Studies on translation initiation and termination in 

Escherichia coli 

 

 

 

Georgina Ibrahim Isak 

Department of Genetics, Microbiology and Toxicology 

Stockholm University, Sweden 2012 

Doctoral thesis 2012 Department of Genetics, Microbiology and Toxicology Stockholm University SE-106 91, Sweden

©Georgina Ibrahim Isak, Stockholm 2012 ISBN 978-91-7447-388-9 Printed in Sweden by Universitetsservice US-AB, Stockholm 2012 Distributor: Department of Genetics, Microbiology and Toxicology Cover illustration: Structure of the ribosome. The 70S ribosome with mRNA and A- P- and E- site tRNAs. Picture adapted with permission from [1]. Copyright © 2009, Rights Managed by Nature Publishing Group.

2

Till min familj 

3

4

Abstract 

 

     Translation initiation factor 1 (IF1) has been shown to be an RNA chaperone. In order to find 

functional interactions that IF1 may have with rRNA, we have isolated second‐site suppressors 

of a cold‐sensitive IF1 mutant. Joining of the ribosomal subunit seems to be affected in the IF1 

mutant  strain and  the  suppressive effect  is a consequence of decreasing  the available pool of 

mature 50S subunits. The results serve as additional evidence that IF1 is an RNA chaperone and 

that final maturation of the ribosome takes place during translation initiation. 

     In  this  study  we  have  also  investigated  the  effect  of  a  cold‐sensitive  mutant  IF1  or 

kasugamycin addition on gene expression using a 2D gel electrophoresis technique. The effect is 

much more dramatic when  cells are  treated with kasugamycin  compared  to mutant  IF1. The 

ybgF gene is uniquely sensitive to the IF1 mutation as well as the addition of kasugamycin. This 

effect on  the native gene could be connected with some property of  the TIR sequence of ybgF 

and supports the notion that kasugamycin addition and the IF1 cold‐sensitive mutation have a 

similar TIR‐specific effect on mRNA translation. 

     Finally  we  have  isolated  a  suppressor  of  a  temperature‐sensitive mutation  in  ribosomal 

release factor 1 (RF1) to shed more light on the translation termination process. The suppressor 

mutation is linked to an IS10 insertion into the cysB gene and results in a Cys‐ phenotype. Our 

results suggest that suppression of the thermosensitive growth is a consequence of the mnm5s2U 

hypomodification  of  certain  tRNA  species.  The  ability  of mnm5s2U  hypomodified  tRNA  to 

induce  frameshifting may be  responsible  for  the  suppression mechanism and  it  supports  the 

hypothesis  that  modified  nucleosides  in  the  anticodon  of  tRNA  act  in  part  to  prevent 

frameshifting by the ribosome. 

 

 

5

 

List of publications  The thesis is based on the following publications   I. Jaroslav Belotserkovsky, Georgina Isak, Leif A. Isaksson (2011) 

Suppression of a cold‐sensitive mutant initiation factor 1 by alterations in the 23S rRNA maturation region. FEBS J., 278(10):1745‐56  

  

II.   Sergey Surkov, Georgina Isak, Leif A. Isaksson  Influences of a mutated translation initiation factor IF1 or kasugamycin on Escherichia coli gene expression. (Submitted) 

   

III. Georgina Isak, Monica Rydén‐Aulin (2009) Hypomodification of the wobble base in tRNAGlu, tRNALys, and tRNAGln suppresses the temperature‐sensitive phenotype caused by mutant release factor 1. 

                        J. Bacteriol.,191(5):1604‐9  

 Permissions to reproduce papers I and III were kindly obtained from the publishers  

       

6

Table of contents 

   

1. Introduction…………………………………………………………………………... 9 1.1 Bacterial translation process………………………………………………………..    9 

1.2 The Bacterial ribosome and its subunits…………………………………………..  10 

   1.2.1 The small ribosomal subunit……………………………………………….......  11 

   1.2.2 The large ribosomal subunit……………………………………………………  11 

1.3 Assembly of ribosomal subunits…………………………………………………...  13 

   1.3.1 rRNA maturation and modifications………………………………………….  13 

   1.3.2 Binding of ribosomal proteins and rRNA folding…………………………...  15 

   1.3.3 Ribosomal assembly factors………………………………………………........  18 

      DEAD‐ box proteins, GTPases, Chaperones and maturation factor……....................  19 

1.4 Bacterial translation initiation…………………………………………………......  21 

   1.4.1 The translation initiation region in messenger RNA………………………...  22 

   1.4.2 The initiator transfer RNA (itRNA)……………………………………………  22 

    Transfer RNA modification…………………………….................................................  23 

   1.4.3 Initiation factor 1 (IF1)…………………………………………………………..    24 

   1.4.4 Initiation factor 2 (IF2)…………………………………………………………..    26 

   1.4.5 Initiation factor 3 (IF3)…………………………………………………………..    27 

   1.4.6 The antibiotic kasugamycin as a translation initiation inhibitor…………… 28 

1.5 Bacterial translation termination and recycling………………………………….. 30 

   1.5.1 Class 1 release factors…………………………………………………………. .  30 

2. Results and discussion………………………………………………………………  34 

2.1 Paper I………………………………………………………………………………..  34 

2.2  Paper II……………………………………………....................................................  36 

2.3 Paper III…...................................................................................................................  37 

3. Concluding remarks…………………………………………………………………  39 

4. Acknowledgements………………………………………………………………….  40 5. References…………………………………………………………………………......     41 

7

8

Abbreviations              ASD       anti Shine‐Dalgarno sequence A‐site                      aminoacyl‐tRNA binding site ASL     anticodon stem‐loop CP  central proturberance  DASL     dimethyl‐A stem‐loop DR  The downstream region E‐site                    exit‐tRNA binding site EF‐Tu  Elongation factor Tu fMet ‐tRNA fMet  formylated initiator tRNA GDP    guanosine diphosphate GTP  guanosine triphosphate GTPase               enzyme hydolyzing GTP IF1, 2, 3                initiation factor itRNA                  initiator tRNA H                          helix HSP                  heat shock protein LB                           Luria‐Bertani medium mRNA                  massenger RNA Nt                         nucleotide OB                        oligomer‐ binding P                          precursor PIC                       pre‐initiation complex P‐site                    peptidyl‐tRNA binding site PTC                      peptidyl transferase center RBS                    ribosome binding site RF1, 2, 3             release factor RRF                    ribosome recycling factor rRNA                    ribosomal RNA SD                        Shine‐Dalgarno sequence TIR                                   translation initiation region tRNA                   transfer RNA Å                         Ångstöm, 1Å = 1 × 10‐10 m  

1. Introduction 

 

1.1 Bacterial translation process  

     Protein synthesis, or translation of the genetic information in mRNA (messenger RNA) into 

amino acid sequence of proteins, is essentially the same in all kingdoms of life and takes place 

on  the  ribosome.  The  ribosome which  is  formed  of  two  subunits  (30S  and  50S  subunits  in 

bacteria) contains three binding sites for tRNA molecules: the A site binds the aminoacyl‐tRNA, 

the P site binds the peptidyl‐tRNA and the E site binds the deacylated tRNA. Protein synthesis 

can be divided  into  four main steps,  initiation, elongation,  termination and  recycling. During 

initiation,  the  initiation  factors  (IFs)  facilitate  the  assembly  of  the  30S  and  50S  subunits  on 

mRNAs  translation  initiation  region  (TIR)  to  form  an  active  ribosomal  particle  and  the 

placement of the initiator tRNAfMet in the P‐site [2, 3]. At the end of the initiation step the A site 

is ready to receive an aminoacyl‐tRNA molecule which is delivered by elongation factor EF‐Tu. 

The proper codon‐anticodon interactions stimulate the GTP‐ase activity of EF‐Tu leading to the 

dissociation  of  EF‐Tu  from  the  complex. As  a  consequence  the  aminoacyl  end  of  the A‐site 

tRNA  releases  and positions  in  the peptidyl‐transferase  center  (PTC)  in  a process  known  as 

accommodation. A peptide bond  is  then  formed between  the A‐  and P‐site  tRNAs  (α amino 

group  of  the  aminoacyl‐tRNA  attacks  the  carbonyl  carbon  of  the  peptidyl‐tRNA)  at  the 

peptidyl‐transferase  center on  the 50S  subunit. Upon peptide bond  synthesis,  the  lengthened 

peptidyl‐tRNA  is bound  to  the A  site, whereas  the deacylated  tRNA  is  in  the P‐site. Peptide 

elongation  is  further  promoted  by  the GTP‐dependent  protein  elongation  factors  EF‐G.  The 

GTP hydrolysis of EF‐G promotes the translocation of peptidyl‐tRNA (carrying a peptide chain 

one amino acid longer) from the A‐site to the P‐site and the deacylated tRNA from the P‐site to 

the E‐site. Consequently, the ribosome moves down the mRNA with an empty A‐site ready to 

receive a new tRNA molecule, the positioning of it is promoted by the elongation factor EF‐Tu 

[4‐6]. Protein synthesis in bacteria terminates when a stop codon on mRNA enters the ribosomal 

A‐site. Release factor 1 or 2 recognizes the stop codon and subsequently catalyses the hydrolysis 

of peptidyl‐tRNA,  releasing  the  nascent polypeptide  from  the  ribosome  [7]. Release  factor  3 

9

triggers the dissociation of release factor 1 or 2 from the A‐site [8]. After the dissociation of RF3 

from the ribosome, the ribosome must be recycled into subunits for a new round of translation 

initiation. Ribosome  recycling  factor RRF,  EF‐G  and  IF3  proteins  are  required  to  release  the 

deacylated tRNA, mRNA and to dissociate the ribosome subunits [9, 10]. In this study we will 

focus in two processes: the translation initiation and termination in bacteria. 

 

1.2 The bacterial ribosome and its subunits 

     The ribosome  is  the  largest and  the most complex ribozyme  found  in nature.  It consists of 

two subunits of unequal size, a small 30S and a large 50S subunit, assembles upon translation 

initiation  and  has  a  relative  sedimentation  rate  of  70S.  The  amount  of  ribosomes  is  tightly 

regulated because making ribosomes is costly for the cell. The eubacteria Escherichia coli (E.coli) 

cell contains about 2,000 ribosomes at slow growth rate and this number can increase to 70,000 

per cell during rapid growth [11]. 

     Many cryo electron microscopy (cryo‐EM) studies have improved the structural knowledge 

of the ribosome and revealed new features such as the localization of several translation factors 

and a folded mRNA and the conformational changes associated with different functional states 

[12‐15]. 

     In E. coli, one third of the ribosome mass consists of proteins and two thirds consist of rRNA. 

The small ribosomal subunit, 30S, is composed of 21 proteins and an rRNA of 1542 nucleotides 

sedimenting at 16S, whereas the  large ribosomal subunit, 50S,  is composed of 33 proteins and 

two rRNAs containing about 120 and 2900 nucleotides sedimenting at 5S and 23S, respectively. 

The  ribosomal  subunits perform distinct  roles during protein  synthesis. The  small  ribosomal 

subunit contains the decoding center that ensures that the tRNA with the correct anticodon  is 

bound to the ribosome and paired with the mRNA codon, whereas the  large subunit contains 

the peptidyl‐transferase center (PTC) that catalyzes the synthesis of  peptide‐bond formation [2, 

16] 

 

 

10

1.2.1 The small ribosomal subunit 

     In the small 30S ribosomal subunit, the 16S rRNA can be divided into tertiary domains which 

are responsible for the global shape of the small subunit (Fig 1). The 5ʹ ‐domain of the 16S rRNA 

forms  the  body,  the  central  domain  forms  the  platform,  and  the  3′  ‐domain, which  is  even 

further  subdivided  into one 3′  ‐major domain  forms  the head  [17] and one 3′  ‐minor domain 

consists of  two helices at  the  subunit  interface, helix 44 and helix 45. H44  stretches  from  the 

bottom of the head to the bottom of the body along the 30S interface and H45 with its conserved 

GGAA hairpin loop, packed against helix 44 is available for interaction with the large subunit 

[18]. In the 30S particle viewed from the interface, the head is connected to the rest of the small 

subunit by a narrow neck which is slightly bent to the left forming a deep cleft. The platform is 

below the head to the right of the cleft and the decoding site with the A and P sites is located at 

the bottom of the cleft between the head and the body [17, 19]. The decoding center, where the 

codon‐anticodon  interaction  takes place,  is entirely constructed of rRNA. This region contains 

the  3′  and  5′  ends of  the  16S  rRNA  and  the upper part of helix  44  [19]. Recently,  two more 

regions with specific activities in translation have been described. The first one is the platform 

center which  plays  an  important  role  in  the  binding  and  adaptation  of  the mRNA  during 

translation [20, 21]. The other one  is the helicase center, constituted by proteins S3, S4 and S5, 

devoted to the unfolding of structures at the 3′ end of mRNA during elongation [22, 23]. 

   The 30S ribosomal proteins are concentrated in the top, sides and back but none of them binds 

entirely  inside  an RNA  domain.  The  subunit  interface, where  the  interaction with  the  large 

subunit occurs, is free of protein, with exception of protein S12 which lies near the decoding site 

at the top of H44. Some other proteins lie at the periphery of the subunit interface which allow 

them to make contact with the 50S subunit [18] (Fig 1A). 

 

1.2.2 The large ribosomal subunit 

     In the large 50S ribosomal subunit, the secoundary structure of 23S rRNA can be subdivided 

into six domains [24] and the 5S rRNA is considered as the subunits seventh rRNA domain [25]. 

It  is  important  to note  that  the  secondary‐structure domains  of  the  rRNA  constitute distinct 

11

morphological domains of the intact 30S subunit but not for the 50S subunit [17]. The 5S rRNA 

and  the  six  secondary  structure domains  of  23S  rRNA  all have  complicated  and  convoluted 

shapes that fit together to produce a compact, monolithic RNA mass and the 5S and 23S rRNA 

do not  interact extensively with  each other  [26, 27]. When  the 50S viewed  from  the  interface 

side,  three protuberances  can be  shown. The  central protuberance  (CP) which  include  the 5S 

rRNA  and  its  associated  proteins,  the  L1  stalk,  consisting  of  protein  L1  and  its  23S  rRNA 

binding site and the L7/L12 stalk, which includes the L11 arm, consisting of protein L11 and its 

23S rRNA binding site [28]. 

Figure 1. Tertiary structures of the 30S (A) and 50S (B) subunits, seen from the interface side 

Ribosomal proteins are shown as blue ribbons and rRNA is shown as translucent gray spheres. 

Important features are labelled. Picture adapted with permission from [29], 2007. Copyright © 

2007, American Society for Microbiology 

 

     The central enzymatic activity of the large subunit, the peptidyl‐transferase center (PTC), is 

located in Domain V. There are 15 proteins that interact with this domain but no protein moiety 

is observable within about 18Å of the PTC which means that the ribosome  is a ribozyme [30]. 

The polypeptide  exit  tunnel begins  just below  the PTC  and provides  a  stable passage of  the 

nascent  polypeptide  through  the  subunit  to  the  cytoplasmatic  side  of  the  50S  subunit.  This 

tunnel is approximately 100Å long and up to 25Å in diameter and largely formed by RNA [30]. 

12

Most of  the 50S ribosomal proteins are  located on  the external surface whereas  the  interior  is 

protein‐poor [26, 27] (Fig 1B). 

 

1.3 Assembly of ribosomal subunits 

     Ribosome  synthesis  and  assembly  is  tightly  controlled  process  because  the  finished 

ribosomal  subunits  must  function  perfectly  to  guarantee  efficiency  and  quality  in  protein 

synthesis.  The  assembly  of  ribosome  occurs  in  a  series  of  steps:  rRNA  maturation  and 

modification, binding of ribosomal proteins and rRNA folding and the binding and release of 

ribosome’s assembly factors. Many of these steps are coupled and occur in parallel during the 

transcription of rRNAs [31, 32].  

 

1.3.1 rRNA maturation and modifications 

     Ribosomal RNA (rRNA) is transcribed as a single transcript including both the 16S rRNA for 

the small subunit and the 23S and 5S rRNAs for the large subunit separated by spacer tRNAs 

and  some  extra  sequences  such  as  the  complementary  sequences  flanking  both  16S  and  23S 

rRNA  to  form  strong base paired  stems  (Reviewed  in  [29])  (Fig 2). The  synthesis of  rRNA  is 

highly  regulated  by  a  so  called  feedback  regulation  [11].  The  single  primary  transcript  is 

processed  into mature 5S, 16S, and 23S rRNA by at  least five nucleases and starts even before 

transcription of the ribosomal RNA is completed [33‐36].  

     RNase III cleaves the primary transcript to yield precursor 16S rRNA (17S rRNA), precursor 

23S rRNA, and precursor 5S rRNA (9S rRNA) which contain the sequences for the mature 16S, 

23S,  and  5S  rRNA  respectively  [37‐39].  17S  rRNA  contains  the  16S  rRNA  sequence with  an 

additional 115 nucleotides  (nt) at  the 5ʹ end and 33 nt at  the 3ʹ end  [37]. The 5ʹ end  is  further 

cleaved  by  RNase  E  to  yield  a  product  with  66  extra  nucleotides  at  the  5ʹ  end,  which  is 

subsequently cleaved by RNase G [40]. Maturation of the 5ʹ end occurs before the 3ʹ end [40, 41] 

and can occur in the absence of RNase E but more slowly [40]. The final processing of the 3ʹ end 

to remove the extra 33 nucleotides is performed by an unknown RNase and this reaction occurs 

efficiently under protein synthesis conditions [42]. Interestingly, mature 16S rRNA can still form 

13

in the absence of RNase III; however mature 23S rRNA cannot be formed [36]. The 23S rRNA 

precursor formed by RNase III cleavage contains the mature 23S rRNA transcript with three or 

seven additional nucleotides at the 5ʹ end and seven to nine additional nucleotides at the 3ʹ end 

[35, 43]. Final processing of  the 5ʹ end of precursor 23S  rRNA  is performed by still unknown 

enzyme, while  final maturation  of  the  3ʹ  end  facilitated  by  RNaseT  [44]  (Fig  2).  Following 

cleavage by RNase  III,  the  3ʹ  ‐terminal part of  the primary  transcript  contains  5S  rRNA  and 

additional  sequences  that may  include one or  two distal  tRNAs. The 5′  ‐termini of  the  tRNA 

sequences are processed by RNase P which  results  in  the  release of  9S  rRNA  [45].  9S  rRNA 

contains  the mature 5S  rRNA with additional 84 nt at  the 5ʹ end and 42 nt at  the 3ʹ end  [46]. 

RNase  E  is  able  to  cleave  the  precursor  at  both  ends  to  leave mature  5S  rRNA  and  three 

additional  nucleotides  at  both  ends  [47]. RNase T  causes  final maturation  at  the  3ʹ  end  [48] 

while final maturation at the 5ʹ end occurs by a still unknown enzyme (Fig 2). 

5′ 3′

Figure 2. Typical  rRNA operon, shown schematically. The spacer  region with  tRNA species 

between the genes for 16S, and 23S rRNA are shown. Promoters P1 and P2, and terminators T1 

and T2 are also indicated. The cleavage site of RNase III (III), RNase G (G), RNase E (E), RNase 

P (P), RNase T (T), and the unknown RNases (?) are shown. From [29]. 

     Most of the modifications in both 16S and 23S rRNA occur on conserved nucleotides (nt) that 

are  located  on  functionally  important  regions  [49,  50].  These modifications  are  thought  to 

influence  the  structure and  the  function of  the  ribosome. 16S  rRNA  is known  to undergo 11 

14

modifications, of which 10 are methylations and one pseudouridine, and 23S rRNA undergoes 

25  modifications,  of  which  one  is  unknown,  one  is  a  methylated  pseudouridine,  14  are 

methylations and 9 are pseudouridines [29, 50, 51]. Remarkably, some modifications of the 16S 

rRNA  are  added  to  naked  rRNA while  others  are  added  during  late maturation  of  the  30S 

rRNA whereas  the modification  of  the  23S  rRNA  is mainly  an  early  event  [29]. Moreover, 

unmodified  in vitro  transcribed 16S  rRNA with all of  the natural 30S  ribosomal proteins  can 

reconstitute  30S  particles with  somewhat  reduced  tRNA‐binding  capacity  compared  to  30S 

subunits  reconstituted with  rRNA modified  in  vivo  [52]. Unlike  the  small  subunit,  in  vivo 

reconstitution  of  a  catalytically  active  large  ribosomal  subunit  seems  to  depend  more  on 

chemical modification of  23S  rRNA  in E.coli  [53].  It was has been  shown  that  the  23S  rRNA 

modifications that are most  important for  in vitro reconstitution of catalytically active particle 

are located in region of 80‐nt (nt 2445‐2523) that contains 7 of the 25 known modifications [53]. 

In vivo modifications  that  take place outside of  the 80‐nt  region,  like  the  three ψ  in helix 69 

(1911, 1915 and 1917) and Um2525, may also be important [54, 55]. The importance and role of 

each modification  remains obscure;  it has been  shown  that  some modifications may alter  the 

features of the nucleotides providing an additional way to fine‐tune the rRNA folding and  its 

interaction.  It  has  also  been  suggested  that methylation,  for  instance  could modulate  rRNA 

maturation  and  affect  stability  of  rRNA  structures.  One  of  the  possible  functions  of  the 

modification could be to act as structural checkpoint (reviewed in [29]).   

 

1.3.2 Binding of ribosomal proteins and rRNA folding 

     In  vitro  reconstitution  studies  of  E.  coli  30S  and  50S  ribosomal  subunits  [56,  57]  have 

established the knowledge of how these individual protein and RNA molecules come together 

to form complete and functional ribosome. The studies showed that an active ribosomal subunit 

could  be  assembled  in  vitro  simply  by  incubating  the mature  components  together  under 

appropriate  conditions  [56,  57].  This means  that  all  the  information  required  for  the  proper 

ribosome  assembly  is  present  in  the  ribosomal  rRNA  and  proteins  themselves  [56,  57]. 

However, in vitro reconstitutions of ribosomal subunits occur more slowly than in vivo and the 

15

reconstitution of  the 50S subunit  is comparatively more slow and  inefficient  [58, 59] and as a 

result  has  not  been  studied  extensively  (see  review  [60]  and  reference  therein).  The  first 

precursors, the RI30 and RI50 are formed at 0°C upon incubation of a subset of proteins and 16S 

or 5S and 23S rRNA respectively. Reconstitution can not continue until the particle is heated to 

40°C to rearrange the conformation and form more compact particles RI30∗ and RI50∗. This change 

allows the association of further proteins to form the active 30S subunit, while the formation of 

active 50S subunit requires continued  incubation with proteins,  followed by a second heating 

step  at  55°C with  high magnesium  concentration  [56,  57].  It was  also  shown  that  in  vitro 

reconstitution of the 30S subunit requires  less energy  if the  latter  is assembled from precursor 

instead  of mature  rRNA  [61],  suggesting  that proper processing  of  the precursor  16S  rRNA 

plays a key role in guiding certain proteins to their appropriate binding sites and in accelerating 

the process (Reviewed in [29]) 

Figure 3. The Nomura assembly map depicts thermodynamic protein binding dependencies 

in  the 30S  subunit. There  is a  clear hierarchy of primary binding proteins  (1°), which  stably 

bind directly to the rRNA; secondary binding proteins (2°), which depend on primary binders; 

and  tertiary  binding  proteins  (3°), which  depend  on  secondary  binders.  The map  is  further 

divided  into  5′  (red),  central  (green),  and  3′  (blue)  domains  on  the  basis  of  binding  position 

relative to the 16S rRNA [62‐64]. From [60] 

16

 

     Nomura  and  coworkers  showed  that  the  protein‐binding  events  are  thermodynamically 

interdependent and that the ribosomal proteins bind to 16S rRNA in a hierarchical manner [56]. 

Nomura and colleagues work resolved the complete assembly map for the 30S subunit [62, 63]. 

The original map by Nomura has been further divided into 5, central and 3 structural domains 

on the basis of binding proteins relative to the 16S rRNA [64]. From the assembly map the 30S 

ribosomal proteins can be classified  into three groups according to their physical  location and 

order  in  the  binding  hierarchy:  primary  binding  proteins,  can  bind  directly  to  16S  rRNA, 

secondary binding proteins, require prior binding of one of  the primary proteins and  tertiary 

binding proteins that need at least one primary and one secondary protein for binding [62, 63, 

65, 66]. Powers et al suggested that  the assembly proceeds mostly from  the 5′  to  the 3′ end of 

16S rRNA [67] (Fig 3).   

     Herold and Nierhans developed thereafter a similar assembly map for the 50S subunit [68], 

but the assembly is not organized by structural domains and many more proteins associate in a 

more complex binding hierarchy. The experimental approaches to the 50S subunit assembly are 

reviewed by [69] but not discussed here. 

     The exact mechanism by which ribosomal proteins and rRNA organize themselves remains 

unknown.  The  hierarchy  of  protein  binding  leads  to  cooperative  assembly  and  this 

cooperativity mostly arises from structural changes in the 16S rRNA induced by the binding of 

previous protein  [33,  70]. The  assembly process  appears  to  occur  by  an  alternating  series  of 

RNA conformational changes and protein‐ binding events. A local RNA folding event creates a 

protein binding site, which  in turn binding of each facilitates the next RNA folding event and 

incrementally driving the RNA structure to the final native state [31, 32]. However, the ability of 

5ʹ domain of  the 16S  rRNA  to  form all of  the predicted  tertiary  interaction  in  the absence of 

proteins  indicates  that  the  initial step  in RNA  folding  is driven purely by  the RNA  [71]. And 

ribosomal proteins play two potential roles in the assembly process, guiding the rRNA into the 

proper  conformations  and  stabilizing  the  native  secondary  structure.  For  instance  the  small 

subunit ribosomal protein S12 has been shown to have RNA chaperone activity in vitro [72] and 

17

in  vivo  [73].  Footprinting  studies  showed  that  binding  of  S4,  S20  and  S17,  primary  binding 

proteins, preorganize the binding site for S16, a secondary binding protein, and binding of S16 

directing  the  assembly  toward  the  native  folded  state  by  destabilizing  the  structure  of  non‐

native conformation [74, 75]. Moreover, it has been shown that about one third of the 34 large 

50S ribosomal subunit proteins exhibit RNA chaperone activity [76]. 

     Most ribosomal proteins are essential for cell viability like the 5S rRNA binding proteins L5 

and  L18  [77].  However  some  nonessential  ribosomal  proteins  can  still  convey  a  selective 

advantage in growth rate, for instance a ribosome that lacks ribosomal protein L25 is viable and 

functional  but  displays  a  slow  growth  phenotype  [77],  or  can  be  important  for  efficient 

assembly and translation capacity like protein S20. A ribosome that lacks ribosomal protein S20 

is viable but loses the ability to form the 70S ribosome [78, 79]. Besides the ribosomal proteins, 

there  are  other  proteins  called  ribosome  assembly  factors, which  guide  the  rRNA  into  the 

proper conformation and stabilize the native structure of the RNA. These factors may serve as 

sensors  of  checkpoints  during  the  assembly  process.  These  assembly  factors  are  especially 

important for assembly of the more complex 50S subunit (see the section down). 

 

1.3.3 Ribosomal assembly factors  

     Proper  rRNA  folding  is  one  of  the most  complicated  events  during  ribosome  assembly 

because the RNA molecule can easily form distinct secondary structures and both the number 

and the stability of these non‐functional structures increase with the growing length of the RNA 

[80,  81].  Many  of  these  alternative  secondary  structures  result  in  kinetically  trapped 

intermediates that reach the native structure very slowly and this can explain why the assembly 

process is much slower in vitro than in vivo [82, 83]. In the cell, ribosome assembly factors allow 

the assembly process to progress more quickly by preventing these kinetic traps and facilitating 

proper rRNA folding and Protein‐RNA interactions. These factors may also lower the activation 

energy required for maturation and thereby omit the heating step that is required to complete 

the maturation in vitro [33] (see section1.3.2 ). Such assembly factors that facilitate and speed‐up 

18

ribosome assembly  include DEAD‐box proteins, GTPases, chaperones and maturation  factors. 

Some of these factors will be discussed here. 

DEAD‐box proteins 

     DEAD‐box  proteins  are  a  large  family  of  RNA  helicases  [84]  that  poses  RNA‐dependent 

ATPase activity [85]. DEAD‐box proteins and the related family DExD/H are believed to have 

multiple roles in ribosome assembly. They help unwinding of local RNA secoundary structures 

and assist proper RNA  folding,  rearranging or dissociating RNA‐protein  interactions  [86, 87]. 

The E.coli ribosome has been associated with three members of the DEAD‐box helicase family 

(SrmB, CsdA and DbpA) [88‐92]. 

     The DEAD‐box protein SrmB  is  thought  to be  involved  in  the early  step of 50S biogenesis 

because a strain with a deletion in the srmB gene has fewer 70S particles, an increased number 

of  free  subunits  as  well  as  accumulation  of  a  50S  precursor  particle  that  sediment  at 

approximately 40S. Moreover, SrmB can associate with the 40S precursor particle, but not with 

30S,  50S  subunits  or  70S particles. This  40S particle  contains  immature  23S  rRNA  and has  a 

reduced  amount  of  some  ribosomal  proteins  or  missing  some  other  like  protein  L13  [90], 

essential for the formation of the first 50S intermediate in vitro [93].  

     The cold‐shock DEAD‐box protein A, CsdA,  is  required  for growth at  temperatures below 

30°C  and  deletion  in  the  csdA  gene  leads  to  a  slow  growth  at  low  temperature  [94]  and  to 

accumulation of the 50S precursor particles that sediment at approximately 40S [91].                       

     DEAD‐box protein A, DbpA, is an ATP‐dependent helicase [95, 96]) and deletion in the dbpA 

gene does not  result  in a growth defect  [97]. A  strain with a mutant DpbA has an  increased 

number  of  free  subunits,  fewer  70S  particles,  as  well  as  accumulation  of  a  50S  precursor 

particles  that sediment at approximately 45S,  implying  that  the DpbA plays a role during  the 

late stages of ribosome assembly [92]. 

GTPases 

     GTPases is another class of proteins that have been proposed to be involved in the assembly 

of  the  ribosome, mainly  in  the  biogenesis  of  the  individual  subunits.  These  proteins  have 

19

additional  domains  that  are  expected  to  mediate  the  interaction  of  the  GTPases  with  the 

ribosome through direct binding to rRNA, binding to a ribosomal protein, or both [98, 99].  

     Era (E. coli ras) is one of the highly conserved, essential GTPase that binds to 16S rRNA and 

the 30S ribosomal subunits  in vitro  [100]. Era binds  to  the 30S subunit between  the head and 

cleft on the side of the subunit that interacts with the 50S subunit to form a 70S ribosome [101]. 

This finding suggests that Era would prevent subunit joining prior to the final maturation of the 

30S subunit into an active particle. Depletion of Era leads to the accumulation of precursor 16S 

rRNA and an increase in the free 30S and 50S subunits compared to the 70S particles implying 

that Era may has a  role  in  the processing of  rRNA  [102].  It has been shown  recently  that Era 

enables  faster  binding  of  several  late‐binding  proteins  to  rRNA  when  included  in  a  30S 

reconstitution [103]. 

Chaperones and maturation factors 

     Another group of RNA‐binding proteins that can help solving the RNA folding problem are 

called chaperones [104]. The chaperones DnaJ and DnaK are part of the heat shock protein 70 

(HSP 70) chaperone machine DnaK‐ DnaJ‐CrpE [105]. Deletion of the dnaJ or dnaK genes leads 

to  assembly  defect  at  a  temperature  above  42°C  with  accumulation  of  30S  precursor  that 

sediment at 21S and 50S precursors that sediment at 32S and 45S [41]. At this temperature over‐

expression  of  heat  shock  proteins  GroEL‐GroES  can  partially  restore  this  defect  [41,  105], 

suggesting an overlapping  function between DnaK‐ DnaJ‐CrpE and GroEL‐GroES. Recently  it 

has been shown that one of the translation initiation factors, IF1 can posses rRNA chaperoning 

activity [106]. 

     Finally, assembly of ribosomes is facilitated by some other proteins called maturation factor. 

Ribosome‐binding factor A (RbfA) is one of these factors that is induced upon cold shock [107]. 

RbfA  has  been  shown  to  associate with  free  30S  subunits  and  cells  lacking  RbfA  are  cold 

sensitive,  have  impaired  growth  rate  and  have  ribosome  profile  defect  [108].  Strain with  a 

deletion  in  the rbfA gene has an  increased amount of 16S precursor [109],  implying  that RbfA 

can  be  a  late maturation  factor  that  is  essential  for  efficient  processing  of  17S  rRNA  to  16S 

rRNA. That RbfA  interacts with  the 5′  ‐terminal helix  region of  the 16S  rRNA, a helix  that  is 

20

found  in mature 16S rRNA,  indicating  that RbfA may also play a role  in maturation after  the 

formation  of  16S  rRNA  [110].  Ribosome  maturation  factor M  (RimM)  is  also  essential  for 

efficient processing of  the 16S rRNA because a deletion of rimM  leads  to  the accumulation of 

precursor 16S rRNA and an increase in the free 30S and 50S subunits [110]. 

 

1.4 Bacterial translation initiation  

     During  translation  initiation,  the  rate‐limiting  and  the most  regulated  step,  the  ribosomes 

assemble on the mRNA in the order of seconds [111]. The three initiation factors are required to 

enhance the fidelity and accuracy of the initiation process and to speed up the formation of the 

70S initiation complex (70SIC) [112]. The initiation process begins at the level of the 30S that is 

dissociated  from  the 50S  subunit by  the action of  IF3 which  is  assisted by  IF1. Subsequently 

binding  of  IF2  to  the  30S  subunit  assist  the  binding  of  the  initiator  fMet‐tRNAfMet  and  the 

translation  initiation  region  (TIR)  of  the  mRNA  to  the  ribosomal  subunit  forming  a  30S 

preinitiation  complex  (Reviewed  in  [3]).  Next  a  short  duplex  between  the  SD  sequence  of 

mRNA and the anti SD (aSD), a conserved sequence at the 3′ end of 16S rRNA is formed [113]. 

The mRNA  is  then  accommodated, with  the help  of  the  IFs  and  the  fMet‐tRNAfMet,  into  the 

mRNA channel leading to the formation of more stable and active 30S initiation complex. In this 

complex the start codon of the mRNA interacts with the anticodon of the initiator tRNA in the 

ribosomal P‐site [2, 114‐116]. The last step of initiation process involves the formation of the 70S 

initiation complex (70SIC) by docking of the large ribosomal subunit (50S) subunit to the 30SIC. 

The docking process  activates  the  ejection  of  IF1  and  IF3  from  the  ribosome. This  transition 

triggers the hydrolysis of the GTP molecule bound to IF2 and results  in the adjustment of the 

initiator fMet‐tRNA in the P‐site and IF2 dissociates from the ribosomal complex [117]. The first 

peptide bond is formed in an EF‐Tu GTP‐dependent step specified by the second mRNA codon 

and the translation enters the elongation phase [5, 118].  

 

 

 

21

1.4.1 The translation initiation region in messenger RNA 

     The most critical event  in  translation  initiation  involves  the recognition and  the binding of 

the 30S  to  the  translation  initiation  region  (TIR) on mRNA  in order  to  select  the appropriate 

initiation  codon.  The  prokaryotic  translational  initiation  region  (TIR)  includes  the  ribosome‐

binding  site  (RBS)  and  the  bases  extending  beyond  5′  and  3′  of  the  (RBS)  [2].  The  (RBS) 

comprises the Shine‐Dalgarno sequence complementary to a conserved sequence present at the 

3′ end of 16S rRNA [113] and the start codon plus a spacer of variable length, separating the SD 

sequence and the  initiation codon [115, 119]. The sequence upstream of the  initiation codon  is 

called  the  5′  untranslated  region  (5′  UTR)  and  it  includes  the  SD  sequence  and  AU‐rich 

sequences upstream of SD act as the recognition motif  for ribosomal protein S1 and shown to 

enhance  translation  in E.coli with  a weak  SD  [120‐122]. AUG  is  the most  common  initiation 

codon and used in 90% of bacterial genes [123, 124]. The spacer region between the SD and the 

start  codon,  which  varies  between  3  and  12  nucleotides  with  an  optimal  spacing  of  7‐9 

nucleotides, has been shown  to  influence  the efficiency of  translation  initiation  [125, 126]. The 

downstream  region  (DR)  following  the  initiation  codon  has  been  proposed  to  enhance 

translation  of  several  mRNA  (for  a  review,  see  [127]).  The  mechanism  proposed  for  the 

stimulation of  translation  is  through a  complementary base pairing between  the DR and  the 

nucleotides 1469‐1483 in helix 44 of the 16S rRNA [128, 129]. However, many studies failed to 

support this proposal [130‐132]. A recent study shows that Shine‐Dalgarno like sequences in the 

downstream  coding  region affect  the  translation  initiation negatively, more  likely by guiding 

the ribosomes away from the start codon [133]. 

 

1.4.2 The initiator transfer RNA (itRNA)  

     The  bacterial  initiator  tRNAfMet  has  a  special  function  in  the  cell;  it  reads  the  start  codon 

aligned in the P‐site, in contrast with elongator tRNAs which binds first to the A‐site of the 30S 

subunit, allowing the initiating ribosome to begin translation in the correct location [3]. Binding 

of tRNAfMet to the P‐site is facilitated by initiations factors IF1, IF2 and IF3 [119, 134].  

22

     Several  structural  features  distinguish  the  initiator  tRNA  and  suggests  a mechanism  by 

which the translation  initiation machinery can discriminate the initiator tRNA from elongator. 

Initiator tRNA contains a C:A mismatch at position 1:72  in the acceptor stem, which has been 

shown  to  be  a  determinant  for  formylation  of  the  methionine  moiety  by  methionyl‐tRNA 

transformylase  [135,  136].  The  presence  of  formylmethionine  is  also  one  of  the  important 

features for binding of the fMet‐tRNAfMet to IF2 [137]. The second feature is the presence of the 

three  conserved G‐C  base  pairs  in  the  anticodon  stem  of  the  initiator  tRNA  that  confers  a 

specific IF3 selection of the initiator tRNA to the P‐site [138]. It was also shown that there is a 

minor groove  interactions between A1339 and G1338 of the 16S rRNA and the G‐C base pairs 

30‐40 and 29‐41 which may play a role  in  the discrimination of  the  initiator  tRNA by  IF3 and 

provide stabilization for the initiator tRNA in the P‐site [139‐141]. A recent study has revealed 

the crystal structure of E.coli  initiator  tRNA at 3.1Å resolution.  In  this study  the  length of  the 

anticodon  stem was  extended  by  one  base  pairs Cm32‐A38  and  an  unique  structure  of  the 

anticodon loop that involves a base triplet between A37 and the G29‐C41 pair was also revealed 

[142]. The third feature of the initiator tRNA is the presence of a purine 11: pyrimidin 24 base 

pair in contrast to pyrimidin 11: purine 24 in other tRNAs [143]. 

Transfer RNA modification 

     Transfer  RNA  from  all  organisms  contains  modified  nucleoside  derivatives  of  the  four 

normal nucleosides adenosine (A), guanosine (G), uridine (U), and cytosine (C) [144, 145]. The 

presence of different modified nucleosides  is  likely  to have different effects on  the activity of 

tRNA;  it may  influence  the  efficiency  of  the  tRNA  in  the  decoding  steps.  Thus,  lack  of  a 

modified nucleoside may induce pleiotropic effects on cell physiology (reviewed in [145]). The 

positions of the modified nucleosides have become known and a number of them are located at 

specific  positions  on  tRNAs  demonstrating  one  of  the  characteristics  of  tRNAs  [146].  For 

instance, the wobble position (position 34), the first position of the anticodon, is often modified 

[146]. In bacteria the uridine at position 34 in tRNALys, tRNAGlu, and tRNAGln is often modified 

to  5‐methylaminomethyl‐2‐thiouridine  mnm5s2U34  [147]  and  the  sulfur  in  the  thiolated 

nucleoside  originates  from  cysteine  [148].  The  effect  of  2‐thiouridine  s2U‐34 modification  on 

23

stabilization  of  tRNA  codon‐anticodon  interactions  has  been  noted,  2‐thiouridine  s2U  have 

almost a conformation that allows the recognition of A but not U and G in the third position of 

the codon [149]. It has been shown that tRNAs with s2U34 modification instead of mnm5s2U34 

are more able to read UAA than UAG codons [150]. Moreover, the efficiency of tRNAUAALys  in 

reading both UAA and UAG in an E.coli strain defective in the synthesis of mnm5s2U34 is also 

reduced [151]. Thus, the modification of this position and the modification of tRNA in common 

seem  to optimize  tRNA  to decode mRNA efficiently and accurately  (reviewed  in  [145]). Björk 

and  Hagervall  showed  a  model  for  how  the  deficiency  in  tRNA  modification, 

hypermodification, or an otherwise defective  tRNA can  induce  frameshifting + 1  in  the P‐site 

[152]. The model suggests that defects in tRNA may induce framshifting at two important steps 

in translation either by affecting the rate at which the ternary complex binds to the ribosomal A‐

site, A‐site effect, or by altering the interaction of the peptidyl‐tRNA in the ribosomal P‐site, P‐

site effect [153]. Finally, Agris P et al showed that the 2‐thiouridine s2U modification is required 

for binding of tRNAUUULys to programmed ribosomes, possibly because of a structural alteration 

in the anticodon loop. In other words, the fact that the unmodified tRNALys did not bind well to 

the ribosome in their assay is a further evidence for slippage and frameshifting as suggested by 

Björk and Hgervall [152] and which we suggest as the best explanation for why the lack of the 

2‐thiouridine  s2U  modification  is  required  for  suppression  of  the  Ts  phenotype  caused  by 

mutant RF1 as discussed in (Paper III).   

 

1.4.3 Initiation factor 1 (IF1) 

     IF1 is the smallest initiation factor with a molecular mass of around 8,2 kDa in E.coli. IF1 is an 

essential protein, which participates in the translation initiation process in prokaryotes and it is 

homologous to the aIFA and eIF1A proteins  in archea and eukaryotes, respectively [154, 155]. 

The  structure  of  IF1,  determined  with  multidimensional  NMR  spectroscopy  [156],  is 

characterized by a rigid five‐stranded β‐barrel flanked by the N‐and C‐terminal tails which are 

disordered  and highly  flexible  [156]. The  IF1  fold  shows  similarities  to proteins  that  interact 

with  oligosaccharides  and  oligonucleotides  like  proteins  belonging  to  the  oligomer‐  binding 

24

(OB) family, and to so call cold shock proteins CspA, CspB [156‐159]. The same RNA‐binding 

motif has been found in the 30S ribosomal protein S1 [160, 161]. The crystal structure of the 30S‐

IF1 complex at high resolution 3,2Å shows that IF1 bound to the 30S subunit is in proximity to 

the A‐site [162] in a cleft formed between helix 44, the 530 loop and protein S12 (Fig 4). IF1 also 

interacts with functionally important bases A1492 and A1493 of the 16S rRNA helix 44, causing 

these  two  bases  to  flip  out,  and  tilting  the  head  of  the  subunit  towards  the  A‐site  [163]. 

Mutagenesis of these two nucleotides was found to inhibit IF1 binding [164].  

 

 

IF1 530 loop

HeadHelix 44

Platform

Body

S12

Figure 4. The binding site of  IF1  in  the 30S subunit. A) The  interaction of  IF1 with  the 30S 

subunit. Important features are labeled. B) The location of IF1 shown from the interface side of 

the 30S subunit. Picture adapted with permission from [163]. Copyright © 2001, AAAS. 

 

     Several  functions  have  been  attributed  to  this  factor,  aside  from  promoting  the  binding 

efficiency  of  IF2  and  IF3  to  the  30S  subunit,  IF1  cooperates with  IF2  to  ensure  the  correct 

positioning  of  the  initiator  tRNA  in  the  P‐site  [165,  166]  and  discriminate  together  against 

unformylated and deacylated  tRNA  [167, 168].  IF1 also  stimulates  the GTPase activity of  IF2 

and  increases  binding  of mRNA  in  the  presence  of  IF2  [169,  170].  It was  shown  that  IF1  is 

25

needed  for  IF2  recycling after  subunit  joining and GTP hydrolysis  [171].  Interestingly,  recent 

data  show  that  IF1  can  behave  as  RNA  chaperone  in  vivo  and  in  vitro  [106]  and  as  a 

transcriptional  antiterminator  in  vivo  [172].  IF1  was  also  suggested  to  stimulate  the  30S 

initiation  complex  formation by  inducing  a  conformation  change over  a  long distance  in  the 

small ribosomal subunit  [166] and  thus  influencing  the association‐dissociation equilibrium of 

the ribosomal subunits [173, 174]. This function is a focus of the paper I in this thesis.  

 

1.4.4 Initiation factor 2 (IF2) 

     Translation initiation factor 2 (IF2) is the largest of the three factors involved in initiation of 

protein biosynthesis in eubacteria and belongs to the family of the GTP‐GDP binding proteins 

like  the elongation  factors EF‐Tu and EF‐G  [175]. The bacterial  initiation  factor  IF2 consists of 

three major  segments:  the  less  conserved N‐terminal  region,  the highly  conserved G domain 

and the C‐terminal part [176, 177]. The N‐terminal region is proposed to enhance the interaction 

of  IF2 with  the  30S  and  50S  ribosomal  subunits  [177,  178]. The C‐terminal part  contains  the 

fMet‐tRNA binding domain and  is  responsible  for  the  recognition of  the  formylated  form of 

fMet‐tRNA  [179‐182], while  the G  domain  contains  the GTP  binding  site  [177,  183].  The N‐

terminal and central segments of the IF2 protein were found to be connected to the C‐terminal 

domain via a long and flexible linker [184].  

     IF2 promotes codon‐anticodon  tRNA pairing  [168, 185, 186] and plays an  important role  in 

the docking of 50S subunits to 30S PICs containing the fMet‐tRNA but not un‐formylated fMet‐

tRNA or elongator tRNA [168, 187]. It has been also reported that the GTP‐bound form of IF2, 

but not GTP hydolysis, promotes rapid docking of the 50S subunit to the fMet‐tRNA‐contiaing 

30S PIC  [188,  189]. A  recent  study  shows  that,  two  classes  of mutations  located  outside  the 

tRNA‐binding domain of IF2 could compensate strongly, A‐type, or weakly, B‐type, for initiator 

tRNA  formylation  deficiency  [187]. More  recently,  the  same  group  showed  that A‐type  IF2 

mutants,  but  not  wild‐type  IF2,  bypass  not  only  the  formylation  requirement  but  also  the 

requirement of an initiator tRNA bound in the P‐site for rapid docking of ribosomal subunits. 

Moreover, A‐type  IF2 mutants with  either GTP or GDP  can promote  rapid  subunit docking, 

26

implying  that  fMet‐tRNAfMet,  per  se  does  not  have  an  active  role  in  rapid  subunit  docking. 

Instead, initiator tRNA is essential for activation of wild‐type IF2 in the 30S PIC and thus drives 

the 30S PIC to active 50S subunit‐docking conformation [190].  

 

1.4.5 Initiation factor 3 (IF3) 

     Bacterial  initiation  factor  IF3  is  one  of  the  three  initiation  factors  required  for  efficient 

translation initiation [3]. E. coli IF3 is an essential protein composed of 180 amino acids with a 

molecular mass of 20,4 kDa  [191, 192].  IF3 contains  two  structural domains of approximately 

equal size; the N‐ and C‐terminal domains [193, 194] which are joined by a long, flexible lysine‐

rich  linker [195, 196]. This  linker has been shown to be essential for IF3 function [197]. The C‐

terminal  domain  is  thought  to  be  responsible  for  30S  subunit  binding while  the N‐terminal 

domain does not bind  to  the 30S on  its own but appear  to contribute  to  IF3 binding stability 

[198‐200]. A single amino acid substitution in the N‐terminal domain has been shown to impair 

all the known functions of IF3 in vivo [201]. A recent cryo electron microscopy (cryo‐EM) study 

shows  that  the N‐terminal domain of  IF3 contacts  the  tRNA, whereas  the C‐terminal domain 

binds to the platform of the 30S subunit [15]. 

     Several  important  functions  have  been  attributed  to  IF3  [200].  It  binds  to  the  small  30S 

ribosomal subunit and prevents the association between the 30S and the 50S subunit [202]. IF3 

promotes  the  correct  30S  initiation  complex  formation  by  stimulating  the  codon‐anticodon 

interaction between the fMet‐tRNAfMet and mRNA in the P‐site [165, 203]. Moreover, IF3 affects 

the  initiation fidelity when  it preferentially dissociates preinitiation complexes with aminocyl‐

tRNA (non‐initiator tRNA) [167, 204], complexes with non‐canonical start codons [205‐207] and 

complexes  containing  leaderless  mRNA  [208].  Both  IF3  domains  have  been  shown  to  be 

involved in these functions because mutation in either the N‐ or C‐ terminal domain can perturb 

IF3 role in start‐codon discrimination [209, 210]. IF3 is also involved in shifting the mRNA from 

the standby site to the decoding P‐site of the 30S ribosomal subunit [211]. Finally, IF3 enhances 

dissociation of  the deacylated  tRNAs  from posttermination complexes and dissociates  the 70S 

subunits during ribosome recycling [10, 212].  

27

 

1.4.6 The antibiotic kasugamycin as a translation initiation inhibitor. 

     The key role of the bacterial ribosome makes  it the site of action for many antibiotics [213]. 

Kasugamycin is an aminoglycoside antibiotic [214] that blocks translation initiation in bacteria 

[215]. Kasugamycin is known to prevent binding of initiator fMet‐tRNA to the P‐site on the 30S 

subunit and on 70S ribosomes [215]. X‐ray structure of kasugamycin bound to the 30S subunit 

[216]  or  to  the  E.coli  70S  ribosome  [217]  reveals  the  kasugamycin  binding  site  within  the 

messenger  RNA  channel  in  the  P  and  E  sites  of  the  small  ribosomal  subunit  (Fig  5). 

Kasugamycin seems to  interact with two universally conserved A794 and G926 nucleotides of 

the 16S rRNA  [218] which  is consistent with  the  fact  that kasugamycin resistance arises when 

these two nucleotides are mutated [219]. The above mentioned evidence about the position of 

the kasugamycin binding site [216, 217] can explain why the antibiotic can block different steps 

of translation initiation (as discussed in paper II).  

     In early studies, it was shown that a mutation in the ksgA gene, responsible for dimethylation 

of A1518 and A1519, confers resistance to the antibiotic kasugamycin [220], increases decoding 

errors during elongation  [221], enhances translation initiation from non‐AUG codon [222], and 

exhibits  cold  sensitive  30S  assembly  and  16S  processing  defects  [223]. More  recently,  X‐ray 

analysis has indicated that the dimethylation of these two adenosines A1518 and A1519 in the 

GGAA  tetraloop of  the 16S rRNA H45 at a  late stage of 30S subunit assembly  [224]  facilitates 

structural rearrangements  in order  to establish an active conformation of  the 30S subunit and 

optimize it to participate in protein synthesis [225]. All these data suggest that the kasugamycin 

may affects a step during subunit joining or later [217] 

     The effect of kasugamycin does not operate by completely preventing the binding of mRNA 

to  the  ribosome. However,  kasugamycin perturbs  the  conformation  of mRNA  and  influence 

positioning  of  the mRNA  at  the P‐  and E‐sites within  the mRNA pathway,  thus preventing 

efficient fMet‐tRNA binding [216, 217, 226]. Thereby, translation initiation of leaderless mRNAs, 

starting directly with 5´ AUG, is not inhibited by kasugamycin [227, 228]. It was shown that the 

inhibitory effect of kasugamycin on translation can be different depending on different mRNA 

28

[229]  and  this  inhibition  is  dependent  to  some  extent  on  the  E‐site  triplet  [217].  It was  also 

shown  that  kasugamycin,  unlike  other  aminoglycosides,  does  not  induce  translational 

misreading  [230,  231],  readthrough  or  frameshifting  [232],  however  increased  translation 

fidelity  in  some  cases were  observed  [233]. More  recently,  kasugamycin  has  been  shown  to 

increase expression of reporter genes that are translation initiation region (TIR)‐dependent, and 

that  kasugamycin  apparently  share  an  identical mode  of  action with  the  cold‐sensitive  IF1 

mutant [234]. (This similarity was investigated in paper II) 

      

Head

Platform

Body

Figure  5.  The  structure  of  ksg  bound  to  the  E.coli  70S  ribosome  determined  by  X‐ray 

crystallography. Location of  the Ksg‐binding pocket  in  the context of  the 30S subunit, Ksg  is 

shown  in  cyan,  the 790  loop  in green,  the 926  region  in blue and  the DASL  in  red. Residues 

29

A794, G926, A1518 and A1519 are shown as sticks. Picture adapted with permission from [217]. 

Copyright © 2006, Rights Managed by Nature Publishing Group. 

1.5 Bacterial translation termination and recycling  

     Translation in bacteria terminates when a stop codon on mRNA reaches the decoding center 

in the A‐site of the small ribosomal subunit. Three stop codons UAA, UAG and UGA signal that 

the nascent polypeptide should be released from the ribosome. These stop codons are decoded 

by protein factors called class 1 release factors (RF) (Fig 6) [235‐237]. In bacteria the UAA and 

UAG stop codons are recognized by release  factor RF1, and  the UGA and UAA by RF2  [238‐

240]. Once stop codon recognition occurs, class I release factor RFs stimulate hydrolysis of the 

ester bond that links the completed polypeptide chain with the tRNA in the P‐site, resulting in 

the release of the polypeptide chain from the ribosome [239, 241, 242]. Subsequently, the release 

of the bound class I release factor from the ribosome is facilitated by a class II release factor RF3 

in a GTP dependent manner  [8]. Zavialov et al  suggested  that  ribosome‐class  I  release  factor 

complex  enhance  the  binding  of GTP  to RF3  only  after  the  release  of  the polypeptide  chain 

[243]. This in turn leads to a conformation change in RF3 and the dissociation of class I release 

factor.   After  the dissociation of class  I release  factor  from  the ribosome, a GTP hydrolysis by 

RF3 results in its own release.  

     Finally,  and  in  order  to  reuse  the  ribosome  and  the  tRNA  for  the  next  round  of  protein 

synthesis  the  translation  complex needs  to break down. This process  requires  three proteins; 

IF3,  ribosome  recycling  factor  (RRF)  and  EF‐G.  RRF  and  EF‐G  catalyzes  the  dissociation  of 

ribosomes  into  subunits  in  a  reaction  requiring GTP  hydrolysis.  This  leads  to  a  complex  in 

which the 30S subunit remains bound to the mRNA with a deacylated tRNA in the P‐site. IF3 

activates the dissociation of the tRNA from the 30S subunit allowing it to recycle [10, 244, 245]  

 

1.5.1 Class 1 release factors 

     After  the discovery of release  factors  (RF), many questions concerning RF  function and  the 

mechanism of translation termination were needed to be resolved. The crystal structure of the 

isolated RF1 from Thermotoga maritime at 2,65 Å [246] and RF2 from E. coli at 1,8 Å [247] showed 

30

that the factor  is composed of four domains. The overall fold of the four domains was similar 

between the two factors, except that the RF1 N‐terminal domain  is shorter and the C‐terminal 

domain is longer than that of RF2 (Fig 6A) [246].  

 

A

Figure  6.  A)  Comparison  of  the  structures  of  the  RF1  and  RF2  in  its  ribosome‐bound 

conformation rotated ≈ 180° from the view shown in B, with domains numbered. The GGQ and 

PVT are shown in red, the domains 1‐4 are indicated, and the switch loop is shown in orange, B) 

The structure of the RF1 termination complex, showing RF1 (yellow), P‐site tRNA (orange), E‐

site tRNA (red), mRNA (green), 16S rRNA (cyan), 23S and 5S rRNA (gray), 30S proteins (blue), 

and 50S proteins (magenta). Picture adapted with permission from [248] and [249]. Copyright © 

2008, Rights Managed by Nature Publishing Group. 

 

31

     The element of release factor involved in stop codon specificity recognition was localized in 

domain 2,  in particular,  to  the conserved motif PxT  (ProXxxThr  in RF1) or SPF  (SerProPhe  in 

RF2). Genetic experiments have shown that swapping these motifs of RF1 and RF2 led to switch 

codon  specificity  [250,  251]. At  the  other  end  of  the  protein,  a  universally  conserved GGQ 

(GlyGlyGln)  motif  in  domain  3  in  RF1  and  RF2  [252]  was  proposed  to  be  essential  for 

promoting  the  hydrolysis  of  the  peptidyl‐tRNA  ester  linkage  [252‐257].  In  cryo‐EM 

reconstructions and X‐ray crystal structures of termination complex, RF1 and RF2 were found 

to  occupy  the A‐site  in  the  ribosome with  domain  2  close  to  the  stop  codon  and  the GGQ 

pointed  into  the  peptidyl‐transferase  center  PTC  (Fig  6B)  [258‐261].  Recently,  more  details 

insights into translational termination come from the high resolution crystal structure of RF1 or 

RF2  bound  to  the  ribosome  [248,  249,  262].  The  structures  reveal  how  stop  codons  are 

recognized by RF1 and RF2 and how the stop codon recognition is communicated to PTC. The 

structures showed that domain 2 is involved directly in the recognition of the bases in the stop 

codons and the universally conserved GGQ motif of domain 3 contacts the acceptor end of the 

P‐site  tRNA,  positioning  the  glutamine  backbone  to  contribute  directly  to  peptidyl‐tRNA 

hydrolysis  [248,  249,  262]. Substitution of glutamine  in  this position by proline  abolishes  the 

catalytic activity of the factor [249]. The factor in complex with the ribosome seems to undergo 

global  conformational  changes  and  these  conformation  changes  are  accompanied  by 

rearrangements of specific regions. Domain 3 shifts considerably  from domain 2 and 4 which 

interact with the decoding center and domain 1 shifts slightly and interacts with the L11 region 

of  the 50S subunit  [262]. The switch  loop, which connects domain 3 and 4 of a release  factor, 

rearranges and interacts with universally conserved nucleotides that reside in the ribosomal A‐

site A1492 and A1493 in 16S rRNA, A1913 in 23S rRNA and protein S12 in the 30S subunit [248, 

249]. This  rearrangement  is critical  for correct positioning of  the GGQ motif  in  the  ribosomal 

peptidyl‐transferase  center  (PTC)  of  the  50S  subunit  and  likely  plays  a  role  in  signal 

transduction  from  the  decoding  center  to  the  PTC  [248,  249,  262].  In  addition,  the  two 

neighboring  glycines  in  the  GGQ  seem  to  adopt  a  backbone  conformation  needed  for  the 

movement  of  U2585,  away  from  the  ester  bond  of  peptidyl  tRNA  [262]  to  expose  it  to 

32

nucleophilic attack by water  [263], and  can  explain  the drastic  reduction  in RF activity upon 

their mutation [252, 255, 264].  

     RF1 is encoded by the prfA gene, and a mutant release factor 1, prfA1, has a clear temperature 

–sensitive  (Ts) phenotype at 42°C,  increased misreading of both stop codons AUU and UAG, 

and enhanced efficiency for some tRNA nonsense suppressors [265, 266]. The mutant RF1 has 

an Arg  to  Pro  change  at  position  137, within  domain  II, which  probably  leads  to  impaired 

binding  of  RF1  to  the  ribosome  and  as  a  consequence  to  reduced  translation  termination 

efficiency  [267,  268].  There  are  many  explanations  for  why  a  mutant  allele  of  RF1  causes 

temperature sensitive growth at 42°C. It was shown for instance that the mutant RF1 terminates 

more slowly than the wild type at 37°C [268]. It is even possible that there is no termination at 

all at high  temperature which  results  in  ribosome stalling on mRNA with genes ending with 

stop codon UAG (M. Ryden‐Aulin, personal communication). Under this condition, one or few 

essential proteins will not express in the cell and the cell will either die or develop a suppressor 

mutation. One suppressor of the Ts‐phenotype has been isolated and a mechanism behind the 

suppression is discussed in paper III. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

33

2.   Results and discussion 

2.1 Suppression of a cold‐sensitive mutant initiation factor 1 by alterations in the 23S rRNA 

maturation region (paper I) 

     Translation  initiation  factor  1  (IF1)  is  an  essential  protein  which  has  been  found  in  all 

organisms  [154,  155].  IF1  has  been  the  subject  of  intensive  research  for many  decades  and 

several  functions have been  attributed  to  it. For  instance,  IF1 was  suggested  to  interact with 

RNA by having RNA chaperone activity [106, 172]. To find functional interaction that IF1 may 

have with  rRNA and  to  learn more about  IF1  function  in  the cell, we selected  for second‐site 

suppressors  of  a  defective  cold‐sensitive  IF1 mutant R69L  of  E.coli.  The  suppressor mutants 

specifically map  to  a  single  rRNA operon on  a plasmid, pKK3535,  in  a  strain,  JB69, with  all 

chromosomal rRNA operons deleted. A set of suppressor mutations  located  in  the processing 

stem  of  precursor  23S  rRNA were  isolated  and  the  strains  called  (JB69/pD1,  pD3  and  pD6) 

depending on  the  location of  the suppressor mutations  in  the plasmid. These mutations were 

found to interfere with processing of the 23S rRNA termini. That the suppressor mutations are 

not  located  in  the  structural  part  of  the  mature  23S  rRNA  suggests  that  the  suppression 

mechanism is indirect and results from some rRNA maturation defect. This was supported by 

the observation  that a  lesion  in RNase  III,  the  enzyme  involved  in  the  initial  cleavage of  the 

processing  stem,  could  suppress  the  IF1  defect  and  that  a  general  defect  in  50S  subunit 

maturation could not suppress the cold sensitivity.  

     Analysing the sucrose gradient ribosomal profiles showed an increase in the relative amount 

of  70S  particles  as  compared with  free  subunits  in  the  IF1 mutant  strain  at  nonpermissive 

temperature (23°C).  Whereas a slight decrease in the extent of subunit association was found in 

the suppressor strains like (JB69/pD3). Our results suggest that the growth defect in the mutant 

IF1  strain  is  at  the  level  of  ribosome  subunit  joining  and  that  the  suppressor mutations  that 

specifically  alter  23S  rRNA  processing  partially  restores  the  growth  defect  by  limiting  the 

available pool of mature 50S subunits. Moreover, a similarly  large  fraction of  the 50S and  the 

70S  ribosomes  of  one  of  the processing  stem mutant  (pD3)  is  composed  of  immature  rRNA 

which means  that  there  is no active  system  that degrades  the  immature 50S  subunits or  that 

34

prevents them from entering the translating pool. However, a more realistic explanation can be 

that the assembly of ribosomal proteins onto the immature rRNA is delayed in these mutants, 

leading to an apparent decrease in the amount of ribosome subunits.   

     We  found  also  that,  in  the  case  of  the wild  type  plasmid  pKK3535  irrespective  of  strain 

background,  there was an  increase  in  the relative amount of  the  fully mature  terminus  in  the 

70S  fraction compared  to  the 50S  fraction. The extended 23S rRNA  termini were  incorporated 

into  the 50S subunits and  the  functional 70S ribosome. However  the amount of  the  immature 

termini  in  the 70S  ribosome was decreased  compared  to  the  fully mature  termini  suggesting 

that  the  final  rRNA maturation occurs on  translating  ribosomes supporting  the evidence  that 

final maturation of the ribosome takes place during translation initiation [29]. 

     It has been shown that IF1 stimulates the formation of the 30S initiation complex by inducing 

a conformation change over a  long distance  in  the small ribosomal subunit  [14, 163, 166, 269] 

and  thus  influencing  the  ribosomal  subunit  association‐dissociation  rate  [270],  which  is 

especially important in the cold [271]. IF1 is also shown to play a role in the cold shock response 

[271‐274]. Moreover, recent data have suggested that IF1 is involved in subunit joining and has 

the ability  to discriminate between  certain mRNAs on  the basis of  their TIRs  [174]. All  these 

data and our results helped us to suggest a model for what happens in the IF1 mutant strain in 

cold based on  the model proposed by  Jonas et al  [107].  Jonas et al suggested  that cold shock 

conditions induce a conformation in the ribosome that becomes blocked in translation initiation, 

whereby only specific mRNAs with appropriate TIR can bypass  this block and be  translated. 

We  proposed  that  IF1  is  involved  in  this mechanism  by  its  ability  to  discriminate  between 

certain mRNAs on  the basis of  their TIR. Depending on  the TIR elements  in mRNA,  IF1  can 

either stabilize this conformation so that no translation occurs or induce a conformation change 

in the 30S subunit so that the rate of association‐dissociation with the 50S subunit is affected so 

that special mRNAs can be translated. The mutant IF1 fails to discriminate between certain TIR 

elements  in mRNA and  thus  induces a conformation change  in  the 30S  independently of  this 

factor  so  that  premature  subunit  joining  is  facilitated  and  translation  of many  unfavourable 

genes in the cold occur leading to cold sensitivity. 

35

2.2  Influences of a mutated  translation  initiation  factor  IF1 or kasugamycin on Escherichia 

coli gene expression (Paper II) 

     Previous study has shown  that IF1 cold‐sensitive mutation and kasugamycin addition  lead 

to  increased  expression  of  reporter  genes  in  a  TIR  dependent manner  [234]. We  have  here 

investigated if a cold‐sensitive mutated IF1 and kasugamycin addition have the same effect on 

protein expression levels of natural genes using a 2D gel electrophoresis technique. Twenty‐one 

protein  spots as a  response  to  either  the  IF1 mutation or  the addition of kasugamycin  to  the 

parental MG1655  strain were  identified  and  quantified  by mass  spectrometry. Expression  of 

several proteins was  affected  similarly under both  conditions. However  the  effect was much 

more dramatic when the cell was treated with kasugamycin compared to the effect by mutant 

IF1.  While  most  of  the  proteins  showed  altered  expression  level  under  the  influence  of 

kasugamycin, more  than a dozen showed no or only  little changes  in  the case of  IF1 mutant. 

Moreover, in the case of kasugamycin treatment the changes in expression level were more than 

3  times  for a number of spots whereas most of  the changes  for  the  IF1 mutant strain did not 

exceed a factor of 2 times. Whereas the highest expression in the IF1 mutant strain was found 

for  the YbgF  protein  (>  5  times)  and  in  the  relative  abundance  of  the  ribosomal  protein  S6 

isoforms,  the  biggest  influence  on  expression  by  kasugamycin were  observed  for  the OppA 

protein  and GroEL  chaperonin  protein.  In  addition,  the  expression  of  YbgF was  also much 

increased after the treatment with kasugamycin as in the case of the IF1 mutant strain. The most 

prominent  feature  in  the  study  is  that  gene  ybgF  seems  to  be  uniquely  sensitive  to  the  IF1 

mutation as well as upon addition of kasugamycin to the wild type strain. The YbgF protein is a 

part of the Tol‐Pal protein complex, which is involved in maintaining outer membrane integrity 

[275, 276], but the function of YbgF is still unknown. 

     To  gain  more  information  about  the  similarity  in  the  function  between  the  altered  IF1 

mutation and the addition of kasugamycin, we chose to compare the effect between these two 

cases. To get a comparison between these two conditions, the response on expression obtained 

after  the  treatment  with  kasugamycin  was  divided  with  the  one  obtained  when  IF1  was 

mutated.  Our  results  suggested  that  the  effect  on  expression  by  kasugamycin  was  quite 

36

different from that caused by a mutated IF1. Several genes were decreased in expression by one 

condition but increased in expression by the other. In addition, the effect in protein expression 

by  kasugamycin,  as  compared  to  the  IF1 mutant,  was  also much more  drastic. While  the 

expression  of  some  genes  by  kasugamycin were  relatively  increased  the  expression  of  some 

other were dramatically decreased and this effect could be consistent with a pleiotropic mode of 

action  by  kasugamycin  [277].  To  explain  the  results,  we  suggested  that  kasugamycin may 

induce a special  translation block  for expression of certain genes  in agreement with an earlier 

data showing that kasugamycin does not inhibit translation of all mRNAs equally well [216]. 

     The high  induction of GroEL chaperone complex by kasugamycin does not  tell us  to what 

extent the addition of kasugamycin can induce mistranslated and thus misfolded proteins. Since 

a  similar  induction  of  GroEL  chaperone  complex  could  not  be  found  in  cells  treated with 

kanamycin  known  to  induce mistranslated  protein. Additionally, GroEL  has  been  shown  to 

facilitate the folding of no more than 5% of all proteins in the cell (reviewed in [278]).  

     As mentioned previously,  several  genes were  affected  similarly  by  an  altered  IF1  and  by 

addition of kasugamycin. TIR regions of four genes with  increased expression and four genes 

with decreased expression were cloned into the protein A’ reporter system [279] to investigate if 

the change in expression is a direct effect manifested at the level of translation initiation. TIRs 

representing several gene sequences gave similar  increased expression both  in  the IF1 mutant 

and after the addition of kasugamycin. TIRs that gave high expression seem to have longer SD 

and  longer AU‐rich  regions. TIR  sequence of  the ybgF gave  the highest  increased  expression 

under both conditions. This suggests that the elevated expression of the gene ybgF on the 2‐D 

gels is the result of a direct TIR influence at the level of translation initiation for this gene.  

 

2.3 Hypomodification of  the wobble base  in  tRNAGlu,  tRNALys, and  tRNAGln suppresses  the 

temperature‐sensitive phenotype caused by mutant release factor (paper III) 

     Bacterial  release  factor  RF1  mediates  termination  of  protein  synthesis,  specifically 

recognizing  stop  codons UAG  and UAA  [238‐240]. RF1  is  encoded  by  the  prfA  gene,  and  a 

mutant release  factor 1, prfA1, has a clear  temperature –sensitive  (Ts) phenotype at 42°C  [265, 

37

38

266]. The mutation affects the structure of RF1 central domain and probably leads to impaired 

binding  of  RF1  to  the  ribosome  and  as  a  consequence  to  reduced  translation  termination 

efficiency [267, 268]. 

     We have mapped and characterized a suppressor of the temperature‐sensitive allele of RF1. 

This suppressor mutation is linked to an IS10 insertion into the cysB gene, a transcription factor 

regulating the cys operon and  leading to a Cys‐ phenotype. We have shown  in the article that 

lack of CysB does not lead to increased expression of the prfA gene, and thus, the suppression 

phenotype  is  not  a  consequence  of  overexpression  of  the  mutant  RF1  protein.  However, 

addition  of  high  concentrations  of  cysteine  to  the  growth  medium  restored  temperature 

sensitive  growth  to  the  suppressed  strain,  and  suggested  that  the  suppression  phenotype  is 

caused  by  the  lack  of  a  component metabolized  downstream  of  cysteine. Working  on  the 

hypothesis that deficiency of a thiolation reaction is responsible for suppression, we tested the 

involvement  of  several  tRNA  thiolation  reactions.  Our  results  showed  that  a  temperature‐

sensitive mutation in ribosome release factor 1 is suppressed by mutations that result in loss of 

either 2‐thiolation or 5‐methylaminomethyl modification (mnm5s2U) of tRNA. 

     To address  the question why a mutant allele of RF1 causes a temperature‐sensitive growth 

phenotype  and  to  understand  how  the  lack  of  the  5‐methylaminomethyl‐2‐thiouridine 

(mnm5s2U)  of  the  wobble  base  of  tRNAGlu,  tRNALys,  and/or  tRNAGln  can  suppress  the  Ts 

phenotype, we speculate that a mutant RF1, known to terminate slower at 37° C [268], fails to 

terminate at high temperature. In such a situation, the ribosome will stall at UAG stop codons 

and as a consequence one or more proteins, sometimes essential proteins, are not expressed and 

thus  the  cell will either die or develop a  suppressor mutation  to overcome  the  stalling.    It  is 

known  that  the mnm5s2U hypomodified  tRNA  can  induce  frameshifting, possibly  caused  by 

poor binding of  the  tRNA  to  the  ribosome  [280].  It has been also  shown  that  the  slippage  in 

mutants defective  in the synthesis of the modified nucleotide mnm5s2U  increases when one of 

the codon for lysine or glutamine is placed in the P‐site, followed by a UAG stop codon [281]. 

Thus, if the gene that is not expressed due to stalling has a codon read by hypomodified tRNAs 

preceding the UAG stop codon, a frameshifting event would allow the ribosome to bypass the 

stop codon in the +1 or ‐1 reading frame. This may permit ribosomes to terminate at an out of 

frame  stop  codon,  UAA  or  UGA  recognized  by  RF2,  and  a  functional  protein  might  be 

produced and hence suppression of the Ts phenotype. 

 

3. Concluding remarks 

     IF1 has been the subject of intensive research for several years but the role of this protein in 

translation  initiation  remains unclear. We  have  now  increased  our  knowledge  about  the  IF1 

function on  the ribosome. We  find  that  IF1 plays a role  in ribosomal subunit  joining and  this 

function could be TIR‐dependent in cold. In the future, in vitro translation assay can help us to 

get more information about the suggested functions. This can be done by isolating the wild‐type 

and the mutant IF1, the 50S and the 30S subunits and the experiment can be run either  in the 

cold or rooms temperature using different mRNA compositions designed previously [234]. 

     We have also investigated if the IF1 mutant and the antibiotic kasugamycin affect the same 

related step in translation initiation. A 2D gel electrophoresis technique has helped us to gain an 

overview  of  proteins  expressed  under  these  two  conditions. We  find  that  the  ybgF  gene  is 

uniquely sensitive  to  the  IF1 mutation as well as  to  the addition of kasugamycin. The  results 

have also suggested that the TIR region of ybgF may have some unique properties that influence 

expression of ygbF at the early translational phase. The unique property of the TIR region of the 

ybgF gene needs  to be  identified  and  investigated more  closely. This  can be done  in  several 

ways, one obvious way  is  to mutate systematically sequences  in  this region and see how  this 

affects the expression of the gene using the protein A’expression assay system.   

     Finally, the results in this thesis give an important contribution for understanding translation 

termination. It supports the hypothesis from other researchers that modified nucleosides in the 

anticodons of  tRNAs act  in part  to prevent  frameshifting by  the ribosome. We  found  that  the 

mnm5s2U  hypomodified  tRNAGlu,  tRNALys,  and/or  tRNAGln  can  suppress  the  Ts  phenotype, 

caused by a mutant allele of RF1, by  inducing  frameshifting which  leads  to bypassing of  the 

ribosome stalling at UAG stop codon in the + 1 or ‐1 reading frame. It will be interesting to see 

how the insertion in cysB does affect the levels of thionucleosides in the suppressed RF1 mutant 

strain′s tRNA and compare it with the effect caused by mnmA or tusB knockout. 

39

40

4. Acknowledgements 

I would like to thank  

My supervisors, Prof. Leif Isaksson and Docent. Monica Rydén‐Aulin for accepting me as your 

Ph.D. student and for all the time you spent on my articles. This thesis would not have been 

possible without your encouragement, guidance and support.  

Jaroslav Belotserkovsky for good collaboration, for your endless help, for English proofreading 

this thesis and giving comments. 

Sergey Surkov for nice collaboration, for sharing your experiences and helpful discussions. 

Prof. Elisabeth Haggård for accepting me for a degree project, for your endless help and 

support and for critical reading of this thesis. 

Dr. Anders Nilsson for your guidance during my degree project and for your friendship and 

help. 

Prof. Ann‐Beth Jonsson for all your help during the dissertation process. 

Dr. Margareta Ohné for your help during the lab courses. 

Natalia Kotova for being a good friend at GMT.  

Ingabritt Olausson and Görel Lindberg for perfect technical support and for your friendly 

attitude. 

Eva Pettersson, Anette Storbacka and Eva Eyton for your administrative help.  

All the present and former members at the GMT department for being pleasant colleagues 

during these years.   

Finally, I am heartily thankful to all my family, especially my mother, my husband Riad who 

supported me during these years, and my children Nour and Rickard for making my life sunny.

5. References  1.  Schmeing,  T.M.,  and  Ramakrishnan, V.  (2009). What  recent  ribosome  structures  have 

revealed about the mechanism of translation. Nature 461, 1234‐1242. 2.  Gualerzi, C.O., Brandi, L.B., Caserta, E., La Teana, A., Spurio, R., Tomsic, J., and Pon, C.L. 

(2000). Translation initiation in bacteria. In The Ribosome. Structure, function, antibiotics, and  cellular  interactions, R.A. Garrett,  S.R. Douthwaite, A. Liljas, A.T. Matheson, P.B. Moore and H.F. Noller, eds. (Washington DC: ASM press), pp. 477‐494. 

3.  Laursen,  B.S.,  Sorensen,  H.P.,  Mortensen,  K.K.,  and  Sperling‐Petersen,  H.U.  (2005). Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 69, 101‐123. 

4.  Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Katunin, V.I., and Wintermeyer, W.  (1997). Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385, 37‐41. 

5.  Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V.  (1998). Complete kinetic mechanism of elongation  factor Tu‐dependent binding of aminoacyl‐tRNA  to  the A  site of  the E.  coli ribosome. EMBO J 17, 7490‐7497. 

6.  Rodnina, M.V., Beringer, M., and Wintermeyer, W. (2007). How ribosomes make peptide bonds. Trends Biochem Sci 32, 20‐26. 

7.  Nakamura, Y., Ito, K., and Isaksson, L.A. (1996). Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147‐150. 

8.  Freistroffer, D.V., Pavlov, M.Y., MacDougall,  J., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (1997). Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP‐dependent manner. EMBO J 16, 4126‐4133. 

9.  Kiel, M.C., Raj, V.S., Kaji, H., and Kaji, A.  (2003). Release of  ribosome‐bound  ribosome recycling factor by elongation factor G. J Biol Chem 278, 48041‐48050. 

10.  Karimi, R., Pavlov, M.Y., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M.  (1999). Novel  roles  for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol Cell 3, 601‐609. 

11.  Condon, C., Liveris, D., Squires, C., Schwartz, I., and Squires, C.L. (1995). rRNA operon multiplicity in E.coli and the physiological implications of rrn inactivation. J Bacteriol 177, 4152‐4156. 

12.  Allen, G.S., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank,  J.  (2005). The cryo‐EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell 121, 703‐712. 

13.  Myasnikov, A.G., Marzi, S., Simonetti, A., Giuliodori, A.M., Gualerzi, C.O., Yusupova, G., Yusupov, M., and Klaholz, B.P. (2005). Conformational transition of initiation factor 2 from  the GTP‐  to GDP‐bound state visualized on  the ribosome. Nat Struct Mol Biol 12, 1145‐1149. 

14.  Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O., and Klaholz, B.P. (2008). Structure of the 30S translation initiation complex. Nature 455, 416‐420. 

15.  Julian, P., Milon, P., Agirrezabala, X., Lasso, G., Gil, D., Rodnina, M.V.,  and Valle, M. (2011).  The  Cryo‐EM  structure  of  a  complete  30S  translation  initiation  complex  from Escherichia coli. PLoS Biol 9, e1001095. 

41

16.  Moore,  P.B.,  and  Steitz,  T.A.  (2003).  The  structural  basis  of  large  ribosomal  subunit function. Annu Rev Biochem 72, 813‐850. 

17.  Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H.D., and Noller, H.F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 Å resolution. Science 292, 883‐896. 

18.  Wimberly,  B.T.,  Brodersen, D.E., Clemons, W.M.J., Morgan‐Warren,  R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T., and Ramakrishnan, V.  (2000). Structure of  the 30S ribosomal subunit. Nature 407, 327‐339. 

19.  Schluenzen, F., Tocilj, A., Zarivach, R., Harms, J., Gluehmann, M., Janell, D., Bashan, A., Bartels, H., Agmon,  I.,  Franceschi,  F.,  et  al.  (2000).  Structure  of  functionally  activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell 102, 615‐623. 

20.  Jenner,  L.,  Romby,  P.,  Rees,  B.,  Schulze‐Briese,  C.,  Springer,  M.,  Ehresmann,  C., Ehresmann, B., Moras, D., Yusupova, G., and Yusupov, M. (2005). Translational operator of mRNA  on  the  ribosome: how  repressor proteins  exclude  ribosome  bnding.  Science 308, 120‐123. 

21.  Marzi, S., Myasnikov, A.G., Serganov, A., Ehresmann, C., Romby, P., Yusupov, M., and Klaholz, B.P. (2007). Structured mRNAs regulate translation initiation by binding to the platform of the ribosome. Cell 130, 1019‐1031. 

22.  Yusupova,  G.Z.,  Yusupov,  M.M.,  Cate,  J.H.,  and  Noller,  H.F.  (2001).  The  path  of messenger RNA through the ribosome. Cell 106, 233‐241. 

23.  Takyar,  S.,  Hickerson,  R.P.,  and  Noller,  H.F.  (2005).  mRNA  helicase  activity  of  the ribosome. Cell 120, 49‐58. 

24.  Noller, H.F., Kop,  J., Wheaton, V., Brosius,  J., Gutell, R.R., Kopylow, A.M., Dohme, F., and Herr, W.  (1981). Secondary structure model  for 23S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res 9, 6167‐6189. 

25.  Steitz, T.A., and Moore, P.B. (2003). RNA, the first macromolecular catalyst: the ribosome is a ribozyme. Trends Biochem Sci. 28, 411‐418. 

26.  Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science 289, 905‐920. 

27.  Harms,  J.,  Schluenzen,  F.,  Zarivach,  R.,  Bashan,  A.,  Gat,  S.,  Agmon,  I.,  Bartels,  H., Franceschi, F., and Yonath, A.  (2001). High  resolution  structure of  the  large  ribosomal subunit from a mesophilic bacterium. Cell 107, 679‐688. 

28.  Schuwirth, B.S., Borovinskaya, M.A., Hau, C.W., Zhang, W., Vila‐Sanjurjo, A., Holton, J.M.,  and  Cate,  J.H.  (2005).  Structures  of  the  bacterial  ribosome  at  3.5  A  resolution. Science 310, 827‐834. 

29.  Kaczanowska, M., and Ryden‐Aulin, M. (2007). Ribosome biogenesis and the translation process in Escherichia coli. Microbiol Mol Biol Rev 71, 477‐494. 

30.  Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000). The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289, 920‐930. 

31.  Williamson, J.R. (2005). Assembly of the 30S ribosomal subunit. Q Rev Biophys 38, 397‐403. 

32.  Holmes, K.L., and Culver, G.M. (2005). Analysis of conformational changes in 16 S rRNA during the course of 30 S subunit assembly. J Mol Biol 354, 340‐357. 

42

33.  Williamson,  J.R.  (2003). After  the  ribosome structure: how are  the subunits assembled? RNA 9, 165‐167. 

34.  Nikolaev, N., Silengo, L., and Schlessinger, D.  (1973). Synthesis of a  large precursor  to ribosomal RNA in a mutant of Escherichia coli. Proc Nat Acad Sci Usa 70, 3361‐3365. 

35.  King,  T.C.,  Sirdeshmukh,  R.,  and  Schlessinger,  D.  (1986).  Nucleolytic  processing  of ribonucleic acid transcripts in procaryotes. Microbiol Rev 50, 428‐451. 

36.  King, C.K., and Schlessinger, D. (1983). S1 nuclease mapping analysis of ribosomal RNA processing in wild type and processing deficient Escherichia coli. J Biol Chem 258, 12034‐12042. 

37.  Young, R.A.,  and  Steitz,  J.A.  (1978). Complementary  sequences  1700 nucleotides  apart from  a  ribonuclease  III  cleavage  site  in Escherichia  coli  ribosomal precursor RNA. Proc Nat Acad Sci USA 75, 3593‐3597. 

38.  Bram, R.J., Young, R.A.,  and  Steitz,  J.A.  (1980).  The  ribonuclease  III  site  flanking  23S sequences in the 30S ribosomal precursor RNA of E. coli. Cell 19, 393‐401. 

39.  Dunn, J.J., and Studier, F.W. (1973). T7 early RNAs and Escherichia coli ribosomal RNAs are cut from large precursor RNAs in vivo by ribonuclease 3. Proc Natl Acad Sci U S A 70, 3296‐3300. 

40.  Li, Z., Pandit, S., and Deutscher, M.P. (1999). RNase G (CafA protein) and RNase E are both required for the 5ʹ maturation of 16S ribosomal RNA. EMBO J 18, 2878‐2885. 

41.  Al Refaii, A., and Alix,  J.H.  (2009). Ribosome biogenesis  is  temperature‐dependent and delayed in Escherichia coli lacking the chaperones DnaK or DnaJ. Mol Microbiol 71, 748‐762. 

42.  Hayes, F., and Vasseur, M. (1976). Processing of the 17‐S Escherichia coli precursor RNA in the 27‐S pre‐ribosomal particle. Eur J Biochem 61, 433‐442. 

43.  Sirdeshmukh, R., and Schlessinger, D.  (1985). Ordered processing of Escherichia coli 23S rRNA in vitro. Nucl Acid Res 13, 5041‐5054. 

44.  Li, Z., Pandit, S., and Deutscher, M.P. (1999). Maturation of 23S ribosomal RNA requiers the exoribonuclease RNase T. RNA 5, 139‐146. 

45.  Jemiolo,  D.K.  (1996).  Processing  of  prokaryotic  ribosomal  RNA.  In  Ribosomal  RNA: structure,  evolution,  processing,  and  function  in protein  synthesis, R.A. Zimmermann and A.E. Dahlberg, eds. (CRC Press), pp. 453‐468. 

46.  Roy,  M.K.,  Singh,  B.,  Ray,  B.K.,  and  Apirion,  D.  (1983).  Maturation  of  5S  rRNA: ribonuclease E cleavages and  their dependence on precursor sequences. Eur  J Biochem 131, 119‐127. 

47.  Misra,  T.K.,  and  Apirion,  D.  (1979).  RNase  E,  an  RNA  processing  enzyme  from Escherichia coli. J Biol Chem 254, 11154‐11159. 

48.  Li, Z., and Deutscher, M.P. (1995). The tRNA processing enzyme RNase T is essential for maturation of 5S RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6883‐6886. 

49.  Bakin,  A.,  and  Ofengand,  J.  (1993).  Four  newly  located  pseudouridylate  residues  in escherichia‐coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center ‐ analysis by the application of a new sequencing technique. Biochemistry 32, 9754‐9762. 

50.  Decatur, W.A.,  and  Fournier, M.J.  (2002).  rRNA modifications  and  ribosome  function. Trends Biochem Sci 27, 344‐351. 

43

51.  Chow,  C.S.,  Lamichhane,  T.N.,  and  Mahto,  S.K.  (2007).  Expanding  the  nucleotide repertoire  of  the  ribosome with  post‐transcriptional modifications. ACS Chem  Biol  2, 610‐619. 

52.  Krzyzosiak, W., Denman, R., Nurse, K., Hellmann, W., Boublik, M., Gehrke, C.W., Agris, P.F., and Ofengand, J. (1987). In vitro synthesis of 16S ribosomal RNA containing single base changes and assembly into a functional 30S ribosome. Biochemistry 26, 2353‐2364. 

53.  Green, R., and Noller, H.F. (1996). In vitro complementation analysis localizes 23S rRNA posttranscriptional  modifications  that  are  required  for  Escherichia  coli  50S  ribosomal subunit assembly and function. RNA 2, 1011‐1021. 

54.  Caldas,  T.,  Binet,  E.,  Bouloc,  P.,  and  Richarme,  G.  (2000).  Translational  defects  of Escherichia  coli mutants  deficient  in  the Um2552  23S  ribosomal  RNA methyltransferase RrmJ/FtsJ. Biochem Biophys Res Com 271, 714‐718. 

55.  Gutgsell, N.S., Deutscher, M.P., and Ofengand,  J.  (2005). The pseudouridine synthetase RluD is required for normal ribosome assembly and function in Escherichia coli. RNA 11, 1141‐1152. 

56.  Traub,  P.,  and  Nomura,  M.  (1968).  Structure  and  function  of  E.  coli  ribosomes.  V. Reconstitution  of  functionally  active  30S  ribosomal  particles  from  RNA  and  proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 59, 777‐784. 

57.  Nierhaus, K.H.,  and Dohme,  F.  (1974).  Total  reconstitution  of  functionally  active  50S ribosomal subunits from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 71, 4713‐4717. 

58.  Green, R.,  and Noller, H.F.  (1999). Reconstitution of  functional  50S  ribosomes  from  in vitro transcripts of Bacillus stearothermophilus 23S rRNA. Biochemistry 38, 1772‐1779. 

59.  Nomura, M., and Fahnestock, S. (1973). Reconstitution of 50S ribosomal subunits and the role of 5S RNA. Basic Life Sci 1, 241‐250. 

60.  Shajani, Z.,  Sykes, M.T.,  and Williamson,  J.R.  (2011). Assembly of bacterial  ribosomes. Annu Rev Biochem 80, 501‐526. 

61.  Mangiarotti, G., Turco, E., Perlo, C., and Altruda, F. (1975). Role of precursor 16S RNA in assembly of E. coli 30S ribosome. Nature 253, 569‐570. 

62.  Mizushima,  S.,  and Nomura, M.  (1970). Assembly mapping of  30S  ribosomal proteins from E coli. Nature 226, 1214‐1218. 

63.  Held, W.A., Ballou, B., Mizushima, S., and Nomura, M. (1974). Assembly mapping of 30S ribosomal proteins from Escherichia coli. J Biol Chem 249, 3103‐3111. 

64.  Grondek,  J.F.,  and  Culver,  G.M.  (2004).  Assembly  of  the  30S  ribosomal  subunit: positioning ribosomal protein S13 in the S7 assembly branch. RNA 10, 1861‐1866. 

65.  Held, W.A., Mizushima, S., and Nomura, M. (1973). Reconstitution of Escherichia coli 30 S ribosomal subunits from purified molecular components. J Biol Chem 248, 5720‐5730. 

66.  Held, W.A.,  and  Nomura, M.  (1973).  Rate  determining  step  in  the  reconstitution  of Escherichia coli 30S ribosomal subunits. Biochemistry Usa 12, 3273‐3281. 

67.  Powers, T., Daubresse, G., and Noller, H.F. (1993). Dynamics of in vitro assembly of 16 S rRNA into 30 S ribosomal subunits. J Mol Biol 232, 362‐374. 

68.  Herold,  M.,  and  Nierhaus,  K.N.  (1987).  Incorporation  of  six  additional  proteins  to complete  the  assembly map  of  the  50S  subunit  from  Escherichia  coli  ribosomes.  J  Biol Chem 262, 8826‐8833. 

44

69.  Klein, D.J., Moore, P.B.,  and Steitz, T.A.  (2004). The  roles of  ribosomal proteins  in  the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit. J Mol Biol 340, 141‐177. 

70.  Culver, G.M. (2003). Assembly of the 30S ribosomal subunit. Biopolymers 68, 234‐249. 71.  Adilakshmi,  T.,  Bellur, D.L.,  and Woodson,  S.A.  (2008). Concurrent  nucleation  of  16S 

folding and induced fit in 30S ribosome assembly. Nature 455, 1268‐1272. 72.  Coetzee,  T., Herschlag, D.,  and  Belfort, M.  (1994).  Escherichia  coli  proteins,  including 

ribosomal protein S12,  facilitate  in vitro splicing of phage T4  introns by acting as RNA chaperones. Genes Dev 8, 1575‐1588. 

73.  Clodi, E., Semrad, K., and Schroeder, R. (1999). Assaying RNA chaperone activity in vivo using a novel RNA folding trap. EMBO J 18, 3776‐3782. 

74.  Ramaswamy, P.,  and Woodson, S.A.  (2009). Global  stabilization of  rRNA  structure by ribosomal proteins S4, S17, and S20. J Mol Biol 392, 666‐677. 

75.  Ramaswamy, P., and Woodson, S.A. (2009). S16 throws a conformational switch during assembly of 30S 5ʹ domain. Nat Struct Mol Biol 16, 438‐445. 

76.  Semrad,  K.,  Green,  R.,  and  Schroeder,  R.  (2004).  RNA  chaperone  activity  of  large ribosomal subunit proteins from Escherichia coli. RNA 10, 1855‐1860. 

77.  Korepanov, A., Gongadze, G.M., Graber, M.B., Court, D.L., and Bubunenko, M.  (2007). Importance of the 5S rRNA‐binding ribosomal proteins for cell viability and translation Escherichia coli. J Mol Biol 366, 1199‐1208. 

78.  Rydén‐Aulin, M., Zhang, S., Kylsten, P., and Isaksson, L.A. (1993). Ribosome activity and modification  of  16S  RNA  are  influenced  by  deletion  of  ribosomal  protein  S20. Mol Microbiol 7, 983‐992. 

79.  Tobin C, Mandava CS, Ehrenberg M, Andersson DI , and S, S. (2010). Ribosomes lacking protein S20 are defective in mRNA binding and subunit association. j Mol Biol 397, 767‐776. 

80.  Weeks, K.M. (1997). Protein‐facilitated RNA folding. Curr Opin Struct Biol 7, 336‐342. 81.  Schroeder, R., Barta, A., and Semrad, K. (2004). Strategies for RNA folding and assembly. 

Nat Rev Mol Cell Biol 5, 908‐919. 82.  Woodson, S.A. (2000). Recent insights on RNA folding mechanisms from catalytic RNA. 

Cell Mol Life Sci 57, 796‐808. 83.  Lindahl, L. (1975). Intermediates and time kinetics of the in vitro assembly of Escherichia 

coli ribosomes. J Mol Biol 92, 15‐37. 84.  Linder, P., Lasko, P.F., Ashburner, M., Leroy, P., Nielsen, P.J., Nishi, K., Schnier, J., and 

Slonimski, P.P. (1989). Birth of the D‐E‐A‐D box. Nature 337, 121‐122. 85.  Mohr, S., Stryker,  J.M., and Lambowitz, A.M.  (2002). A DEAD‐box protein  functions as 

an ATP‐dependent RNA chaperone in group I intron splicing. Cell 109, 769‐779. 86.  Jankowsky, E., Gross, C.H., Shuman, S., and Pyle, A.M.  (2001). Active disruption of an 

RNA‐protein interaction by a DExH/D RNA helicase. Science 291, 121‐125. 87.  Linder, P. (2006). Dead‐box proteins: a family affair‐‐active and passive players in RNP‐

remodeling. Nucleic Acids Res 34, 4168‐4180. 88.  Jagessar, K.L., and Jain, C. (2010). Functional and molecular analysis of Escherichia coli 

strains lacking multiple DEAD‐box helicases. RNA 16. 89.  Jain, C.  (2008).  The  E.  coli RhlE RNA  helicase  regulates  the  function  of  related RNA 

helicases during ribosome assembly. RNA 14, 381‐389. 

45

90.  Charollais, J., Pflieger, D., Vinh, J., Dreyfus, M., and Iost, I. (2003). The DEAD‐box RNA helicase SrmB is involved in the assembly of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli. Mol Microbiol 48, 1253‐1265. 

91.  Charollais,  J., Dreyfus, M.,  and  Iost,  I.  (2004). CsdA,  a  cold‐shock RNA  helicase  from Escherichia  coli,  is  involved  in  the biogenesis of 50S  ribosomal  subunit. Nucleic Acids Res 32, 2751‐2759. 

92.  Sharpe  Elles,  L.M.,  Sykes,  M.T.,  Williamson,  J.R.,  and  Uhlenbeck,  O.C.  (2009).  A dominant negative mutant of the E. coli RNA helicase DbpA blocks assembly of the 50S ribosomal subunit. Nucleic Acids Res 37, 6503‐6514. 

93.  Spillmann,  S.,  Dohme,  F.,  and  Nierhaus,  K.H.  (1977).  Assembly  in  vitro  of  the  50  S subunit  from Escherichia coli  ribosomes: proteins essential  for  the  first heat‐dependent conformational change. J Mol Biol 115, 513‐523. 

94.  Jones, P.G., Mitta, M., Kim, Y.,  Jiang, W., and  Inouye, M.  (1996). Cold shock  induces a major  ribosomal‐associated  protein  that  unwinds  double‐stranded  RNA  in  Escherichia coli. Proc Nat Acad Sci USA 93, 76‐80. 

95.  Nicol,  S.M.,  and  Fullerpace,  F.V.  (1995).  The  ʹʹDEAD  boxʹʹ  protein  DbpA  interacts specifically with the peptidyltransferase center in 235 rRNA. Proc Natl Acad Sci USA 92, 11681‐11685. 

96.  Fuller‐Pace, F.V., Nicol, S.M., Reid, A.D., and Lane, D.P.  (1993). DbpA  ‐ A DEAD Box Protein Specifically Activated by 23S rRNA. EMBO J 12, 3619‐3626. 

97.  Peil, L., Virumae, K., and Remme, J. (2008). Ribosome assembly in Escherichia coli strains lacking the RNA helicase DeaD/CsdA or DbpA. FEBS J 275, 3772‐3782. 

98.  Karbstein, K. (2007). Role of GTPases in ribosome assembly. Biopolymers 87, 1‐11. 99.  Britton,  R.A.  (2009).  Role  of  GTPases  in  bacterial  ribosome  assembly.  Annu  Rev 

Microbiol 63, 155‐176. 100.  Sayed, A., Matsuyama, S., and Inouye, M. (1999). Era, an essential Escherichia coli small 

G‐protein, binds to the 30S ribosomal subunit. Biochem Biophys Res Commun 264, 51‐54. 101.  Sharma, M.R., Barat, C., Wilson, D.N., Booth, T.M., Kawazoe, M., Hori‐Takemoto, C., 

Fucini, P., and Agrawal, R.K.  (2005).  Interaction of Era with  the 30S ribosomal subunit: Implications for 30S subunit assembly. Mol Cell 18, 319‐329. 

102.  Inoue, K., Alsina, J., Chen, J., and Inouye, M. (2003). Suppression of defective ribosome assembly  in  a  rbfA  deletion mutant  by  overexpression  of  Era,  an  essential GTPase  in Escherichia coli. Mol Microbiol 48, 1005‐1016. 

103.  Bunner, A.E., Beck, A.H., and Williamson,  J.R. Kinetic cooperativity  in Escherichia coli 30S  ribosomal  subunit  reconstitution  reveals  additional  complexity  in  the  assembly landscape. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 5417‐5422. 

104.  Herschlag, D. (1995). RNA chaperones and the RNA folding problem. J Biol Chem 270, 20871‐20874. 

105.  El Hage, A., Sbai, M., and Alix, J.H. (2001). The chaperonin GroEL and other heat‐shock proteins, besides DnaK, participate  in ribosome biogenesis  in Escherichia coli. Mol Gen Genet 264, 796‐808. 

106.  Croitoru, V., Semrad, K., Prenninger, S., Rajkowitsch, L., Vejen, M., Søgaard Laursen, B., Sperling‐Petersen, H.U., and Isaksson, L.A. (2006). RNA cahperone activity of translation initiation factor IF1. Biochimie 88, 1875‐1882. 

46

107.  Jones, P.G., and Inouye, M. (1996). RbfA, a 30S ribosomal binding factor, is a cold‐shock protein whose absence triggers the cold‐shock response. Mol Microbiol 21, 1207‐1218. 

108.  Dammel, C.S., and Noller, H.F.  (1995). Suppression of a cold‐sensitive mutation  in 16S rRNA by overepression of a novel ribosome‐binding factor, RbfA. Genes & Dev 9, 626‐637. 

109.  Xia,  B., Ke, H.P.,  Shinde, U.,  and  Inouye, M.  (2003).  The  rrole  of RbfA  in  16S  rRNA processing at low temperature in Escherichia coli. J Mol Biol 332, 575‐584. 

110.  Lovgren,  J.M., Bylund, G.O., Srivastava, M.K., Lundberg, L.A., Persson, O.P., Wingsle, G.,  and Wikstrom,  P.M.  (2004).  The  PRC‐barrel  domain  of  the  ribosome maturation protein RimM mediates binding to ribosomal protein S19 in the 30S ribosomal subunits. RNA 10, 1798‐1812. 

111.  Kozak, M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene 234, 187‐208. 

112.  Boelens,  R.,  and  Gualerzi,  C.O.  (2002).  Structure  and  function  of  bacterial  initiation factors. Curr Protein Pept Sci 3, 107‐119. 

113.  Shine,  J.,  and  Dalgarno,  L.  (1974).  The  3ʹ‐terminal  sequence  of  Escherichia  coli  16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc Natl Acad Sci. USA 71, 1342‐1346. 

114.  Gualerzi, C.O., Brandi, L., Caserta, E., Garofalo, C., Lammi, M., La Teana, A., Petrelli, D., Spurio, R., Tomsic, J., and Pon, C.L. (2001). Initiation factors in the early events of mRNA translation in bacteria. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 66, 363‐376. 

115.  Gualerzi,  C.O.,  and  Pon,  C.L.  (1990).  Initiation  of mRNA  translation  in  prokaryotes. Biochemistry 29, 5881‐5889. 

116.  Simonetti, A., Marzi, S.,  Jenner, L., Myasnikov, A., Romby, P., Yusupova, G., Klaholz, B.P., and Yusupov, M. (2009). A structural view of translation initiation in bacteria. Cell Mol Life Sci 66, 423‐436. 

117.  Grigoriadou, C., Marzi,  S., Kirillov,  S., Gualerzi, C.O.,  and Cooperman, B.S.  (2007). A quantitative kinetic scheme for 70 S translation  initiation complex formation. J Mol Biol 373, 562‐572. 

118.  Blaha, G., Stanley, R.E., and Steitz, T.A. (2009). Formation of the first peptide bond: the structure of EF‐P bound to the 70S ribosome. Science 325, 966‐970. 

119.  McCarthy,  J.E.,  and  Brimacombe,  R.  (1994).  Prokaryotic  translation:  the  interactive pathway leading to initiation. Trends Genet 10, 402‐407. 

120.  Komarova, A.V., Tchufistova, L.S., Dreyfus, M., and Boni, I.V. (2005). AU‐rich sequences within  5ʹ untranslated  leaders  enhance  translation  and  stabilize mRNA  in Escherichia coli. J Bacteriol 187, 1344‐1349. 

121.  Boni,  I.V.,  Isaeva,  D.M.,  Musychenko,  M.L.,  and  Tzareva,  N.V.  (1991).  Ribosome‐messenger  recognition: mRNA  target sites  for  ribosomal protein S1. Nucleic Acids Res 19, 155‐162. 

122.  Hook‐Barnard, I.G., Brickman, T.J., and McIntosh, M.A. (2007). Identification of an AU‐rich translational enhancer within the Escherichia coli fepB leader RNA. J Bacteriol 189, 4028‐4037. 

47

123.  Blattner, F.R., Plunkett, G., 3rd, Bloch, C.A., Perna, N.T., Burland, V., Riley, M., Collado‐Vides,  J., Glasner,  J.D., Rode, C.K., Mayhew, G.F.,  et  al.  (1997). The  complete genome sequence of Escherichia coli K‐12. Science 277, 1453‐1462. 

124.  Schneider, T.D., Stormo, G.D., Gold, L., and Ehrenfeucht, A. (1986). Information content of binding sites on nucleotide sequences. J Mol Biol 188, 415‐431. 

125.  Gold, L.  (1988). Posttranscriptional  regulatory mechanisms  in Escherichia  coli. Ann Rev Biochem 57, 199‐233. 

126.  Ringquist, S., Shinedling, S., Barrick, D., Green, L., Binkley, J., Stormo, G.D., and Gold, L. (1992). Translation  initiation  in Escherichia coli: sequences within the ribosome‐binding site. Mol Microbiol 6, 1219‐1229. 

127.  Sprengart, M.L., and Porter, A.G.  (1997). Functional  importance of RNA  interactions  in selection of translation initiation codons. Mol Microbiol 24, 19‐28. 

128.  Sprengart, M.L., Fatscher, H.P., and Fuchs, E.  (1990). The  initiation of  translation  in E. coli:  apparent  base  pairing  between  the  16srRNA  and  downstream  sequences  of  the mRNA. Nucleic Acids Res 18, 1719‐1723. 

129.  Sprengart, M.L., Fuchs, E., and Porter, A.G. (1996). The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. EMBO J 15, 665‐674. 

130.  Blasi, U., OʹConnor, M.,  Squires, C.L.,  and Dahlberg, A.E.  (1999). Misled  by  sequence complementarity:  does  the  DB‐anti‐DB  interaction  withstand  scientific  scrutiny? Mol Microbiol 33, 439‐441. 

131.  La  Teana, A.,  Brandi, A., OʹConnor, M.,  Freddi,  S.,  and  Pon, C.L.  (2000).  Translation during  cold  adaptation  does  not  involve  mRNA‐rRNA  base  pairing  through  the downstream box. RNA 6, 1393‐1402. 

132.  OʹConnor,  M.,  Asai,  T.,  Squires,  C.L.,  and  Dahlberg,  A.E.  (1999).  Enhancement  of translation  by  the  downstream  box  des  not  involve  base  pairing  of mRNA with  the penultimate stem sequence of 16S rRNA. Proc Nat Acad Sci Usa 96, 8973‐8978. 

133.  Jin, H., Zhao, Q., Gonzalez de Valdivia, E.I., Ardell, D.H., Stenstrom, M., and Isaksson, L.A.  (2006).  Influences on gene  expression  in vivo by a Shine‐Dalgarno  sequence. Mol Microbiol 60, 480‐492. 

134.  Calogero, R.A., Pon, C.L., Canonaco, M.A.,  and Gualerzi, C.O.  (1988).  Selection  of  the mRNA translation initiation region by Escherichia coli ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 6427‐6431. 

135.  Lee, C.P., Seong, B.L., and RajBhandary, U.L.  (1991). Structural and sequence elements important  for  recognition  of  Escherichia  coli  formylmethionine  tRNA  by  methionyl‐tRNA transformylase are clustered in the acceptor stem. J Biol Chem 266, 18012‐18017. 

136.  Guillon, J.M., Meinnel, T., Mechulam, Y., Lazennec, C., Blanquet, S., and Fayat, G. (1992). Nucleotides of tRNA governing the specificity of Escherichia coli methionyl‐tRNA(fMet) formyltransferase. J Mol Biol 224, 359‐367. 

137.  RajBhandary,  U.L.,  and  Chow,  C.M.  (1995).  Initiator  tRNA  and  initiation  of  protein synrthesis. In tRNA; structure, biosynthesis and function., D. Soll and U.L. RajBhandary, eds. (Washington DC: American society for microbiologi), pp. 511‐528. 

138.  Hartz, D., Binkley, J., Hollingsworth, T., and Gold, L. (1990). Domains of initiator tRNA and  initiation  codon  crucial  for  initiator  tRNA  selection by Escherichia  coli  IF3. Genes Dev 4, 1790‐1800. 

48

139.  Yusupova, G., Jenner, L., Rees, B., Moras, D., and Yusupov, M. (2006). Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome. Nature 444, 391‐394. 

140.  Selmer, M., Dunham,  C.M., Murphy,  F.V.t., Weixlbaumer, A.,  Petry,  S.,  Kelley, A.C., Weir,  J.R., and Ramakrishnan, V. (2006). Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313, 1935‐1942. 

141.  Lancaster, L., and Noller, H.F. (2005). Involvement of 16S rRNA nucleotides G1338 and A1339 in discrimination of initiator tRNA. Mol Cell 20, 623‐632. 

142.  Barraud,  P.,  Schmitt,  E.,  Mechulam,  Y.,  Dardel,  F.,  and  Tisne,  C.  (2008).  A  unique conformation of the anticodon stem‐loop is associated with the capacity of tRNAfMet to initiate protein synthesis. Nucleic Acids Res 36, 4894‐4901. 

143.  Varshney, U., Lee, C.P., and RajBhandary, U.L. (1993). From elongator tRNA to initiator tRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 2305‐2309. 

144.  Limbach, P.A., Crain, P.F., and Mccloskey, J.A. (1994). The modified nucleosides of RNA: summary. Nucleic Acids Res 22, 2183‐2196. 

145.  Bjork, G.R., Ericson, J.U., Gustafsson, C.E., Hagervall, T.G., Jonsson, Y.H., and Wikstrom, P.M. (1987). Transfer RNA modification. Annu Rev Biochem 56, 263‐287. 

146.  Nishimura,  S.  (1979).  In  Transfer  RNA:  Structure,  Properties  and  Recognition,  P.R. Schimmel, D. Söll and J.N. Abelson, eds. (New York: Cold Spring Harbor Lab), pp. 59‐79. 

147.  Lundgren, H.K., and Björk, G.R. (2006). Structural alterations of the cysteine desulfurase IscS  of  Salmonella  enterica  serovar  typhimurium  reveal  substrate  specificity  of  IscS  in tRNA thiolation. J Bacteriol 188, 3052‐3062. 

148.  Ajitkumar,  P.,  and  Cheravil,  J.D.  (1988).  Thionucleotides  in  transfer  ribonucleic  acid: diversity, structure, biosynthesis, and function. Microbiol Rev 52, 103‐113. 

149.  Yokoyama, S., Watanabe, T., Murao, K., Ishikura, H., Yamaizumi, Z., Nishimura, S., and Miyazawa, T. (1985). Molecular mechanism of codon recognition by tRNA species with modified uridine  in  the  first position  of  the  anticodon. Proc. Natl. Acad.  Sci. USA  82, 4905‐4909. 

150.  Elseviers, D., Petrullo, L.A., and Gallagher, P.J. (1984). Novel E coli mutants deficient  in biosynthesis of 5‐methylaminomethyl‐2‐thiouridine. Nucleic Acids Res 12, 3521‐3534. 

151.  Hagervall,  T.G.,  and Björk, G.R.  (1984). Undermodification  in  the  first  position  of  the anticodon of supG‐tRNA reduces translation efficiency. Mol Gen Genet 196, 194‐200. 

152.  Björk, G.R.,  and T. G. Hagervall.  (2005  ). Transfer RNA modification.Chapter  4.6.2.  In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. , A. Böck, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nyström and C.L. Squires, eds. ( Washington DC: ASM Press. ). 

153.  Urbonavicius,  J.,  Q,  Q.,  Durand,  J.M.B.,  Hagervall,  T.G.,  and  Björk,  G.R.  (2001). Improvement  of  reading  frame maintanance  is  a  common  function  for  several  tRNA modifications. EMBO J 20, 4863‐4873. 

154.  Cummings, H.S., and Hershey,  J.W.  (1994). Translation  initiation  factor  IF1  is essential for cell viability in Escherichia coli. J Bacteriol 176, 198‐205. 

155.  Kyrpides,  N.C.,  and Woese,  C.R.  (1998).  Universally  conserved  translation  initiation factors. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 224‐228. 

49

156.  Sette, M., van Tilborg, P., Spurio, R., Kaptein, R., Paci, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (1997).  The  structure  of  the  translational  initiation  factor  IF1  from  E.coli  contains  an oligomer‐binding motif. EMBO J 16, 1436‐1443. 

157.  Schnuchel,  A., Wiltscheck,  R.,  Czisch, M., Herrler, M., Willimsky,  G.,  Graumann,  P., Marahiel, M.A.,  and Holak, T.A.  (1993).  Structure  in  solution  of  the major  cold‐shock protein from Bacillus subtilis. Nature 364, 169‐171. 

158.  Schindelin, H.,  Jiang, W.,  Inouye, M.,  and Heinemann, U.  (1994). Crystal  structure  of CspA,  the major  cold  shock protein of Escherichia  coli. Proc Natl Acad  Sci U  S A  91, 5119‐5123. 

159.  Schindelin,  H.,  Marahiel,  M.A.,  and  Heinemann,  U.  (1993).  Universal  nucleic  acid‐binding domain revealed by crystal structure of the B. subtilis major cold‐shock protein. Nature 364, 164‐168. 

160.  Gribskov, M. (1992). Translational  initiation factors IF‐1 and eIF‐2 alpha share an RNA‐binding motif with prokaryotic ribosomal protein S1 and polynucleotide phosphorylase. Gene 119, 107‐111. 

161.  Bycroft, M.,  Hubbard,  T.J.,  Proctor, M.,  Freund,  S.M.,  and Murzin,  A.G.  (1997).  The solution structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid‐binding fold. Cell 88, 235‐242. 

162.  Moazed, D., Samaha, R.R., Gualerzi, C., and Noller, H.F. (1995). Specific protection of 16 S rRNA by translational initiation factors. J Mol Biol 248, 207‐210. 

163.  Carter,  A.P.,  Clemons, W.M.,  Jr.,  Brodersen,  D.E., Morgan‐Warren,  R.J.,  Hartsch,  T., Wimberly,  B.T.,  and Ramakrishnan, V.  (2001). Crystal  structure  of  an  initiation  factor bound to the 30S ribosomal subunit. Science 291, 498‐501. 

164.  Dahlquist, K.D.,  and Puglisi,  J.D.  (2000).  Interaction  of  translation  initiation  factor  IF1 with the E. coli ribosomal A site. J Mol Biol 299, 1‐15. 

165.  Wintermeyer, W., and Gualerzi, C. (1983). Effect of Escherichia coli  initiation factors on the  kinetics  of N‐Acphe‐tRNAPhe  binding  to  30S  ribosomal  subunits. A  fluorescence stopped‐flow study. Biochemistry 22, 690‐694. 

166.  Pon, C.L., and Gualerzi, C.O.  (1984). Mechanism of protein biosynthesis  in prokaryotic cells. Effect of initiation factor IF1 on the initial rate of 30 S initiation complex formation. FEBS Lett 175, 203‐207. 

167.  Hartz,  D., McPheeters,  D.S.,  and  Gold,  L.  (1989).  Selection  of  the  initiator  tRNA  by Escherichia coli initiation factors. Genes Dev 3, 1899‐1912. 

168.  Antoun, A., Pavlov, M.Y., Lovmar, M., and Ehrenberg, M. (2006). How initiation factors maximize the accuracy of tRNA selection in initiation of bacterial protein synthesis. Mol Cell 29, 183‐193. 

169.  Kolakofsky,  D.,  Dewey,  K.F.,  Hershey,  J.W.,  and  Thach,  R.E.  (1968).  Guanosine  5ʹ‐triphosphatase activity of initiation factor f2. Proc Natl Acad Sci U S A 61, 1066‐1070. 

170.  Studer,  S.M.,  and  Joseph,  S.  (2006).  Unfolding  of mRNA  secondary  structure  by  the bacterial translation initiation complex. Mol Cell 22, 105‐115. 

171.  Chae, Y.B., Mazumder, R., and Ochoa, S.  (1969). Polypeptide chain  initiation  in E. coli: studies on the function of initiation factor F1. Proc Natl Acad Sci U S A 63, 828‐833. 

50

172.  Phadtare,  S., Kazakov, T., Bubunenko, M., Court, D.L., Pestova, T.,  and  Severinov, K. (2007). Transcription antitermination by  translation  initiation  factor  IF1.  J Bacteriol 189, 4087‐4093. 

173.  Ramakrishnan, V. (2002). Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108, 557‐572. 

174.  Milon, P., Konevega, A.L., Gualerzi, C.O., and Rodnina, M.V. (2008). Kinetic checkpoint at a late step in translation initiation. Mol Cell 30, 712‐720. 

175.  Bourne,  H.R.,  Sanders,  D.A.,  and  McCormick,  F.  (1991).  The  GTPase  superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature 349, 117‐127. 

176.  Severini, M., Choli, T., La Teana, A., and Gualerzi, C.O.  (1990). Proteolysis of Bacillus stearothermophilus IF2 and specific protection by GTP. FEBS Lett 276, 14‐16. 

177.  Caserta,  E.,  Tomsic,  J.,  Spurio, R.,  La  Teana, A.,  Pon, C.L.,  and Gualerzi, C.O.  (2006). Translation  initiation  factor  IF2  interacts  with  the  30  S  ribosomal  subunit  via  two separate binding sites. J Mol Biol 362, 787‐799. 

178.  Kapralou,  S.,  Fabbretti, A., Garulli, C.,  Spurio, R., Gualerzi, C.O., Dahlberg, A.E.,  and Pon,  C.L.  (2008).  Translation  initiation  factor  IF1  of  Bacillus  stearothermophilus  and Thermus thermophilus substitute for Escherichia coli IF1 in vivo and in vitro without a direct IF1‐IF2 interaction. Mol Microbiol 70, 1368‐1377. 

179.  Krafft, C., Diehl, A., Laettig, S., Behlke, J., Heinemann, U., Pon, C.L., Gualerzi, C.O., and Welfle,  H.  (2000).  Interaction  of  fMet‐tRNA(fMet)  with  the  C‐terminal  domain  of translational  initiation  factor  IF2  from Bacillus  stearothermophilus. FEBS Lett 471, 128‐132. 

180.  Szkaradkiewicz, K., Zuleeg, T., Limmer, S., and Sprinzl, M.  (2000).  Interaction of  fMet‐tRNAfMet  and  fMet‐AMP  with  the  C‐terminal  domain  of  Thermus  thermophilus translation initiation factor 2. Eur J Biochem 267, 4290‐4299. 

181.  Spurio, R., Brandi, L., Caserta, E., Pon, C.L., Gualerzi, C.O., Misselwitz, R., Krafft, C., Welfle, K., and Welfle, H. (2000). The C‐terminal subdomain (IF2 C‐2) contains the entire fMet‐tRNA binding site of initiation factor IF2. J Biol Chem 275, 2447‐2454. 

182.  Milon, P., Carotti, M., Konevega, A.L., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V., and Gualerzi, C.O.  (2010).  The  ribosome‐bound  initiation  factor  2  recruits  initiator  tRNA  to  the  30S initiation complex. EMBO Rep 11, 312‐316. 

183.  Moreno,  J.M., Drskjotersen, L., Kristensen,  J.E., Mortensen, K.K., and Sperling‐Petersen, H.U. (1999). Characterization of the domains of E. coli initiation factor IF2 responsible for recognition of the ribosome. FEBS Lett 455, 130‐134. 

184.  Laursen, B.S., Kjaergaard, A.C., Mortensen, K.K., Hoffman, D.W., and Sperling‐Petersen, H.U. (2004). The N‐terminal domain (IF2N) of bacterial translation initiation factor IF2 is connected to the conserved C‐terminal domains by a flexible linker. Protein Sci 13, 230‐239. 

185.  La  Teana,  A.,  Pon,  C.L.,  and  Gualerzi,  C.O.  (1993).  Translation  of  mRNAs  with degenerate  initiation  triplet AUU  displays  high  initiation  factor  2  dependence  and  is subject to initiation factor 3 repression. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 4161‐4165. 

186.  Antoun, A., Pavlov, M.Y., Lovmar, M., and Ehrenberg, M. (2006). How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. EMBO J 25, 2539‐2550. 

51

187.  Zorzet A,  P.M., Nilsson AI,  Ehrenberg M, Andersson D  (2010).  Error‐prone  initiation factor 2 mutations reduce the fitness cost of antibiotic resistance. Mol Microbiol 75, 1299‐1313. 

188.  Antoun, A., Pavlov, M.Y., Andersson, K., Tenson, T., and Ehrenberg, M. (2003). The roles of initiation factor 2 and guanosine triphosphate in initiation of protein synthesis. EMBO J 22, 5593‐5601. 

189.  Antoun, A., Pavlov, M.Y., Tenson, T., and Ehrenberg, M.M. (2004). Ribosome formation from subunits studied by stopped‐flow and Rayleigh light scattering. Biol Proced Online 6, 35‐54. 

190.  Pavlov, M.Y. (2010). Activation of initiation factor 2 by ligands and mutations for rapid docking of ribosomal subunits. In EMBO J, :. Volume 30. pp. 289‐301. 

191.  Olsson, C.L., Graffe, M., Springer, M., and Hershey, J.W. (1996). Physiological effects of translation  initiation factor IF3 and ribosomal protein L20  limitation  in Escherichia coli. Mol Gen Genet 250, 705‐714. 

192.  Sacerdot, C., Fayat, G., Dessen, P., Springer, M., Plumbridge, J.A., Grunberg‐Manago, M., and Blanquet, S.  (1982). Sequence of a 1.26‐kb DNA  fragment containing  the structural gene for E.coli initiation factor IF3: presence of an AUU initiator codon. EMBO J 1, 311‐315. 

193.  Fortier, P.L.,  Schmitter,  J.M., Garcia, C.,  and Dardel,  F.  (1994). The N‐terminal  half  of initiation factor IF3 is folded as a stable independent domain. Biochimie 76, 376‐383. 

194.  Kycia, J.H., Biou, V., Shu, F., Gerchman, S.E., Graziano, V., and Ramakrishnan, V. (1995). Prokaryotic  translation  initiation  factor  IF3  is  an  elongated  protein  consisting  of  two crystallizable domains. Biochemistry 34, 6183‐6187. 

195.  Moreau, M., de Cock, E., Fortier, P.L., Garcia, C., Albaret, C., Blanquet, S., Lallemand, J.Y.,  and Dardel, F.  (1997). Heteronuclear NMR  studies  of E.  coli  translation  initiation factor IF3. Evidence that the inter‐domain region is disordered in solution. J Mol Biol 266, 15‐22. 

196.  Hua, Y.,  and Raleigh, D.P.  (1998). On  the global  architecture of  initiation  factor  IF3:  a comparative study of the linker regions from the Escherichia coli protein and the Bacillus stearothermophilus protein. J Mol Biol 278, 871‐878. 

197.  de Cock, E., Springer, M., and Dardel, F.  (1999). The  interdomain  linker of Escherichia coli  initiation  factor  IF3:  a  possible  trigger  of  translation  initiation  specificity.  Mol Microbiol 32, 193‐202. 

198.  Sette, M., Spurio, R., van Tilborg, P., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (1999). Identification of  the  ribosome  binding  sites  of  translation  initiation  factor  IF3  by multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. RNA 5, 82‐92. 

199.  Garcia,  C.,  Fortier,  P.L.,  Blanquet,  S.,  Lallemand,  J.Y.,  and Dardel,  F.  (1995).  Solution structure  of  the  ribosome‐binding  domain  of  E.  coli  translation  initiation  factor  IF3. Homology with the U1A protein of the eukaryotic spliceosome. J Mol Biol 254, 247‐259. 

200.  Petrelli, D., LaTeana, A., Garofalo, C., Spurio, R., Pon, C.L., and Gualerzi, C.O.  (2001). Translation  initiation  factor  IF3:  two domains,  five  functions, one mechanism? EMBO  J 20, 4560‐4569. 

52

201.  Maar, D., Liveris, D., Sussman, J.K., Ringquist, S., Moll, I., Heredia, N., Kil, A., Blasi, U., Schwartz,  I., and Simons, R.W.  (2008). A single mutation  in  the  IF3 N‐terminal domain perturbs the fidelity of translation initiation at three levels. J Mol Biol 383, 937‐944. 

202.  van  Duin,  J.,  Kurland,  C.G.,  Dondon,  J.,  and  Grunberg‐Manago,  M.  (1975).  Near neighbors of IF3 bound to 30S ribosomal subunits. FEBS Lett 59, 287‐290. 

203.  Gualerzi,  C.,  Risuleo,  G.,  and  Pon,  C.L.  (1977).  Initial  rate  kinetic  analysis  of  the mechanism  of  initiation  complex  formation  and  the  role  of  initiation  factor  IF‐3. Biochemistry 16, 1684‐1689. 

204.  Hartz, D., McPheeters, D.S., and Gold, L. (1990). From polynucleotide to natural mRNA translation  initiation:  function  of  Escherichia  coli  initiation  factors.  In  The  ribosome. Structure, function, and evolution., W.E. Hill, A. Dahlberg, R.A. Garrett, P.B. Moore, D. Schlessinger and J.R. Warner, eds. (Washington D. C.: ASM), pp. 275‐280. 

205.  Gualerzi,  C.,  Pon,  C.L.,  and  Kaji,  A.  (1971).  Initiation  factor  dependent  release  of aminoacyl‐tRNAs  from  complexes of 30S  ribosomal  subunits,  synthetic polynucleotide and aminoacyl tRNA. Biochem Biophys Res Commun 45, 1312‐1319. 

206.  Pon,  C.L.,  and  Gualerzi,  C.  (1974).  Effect  of  initiation  factor  3  binding  on  the  30S ribosomal subunits of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 71, 4950‐4954. 

207.  Grigoriadou,  C., Marzi,  S.,  Pan, D., Gualerzi,  C.O.,  and  Cooperman,  B.S.  (2007).  The translational fidelity function of IF3 during transition from the 30 S initiation complex to the 70 S initiation complex. J Mol Biol 373, 551‐561. 

208.  Tedin, K., Moll, I., Grill, S., Resch, A., Graschopf, A., Gualerzi, C.O., and Blasi, U. (1999). Translation  initiation  factor 3 antagonizes authentic  start  codon  selection on  leaderless mRNAs. Mol Microbiol 31, 67‐77. 

209.  Sacerdot,  C.,  de  Cock,  E.,  Engst,  K.,  Graffe, M.,  Dardel,  F.,  and  Springer, M.  (1999). Mutations  that alter  initiation codon discrimination by Escherichia coli  initiation  factor IF3. J Mol Biol 288, 803‐810. 

210.  Sussman,  J.K.,  Simons,  E.L.,  and  Simons,  R.W.  (1996).  Escherichia  coli  translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo. Mol Microbiol 21, 347‐360. 

211.  La Teana, A., Gualerzi, C.O., and Brimacombe, R. (1995). From stand‐by to decoding site. Adjustment  of  the mRNA  on  the  30S  ribosomal  subunit  under  the  influence  of  the initiation factors. RNA 1, 772‐782. 

212.  Hirokawa, G., Kiel, M.C., Muto, A., Selmer, M., Raj, V.S., Liljas, A., Igarashi, K., Kaji, H., and Kaji, A. (2002). Post‐termination complex disassembly by ribosome recycling factor, a functional tRNA mimic. EMBO J 21, 2272‐2281. 

213.  Gale, E.F. (1981). The molecular basis of antibiotic action. 214.  Suhara, Y., Maeda, K., and Umezawa, H.  (1966). Chemical studies on kasugamycin. V. 

The structure of kasugamycin. Tetrahedron Lett 12, 1239‐1244. 215.  Okuyama,  A.,  Machiyama,  N.,  Kinoshita,  T.,  and  Tanaka,  N.  (1971).  Inhibition  by 

kasugamycin of  initiation  complex  formation on  30S  ribosomes. Biochem Biophys Res Commun 43, 196‐199. 

216.  Schluenzen,  F.,  Takemoto,  C.,  Wilson,  D.N.,  Kaminishi,  T.,  Harms,  J.M.,  Hanawa‐Suetsugu, K.,  Szaflarski, W., Kawazoe, M.,  Shirouzu, M., Nierhaus, K.H.,  et  al.  (2006). The antibiotic kasugamycin mimics mRNA nucleotides to destabilize tRNA binding and inhibit canonical translation initiation. Nat Struct Mol Biol 13, 871‐878. 

53

217.  Schuwirth, B.S., Day,  J.M., Hau, C.W.,  Janssen, G.R., Dahlberg, A.E., Cate,  J.H.D.,  and Vila‐Sanjurjo,  A.  (2006).  Structural  analysis  of  kasugamycin  inhibition  of  translation. Nature Struct Mol Biol. 

218.  Woodcock, J., Moazed, D., Cannon, M., Davies, J., and Noller, H.F. (1991). Interaction of antibiotics with A‐  and P‐site‐specific bases  in  16S  ribosomal RNA. EMBO  J  10,  3099‐3103. 

219.  Vila‐Sanjurjo,  A.,  Squires,  C.L.,  and  Dahlberg,  A.E.  (1999).  Isolation  of  kasugamycin resistant mutants in the 16 S ribosomal RNA of Escherichia coli. J Mol Biol 293, 1‐8. 

220.  Helser,  T.L.,  Davies,  J.E.,  and  Dahlberg,  J.E.  (1971).  Change  in  methylation  of  16S ribosomal RNA associated with mutation to kasugamycin resistance in Escherichia coli. Nat New Biol 233, 12‐14. 

221.  Van Buul, C.P., Damm,  J.B., and Van Knippenberg, P.H.  (1983). Kasugamycin  resistant mutants of Bacillus  stearothermophilus  lacking  the enzyme  for  the methylation of  two adjacent adenosines in 16S ribosomal RNA. Mol Gen Genet 189, 475‐478. 

222.  OʹConnor, M., Thomas, C.L., Zimmermann, R.A., and Dahlberg, A.E.  (1997). Decoding fidelity at the ribosomal A and P sites: influence of mutations in three different regions of the decoding domain in 16S rRNA. Nucleic Acids Res 25, 1185‐1193. 

223.  Connolly,  K.,  Rife,  J.P.,  and  Culver, G.  (2008). Mechanistic  insight  into  the  ribosome biogenesis functions of the ancient protein KsgA. Mol Microbiol 70, 1062‐1075. 

224.  Thammana,  P.,  and  Held,  W.H.  (1974).  Methylation  of  16S  RNA  during  ribosome assembly in vitro. Nature 251, 682‐686. 

225.  Demirci, H., Belardinelli, R., Seri, E., Gregory, S.T., Gualerzi, C., Dahlberg, A.E., and Jogl, G. (2009). Structural rearrangements in the active site of the Thermus thermophilus 16S rRNA methyltransferase KsgA  in a binary complex with 5ʹ‐methylthioadenosine.  J Mol Biol 388, 271‐282. 

226.  Mankin, A.S.  (2006). Antibiotic blocks mRNA path on  the  ribosome. Nature struct mol biol 13, 858‐860. 

227.  Chin, K., Shean, C.S., and Gottesman, M.E. (1993). Resistance of lambda‐cI translation to antibiotics that inhibit translation initiation. J Bacteriol 175, 7471‐7473. 

228.  Moll, I., and Blasi, U. (2002). Differential  inhibition of 30S and 70S  translation  initiation complexes on  leaderless mRNA by kasugamycin. Biochem Biophys Res Commun 297, 1021‐1026. 

229.  Kozak, M.,  and  Nathans,  D.  (1972).  Differential  inhibition  of  coliphage MS2  protein synthesis by ribosome‐directed antibiotics. J Mol Biol 70, 41‐55. 

230.  Tanaka, N., Yamaguchi, H., and Umezawa, H. (1966). Mechanism of kasugamycin action on polypeptide synthesis. J Biochem 60, 429‐434. 

231.  Masukawa,  H.,  Tanaka,  N.,  and  Umezawa,  H.  (1968).  Inhibition  by  kasugamycin  of protein synthesis in Piricularia oryzae. J Antibiot (Tokyo) 21, 73‐74. 

232.  Cassan, M., Berteaux, V., Angrand, P.O., and Rousset, J.P. (1990). Expression vectors for quantitating in vivo translational ambiguity: their potential use to analyse frameshifting at the HIV gag‐pol junction. Res Virol 141, 597‐610. 

233.  van  Buul, C.P., Visser, W.,  and  van Knippenberg,  P.H.  (1984).  Increased  translational fidelity  caused  by  the  antibiotic  kasugamycin  and  ribosomal  ambiguity  in  mutants harbouring the ksgA gene. FEBS Lett 177, 119‐124. 

54

234.  Surkov S, N.H., Rasmussen LC, Sperling‐Petersen HU,  Isaksson LA  (2009).  translation initiation  region  dependency  of  translation  initiation  in  Escherichia  coli  by  IF1  and kasugamycin. FEBS J 277, 2428‐2439. 

235.  Capecchi, M.R. (1967). Polypeptide chain termination in vitro:Isolation of a release factor. Proc Natl Acad Sci. USA 58, 1144‐1151. 

236.  Caskey, C.T., Beaudet, A.L., Scolnick, E.M., and Rosman, M. (1971). Hydrolysis of fMet‐tRNA by peptidyl transferase. Proc Natl Acad Sci. USA 68, 3163‐3167. 

237.  Vogel,  Z.,  Zamir,  A.,  and  Elson,  D.  (1969).  The  possible  involvement  of  peptidyl transferase in the termination step of protein biosynthesis. Biochemistry 8, 5161‐5168. 

238.  Capecchi, M.R.,  and Klein, H.A.  (1969). Characterization  of  three proteins  involved  in polypeptide chain termination. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 34, 469‐477. 

239.  Scolnick, E., Tompkins, R., Caskey, T., and Nirenberg, M. (1968). Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc Natl Acad Sci. USA 61, 768‐774. 

240.  Scolnick, E.M., and Caskey, C.T. (1969). Peptide chain termination. V. The role of release factors in mRNA terminator codon recognition. Proc Natl Acad Sci U S A 64, 1235‐1241. 

241.  Caskey, C.T., Tompkins, R., Scolnick, E., Caryk, T., and Nirenberg, M. (1968). Sequential translation of trinucleotide codons for the initiation and termination of protein synthesis. Science 162, 135‐138. 

242.  Capecchi,  M.R.  (1967).  A  rapid  assay  for  polypeptide  chain  termination.  Biochem Biophys Res Comm 28, 773‐778. 

243.  Zavialov,  A.V.,  Buckingham,  R.H.,  and  Ehrenberg,  M.  (2001).  A  posttermination ribosomal complex  is  the guanine nucleotide exchange  factor  for peptide  release  factor RF3. Cell 107, 115‐124. 

244.  Janosi,  L., Hara, H.,  Zhang,  S.,  and  Kaji, A.  (1996).  Ribosome  recycling  by  ribosome recycling  factor  (RRF)‐‐an  important but overlooked  step of protein biosynthesis. Adv Biophys 32, 121‐201. 

245.  Janosi, L., Ricker, R., and Kaji, A. (1996). Dual functions of ribosome recycling factor  in protein  biosynthesis:  Disassembling  the  termination  complex  and  preventing translational errors. Biochimie 78, 959‐969. 

246.  Shin,  D.H.,  Brandsen,  J.,  Janacarik,  J.,  Yokota,  H.,  Kim,  R.,  and  Kim,  S.‐H.  (2004). Structural analyses of peptide  release  factor 1  from Thermotoga maritima  reveal domain flexibility required for its interaction with the ribosome. J Mol Biol 341, 227‐239. 

247.  Vestergaard,  B.,  Van,  L.B.,  Andersen,  G.R.,  Nyborg,  J.,  Buckingham,  R.H.,  and Kjeldgaard, M.  (2001).  Bacterial  polypeptide  release  factor  RF2  is  structurally  distinct from eukaryotic eRF1. Mol Cell 8, 1375‐1382. 

248.  Laurberg, M., Asahara, H., Korostelev, A., Zhu, J., Trakhanov, S., and Noller, H.F. (2008). Structural basis for translation termination on the 70S ribosome. Nature 454, 852‐857. 

249.  Korostelev, A., Asahara, H., Lancaster, L., Laurberg, M., Hirschi, A., Zhu, J., Trakhanov, S.,  Scott, W.G.,  and Noller, H.F.  (2008). Crystal  structure  of  a  translation  termination complex formed with release factor RF2. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 19684‐19689. 

250.  Ito, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (2000). A tripeptide ʹanticodonʹ deciphers stop codons in messenger RNA. Nature 403, 680‐684. 

251.  Nakamura, Y., and Ito, K. (2002). A tripeptide discriminator for stop codon recognition. Febs Lett 514, 30‐33. 

55

252.  Frolova, L.Y., Tsivkovskii, R.Y., Sivolobova, G.F., Oparina, N.Y., Serpinsky, O.I., Blinov, V.M.,  Tatkov,  S.I.,  and Kisselev,  L.L.  (1999). Mutations  in  the  highly  conserved GGQ motif  of  class  1  polypeptide  release  factors  abolish  ability  of  human  eRF1  to  trigger peptidyl‐tRNA hydrolysis. Rna 5, 1014‐1020. 

253.  Song, H., Mugnier, P., Das, A.K., Webb, H.M., Evans, D.R., Tuite, M.F., Hemmings, B.A., and Barford, D.  (2000). The crystal structure of human eukaryotic  release  factor eRF1‐‐mechanism of stop codon recognition and peptidyl‐tRNA hydrolysis. Cell 100, 311‐321. 

254.  Seit‐Nebi,  A.,  Frolova,  L.,  Justesen,  J.,  and  Kisselev,  L.  (2001).  Class‐1  translation termination  factors:  invariant  GGQ  minidomain  is  essential  for  release  activity  and ribosome binding but not for stop codon recognition. Nucleic Acids Res 29, 3982‐3987. 

255.  Zavialov,  A.V.,  Mora,  L.,  Buckingham,  R.H.,  and  Ehrenberg,  M.  (2002).  Release  of peptide  promoted  by  the  GGQ motif  of  class  1  release  factors  regulates  the  GTPase activity of RF3. Mol Cell 10, 789‐798. 

256.  Mora,  L.,  Heurgue‐Hamard,  V.,  Champ,  S.,  Ehrenberg,  M.,  Kisselev,  L.L.,  and Buckingham, R.H.  (2003). The essential role of  the  invariant GGQ motif  in  the  function and stability in vivo of bacterial release factors RF1 and RF2. Mol Microbiol 47, 267‐275. 

257.  Trobro,  S.,  and  Aqvist,  J.  (2007).  A model  for  how  ribosomal  release  factors  induce peptidyl‐tRNA cleavage in termination of protein synthesis. Mol Cell 27, 758‐766. 

258.  Klaholtz, B.P., Pape, T., Zavialov, A.V., Myasnikov, A.G., Orlova, E.V., Vestergaard, B., Ehrenberg,  M.,  and  van  Heel,  M.  (2003).  Structure  of  the  Escherichia  coli  ribosomal termination complex with release factor 2. Nature 421, 90‐94. 

259.  Petry,  S.,  Brodersen,  D.E., Murphy  IV,  F.V.,  Dunham,  C.M.,  Selmer, M.,  Tarry, M.J., Kelley, A.C., and Ramakrishnan, V. (2005). Crystal structures of the ribosome in complex with release factors RF1 and RF2 bound to a cognate stop codon. Cell 123, 1255‐1266. 

260.  Rawat, U.B.S., Gao, H., Zavialov, A.V., Gursky, R., Ehrenberg, M., and Frank,  J.  (2006). Interactions of  the release  factor RF1 with  the ribosome as revealed by cryo‐EM.  J Mol Biol. 

261.  Rawat,  U.B.S.,  Zavialov,  A.V.,  Sengupta,  J.,  Valle,  F.,  Grasucci,  R.A.,  Linde,  J., Vestergaard, B., Ehrenberg, M., and Frank, J. (2003). A cryo‐electron microscopic study of ribosome‐bound termination factor RF2. Nature 421, 87‐90. 

262.  Weixlbaumer,  A.,  Jin, H., Neubauer,  C.,  Voorhees,  R.M.,  Petry,  S.,  Kelley,  A.C.,  and Ramakrishnan, V. (2008). Insights into translational termination from the structure of RF2 bound to the ribosome. Science 322, 953‐956. 

263.  Schmeing,  T.M.,  Huang,  K.S.,  Kitchen,  D.E.,  Strobel,  S.A.,  and  Steitz,  T.A.  (2005). Structural  insights  into the roles of water and the 2ʹ hydroxyl of  the P site tRNA  in the peptidyl transferase reaction. Mol Cell 20, 437‐448. 

264.  Shaw,  J.J.,  and  Green,  R.  (2007).  Two  distinct  components  of  release  factor  function uncovered by nucleophile partitioning analysis. Mol Cell 28, 458‐467. 

265.  Rydén, M., Murphy,  J., Martin,  R.,  Isaksson,  L.,  and Gallant,  J.  (1986). Mapping  and Complementaion Studies of the Gene for Release Factor 1. J Bacteriol 168, 1066‐1069. 

266.  Rydén, S.M., and Isaksson, L.A. (1984). A temperature‐sensitive mutant of Escherichia coli that  shows  enhanced misreading  of UAG/A  and  increased  efficiency  for  some  tRNA nonsense suppressors. Mol Gen Genet 193, 38‐45. 

56

57

267.  Zhang,  S.,  Rydén‐Aulin,  M.,  Kirsebom,  L.A.,  and  Isaksson,  L.A.  (1994).  Genetic implication for an interaction between release factor one and ribosomal protein L7/L12 in vivo. J Mol Biol 242, 614‐618. 

268.  Roesser, J.R., and Yanofsky, C. (1988). Ribosome release modulates basal level expression of the trp operon of Escherichia coli. J Biol Chem 263, 14251‐14255. 

269.  Qin,  D.,  and  Fredrick,  K.  (2009).  Control  of  translation  initiation  involves  a  factor‐induced rearrangement of helix 44 of 16S ribosomal RNA. Mol Microbiol 71, 1239‐1249. 

270.  Grunberg‐Manago, M., Dessen, P., Pantaloni, D., Godefroy‐Colburn, T., Wolfe, A.D., and Dondon, J. (1975). Light‐scattering studies showing the effect of initiation factors on the reversible dissociation of Escherichia coli ribosomes. J Mol Biol 94, 461‐478. 

271.  Giangrossi, M., Brandi, A., Giuliodori, A.M., Gualerzi, C.O., and Pon, C.L. (2007). Cold‐shock‐induced de novo transcription and translation of infA and role of IF1 during cold adaptation. Mol Microbiol 64, 807‐821. 

272.  Giuliodori, A.M., Brandi, A., Gualerzi, C.O., and Pon, C.L. (2004). Preferential translation of cold‐shock mRNAs during cold adaptation. RNA 10, 265‐276. 

273.  Gualerzi,  C.O.,  Giuliodori,  A.M.,  and  Pon,  C.L.  (2003).  Transcriptional  and  post‐transcriptional control of cold‐shock genes. J Mol Biol 331, 527‐539. 

274.  Ko,  J.H.,  Lee,  S.J., Cho,  B.,  and  Lee, Y.  (2006). Differential  promoter  usage  of  infA  in response to cold shock in Escherichia coli. FEBS Lett 580, 539‐544. 

275.  Lazzaroni,  J.C.,  Germon,  P.,  Ray, M.C.,  and  Vianney,  A.  (1999).  The  Tol  proteins  of Escherichia  coli  and  their  involvement  in  the  uptake  of  biomolecules  and  outer membrane stability. FEMS Microbiol Lett 177, 191‐197. 

276.  Walburger, A., Lazdunski, C., and Corda, Y. (2002). The Tol/Pal system function requires an  interaction between  the C‐terminal domain  of TolA  and  the N‐terminal domain  of TolB. Mol Microbiol 44, 695‐708. 

277.  Evers, S., Di Padova, K., Meyer, M., Langen, H., Fountoulakis, M., Keck, W., and Gray, C.P.  (2001). Mechanism‐related changes  in  the gene  transcription and protein synthesis patterns  of  Haemophilus  influenzae  after  treatment  with  transcriptional  and translational inhibitors. Proteomics 1, 522‐544. 

278.  Lorimer, G.H. (1996). A quantitative assessment of the role of the chaperonin proteins in protein folding in vivo. FASEB J 10, 5‐9. 

279.  Bjornsson, A., Mottagui‐Tabar, S., and Isaksson, L.A. (1998). The analysis of translational activity using a reporter gene constructed  from repeats of an antibody‐binding domain from protein A. Methods Mol Biol 77, 75‐91. 

280.  Agris, P.F. (2004). Decoding the genome: a modified view. Nucleic Acids Res 32, 223‐238. 281.  Miller,  J.H.  (1972). Experiments  in molecular genetics,  (New York: Cold Spring Harbor 

Laboratory Press).    

 

58