darivatelja u Europi, odnosno ona je

jedina europska zemlja koja ima više od milijun dobrovoljnih darivatelja [20].

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

2008 2009 2010 2011 2012 2013

16

Slika 10. Broj nacionalnih registara dobrovoljnih darivatelja uključenih u rad BMDW-a (engl.

Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]).

Slika 11. Udio broja dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u (engl. Bone Marrow Donors

Worldwide) po kontinentima. (Preuzeto s [20]).

17

Slika 12. Broj darivatelja u europskim zemljama čiji su nacionalni registri uključeni u BMDW

(engl. Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]).

18

2.0. Ciljevi istraživanja

1. Analizirati raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 među bolesnicima u

programu TKMS s nesrodnog darivatelja u Hrvatskoj.

2. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -DRB1 među bolesnicima u programu

TKMS s nesrodnog darivatelja.

3. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u

programu TKMS s nesrodnog darivatelja.

4. Utvrditi prisutnost neuobičajenih haplotipova HLA među bolesnicima

5. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u CBMDR-u.

6. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u BMDW-u.

7. Za bolesnike u programu TKMS iz Hrvatske odrediti „rizične“ alele HLA za

pronalaženje HLA podudarnog darivatelja 10/10.

19

3.0. Materijali i metode

3.1. Ispitanici

Ovo istraživanje obuhvatilo je 150 bolesnika koji su se liječili na Zavodu za

hematologiju, Klinike za internu medicinu, Kliničkog bolničkog centra Zagreb. Svim

ispitanicima je iz uzorka periferne krvi izolirana DNA te se odgovarajućim metodama pristupilo

postupku tipizacije tkiva, odnosno određivanju alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1.

3.2. Izolacija DNA

Izolacija DNA iz uzorka periferne krvi izvedena je upotrebom komercijalnog seta za

izolaciju (MagNA Pure LC DNA; Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany) prema

uputama koje je naveo proizvođač.

3.3. Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1

Aleli navedenih lokusa HLA određivali su se metodama PCR-SSO (engl. Polymerase

Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotides) i PCR-SSP (engl. Polymerase Chain

Reaction - Sequence Specific Primers). Metoda PCR-SSO manje je specifična i koristi se za

postupke tipizacije tkiva na tzv. niskoj ili srednjoj rezoluciji. Temelji se na klasičnom

umnožavanju specifičnog dijela DNA pomoću biotinom obilježenih početnica. Umnožena DNA

se zatim hibridizira upotrebom mikrosfera na koje su vezane DNA probe specifične za određene

oligonukleotidne sljedove. DNA probe označene su fluorokromom streptavidin-fikoeritrin (engl.

Streptavidin-Phycoerythrin - SAPE). Kromogena interakcija boje SAPE i biotina događa se

samo u slučaju specifičnog vezanja određene DNA probe za komplementaran slijed nukleotida

na amplifikonima što se očitava kao pozitivna reakcija pomoću Luminex tehnologije (The

Luminex, LABScan™ 100). S obzirom da se svaka mikrosfera sa specifičnim DNA probama

može razlikovati od ostalih (zahvaljujući endogenim bojama), uređaj može s visokom točnošću

odrediti koja se DNA proba vezala odnosno o kojem se alelnom obliku gena HLA radi. Rezultati

ovog postupka analiziraju se u programu Quicktype For Lifecodes (Slika 13).

20

Slika 13. Rezultati analize postupka hibridizacije DNA (metoda PCR-SSO). A) Proba CON je

kontrolna i mora biti pozitivna za sve uzorke. B) Mikrosfera 06 pokazuje pozitivnu reakciju na

uzorku C1. C) Na uzorku C1 mikrosfera 01 negativna.

Sljedeća metoda određivanja alela HLA znatno je osjetljivija i koristi se za postupke

tipizacije tkiva na visokoj rezoluciji. Radi se o metodi PCR-SSP koja se temelji na umnožavanju

specifičnog slijeda DNA upotrebom početnica specifičnih za jedan ili više alela HLA. Početnice

se vežu samo za one sljedove DNA kojima su u potpunosti komplementarne, stoga nastali

amplifikoni predstavljaju specifično umnožene alele pojedinog lokusa HLA. Nakon PCR

reakcije, uzorci umnožene DNA nanose se na agarozni gel u kombinaciji s bojom te se

primjenjuje tehnika elektroforetskog razdvajanja DNA na temelju veličine njezinih fragmenata

(Slika 14).

21

Slika 14. Prikaz rezultata tipizacije HLA metodom PCR-SSP. Uzorci 1, 3, 5, 7 i 8 predstavljaju

pozitivne reakcije sa specifično umnoženim PCR produktom dok su reakcije 2, 4 i 6 negativne

(vidljiva je samo kontrolna DNA).

3.4. Statistička analiza rezultata

Učestalosti alela i haplotipova HLA među našim bolesnicima određene su metodom

izravnog brojanja. Razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA između naše skupine bolesnika i

zdrave populacije kao i razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA u odnosu na druge

populacije u Europi utvrđene su upotrebom χ2

testa. Razina statističke značajnosti, odnosno P

vrijednost ispravljena je za svaki lokus HLA s obzirom na broj uočenih alela pojedinog lokusa

HLA. Podaci o učestalosti haplotipova među bijelcima europskog porijekla utvrđeni su pomoću

programa HaploStats [21].

22

4.0. Rezultati

4.1. Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u programu

nesrodne TKMS

Učestalost alela lokusa HLA-A kod 150 bolesnika uključenih u istraživanje prikazana je

u Tablici 2. Ukupan broj otkrivenih alela HLA-A bio je 24. Najčešći aleli HLA-A kod

navedenih ispitanika bili su: A*02:01, A*01:01, A*24:02, A*03:01, A*11:01 i A*26:01. Devet

alela: A*02:05, A*03:02, A*24:03, A*24:07, A*29:01, A*30:01, A*30:04, A*66:01, A*69:01 i

A*80:01 pojavili su se samo jednom među našim bolesnicima.

Tablica 2. Učestalost alela HLA-A među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150)

n - broj uočenih alela HLA; % - učestalost alela

Alel HLA-A* n % Alel HLA-A* n %

01:01 41 0,1367 26:01 15 0,0500

02:01 83 0,2767 29:01 1 0,0033

02:02 2 0,0067 29:02 3 0,0100

02:05 1 0,0033 30:01 1 0,0033

03:01 37 0,1233 30:04 1 0,0033

03:02 1 0,0033 31:01 6 0,0200

11:01 15 0,0500 32:01 13 0,0433

23:01 9 0,0300 33:01 5 0,0167

24:02 38 0,1267 66:01 1 0,0033

24:03 1 0,0033 68:01 13 0,0433

24:07 1 0,0033 69:01 1 0,0033

25:01 10 0,0333 80:01 1 0,0033

23

Analiza raspodjele alela HLA-B unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici 3. S

obzirom da je gen HLA-B najpolimorfniji gen HLA, 35 otkrivenih alela je u skladu s

očekivanjima. Najčešći alel ovog lokusa bio je B*51:01 s učestalošću od 13,0%, a još su samo

dva alela (B*18:01 i B*08:01) bila zastupljena s učestalošću većom od 10,0%. Aleli HLA-B s

najmanjom zastupljenošću bili su: B*07:04, B*07:05, B*14:01, B*41:01, B*45:01, B*50:01 i

B*53:01.

Tablica 3. Učestalost alela HLA-B kod bolesnika u programu nesrodne TKMS (N=150)

n - broj uočenih alela; % - učestalost alela

Alel HLA-B* n % Alel HLA-B* n %

07:02 22 0,0733 40:02 6 0,0200

07:04 1 0,0033 41:01 1 0,0033

07:05 1 0,0033 41:02 4 0,0133

08:01 31 0,1033 44:02 12 0,0400

13:02 6 0,0200 44:03 6 0,0200

14:01 1 0,0033 44:05 3 0,0100

14:02 6 0,0200 44:27 5 0,0167

15:01 6 0,0200 45:01 1 0,0033

18:01 33 0,1100 49:01 8 0,0267

27:02 9 0,0300 50:01 1 0,0033

27:05 12 0,0400 51:01 39 0,1300

35:01 21 0,0700 52:01 8 0,0267

35:02 2 0,0067 53:01 1 0,0033

35:03 13 0,0433 55:01 3 0,0100

35:08 3 0,0100 56:01 3 0,0100

38:01 9 0,0300 57:01 10 0,0333

39:01 8 0,0267 58:01 3 0,0100

40:01 2 0,0067

24

U Tablici 4 prikazana je učestalost alela HLA-C među nesrodnim bolesnicima

uključenim u ovo istraživanje. Ukupno je pronađen 21 različiti alel HLA-C, od kojih je najveću

učestalost pokazao alel C*07:01 (20,3%), slijedio ga je alel C*04:01 (14,7%) te aleli C*02:02

(9,7%), C*12:03 (9,3%) i C*07:02 (8,0%). Najmanje zastupljeni aleli HLA-C bili su C*07:18,

C*16:02 i C*17:01 s učestalošću od svega 0,3%.

Tablica 4. Učestalost alela HLA-C među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150)

Alel HLA-C* n %

01:02 13 0,0433

02:02 29 0,0967

03:02 2 0,0067

03:03 7 0,0233

03:04 2 0,0067

04:01 44 0,1467

05:01 11 0,0367

06:02 20 0,0667

07:01 61 0,2033

07:02 24 0,0800

07:04 5 0,0167

07:18 1 0,0033

08:02 7 0,0233

12:02 9 0,0300

12:03 28 0,0933

14:02 13 0,0433

15:02 16 0,0533

16:01 2 0,0067

16:02 1 0,0033

17:01 1 0,0033

17:03 4 0,0133

n - broj uočenih alela; % - učestalost alela

25

Analiza raspodjele alela HLA-DRB1 unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici

5. U ovom je istraživanju utvrđeno 30 različitih alela HLA-DRB1. Tri alela: DRB1*03:01

(15,3%), DRB1*01:01 (11,7%) i DRB1*11:04 (10,7%) bila su najčešća, dok su preostali

otkriveni aleli DRB1 bili zastupljeni s učestalošću manjom od 10,0%. Najraznovrsniji gen DRB1

u ovom istraživanju bio je DRB1*04 sa sedam različitih alela (DRB1*04:01, DRB1*04:02,

DRB1*04:03, DRB1*04:04, DRB1*04:07, DRB1*04:08 i DRB1*04:15). Najmanje zastupljeni

aleli HLA-DRB1 bili su: DRB1*01:03, DRB1*04:03, DRB1*04:07, DRB1*04:15,

DRB1*11:02, DRB1*11:03, DRB1*11:15, DRB1*11:28 i DRB1*16:02.

Tablica 5. Učestalost alela HLA-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150)

Alel HLA-DRB1* n % Alel HLA-DRB1* n %

01:01 35 0,1167 11:02 1 0,0033

01:02 2 0,0067 11:03 1 0,0033

01:03 1 0,0033 11:04 32 0,1067

03:01 46 0,1533 11:15 1 0,0033

04:01 5 0,0167 11:28 1 0,0033

04:02 3 0,0100 12:01 4 0,0133

04:03 3 0,0100 13:01 14 0,0467

04:04 5 0,0167 13:02 11 0,0367

04:07 1 0,0033 13:03 5 0,0167

04:08 2 0,0067 14:01 3 0,0100

04:15 1 0,0033 14:54 4 0,0133

07:01 29 0,0967 15:01 25 0,0833

08:01 4 0,0133 15:02 7 0,0233

10:01 4 0,0133 16:01 25 0,0833

11:01 24 0,0800 16:02 1 0,0033

n – broj uočenih alela; % - učestalost alela

26

Učestalost alela lokusa HLA-DQB1 kod 150 tipiziranih bolesnika uključenih u

istraživanje prikazane su u Tablici 6. Ukupno 16 različitih alela HLA-DQB1 lokusa otkriveno je

unutar ove skupine bolesnika. Najučestalijih 5 alela DQB1 bili su: DQB1*03:01 (23,3%),

DQB1*02:01 (15,3%), DQB1*05:01 (14,0%), DQB1*05:02 (9,0%) i DQB1*06:02 (8,3%).

Najmanje zastupljeni aleli bili su DQB1*03:04 i DQB1*03:19, s učestalošću od svega 0,3%, dok

je alel DQB1*06:09 bio prisutan dvaput.

Tablica 6. Učestalost alela HLA-DQB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150)

n – broj uočenih alela; % - učestalost alela

Alel HLA-DQB1* n %

02:01 46 0,1533

02:02 20 0,0667

03:01 70 0,2333

03:02 17 0,0567

03:03 10 0,0333

03:04 1 0,0033

03:19 1 0,0033

04:02 3 0,0100

05:01 42 0,1400

05:02 27 0,0900

05:03 7 0,0233

06:01 7 0,0233

06:02 25 0,0833

06:03 14 0,0467

06:04 8 0,0267

06:09 2 0,0067

27

4.2. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS

U Tablici 7 prikazana je raspodjela 30 najčešćih haplotipova HLA-A-B-DRB1

uočenih unutar skupine bolesnika uključenih u program nesrodne TKMS. Ukupan broj utvrđenih

haplotipova HLA-A-B-DRB1 bio je 227, dakle 197 haplotipova HLA-A-B-DRB1 pojavilo se

samo jednom. Iz Tablice 7 vidljivo je da su samo četiri haplotipa HLA-A-B-DRB1 bila prisutna

više od pet puta. Najučestaliji haplotip bio je HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%) kojeg

je imalo čak 22 bolesnika.

Tablica 7. Prikaz najučestalijih haplotipova HLA-A-B-DRB1 unutar skupine bolesnika u

programu TKMS (N=150)

HLA-A*-B*-DRB1* n % HLA-A*-B*-DRB1* n %

01:01-08:01-03:01 22 0,0733 02:01-35:01-13:01 2 0,0067

02:01-18:01-11:04 8 0,0267 02:01-41:02-13:03 2 0,0067

02:01-51:01-01:01 7 0,0233 02:01-44:02-15:01 2 0,0067

01:01-57:01-07:01 6 0,0200 02:01-44:03-07:01 2 0,0067

01:01-52:01-15:02 4 0,0133 02:01-44:27-16:01 2 0,0067

03:01-18:01-11:04 4 0,0133 02:01-51:01-11:01 2 0,0067

02:01-27:05-01:01 3 0,0100 03:01-07:02-11:01 2 0,0067

02:01-51:01-16:01 3 0,0100 03:01-07:02-13:02 2 0,0067

11:01-35:01-01:01 3 0,0100 03:01-07:02-15:01 2 0,0067

24:02-51:01-01:01 3 0,0100 03:01-35:01-11:04 2 0,0067

01:01-51:01-15:01 2 0,0067 03:01-51:01-01:01 2 0,0067

02:01-07:02-15:01 2 0,0067 24:02-07:02-15:01 2 0,0067

02:01-08:01-03:01 2 0,0067 24:02-57:01-07:01 2 0,0067

02:01-15:01-11:04 2 0,0067 26:01-13:02-07:01 2 0,0067

02:01-27:02-16:01 2 0,0067 68:01-58:01-13:02 2 0,0067

n – broj haplotipova; % - učestalost haplotipova

28

4.3. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika u program nesrodne

TKMS

Tablica 8 prikazuje 10 HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 haplotipova uočenih dva ili više puta

među našim bolesnicima. Učestalost visoko očuvanog haplotipa HLA-A*01:01-B*08:01-

C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01 ostala je nepromijenjena u usporedbi s Tablicom 7 gdje su

promatrani haplotipovi HLA-A-B-DRB1. Učestalost ostalih haplotipova HLA promijenila se

neznatno, što jasno govori o snažnoj neravnoteži udruživanja između pojedinih alela HLA zbog

koje se, čak i u slučaju proširenja promatranog haplotipa HLA s dva dodatna lokusa, učestalost

haplotipova HLA ne mijenja značajno.

Važno je spomenuti da su haplotipovi 150 bolesnika uključenih u ovo istraživanje

utvrđeni na temelju podataka o tipizaciji članova uže obitelji, primjenom Mendelovih zakona

nasljeđivanja odnosno segregacije (tzv. segregacijska analiza).

Tablica 8. Prikaz deset najučestalijih haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika

uključenih u program nesrodne TKMS

HLA-A*-B*-C*-DRB1*-DQB1* n %

01:01-08:01-07:01-03:01-02:01 22 0,0733

02:01-18:01-07:01-11:04-03:01 7 0,0233

02:01-51:01-14:02-01:01-05:01 5 0,0166

01:01-57:01-06:02-07:01-03:03 5 0,0166

01:01-52:01-12:02-15:02-06:01 4 0,0133

03:01-18:01-07:01-11:04-03:01 4 0,0133

11:01-35:01-04:01-01:01-05:01 3 0,0100

02:01-27:05-02:02-01:01-05:01 2 0,0066

02:01-51:01-14:02-16:01-05:02 2 0,0066

24:02-51:01-14:02-01:01-05:01 2 0,0066

n – broj uočenih haplotipova; % - učestalost haplotipova

29

Tablica 9 prikazuje haplotipove HLA unutar naše skupine bolesnika s neuobičajenim

kombinacijama alela HLA-B-C, odnosno HLA-DRB1-DQB1. Kod 15 bolesnika (10%) uočena je

neuobičajena kombinacija alela na lokusima HLA-B i -C, od toga kombinacija B*35:03-C*12:03

kod čak tri bolesnika. Neuobičajene kombinacije alela DRB1 i DQB1 uočili smo u haplotipu kod

četiri bolesnika (2,7%)

Tablica 9. Prikaz neuobičajenih kombinacija alela HLA-B-C i HLA-DRB1-DQB1 kod

bolesnika u programu nesrodne TKMS

Haplotip

HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1*

02:01 15:01 02:02 07:01 02:02

01:01 18:01 07:18 03:01 02:01

02:01 18:01 03:02 11:04 03:01

24:02 35:01 14:02 03:01 02:01

11:01 35:03 12:03 04:08 03:04

24:02 35:03 12:03 07:01 03:03

26:01 35:03 12:03 07:01 02:02

26:01 35:08 12:03 04:04 03:01

23:01 44:02 04:01 07:01 02:02

24:02 44:02 04:01 13:01 06:03

02:02 49:01 04:01 03:01 02:01

02:01 51:01 06:02 11:01 03:01

03:01 51:01 12:02 01:01 05:01

03:01 51:01 16:01 11:02 03:19

31:01 51:01 05:01 13:01 06:03

29:01 07:05 15:02 11:04 02:02

03:01 39:01 12:03 12:01 02:02

24:02 49:01 07:01 13:02 06:02

02:01 44:05 02:02 15:01 05:02

neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C

neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1

30

4.4. Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike u

programu nesrodne TKMS

U Tablici 10 prikazane su tipizacije HLA-A, -B, -DRB1 bolesnika u programu nesrodne

TKMS za koje je pronađeno pet ili više mogućih darivatelja u CBMDR-u. Pri tome se radi o

darivateljima koji su s bolesnikom HLA podudarni 6/6 i to na niskoj rezoluciji.

Tablica 10. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali pet ili više mogućih darivatelja

(HLA podudarnost 6/6).

n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru

Bolesnik

Tipizacija

n HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1*

B50 01:01 01:01 08:01 08:01 03:01 03:01 107

B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 74

B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03:01 47

B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07:01 31

B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10:01 10

B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11:28 8

B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15:01 8

B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11:04 7

B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13:01 6

B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13:02 6

B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01:01 5

B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11:04 5

B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11:01 5

B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01:01 5

B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12:01 5

B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16:01 5

B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11:04 5

31

Najveći broj HLA podudarnih nesrodnih darivatelja pronađeno je za one bolesnike koji su bili

homozigoti ili su barem na jednom kromosomu 6 imali visoko očuvani haplotip HLA-A*01:01-

B*08:01-DRB1*03:01.

Iz rezultata prikazanih u Tablici 11 vidljivo je da su za 13 bolesnika pronađena 2-4 moguća

darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u hrvatskom registru.

Tablica 11. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali 2-4 moguća darivatelja

(HLA podudarnost 6/6).

n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru

Bolesnik

Tipizacija

n HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n

B17 03:01 02:01 07:02 52:01 13:02 15:02 4

B18 32:01 03:01 07:02 51:01 15:01 01:01 3

B19 24:02 23:01 35:02 49:01 11:01 04:15 3

B20 01:01 02:01 52:01 27:02 15:02 16:01 3

B21 02:01 01:01 44:27 57:01 16:01 07:01 3

B22 03:01 02:01 18:01 07:02 01:01 14:54 2

B23 01:01 02:01 52:01 18:01 15:02 11:04 2

B24 03:01 24:02 35:01 51:01 11:04 01:01 2

B25 01:01 26:01 49:01 38:01 04:04 13:01 2

B26 32:01 03:01 07:02 35:01 04:01 16:01 2

B27 29:02 02:01 44:03 18:01 07:01 11:04 2

B28 25:01 26:01 18:01 38:01 14:01 04:04 2

B29 11:01 24:02 35:01 27:02 01:01 16:01 2

32

Za ukupno 20 bolesnika pronađen je samo jedan mogući darivatelj HLA podudarnosti 6/6 (niska

rezolucija) u hrvatskom registru što je vidljivo iz Tablice 12.

Tablica 12. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali jednog mogućeg darivatelja

(HLA podudarnost 6/6)

n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru

Bolesnik

Tipizacija

N HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n

B30 02:01 32:01 51:01 35:01 01:01 16:01 1

B31 02:01 24:02 51:01 57:01 16:01 07:01 1

B32 01:01 26:01 08:01 57:01 03:01 11:01 1

B33 33:01 24:02 14:02 44:05 01:02 11:04 1

B34 02:01 11:01 35:01 35:03 13:02 01:03 1

B35 23:01 24:02 44:02 07:02 07:01 15:01 1

B36 01:01 11:01 57:01 35:01 07:01 16:01 1

B37 02:01 26:01 07:02 38:01 04:02 14:54 1

B38 11:01 02:01 18:01 51:01 11:04 13:01 1

B39 02:01 03:01 44:03 39:01 07:01 12:01 1

B40 02:01 26:01 35:08 38:01 16:01 04:02 1

B41 03:01 02:01 07:02 15:01 01:01 07:01 1

B42 02:01 26:01 27:02 38:01 07:01 04:01 1

B43 24:02 23:01 44:02 55:01 13:01 07:01 1

B44 24:02 02:01 40:01 44:03 15:01 07:01 1

B45 01:01 24:02 57:01 51:01 07:01 11:01 1

B46 02:01 03:01 44:05 18:01 15:01 11:04 1

B47 02:01 68:01 07:02 27:02 15:01 16:01 1

B48 01:01 24:02 57:01 35:03 07:01 07:01 1

B49 33:01 24:02 14:02 40:02 01:01 11:01 1

33

Na temelju podataka prikazanih u Tablicama 10, 11 i 12 vidljivo je da je 50 bolesnika

imalo mogućeg darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u CBMDR-u. Preostalih

100 bolesnika nije imalo niti jednog mogućeg darivatelja u našem registru i za njih je trebalo

tražiti darivatelja u BMDW-u.

S obzirom da BMDW obuhvaća podatke velikog broja registara dobrovoljnih darivatelja,

a koji su tipizirani na različitoj rezoluciji, napravili smo dvije različite analize. Naime, pojedini

registri tipiziraju svoje darivatelje na niskoj rezoluciji za lokuse HLA-A, -B i -DRB1, dok drugi

registri tipizaciju svojih darivatelja rade na srednjoj i visokoj rezoluciji za 4 ili 5 lokusa (HLA-A,

-B, -C, -DRB1 i -DQB1). S druge strane, postoji i određeni broj darivatelja tipiziranih serološkim

metodama. Rezultati pretraživanja BMDW-a za naše bolesnike prikazani su u Tablici 13. Za

ukupno 18 bolesnika pronađeno je deset ili više mogućih darivatelja (HLA podudarnost 10/10) u

BMDW-u.

34

Tablica 13. Prikaz bolesnika s deset ili više mogućih darivatelja u svjetskom registru

(HLA podudarnost 10/10).

Bolesnik

Tipizacija n HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1*

B50 01:01 01:01 08:01 08:01 07:01 07:01 03:01 03:01 02:01 02:01 1161

B3 01:01 23:01 08:01 44:03 07:01 04:01 03:01 07:01 02:01 02:02 356

B2 11:01 01:01 35:01 08:01 04:01 07:01 01:01 03:01 05:01 02:01 237

B51 01:01 02:01 08:01 52:01 07:01 12:02 03:01 15:02 02:01 06:01 93

B1 01:01 02:01 08:01 18:01 07:01 07:01 03:01 11:01 02:01 03:01 51

B52 02:01 03:01 07:02 44:02 07:02 05:01 07:01 04:01 02:02 03:01 40

B27 29:02 02:01 44:03 18:01 16:01 07:01 07:01 11:04 02:02 03:01 34

B53 01:01 02:01 08:01 14:01 07:01 08:02 03:01 07:01 02:01 02:02 33

B54 01:01 02:01 08:01 51:01 07:01 01:02 03:01 11:01 02:01 03:01 22

B10 02:01 03:01 35:01 51:01 04:01 14:02 08:01 01:01 04:02 05:01 20

B13 01:01 11:01 08:01 27:05 07:01 02:02 03:01 01:01 02:01 05:01 14

B55 03:01 02:01 07:02 38:01 07:02 12:03 15:01 11:04 06:02 03:01 13

B56 24:02 02:01 51:01 07:02 14:02 07:02 01:01 15:01 05:01 06:02 13

B57 01:01 24:02 57:01 51:01 06:02 15:02 07:01 11:01 03:03 03:01 12

B23 01:01 02:01 52:01 18:01 12:02 07:01 15:02 11:04 06:01 03:01 12

B12 01:01 25:01 08:01 40:02 07:01 02:02 03:01 11:01 02:01 03:01 12

B58 24:02 01:01 18:01 57:01 07:01 06:02 11:04 07:01 03:01 03:03 11

B8 01:01 24:02 08:01 51:01 07:01 14:02 03:01 13:01 02:01 06:03 10

n – broj mogućih darivatelja u svjetskom registru

35

Usporedba broja nesrodnih darivatelja podudarnih s bolesnikom na 3 lokusa HLA (HLA

podudarnost 6/6) u CBMDR-a i BMDW-a prikazana je u Tablici 14. Najveći broj darivatelja

pronađenih u oba registra imaju oni bolesnici kod kojih je utvrđeno prisustvo haplotipa: HLA-

A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01.

Tablica 14. Usporedba broja darivatelja u CBMDR-u HLA podudarnosti 6/6 i broja

mogućih darivatelja u BMDW-u

n1 – broj darivatelja u hrvatskom registru; n

2 – broj mogućih darivatelja u svjetskom registru

Bolesnik Tipizacija

n1

n2 HLA-A* HLA-B* HLA-C*

B50 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 107 46369

B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 74 3505

B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03:01 47 9439

B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07:01 31 11021

B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10:01 10 26

B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11:28 8 198

B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15:01 8 390

B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11:04 7 210

B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13:01 6 515

B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13:02 6 241

B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01:01 5 771

B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11:04 5 124

B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11:01 5 141

B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01:01 5 956

B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12:01 5 290

B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16:01 5 25

B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11:04 5 574

36

5.0. Rasprava

Alogenična TKMS je metoda liječenja mnogih malignih bolesti i genetskih poremećaja

krvotvornog sustava. Ukoliko unutar obitelji nema HLA podudarnog darivatelja, a procijenjeno

je da bolesnik zadovoljava sve uvjete za primjenom ove terapijske metode, pristupa se potrazi za

fenotipski HLA podudarnim nesrodnim darivateljem. Kao što je u radu navedeno, približno 2/3

bolesnika unutar obitelji nema HLA podudarnog darivatelja što jasno pokazuje kolika je važnost

nesrodne TKMS. Upravo činjenica da se u tolikom postotku slučajeva pristupa potrazi za

nesrodnim darivateljem ukazuje na veliku potrebu za stvaranjem i razvojem nacionalnih registara

dobrovoljnih darivatelja KMS te njihovim uključivanjem u BMDW [11]. Pronalazak HLA

podudarnog darivatelja za 5 lokusa HLA (HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1) znatno otežava

činjenica da se radi o najpolimorfnijim genima kod čovjeka.

Osim uključivanja što većeg broja dobrovoljnih darivatelja u nacionalni i svjetski

registar, pronalasku HLA podudarnog nesrodnog darivatelja pridonose i analize raspodjele alela

i haplotipova HLA unutar pojedine populacije [11]. Cilj ovog rada bio je analizirati upravo

raspodjelu alela i haplotipova HLA kod skupine od 150 bolesnika uključenih u program

nesrodne TKMS u Hrvatskoj te odrediti koji su to neuobičajeni aleli ili haplotipovi HLA koji

otežavaju pronalazak HLA podudarnog nesrodnog darivatelja.

Raspodjela alela HLA-A među bolesnicima nije pokazala statistički značajna odstupanja

od raspodjele u zdravoj populaciji, odnosno bila je u skladu s istraživanjem provedenim 2014. na

uzorku od 4000 dobrovoljnih darivatelja iz CBMDR-a [12]. Međutim, među našim bolesnicima

jedan bolesnik imao je alel A*29:01 koji nije uočen među dobrovoljnim darivateljima u

prethodnom istraživanju [12]. Riječ je o alelu koji je rijedak među bijelcima i češće se pojavljuje

u pojedinim populacijama u Aziji i Africi [13]. Na lokusu HLA-B kod naših bolesnika nije

otkriven niti jedan novi alel u odnosu na istraživanje iz 2014. godine [12]. S druge strane, na

lokusu HLA-DRB1 među našom skupinom bolesnika uočena su dva alela koja nisu bili

otkrivena među dobrovoljnim darivateljima u već spomenutom istraživanju [12]. Naime, jedan je

bolesnik imao alel HLA-DRB1*11:15, a drugi alel HLA-DRB1*11:28. Trenutačno nema velikog

broja podataka o učestalosti spomenutih alela u svijetu, ali je svakako poznato (prema

rezultatima brojnih populacijskih istraživanja) da su aleli DRB1*11:15 i DRB1*11:28 relativno

rijetki, kako u hrvatskoj populaciji tako i u ostalim populacijama u Europi.

37

Usporedba učestalosti alela HLA među našim ispitanicima s rezultatima istraživanja

provedenima proteklih godina u Europi pokazala je statistički značajna odstupanja za alele:

B*27:02, B*40:02 i DRB1*11:04 koji su učestaliji u našoj populaciji (bolesničkoj i zdravoj),

nego u pojedinim populacijama na sjeveru i zapadu Europe [12, 14, 15, 22]. Naime, alel B*27:05

je puno češći, u usporedbi s alelom B*27:02, u populacijama središnje i zapadne Europe. S druge

strane, u hrvatskoj populaciji razlika u učestalosti između dva spomenuta alela znatno je manje

izražena. To je potvrđeno i ovim istraživanjem. Kod 12 od 21 (57,1%) HLA B*27 pozitivnog

bolesnika uočen je alel 27:05, dok je kod preostalih devet bolesnika (42,9%) uočen alel 27:02.

Slični su rezultati dobiveni i istraživanjem provedenim 2014. godine na 4000 dobrovoljnih

darivatelja [12]. Učestalost alela B*27:02 (3%) u skladu je s njegovom učestalošću kod

populacija na području jugoistočne Europe [12].

Nadalje, ovim je istraživanjem potvrđena znatno veća učestalost alela B*40:02 (2%) u

odnosu na alel B*40:01 (0,7%) među našim bolesnicima što je u skladu s učestalošću tog alela

među zdravim osobama. Taj rezultat statistički značajno odstupa od rezultata drugih

populacijskih istraživanja gdje je uočena veća učestalost alela B*40:01 u odnosu na alel B*40:02

kod mnogih europskih populacija (Austrijanci, Belgijci, Britanci, Česi, Nijemci, Poljaci,

Rumunji, Talijani) [14, 15].

Usporedba alela DRB1*11:01 i DRB1*11:04 pokazala je da su oba prisutna među našim

ispitanicima sa sličnom učestalošću (Tablica 5). Takav rezultat u skladu je s prethodnim

istraživanjem provedenim među dobrovoljnim darivateljima u Hrvatskoj [12]. Statistički

značajna razlika uočena je usporedbom učestalosti alela DRB1*11:04 među našim ispitanicima s

rezultatima istraživanja provedenim među populacijama središnje i sjeverne Europe (Austrijanci,

Belgijanci, Česi, Nijemci, Nizozemci, Poljaci) te podataka iz AFND (engl. Allele Frequency Net

Database) koji jasno pokazuju da je u spomenutim populacijama češći alel DRB1*11:01.

Analizom rezultata o učestalosti haplotipova HLA-A-B-DRB1 u ispitivanoj skupini

uočeno je da su dva najučestalija haplotipa HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 i A*02:01-

B*18:01-DRB1*11:04 što je u skladu s rezultatima ostalih istraživanja gdje su dva navedena

haplotipa također najčešća među zdravim ispitanicima u hrvatskoj populaciji [12]. Haplotip

HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 jedan je od najčešćih haplotipova u svim europskim

populacijama (do sada referiranim), dok učestalost haplotipa HLA-A*02:01-B*18:01-

DRB1*11:04 pokazuje regionalne razlike. Naime, puno je češći na jugu u odnosu na sjever

38

Europe. Pretpostavka je da se alel DRB1*11:04 (a time i navedeni haplotip) širio iz Male Azije

prema Europi, iz čega proizlaze i opisane regionalne razlike. Najučestaliji haplotip HLA-A-B-C-

DRB1-DQB1 među našim ispitanicima je A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-

DQB1*02:01, prisutan kod 22 bolesnika (7,3%) Riječ je o visoko očuvanom haplotipu.

Kod 19 bolesnika uočene su neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C, odnosno HLA-

DRB1-DQB1. Od toga je kod 15 bolesnika uočena neuobičajena kombinacija alela HLA-B-C, a

kod četiri bolesnika neuobičajena kombinacija alela HLA-DRB1-DQB1. Neuobičajena

kombinacija skupine alela B*35 (B*35:03 i B*35:08) s alelom C*12:03 uočena je kod četiri

bolesnika što je iznenađujući rezultat s obzirom da su aleli skupine B*35 u jakoj neravnoteži

udruživanja s alelom C*04:01.

Alel B*51:01, za razliku od alela skupine B*35, ne pokazuje tako snažnu neravnotežu

udruživanja niti s jednim alelom na lokusu HLA-C. U našoj populaciji najčešće dolazi u

kombinaciji s alelima: *C-01:02, C*02:02, C*14:02, C*15:02, C*16:02 od kojih najviše s alelom

C*14:02 i C*15:02. Iz tog su razloga haplotipovi s alelom B*51:01 (Tablica 9) neuobičajeni i

predstavljaju problem u pronalaženju 10/10 HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. Rezultati

ovog istraživanja u skladu s istraživanjem provedenim među švicarskim bolesnicima u kojem su

autori došli do sličnih zaključaka [16].

Haplotip B*44:02-C*04:01, uočen kod dva bolesnika, također predstavlja rizičan

čimbenik u pronalaženju HLA podudarnog darivatelja jer alel B*44:02 najčešće dolazi u

kombinaciji s alelom C*05:01 (>70% slučajeva) dok se alel C*04:01 pojavljuje češće u

kombinaciji s alelom B*44:03 [17].

Analiza broja darivatelja s obzirom na genotip HLA pokazala je da je najveći broj

darivatelja imao bolesnik „B50” koji je bio homozigot za visoko očuvani haplotip: HLA-

A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01. To je bilo i za očekivati s obzirom na

rasprostranjenost tog haplotipa u svijetu. Potrebno je istaknuti da za 75 bolesnika, u trenutku

pretraživanja BMDW-a, nije bilo niti jednog darivatelja koji je bio HLA podudaran s bolesnikom

za alele lokusa HLA-A, -B i –DRB1 na visokoj rezoluciji. Međutim, unutar ove skupine

bolesnika, za njih 69 postojala je mogućnost da će pronaći darivatelja podudarnog za alele HLA-

A, -B i -DRB1. Za 6 bolesnika (Tablica 15), u trenutku pretraživanja CBMDR-a i BMDW-a,

nije postojala mogućnost da će pronaći HLA podudarnog darivatelja 6/6, a time ni 10/10 (visoka

rezolucija). Riječ je o bolesnicima koji imaju ili neki rijetki alel (npr. bolesnik B62 ima rijetki

39

alel na lokusu HLA-A - alel A*69:01; bolesnik B60 alel A*30:04; bolesnik B64 alel A*80:01) ili

imaju neuobičajene haplotipove HLA-A-B-DRB1 (preostala trojica bolesnika).

Tablica 15. Prikaz HLA tipizacije bolesnika kojima nije pronađen niti jedan mogući

darivatelj u svjetskom registru (HLA podudarnost 6/6).

Bolesnik Tipizacija

HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1*

B59 25:01 02:01 18:01 49:01 11:01 12:01

B60 30:04 30:01 13:02 08:01 07:01 07:01

B61 26:01 31:01 07:02 51:01 13:01 13:01

B62 26:01 69:01 35:08 51:01 04:04 04:07

B63 31:01 24:02 51:01 50:01 04:08 03:01

B64 01:01 80:01 18:01 58:01 03:01 03:01

40

6.0. Zaključak

1. Raspodjela alela na lokusima HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 unutar ispitivane skupine

bolesnika u programu TKMS s nesrodnog darivatelja u Hrvatskoj nije pokazala statistički

značajne razlike u usporedbi s učestalošću tih alela među zdravim ispitanicimna.

2. Najčešći aleli među našim ispitanicima bili su: HLA-A*02:01 (27,7%), B*51:01 (13,0%),

C*07:01 (20,3%), DRB1*03:01 (15,3%) i DQB1*03:01 (23,3%).

3. Otkriveno je 227 različitih haplotipova HLA-A-B-DRB1 među našim ispitanicima, od

čega se 197 haplotipova HLA pojavilo samo jednom. Najzastupljeniji je bio: HLA-

A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%).

4. Najučestaliji haplotip koji je obuhvatio 5 lokusa HLA bio je: HLA-A*01:01-B*08:01-

C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01 (7,3%) što je u skladu s podacima za kontrolnu

populaciju.

5. U istraživanoj skupini bolesnika, njih 19 (12,7%) imalo je neuobičajenu kombinaciju

alela u haplotipu HLA, od toga je 15 bolesnika imalo neuobičajenu kombinaciju alela

HLA-B-C, a 4 bolesnika neuobičajenu kombinaciju alela HLA-DRB1-DQB1.

6. Za ukupno 50 bolesnika pronađen je barem jedan HLA podudarni nesrodni darivatelj

(6/6, niska rezolucija) u CBMDR-u.

7. Za polovicu naših bolesnika, njih ukupno 75, pronađen je barem jedan HLA podudarni

nesrodni darivatelj u BMDW-u, dok za 6 bolesnika nije pronađen niti jedan darivatelj

koji bi s bolesnikom bio HLA podudaran 10/10.

8. Rijetki aleli (A*29:01, B*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15 i DRB1*11:28)

kao i neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C, odnosno HLA-DRB1-DQB1 pokazali su

se kao ograničavajući čimbenici u pronalasku HLA podudarnog nesrodnog darivatelja.

41

7.0. Literatura

[1] Mehra N. K. (2010): The HLA Complex in Biology and Medicine: A Resource Book.

Jaypee Brothers Medical Publishers Ltd., New Delhi.

[2] Andreis I., Batinić D., Čulo F., Grčević D., Lukinović-Škudar V., Marušić M., Taradi M.,

Višnjić D. (2009): Imunologija. Medicinska naklada, Zagreb.

[3] Kindt T. J., Osborne B. A., Goldsby R. A. (2006): Kuby Immunology. Freeman, W. H. &

Company, New York.

[4] Undlien D. E., Lie B. A., Thorsby E. 2001. HLA complex genes in type 1 diabetes and other

autoimmune diseases.Which genes are involved? Trends in Gentics 17, 93-100.

[5] Williams T. M. 2001. Human leukocyte antigen gene polymorphism and the

histocompatibility laboratory. The Journal of Molecular Diagnostics 3, 98-104.

[6] Badrinath S., Huyton T., Blasczyk R., Bade-Doeding C. (2014): HLA Class I Polymorphism

and Tapasin Dependency. U: Xi Y. (ur.) HLA and Associated Important Diseases. London,

InTech, 41-60.

[7] Grubić Z. 2012. Tipizacija HLA u procjeni kompatibilnog darivatelja. Bilten KROHEMA 4,

42-44.

[8] Nunes J. M., Buhler S., Roessli D., Sanchez-Mazas A. 2014. The HLA-net GENE[RATE]

pipeline for effective HLA data analysis and its application to 145 population samples from

Europe and neighbouring areas. Tissue Antigens 83, 307-323.

42

[9] Serventi-Seiwerth R., Mikulić M., Mrsić M., Grubić Z., Bojanić I., Štingl K., Labar B. 2011.

Transplantacija alogenih krvotvornih matičnih stanica od HLA podudarnog nesrodnog

darivatelja. Medicina Fluminensis 47, 381-388.

[10] Mikulić M., Grubić Z. 2012. Postupak pronalaženja nesrodnog darivatelja krvotvornih

matičnih stanica. Bilten KROHEMA 4, 39-41.

[11] Gourraud P. A., Balère M. L., Faucher C., Loiseau P., Dormoy A., Marry E., Garnier F.

2014. HLA phenotypes of candidates for HSCT: comparing transplanted versus non-

transplanted candidates, resulting in the predictive estimation of the probability to find a

10/10 HLA matched donor. Tissue Antigens 83, 17-26.

[12] Grubic Z., Burek Kamenaric M., Mikulic M., Stingl Jankovic K., Maskalan M., Zunec R.

2014. HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1 allele and haplotype diversity among volunteer

bone marrow donors from Croatia. International Journal of Immunogenetics. 41, 211-221.

[13] Brézin A. P., Monnet D., Cohen J. H.M., Levinson R. D. 2012. HLA-A29 and Birdshot

Chorioretinopathy. Ocular Immunology and Inflammation 19, 397-400.

[14] Pingel J., Solloch U.V., Hofmann J.A., Lange V., Ehninger G., Schmidt A.H. 2012. High-

resolution HLA haplotype frequencies of stem cell donors in Germany with foreign

parentage: how can they be used to improve unrelated donor searches? Human Immunology

74, 330-340

43

[15] Testi M., Andreani M., Locatelli F., Arcese W., Troiano M., Battarra M., Gaziev J.,

Lucarelli G. 2014. Influence of HLA characteristics of Italian patients on donor search

outcome in unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Tissue Antigens 84, 198-205.

[16] Bettens F., Nicoloso de Faveri G., Tiercy J.M. 2009. HLA-B51 and haplotypic diversity of

B-Cw associations: implications for matching in unrelated hematopoietic stem cell

transplantation. Tissue Antigens 73, 316-325.

[17] Cao K., Hollenbach J., Shi X., Shi W., Chopek M., Fernandez-Vina M.A. 2001.

Analysis of the frequencies of HLA-A, B, and C alleles and haplotypes in the five major

ethnic groups of the United States reveals high levels of diversity in these loci and

contrasting distribution patterns in these population. Human Immunology 62, 1009-1030.

[18] http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html

[19] http://www.pypop.org/popdata/index.html

[20] http://www.bmdw.org/index.php?id=97

[21] http://www.haplostats.org/haplostats?execution=e1s1

[22] http://www.allelefrequencies.net/

Životopis

Rođen sam 22. svibnja 1990. u Slavonskom Brodu. Osnovnu školu Ivan Goran Kovačić u

Slavonskom Brodu završio sam 2005. godine. Iste godine upisao sam srednju školu,

Gimanziju Matija Mesić u Slavonskom Brodu, koju sam završio 2009. godine.

Preddiplomski studij Znanosti o okolišu na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu,

Sveučilišta u Zagrebu upisao sam 2009., a 2012. stekao sam zvanje prvostupnika struke

Znanosti o okolišu (univ. bacc. oecol.), obranivši Seminarski rad pod nazivom “Bakterije kao

indikatori kvalitete vode”. Iste sam godine upisao diplomski studij Eksperimentalne biologije

(modul: Fiziologija i imunobiologija). Diplomirao sam 6. veljače 2015. godine obranivši

diplomski rad: “Raznovrsnost alela HLA među bolesnicima u programu transplantacije

krvotvornih matičnih stanica”, pod mentorstvom prof. dr. sc. Zorane Grubić.