HLA TAYİNİNDE KULLANILANYÖNTEMLER,SORUNLAR

ve ÇÖZÜM ÖNERİLERİ

Dr. Türkan Patıroğlu

Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi

Pediatrik Hematoloji ve İmmünoloji Bilim Dalları Kayseri

HLA-Klinik önemi

• Antropolojik çalışmalar

• Babalık tayini

• Hastalıklarla ilişki

• Transplantasyon:

Renal: Graft ömrünü etkiler,

Renal ve pankreas:HLA-DR daha önemli

KİT: Tam uyum (GvHH)

Güvenirlik

• HLA-klas I ve klas-II için %97

HLA Tiplendirme Testleri

Serolojik test

Mikrolenfositotoksisite

Moleküler testler

(PCR’a dayalı testler)SP,SSO,SSPC,SBT

Hücresel testler (Miks lenfosit Reaksiyonu)

Serolojik Testler

MakroaglütinasyonMikrolenfositotoksisite

Seroloji Plakları

Klas-I ve II

Kuyucuk sayısı:

60,72,120,144

Kullanılan Hücrelerin Özellikleri

• Viabilite

• Saflık

• Temizlik

• Hücrelerin izolasyonu

-48 st içinde kullanılmalı

-Buffy coat eldesi

-Magnetik boncuklar ile T-B hücre

saflaştırılması

Mikrolenfositotoksisite Yöntem

• Plak oda ısısında eritilir

• Kompleman hazırlanır(1viyal 2 ml distile su)

• 1 µl hücre süsp. kuyucuklara konur

• Oda ısısında(18-22 C) 30 dk beklenir

• 5 µl tavşan komplemanı eklenir

• 1 µl boya solüsyonu eklenir

• +4 C’de 15 dk. karanlıkta saklanır

• Okuma (floresan ataçmanlı mikroskopta)

Mikrolenfositotoksisite Skorlama

Ölü hücre % Skor Değerlendirme

0-10 1 (-)

11-20 2 Olası (-)

21-50 4 Zayıf (+)

51-80 6 (+)

81-100 8 Kuvvetli (+)

Mikrolenfositotoksisite Sorunlar

Yalancı pozitiflik:

• Lenfosit kalitesinin kötü olması

• Kontaminasyon

• Komplemanın kuvvetli olması

• İnkübasyon sürelerinin uzaması

• Isının yüksek olması

• Diğer hatalı teknik detaylar

Mikrolenfositotoksisite Sorunlar

Yalancı negatiflik• Trombosit ve granülosit kontaminasyonu• Komplemanın unutulması• İnkübasyon sürelerinin kısa olması• Isının düşük olması• Hastanın aldığı ilaçlar• Diğer hatalı teknik detaylar

– Antiserumun bozuk olması, – Uygunsuz taşınma– Kuyucuklardaki hücre sayısının fazlalığı

Mikrolenfositotoksisite

Avantajları

• Basit• Hızlı

Dezavantajları

• Hata payı yüksek (ölü hücrelerin değerlendirilmesi subjektif)

• Yetersiz B lenfosit izolasyonu(klas-II için)

• CREG• Tekrarı zor (Ag-Ab-C birleşmesine bağlı)

• Saptanamayan aleller veya tek alelsaptanması

• Yanlış saptanan aleller

Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?

Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)

olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir

Bw4, Bw 6 Birliktelikleri

Bw4 Bw6

B5 B53 B7 B41 B65(14)

B5102 B57(17) B703 B42 B67

B5103 B58(17) B8 B45(12) B70

B13 B59 B14 B46 B71(70)

B17 B63(15) B18 B48 B72(70)

B27 B77(15) B22 B50(21) B73

B37 B2708 B54(22) B75(15)

B38(16) A9 B35 B55(22) B76(15)

B44(12) A23(9) B39(16) B56(22) B78

B47 A24(9) B 3901 B60(22) B81

B49(21) A2403 B3902 B61(40)

B51(5) A25(10) B40 B62(40)

B52(5) A32(19) B4005 B64(14)

Marsh SGE, Parham P, Barber LD, 2000

Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?

Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)

olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir

Cross Reaktif Antijen Grupları (CREG),

Bw4 Bw6 Bulunduran Antijenler

CREG Yer Alan Antijenler

A01C A1, A3, A11, A29, A30, A31, A36, A80

A10C A10, A11, A19, A25, A26, A32, A33, A34, A43, A66, A74

A02C A2, A9, A23, A24, A28, A68, A69, A203, A210, A2403, B17,

B57, B58

B05C B5, B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102, B5103

B07C B7, B8, B13, B22, B27, B40, B41, B42, B47, B48, B54, B55,

B56, B59, B60, B61, B67, B81, B82, B703

B08C B8, B14, B16, B18, B38, B39, B59, B64, B65, B67, B3901,

B3902

B12C B12, B13, B21, B37, B40, B41, B44, B45, B47, B49, B50, B60,

B61, B4005

B21C B5, B15, B17, B21, B35, B46, B49, B50, B51, B52, B53, B57,

B58, B62, B63, B70, B71, B72, B73, B75, B76, B77, B78,

B4005, B5102, B5103

Çapraz Reaksiyonlar

Isı, süre,komplemanınşiddeti çapraz reakoluşturabilir

Aynı kuyuda 2 farklı Ag

ile reaksiyona giren 2

farklı Ab olabilir

Antiserum 2 farklı Ag

üzerinde de bulunan

ortak bir antijenik epitop

ile reaksiyon verebilir

(CREG)

Homozigotluk durumunda beklenmeyen çapraz reaksiyon olabilir. A2 için homozigot ise, A28 ile

çapraz reaksiyon

CREG

Çin’de yapılan bir çalışmada: A 19, B62,B40,B75

Tan et al.Transplantation Proceedings 2000:32

Kadaverik renal transplantasyonda CREG ile graft ömrü ilişkili bulunmuş

Laux G, Opelz G. Transplantation 2004

Mikrolenfositotoksisite Sonuç net değilse?

Zayıf (+)ise: • Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4 (+) olmalı• Eleme yöntemiA32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34-• Broad veya split Ag belirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+)

olmalı• CREG tablolarının kullanılması• Linkeage disequilibriumReaksiyonlarEtnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir

• Aile çalışmaları

Haplotip belirleme

Antijenik birliktelikler

Eksik Ag tanımlama

Homozigotluğun tanımlanması

Etnik özelliklerin gösterilmesi

• Moleküler çalışma

Moleküler Teknik Avantajları

• Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )• Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)

• Canlı hücre gerektirmez

• DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir

• Örnek volümü daha az

• Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir

• Homozigot ise tam gösterim

• Otomasyona daha uygun

• Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir

Kalitesi kötü lenfosit

• Yetersiz sayıda lenfosit

(Lösemi veya aplastik anemi,kemoterapi)

• Uzun süreli hemodiyaliz

• İzole edilen lenfositlerde ölü hücre oranının yüksek olması

Moleküler Teknik Avantajları

• Güvenilir (seroloji=düşük çözünür )• Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun)

• Canlı hücre gerektirmez

• DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir

• Örnek volümü daha az

• Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir

• Homozigot ise tam gösterim

• Otomasyona daha uygun

• Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir

Mikrolenfositotoksisite Moleküler yöntem Karşılaştırmaları

• İki yöntem arasında hata %23; HLA-A:%8.8,HLA-B:%14.2• En sık hata: B15:%13.9, A32:%7.2, A31:%5.7• Klas-I’de hata %8.5• Klas-II’de hata %20

Mytilineos J et al.Human Immunol 1998;59

��KİT hastalarında %30.6 sonuç yok�En sık hata:HLA- A10, A19 ve B15

Seyhun Y ve ark.Gaziantep Tıp Dergisi2008,41�Kord kanı HLA çalışması %13.8

Li D et al.ZhonghuaXue YeXueZaZhi 2000;21

Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları

A33;%4.5

Saptanamayan

aleller

B15;%24,

A32;%7.9

A33;%4.5

Homozigot ?

B15 %15

B53 %8.1

A32 %6.9

Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları

A(%) B(%)

• Tan(n:525) 9 12.2

• Mytilineous(n:421) 4.8 10.5

• Kulcsarova(n:50) 9 11

• Seyhun(n:1567) 24.1 15.8

Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları

HLA-C ekspresyonu A ve B’ye göre daha zayıf

1 alel noksanlığı %78.2

Yanlış sonuç %13.7, Cw7 aleli Cw5 olarak değerlendirilmişTorio a et al.Transplantation Proceedings2004;34

Serolojik HLA-Cw n:1203HLA-Cw noksanlığı n:26Tek Cw noksanlığı n:132 Cw alel noksanlığı n:13

Mytilineous et al.Tissue Antigen1997;50

Moleküler Yöntemler

• SSP: Sequence Specific Priming (bir alel veya alelgrubuna yönelik primerler)

• SSO: Sequence Specific Oligonucleotid (tüm bölgeyi içeren primerler)

• SSCP:Sequence Specific Conformational Polymorphism

• SBT: Sequence Based Typing

SSP

Primer hangi alel için hazırlanmış ise DNA’nın o kısmına bağlanır. Primer’e özgü segment varsa Amplifikasyon olur

Yöntem:DNA izolasyonu

DNA amplifikasyonu

Elektroforez

Görüntüleme

Verilerin sisteme girilmesi

Analiz

SSP: Tekrar Gereken Durumlar

• Kuyularda (+) bandın yokluğu ile birlikte internal kontrol bandın olmayışı

• Reaksiyon olmayan kuyu ile tezat bir sonuç varsa;Örnek:DRB1 için23+(DR53),8+(DR4),9(DR7) çalışmamış ise

• İkiden fazla sonuç veriyorsa; (DR15 ve DR11, DR15 ve DR13vb.DR11?DR13?)

• Seroloji ile uyumsuz bir sonuç varsa;

• Nonspesifik bandlar fazla ise;

• Bandlar çok soluk ise,

• Aile içinde klas-I tam uyumlu ama klas-II’de uyumsuzluk varsa

SSP: Sorunlar-I

Reaksiyon yok• Az veya kalitesiz DNA

Reaksiyonun zayıf olması• Az veya kalitesiz DNA

Bir lokusta beklenenden çok alele özgü band var• Yeni bir alel olabilir• Kontaminasyon varsa, bantların koyu olması gerekir

Tüm lokuslarda çok sayıda alel spesifik bandlar olması• PCR kaynaklı olabilir;• Program kesintileri etkiler (nonspesifik bağlanmalar nedeni ile)• Örnek veya master mix kontaminedir

SSP: Sorunlar-II

Bir lokusta alele uygun band yok? • Bilinmeyen bir alel için homozigotluk• Kitler doğru koşullarda saklanmamışsa• Hatalı master mix

Alele özgün band var ama kontrol bandı yok?

Kontrole ait band var ama alele özgün band yok? • Hatalı master mix• Cihazın kullanımı ile ilgili sorunlar olabilir

Çalışmanın bir kısmı sorunlu ?• Genellikle cihazın kullanımı ile ilgilidir

Hasta A*02

A*26

B*38

B*51

DRB1*10

DRB1*13

Kardeş

(Kord kanı)

A*02

A*26

B*38

B*51

DRB1*13

DRB1*13??

Anne DRB1*04

DRB1*13

Baba DRB1*10

DRB1*15

SSP: Sorunlar ve Öneriler

DNA kalitesini artırmak için; • Daha az DNA, 2 kat taq polimeraz konmalı• DNA zaman içinde bozulmuşsa,örnek yenilenmeli

Bandlar soluk ise; • Daha fazla DNA• Master mix yeniden hazırlanmalı• Taq miktarı artırılmalı

Beklenenden çok alel varsa;• Yeni bir alel mi? Sekans yapılmalı

• Cihaz hatalarında çalışma tekrarlanmalı, cihaz kalibre edilmeli, • Hata belli bir lot ile oluyorsa, değiştirilmeli• Özellikle verici akraba dışı ise yüksek çözünürlükte çalışma yapılmalı

SSO

• Bir HLA bölgesine özgün primerler kullanılarak çoğalma sağlanır

• Specific oligonucleotidlerin boncuk gibi katı bir ortamda bağlanması

• Reaktif eklenmesi

• Hibridizasyon

• Yıkama işlemi

• Enzim işaretli avidin eklenmesi ile DNA’nın enzimle işaretlenmesi

• Enzimin substratının ortama ilavesi ile hangi oligonükleotid probun bağlandığı saptanır

SSO Dezavantaj

• Bölgeye özgün olanlardan başka gruba özgün çalışmaların yapılması

Moleküler Yöntem Dezavantajları

• Çok sayıda tüp,primer ve işlem gerektirir

• Doğru sonuç için tüm eksonlar değerlendirilmeli

• HLA alelleri arasında ortak dizilimlerden dolayı karışıklıklar olabilir. Bu nedenle duyarlılığı artırıcı yöntemler (“nested PCR”, ”multiplex PCR”) kullanılabilir

Neden Multiplex?

• Farklı allellere özgü olan farklı probları taşıyan farklı renklerdeki (~100 renk) boncukları kullanarak aynı anda pekçok allelin varlığının test edilebilmesi

• HLA allellerinin düşük/orta/ yüksek çözünürlükte belirlenebilmesi

Luminex

Mikro boncukların kullanımına dayalı, çoklu analiz imkanı olan, floresan ölçümü yapabilen hibridizasyonve floresan tayin yöntemlerini birlikte kullanan multiplex bir sistem

Luminex:Yöntem

• DNA izolasyonu

• DNA amplifikasyonu

• Hibridizasyon

• Quicktype for LifeMatch

kullanarak hasta girişleri

• Çalışmanın okutulması

• Analiz

Luminex:Sorunlar ve çözüm

• DNA’nın bozulması veya az olması reaksiyonda yetmezliklere neden olur.DNA kalitesine duyarlı olan lokuslar sırasıyla: C > A > B > DQ > DR dir.

• DNA kontaminasyonu karmaşık sonuçlar alınmasına yol açar.

• Sık DNA sorunu varsa hibridizasyon öncesi jel elektroforezi uygulanarak amplifikasyonun kontrol edilmesi gerekir

• Materyalin taşınması , ısı ve ışıktan ( probeMixve SA-PE) koruması, süreye uyum önemlidir

• Çalışma için sadece rekombinant Taq polimeraz kullanılmalıdır.

• İyi karışmayan boncuklar, düşük prob sayımlarına ve verilerin analiz edilemesine sebep olur.

Luminex:Sorunlar ve çözüm

• Plastik malzemelerin kalitesiz olması, boncukların bu malzemenin çeperine yapışmasına neden olur ve analiz sorunlarına yol açar

• Hibridizasyon sırasında olabilecek buharlaşmalar, bazan yetersiz sonuç alınmasına sebep olabilir.

• Hazırlanan SA-PE solusyonunun iyi karışmaması çalışmada farklı tip sonuçlara neden olur

• Amplifiye olmus ürünler en kısa sürede işleme konmalıdır,yükleme cihaza hemen yapılamayacaksa ürün 3 gün boyunca 2-8˚C’de saklanabilir. En çok 1 hf.-20˚C’de saklanabilir.

• Her koşulda bir negatif ve bir pozitif kontrol kullanılması gerekir.

SBT

Aleller, nükleotid dizilerinin incelenmesi ile

bulunur

• Klas-I için:Ekson 2-3

• Klas-II için:Ekson 2

İlk adım:

Lokusa veya alel sekansına özgü primerler

Ampflikonların oluşması

İkinci adım:Reaksiyonun durdurulması

SBT:Avantajları

• Seroloji ile saptanamayan aleller

• Benzer alellerin ayırımı

• Mutasyonların saptanması

Miks Lenfosit Reaksiyonu(MLR)

• Kültür ortamındaki lenfositlerin aynı ortamdaki ikinci bir seri hücrenin yüzey Ag’lerine karşı çoğalmasıdır

• Bir hücre serisi ışınlama veya mitomisin-C ile immün cevapsız hale gelir

• Uyarılan hücrelerin çoğalması radyoaktif yöntemlerle ölçülür

• HLA-Klas II antijenlerinin uyum veya uyumsuzluğu gösterilir

Öneriler

• İyi bir değerlendirme için: Irk,haplotip bilgisi, popülasyondaki alelsıklığı dikkate alınmalı

• Alıcı-verici için: HLA-A,B,DR çalışılmalı

• Hasta KİT’e hazırlanıyorsa moleküler yöntem tercih edilmeli

• Uygun donör taraması için seroloji yapılmalı

• Donör arama:Hastanın 1 derece akrabaları taranmalı

• Hematolojik malignite varsa moleküler yöntem tercih edilmeli

SBT

Ne zaman yapalım ?

• Diğer yöntemlerle saptanamayan HLA tiplerinde

• KİT için akraba dışı donör aranmasında

Sorunlar ?

Eğitimin sürekliliği

Uluslar arası kalite kontrolu

EFI veya ASHI akreditasyonu