STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR- …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29325/1/WAHIDIN... · Inh A enzyme. The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR-

AKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA

AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN

PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN

MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI

WAHIDIN SALEH

NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR-

AKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA

AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN

PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN

MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI

Diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far)

WAHIDIN SALEH

NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

iii

iv

v

vi UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Wahidin Saleh

Program Studi: Farmasi

Judul : Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis

Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan

Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A

Telah dilakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil p-

metoksisinamat dengan Metode Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA)

Hansch dan penambatan molekuler pada Enzim Inh A. HKSA di analisa dengan

regresi multilinier menggunakan program SPSS. Penambatan molekuler di analisa

dengan program autodockvina dan divisualisasi dengan program Pymol dan

Ligplot. Hasil persamaan HKSA terbaik adalah Log(1/MIC) = -18.7 +

0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index)

- 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Hasil penambatan molekuler,

menunjukkan senyawa ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide)

memiliki nilai ΔGbind terendah (-9,4 kcal/mol) dan hasil dari HKSA memiliki nilai

MIC prediksi terkecil (0,008 μM). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut

diprediksikan memiliki aktivitas anti-tuberkulosis yang potensial dibandingkan

oleh EPMS.

Kata kunci: Anti-tuberkulosis, Hansch, penambatan molekul

vii UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Wahidin Saleh

Program Study : Pharmacy

Title : Quantitative Structure-Activity Relationship study of

amidation derivate of Ethyl p-methoxycinnamate on its Anti-

tuberculosis using Hansch analysis and molecular docking at

Inh A enzyme.

The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives ethyl p-methoxycinnamate

has been determined by using Quantitative Structure-Activity Relationship

(QSAR) Hansch’s method and molecular docking at Inh A enzyme. QSAR was

analyzed by multilinier regression using SPSS. Molecular docking was analyzed

by autodockvina program and visualized by Pymol dan Ligplot program. The best

QSAR equation is Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energy HOMO) -

2.812(Energy LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) +

0.243(MolarRefractivity). Results of molecular docking, indicated that ((2E)-N,N-

dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide) compound has the lowest ΔGbind

value (-9.4 kcal / mol) and the result of QSAR has the smallest MIC predictive

value (0,008 μM). It’s suggested that this compound have potential anti-

tuberculosis activity compared by EPMC.

Key Word: Anti-tuberculosis, Hansch, Molecular docking

viii UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah

kepada junjungan kita, Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan

karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan

judul “Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa

Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan

Molekuler pada Enzim Inh A”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah,

Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Kedua orang tua bapak dan ibu tercinta, Bapak Mamat dan Ibu Tri Larasati

yang telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril

maupun materi, tiada yang bisa penulis balas atas semua pemberiannya,

hanya ucapan terimakasih ini yang bisa penulis sampaikan.

2. Bapak Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing I dan Ibu Ismiarni

Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan

ilmu, nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan

penulisan skripsi ini.

3. Bapak Professor Dr. Dede Rosyada, MA selaku rektor UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif


5. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu

Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif


ix UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

6. Ibu Dr. Hj. Delina Hasan, M. Kes., Apt selaku pembimbing akademik

yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan

7. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu

pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

8. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra M.Sc dan Kak Fikri yang turut

membantu dan menambahkan ilmu tentang penelitian ini.

9. Teman-teman seperjuangan “Docking Team”: Eko, Cacad, Haidar,

Mazaya, dan Wahyu yang telah memberikan waktu dan pikiran untuk

saling sharing permasalahan dan ilmu tentang penelitian ini.

10. Teman satu kontrakan dan bermain: Ali, Rijal, Mozer, Andis, Rais, Galih,

Ari, Akas, dll.

11. Teman belajar selama kuliah: Reza, Echa, Aziz, Fio, Achi, Nicky, Ayu,

Henny, Ichob, Wina, Gina, Merri, dll.

12. Teman-teman Farmasi 2011, khususnya untuk kelas C atas kebersamaan

dan memori selama menempuh ilmu dikampus ini.

13. Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka

Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mba Rani, dan Ka Rahmadi yang banyak

membantu selama penelitian dan praktikum semester sebelumnya.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.

Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis

harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil

penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi

mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu

pengetahuan.

Ciputat, Juni 2015

Penulis

x UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

xi UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISIONALITAS ............................................ iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEBIMBING .................................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah................................................................................ 4

1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 4

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5

2.1 Etil p-Metoksisinamat ........................................................................ 5

2.2 Reaksi Amidasi .................................................................................. 6

2.3 Tuberkulosis ....................................................................................... 8

2.4 Pengobatan Tuberkulosis ................................................................... 9

2.5 Isoniazid ........................................................................................... 10

2.6 Asam Amino, Protein, dan Enzim.................................................... 12

2.7 Enzim Inh A .................................................................................... 17

2.8 Jenis Ikatan ....................................................................................... 18

2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Biologis (HKSA)

pendekatan Hansch ............................................................................ 18

2.9.1 Parameter hidrofobik ...................................................... 20

2.9.2 Parameter elektronik ...................................................... 21

2.9.3 Parameter sterik .............................................................. 22

2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch .................................... 23

2.9.5 Kriteria Statistik ............................................................. 24

2.10 Penambatan molekuler (Molecular Docking) .................................. 25

2.11 Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler ............................ 27

2.11.1 Hyperchem ..................................................................... 27

2.11.2 Protein Data Bank .......................................................... 27

2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer .................................... 28

2.11.4 Marvin Sketch ................................................................ 28

2.11.5 Autodock ........................................................................ 28

2.11.6 Autodock Vina ............................................................... 29

2.11.7 Pymol ............................................................................. 30

2.11.8 Ligplot ............................................................................ 30

xii UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 31

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian............................................................ 31

3.2 Alat .................................................................................................... 31

3.2.1 Perangkat Keras ............................................................. 31

3.2.2 Perangkat Lunak............................................................. 31

3.3 Bahan ................................................................................................. 32

3.3.1 Struktur molekul tiga dimensi Enzim Inh A

Mycobacterium tuberculosis .......................................... 32

3.3.2 Struktur tiga dimensi Ligan senyawa Amidasi Etil p-

metoksisinamat ............................................................... 32

3.3.3 Data Anti-tuberculosis beberapa Senyawa beserta

strukturnya ..................................................................... 32

3.4 Cara Kerja .......................................................................................... 32

3.4.1 HKSA pendekatan Hansch ............................................. 32

3.4.1.1 Pemilihan data sets ........................................... 32

3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets .................... 33

3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA ........................ 33

3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets ........................ 33

3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA ............................... 34

3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets ........................... 34

3.4.2 Penambatan Molekul ...................................................... 34

3.4.2.1 Penyiapan dan optimasi enzim Inh A ............... 34

3.4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (Senyawa uji) .... 35

3.4.2.3 Penambatan molekul dengan autodock vina .... 35

3.4.2.4 Analisa dan visualisasi hasil penambatan

molekul ............................................................. 36

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 37

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch .......... 37

4.1.1 Pemilihan data sets ........................................................ 37

4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets ................................. 40

4.1.3 Membangun dan Validasi persamaan HKSA ................ 42

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets ......................................... 46

4.2 Penambatan molekul.......................................................................... 51

4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A .... 51

4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji) .................. 52

4.2.3 Penambatan molekul dengan Autodock vina ................. 56

4.2.4 Analisa dan Visualisasi penambatan molekul ................ 57

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 63

5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 63

5.2 Saran .................................................................................................. 63

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 64

LAMPIRAN ................................................................................................... 68

xiii UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat............................................................ 5

Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida ..................................................................... 7

Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting .................................................. 7

Gambar 2.4 Reaksi Sintesis Amida ......................................................................... 7

Gambar 2.5 Struktur Isoniazid .............................................................................. 11

Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid................................................................ 12

Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino ............................................................ 13

Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion ........ 21

Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log

(1/MIC) prediksi .............................................................................. 46

Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11 ..... 50

Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3

senyawa uji dengan ∆Gbind terendah ................................................ 60

xiv UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Asam Amino ......................................................................................... 13

Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino .............................................................. 15

Tabel 2.3 Penggolongan Enzim ............................................................................ 16

Tabel 4.1 Data sets yang digunakan ..................................................................... 37

Tabel 4.2 Data Training sets ................................................................................. 39

Tabel 4.3 Data test sets.......................................................................................... 39

Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training sets............................................... 41

Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA ............................................................ 42

Tabel 4.6 Model Persamaan .................................................................................. 43

Tabel 4.7 Data Nilai PRESS ................................................................................. 44

Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set ..................................................... 45

Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set ........................... 45

Tabel 4.10 Data sample sets .................................................................................. 47

Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets ................................................................ 48

Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA

2 ........................................................................................................... 49

Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking .................................................. 53

Tabel 4.14 Hasil penambatan molekuler ............................................................... 58

Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi .................................................. 61

xv UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian .................................................................................. 68

Lampiran 2. Prosedur Kerja HKSA ...................................................................... 70

Lampiran 3. Prosedur Kerja Penambatan Molekuler ............................................ 77

Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya ................................. 81

xvi UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

Enzim Inh A Enoyl acyl carrier protein reductase

EPHS Etil p-hidroksisinamat

EPMS Etil p-metoksisinamat

HKSA Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktifitas

HOMO Highest Occupied Moleculer Orbital

INH Isoniazid

LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital

MIC Minimum Inhibitor Concentration

NADH Nicotinamide Adenin Dinucleotide

PDB Protein Data Bank

PRESS Predicted Residual Sums of Squares

RMSD Root Mean Square Deviation

SE Standard Error

ΔGbind Energi bebas Gibss

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tuberkulosis adalah suatu penyakit infeksi yang disebabkan oleh

bakteri basil tahan asam Mycobacterium tuberculosis serta bertahan dalam

tubuh manusia selama bertahun-tahun, ditularkan melalui droplet yang

mengandung basil tersebut (airborne disease). Sebagian besar kuman TB

menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Depkes

RI, 2011). Genus Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena

dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang

mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam

mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada

dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Dalam jaringan tubuh

kuman Mycobacterium tuberculosis dapat mengalami fase dorman

(tertidur lama) selama beberapa tahun (Poeloengan et al., 2007; Depkes

RI, 2002).

Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh

Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah

dilaporkan pada WHO. Dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien

dengan diagnosa baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan.

Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB

terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria.

Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah

pasien TB didunia. (Depkes RI, 2011; WHO, 2014).

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Obat yang umum dipakai pada pengobatan tuberkulosis adalah

Isoniazid, Etambutol, Rifampisin, Pirazinamid, dan Streptomisin.

Kelompok obat ini disebut sebagai obat primer. Isoniazid adalah obat TB

yang paling poten dalam hal membunuh bakteri dibandingkan dengan

rifampisin dan streptomisin (Depkes RI, 2005).

Isoniazid bekerja dengan menghambat biosintesis asam mikolat

yang merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium. Beberapa

hipotesis diajukan berkaitan dengan mekanisme kerja isoniazid,

diantaranya adalah efek pada lemak, biosintesis asam nukleat dan

glikolisis. (Goodman and Gilman, 2005; Katzung, B., 2004).

Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari

Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting yang

terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis.

Adanya isoniazid yang berikatan dengan kofaktor Nicotinamide Adenine

Dinucleotide (NADH) membentuk INH-NAD akan menghambat aktivitas

enzimatik Inh A, sehingga akan mengganggu biosintesis asam mikolat

yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakterium (He et al,

2007).

Etil p-metoksisinamat (EPMS) yang merupakan salah satu zat

kimia dari rimpang kencur (Kaempferia galanga), telah dilaporkan tidak

hanya memiliki aktivitas analgesik-anti inflamasi seperti NSAID yang

menghambat siklooksigenase, tetapi juga menghambat proliferasi sel

tumor dalam spesimen epidermis tikus, selain itu juga memiliki aktivitas

biologis terhadap penghambatan pertumbuhan Mycobacterium

tuberculosis dan Candida albicans (Dash et al., 2014). Hasil dari

penelitian Lakhsmanan et al., (2011), Etil p-metoksisinamat diprediksikan

memiliki sifat anti-tuberkulosis dengan mekanisme yang mirip dengan

isoniazid, yaitu berpengaruh terhadap proses biosintesis asam mikolat.

3


Berdasarkan penelitian tersebut, peneliti tertarik untuk melakukan

uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa hasil modifikasi struktur dari reaksi

amidasi senyawa EPMS sebagai senyawa penuntunnya (lead compound),

yang telah diketahui memilki aktivitas anti-tuberkulosis. Salah satu cara

untuk memberikan informasi aktivitas biologis suatu senyawa adalah

dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas

(HKSA).

HKSA merupakan bagian penting rancangan obat dalam usaha

mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang lebih besar, keselektifan

yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan

kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model

HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena

untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, faktor

coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih

pendek (Siswandono, 2008).

Selain dengan pendekatan HKSA antara senyawa turunan amidasi

EPMS dengan senyawa turunan asam sinamat yang memiliki aktivitas

anti-tuberkulosis, diketahui juga penentuan aktivitas bisa menggunakan

metode penambatan molekuler (molecular docking). Senyawa amidasi

EPMS akan digunakan sebagai ligan yang akan diprediksi hasil

penambatannya dengan suatu makromolekul, yaitu enzim Inh A yang

terdapat di M. tuberculosis, kemudian divisualisasi interaksi ligan-

makromolekul dengan menggunakan program Pymol dan LigPlot. Hasil

dari penelitian ini, diharapkan akan mendapatkan senyawa amidasi EPMS

yang memiliki prediksi aktivitas yang baik untuk pengobatan anti-

tuberkulosis dengan metode HKSA Hansch dan penambatan molekul pada

enzim Inh A. Sehingga, senyawa tersebut pada penelitian selanjutnya

dapat disintesis dan diuji secara in-vitro dan in-vivo terhadap aktivitas anti-

tuberkulosisnya.

4


1.2 Rumusan Masalah

Apakah senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas

anti-tuberkulosis dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif

struktur-aktivitas pendekatan Hansch dan melalui penambatan molekuler

pada enzim Inh A?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Memperoleh hubungan kuantitatif struktur-aktivitas anti-tuberkulosis

senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan pendekatan Hansch.

b. Melihat interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan

enzim Inh A dalam penghambatan pembentukan asam mikolat

Mycobacetrium tuberculosis.

1.4 Manfaat Penelitian

a. Memberikan informasi acuan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat

yang akan disintesis dan diujikan secara in-vitro untuk aktivitas anti-

tuberkulosis.

b. Membantu dalam memberi informasi pada pembuatan obat anti-

tuberkulosis baru.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil p-metoksisinamat

Senyawa etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan

senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi

yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil

yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat

menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran

yaitu etanol, etil asetat, metanol, air dan heksana, termasuk turunan

asam sinamat, dimana asam sinamat adalah turunan senyawa phenil

propanoad. Senyawa-senyawa yang termasuk turunan sinamat

adalah para hidroksi sinamat, 3,4-dihidroksisinamat, dan 3,4,5

trimetoksisinamat (Barus, 2009).

Tanaman kencur memang mengandung senyawa tabir surya

yaitu etil p-metoksisinamat, yang telah dibuktikan kebenarannya

oleh pengalaman nenek moyang kita. Etil p-metoksisinamat (EPMS)

adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur yang

merupakan bahan dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit

dari sengatan sinar matahari. (Barus, 2009). Umar et al, (2014)

menyatakan bahwa Etil p-metoksisinamat memilki potensi anti-

inflamasi dengan menghambat sitokin proinflamasi dan

angiogenesis, sehingga menghambat fungsi utama dari sel endotel.

Dengan demikian, etil p-metoksisinamat bisa menjadi agen terapi

yang menjanjikan untuk pengobatan penyakit inflamasi dan

gangguan yang berkaitan dengan angiogenesis.

Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat (Barus, 2009)

6


Sebagai antimikroba, Etil p-metoksisinamat diisolasi dari

ekstrak Kampheria galanga memiliki aktivitas yang cukup terhadap

Mycobacterium tuberculosis dan Candida albicans. (Kanjanapothi et

al., 2004; Techaprasan et al., 2010). Baru-baru ini, Etil p-

metoksisinamat dengan uji microtiter resazurin telah terbukti

menghambat isolat klinis pasien multidrug resistant (MDR) dari

Mycobacterium tuberculosis dengan konsentrasi hambat minimum

(MIC) dari 0,242-0,485 mM. (Lakshmanan et al., 2011). Aktivitas

larvasida Etil p-metoksisinamat telah ditunjukkan oleh Kim et al.,

(2008), sekitar (LC50 = 12,3-20,7 mg/L) terhadap A. aegypti, O.

togoi dan C. pipens pallens. Namun, etil-sinamat dan 3-Carene

memiliki aktivitas larvasida yang lebih (LC50 = 24,1 dan 21,6 mg/L

masing-masing) terhadap C. pipens pallens tapi kurang aktivitas

(LC50=40-60 mg/L) terhadap A. aegypti dan O. togio.

2.2 Reaksi Amidasi

Proses amidasi adalah suatu reaksi penambahan gugus aktif

amin dengan pengantian atom nitrogen pada gugus karbonil dengan

struktur R–CO–NR′R″. Amin merupakan senyawa organik dan

memiliki gugus fungsional yang mengandung atom Nitrogen. Amin

adalah turunan ammonia dengan salah satu atom hidrogen diganti

dengan alkil atau aril (David, 2007). Amida adalah suatu senyawa

yang mempunyai suatu nitrogen trivalent yang terikat pada gugus

karbonil.

Suatu amida diberi nama dari nama asam kaboksilat

induknya, dengan mengubah imbuhan asam …-oat (atau -at)

menjadi –amida. Amida di sintesa dari derivat asam karboksilat dan

ammonia atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999).

7


Berikut ini beberapa amida yang penting, gugus amidanya

dilingkari:

Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia

atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999). Contoh reaksi pembuatan

amida adalah seperti di bawah ini:

Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida (Fessenden, 1999)

a. IUPAC: etanamida b. IUPAC: butanamida

Trivial: asetamida Trivial: butiramida

a. b.

a. b.

c.

Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting (Fessenden, 1999):

a. nikotinimida b. kafeina c. LSD

Gambar 2.4

Reaksi Sintesis Amida (Fessenden, 1999)

8


2.3 Tuberkulosis

Tuberkulosis atau TB adalah penyakit bakteri menular yang

disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yang paling sering

menyerang paru-paru. Hal ini ditularkan dari orang ke orang melalui

droplet dari tenggorokan dan paru-paru orang dengan penyakit

pernapasan aktif. Pada orang yang sehat, infeksi Mycobacterium

tuberculosis sering tidak menimbulkan gejala, karena sistem

kekebalan tubuh seseorang bertindak sebagai "wall off" bakteri.

Gejala TB aktif paru seperti batuk, kadang-kadang dengan sputum

atau darah, nyeri dada, kelemahan, penurunan berat badan, demam

dan berkeringat di malam hari. Tuberkulosis bisa diobati dengan

program antibiotik enam bulan (WHO, 2015).

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit infeksius, yang terutama

menyerang penyakit parenkim paru (Brunner et al., 2002).

Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh

Mycobacterium tuberkulosis. Pada tahun 1995, diperkirakan ada 9

juta pasien TB baru dan 3 juta kematian akibat TB diseluruh dunia.

Diperkirakan 95% kasus TB dan 98% kematian akibat TB

didunia, terjadi pada negara-negara berkembang. Demikian juga,

kematian wanita akibat TB lebih banyak dari pada kematian karena

kehamilan, persalinan dan nifas. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB

telah dilaporkan pada WHO, dari jumlah tersebut, 5,7 juta

merupakan pasien dengan diagnosis baru dan 0,4 juta lainnya telah

menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan

negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India,

Cina, Afrika Selatan dan.Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di

Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia.

Diperkirakan, setiap tahun ada 429.730 kasus baru dan kematian

62.246 orang. Insidensi kasus TB BTA positif sekitar 102 per

100.000 penduduk. (Depkes RI 2011; WHO 2014).

9


Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri aerob obligat

yang pertumbuhannya di bantu oleh tekanan CO2 5-10 %, tetapi di

hambat oleh pH di bawah 6,5 dan asam lemak rantai panjang. Basil

tuberkel tumbuh hanya pada suhu 35-37ºC, yang sesuai dengan

kemampuannya menginfeksi organ dalam terutama paru. Genus

Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya

kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung

arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat.

Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya

dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium.

Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan

Asam (BTA). Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Robert Koch

pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya

bakteri tersebut diberi nama basil Koch (Poeloengan et al., 2007).

Mycobacterium tuberculosis ini berbentuk batang, berukuran

panjang 1-4 mikron dan tebal 0,3-0,6 mikron, mempunyai sifat

khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan. Oleh karena itu

disebut pula sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Secara khas kuman

membentuk granula dalam paru menimbulkan nekrosis atau

kerusakan jaringan. Kuman TB cepat mati dengan sinar matahari

langsung, tetapi dapat bertahan hidup beberapa jam di tempat gelap

dan lembab. Dalam jaringan tubuh dapat mengalami fase dorman

selama bertahun-tahun (Suarni, 2009; Depkes RI, 2002).

2.4 Pengobatan Tuberkulosis

Pengobatan TB bertujuan untuk menyembuhkan pasien,

mencegah kematian, mencegah kekambuhan, memutuskan rantai

penularan dan mencegah terjadinya resistensi kuman terhadap Obat

Anti Tuberkulosis (OAT) (Depkes RI, 2011). Pengobatan terhadap

TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti

tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu

lini pertama dan lini kedua.

10


Kelompok lini pertama, yaitu isoniazid, rifampisin,

etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok

lini pertama ini efektifitasnya tinggi, toksisitas dapat ditolerir.

Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon,

sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin, kapreomisin, dan para

aminosalisilat (Niemann, S. dan Gerdes, S.R., 2003).

Pengobatan tuberkulosis dilakukan dengan prinsip-prinsip

sebagai berikut:

a. Obat anti TB (OAT) harus diberikan dalam bentuk

kombinasi beberapa jenis obat, dalam jumlah cukup dan

dosis tepat sesuai dengan kategori pengobatan. Jangan

gunakan OAT tunggal (monoterapi). Pemakaian OAT-

Kombinasi Dosis Tetap (OAT-KDT) lebih

menguntungkan dan sangat dianjurkan.

b. Untuk menjamin kepatuhan pasien menelan obat,

dilakukan pengawasan langsung (DOT = Directly

Observed Treatment) oleh seorang Pengawas Menelan

Obat (PMO).

c. Pengobatan TB diberikan dalam 2 tahap, yaitu tahap

intensif dan lanjutan.

2.5 Isoniazid

Isoniazid (Hydrazide Penisilamin, INH) telah digunakan

sebagai anti-tuberkulosis yang paling umum sejak pengakuan

tentang aktivitas klinisnya pada tahun 1952 (Robitzek et al., 1952).

Terdiri dari cincin piridin dan gugus hydrazide, INH adalah analog

nikotinamid, secara struktural terkait dengan obat anti-TB Etionamid

dan pirazinamid (Kolyva et al., 2012).

11


Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat

utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis. Sering digunakan

dalam bentuk kombinasi. Penggunaan pada pasien dewasa secara

umumnya adalah 300 mg per hari melalui oral pada keadaan

lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi,

yakni: 5 mg/kg per hari (WHO), 10 mg/kg per hari di Inggris dan 10

mg/kg hingga 15 mg/kg per hari di Amerika Serikat (USA), dengan

semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari

(Sweetman, 1999).

INH merupakan obat anti tuberkulosis yang bersifat pro-drug

dimana obat ini akan dirubah menjadi metabolit aktifnya didalam sel

supaya menjadi substansi yang toksik untuk sel mikobakterial. INH

yang telah aktif ini nantinya akan mempengaruhi sintesis asam

mikolat. Asam mikolat ini merupakan salah satu komponen penting

untuk pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010).

Setelah masuk ke dalam sel mikobakterium, INH dirubah

menjadi bentuk aktifnya oleh enzim katalase–peroksidase (Kat G)

dimana enzim ini dikode oleh gen katG. INH yang telah aktif ini

akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide ( NADH )

yang merupakan suatu kofaktor yang terikat pada enzim Inh A. INH

aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH–

NAD. Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase

merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap

awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen InhA.

Gambar 2.5 Struktur Isoniazid (Kolyva et al., 2012)

12


Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena

penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik

InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan

salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel (Nofriyanda,

2010).

2.6 Asam amino, protein, dan enzim

Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih

gugus karboksil (−COOH) dan satu atau lebih gugus amino (−NH2)

yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus

karboksil (atom C alfa). Asam-asam amino bergabung melalui ikatan

peptida yaitu ikatan antara gugus karboksil dari asam amino dengan

gugus amino dari asam amino yang disampingnya (Sudarmadji,

1989). Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut

dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform.

Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun

dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang

terdiri atas beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air

tetapi larut dalam pelarut organik. Demikian amina pula umumnya

tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik (Poejiadi,

1994).

Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid

13


Ada dua struktur kimia asam amino, yaitu struktur yang tidak

bermuatan dan struktur ion pada pH fisiologis. Gugus karboksil

bersifat sebagai sebagai donor proton; gugus amino bersifat sebagai

akseptor proton; dan gugus R yang dikenal sebagai rantai samping

atau rantai cabang mempunyai sifat yang khas (Sumardjo, 2008).

Di alam, terdapat sekitar 300 jenis asam amino. Namun

ternyata hanya 20 asam amino yang secara alami merupakan bahan

pembangun protein. Asam amino pembangun atu penyusun protein

adalah alfa asam amino, yaitu asam amino yang gugus anionnya

terikat pada atom karbon alfa (Sumardjo, 2008).

Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino (Sumardjo, 2008)

Tabel 2.1 Asam Amino (Sumardjo, 2008)

14


15


Rantai samping atau rantai cabang asam-asam amino

mempunyai sifat yang khas. Berdasarkan sifat yang khas tersebut,

asam-asam amino diklasifikasikan menjadi tiga kelompok: asam

amino yang bersifat basa yaitu asam amino dengan rantai samping

mengandung gugus anion atau lingkar heterosiklik berupa hetero

atom nitrogen; asam amino yang bersifat asam, yaitu asam amino

dengan rantai samping mengandung gugus karboksil; dan asam

amino netral, yaitu asam amino dengan rantai samping selain yang

telah disebutkan (Sumardjo, 2008).

Protein merupakan makrobiomolekul asam-asam alfa amino

dengan susunan yang kompleks dan berat molekulnya sekitar 5000

sampai beberapa juta. Struktur tiga dimensi protein tersebut dapat

dijelaskan dengan mempelajari tingkat organisasinya, yaitu

menyangkut struktur primer, sekunder, tersier, dan quartener.

Struktur primer protein adalah jumlah, jenis, serta urutan asam

amino yang membentuk rantai polipeptida. struktur primer

menentukan sifat dasar berbagai macam protein. Struktur sekunder

adalah struktur yang berikatan kovalen dan berikatan hydrogen dari

polipeptida dalam molekul protein dan dapat berbentuk spiral (α-

heliks) atau lembaran (zig-zag).

Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino (Sumardjo, 2008)

16


Struktur tersier terbentuk karena terjadi pelipatan rantai

polipetida sehingga membentuk protein globular. Struktur kuartener

protein dibentuk oleh dua atau lebih rantai polipeptida saling

dihubungkan oleh ikatan elektrostatik dan ikatan hidrogren. Dalam

struktur kuartener protein yang kompleks, gaya van der walls di

antara atom-atom yang berdekatan kemungkinan ikut berperan

(Sumardjo, 2008).

Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis

seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni

yang telah diamati sampai saat ini adalah protein. Aktivitas

katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai

protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang

sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja

dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang

bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi

terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan

sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat

molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat

sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya

(Lehninger, 1995).

Penggolongan enzim secara internasional telah dilakukan

secara sistematis. Sistem ini menempatkan semua enzim ke dalam

enam kelas utama, masing-masing dengan sub kelas, berdasarkan

atas jenis reaksi yang dikatalisa.

Tabel 2.3 Penggolongan Enzim

17


2.7 Enzim Inh A

Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari

Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting

yang terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M.

tuberculosis. Dependent-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan

oleh gen Inha Mycobacterium yang telah diketahui sebagai target

molekul utama dari frontline obat anti tuberkulosis isoniazid (INH).

Penelitian terbaru menunjukkan bahwa Inh A juga sebagai

secondline target untuk obat antitubercular etionamid (ETA). Inh A

mengkatalisis pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di jalur

biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Penghambatan

Inh A mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur

utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai pro-drug, INH pertama-

tama harus diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase katG ke

dalam bentuk aktif radikal asilnya. Produk adisi yang dihasilkan dari

ikatan kovalen INH diaktifkan dengan Inh A kosubstrat NADH, atau

produk oksidasi NAD+, berfungsi sebagai Inh A inhibitor yang

ampuh. (He et al., 2007).

Gen katG berfungsi dalam mengkode enzim catalase-

peroxidase (Kat G). Enzim ini berperan dalam merubah INH

menjadi metabolit aktifnya supaya INH bisa berikatan dengan

NADH membentuk ikatan INH-NAD. Terjadinya mutasi pada gen

katG akan menyebabkan hilangnya aktivitas enzim catalase-

peroxidase sehingga INH yang masuk ke dalam sel tidak dapat

dirubah menjadi bentuk aktifnya. INH yang tidak dalam bentuk

aktifnya tidak dapat mengganggu aktivitas enzim enoyl acyl carrier

protein (ACP) reductase.

INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide

Adenine Dinucleotide (NADH) yang merupakan suatu kofaktor yang

terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan

membentuk suatu ikatan kovalen INH–NAD.

18


Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase

merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap

awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen inhA.

Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena penggabungan

INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan

menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan

utama sebagai pembentuk dinding sel.

Setelah terjadi perubahan INH menjadi bentuk aktifnya, maka

INH ini akan bekerja pada target utamanya yaitu mengganggu Inh A

atau enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase melalui

adanya ikatan kovalen INH-NAD. Dengan adanya ikatan ini maka

terjadi hambatan aktivitas enzimatik Inh A sehingga mengganggu

sintesis asam mikolat. (Nofriyanda, 2010).

2.8 Jenis Ikatan

Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan dalam interaksi

ligan-makromolekul. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan

intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der

waals, dan ikatan dipol–dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan

kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001). Selain ikatan tersebut,

terdapat ikatan hidrofob yang merupakan salah satu kekuatan

penting pada proses penggabungan daerah non polar molekul obat

dengan daerah non polar reseptor biologis (Siswandono, 2008)

2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) pendekatan

Hansch

Pendekatan hubungan struktur dan aktivitas biologis mulai

berkembang pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh

Corwin Hansch dan kawan-kawan, yang menghubungkan struktur

kimia dan aktivitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika

umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat ionisasi, atau ukuran

molekul (Siswandono, 2008).

19


Analisis Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA)

merupakan salah satu aplikasi dari kimia komputasi dan juga bagian

yang dipelajari dalam bidang kimia medisinal. Dengan metoda

analisis HKSA, senyawa yang akan disintesis dapat didesain terlebih

dahulu berdasarkan hubungan antara sifat-sifat kimia serta fisik

molekul dengan aktivitas biologisnya, dengan menggunakan

hubungan tersebut, aktivitas teoritik suatu senyawa baru dapat

diprediksi, dan dengan demikian fokus riset dapat dipersempit, biaya

dan waktu pun dapat dihemat. Saat ini telah dikenal tiga metoda

analisis HKSA yakni metoda HKSA Free-Wilson, metoda Hansch

dan metoda HKSA tiga dimensi (Kubinyi, 1993).

Hansch (1963), mengemukakan suatu konsep bahwa

hubungan struktur kimia dengan aktivitas biologis (log 1/C) suatu

turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui

parameter-parameter sifat kimia-fisika dari substituent yaitu

parameter hidrofobik (π), elektronik (σ) dan sterik (Es).

Model pendekatan ini disebut juga dengan model hubungan

energi bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau

pendeakatan ekstra termodinamika. Pendekatan ini menggunakan

dasar persamaan Hammet yang didapat dari kecepatan hidrolisis

turunan asam benzoat (Siswandono, 2008).

Proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan

kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia.

Dalam hubungan struktur dan aktivitas, ketiga parameter tersebut

dilibatkan, terutama parameter eketronik dan sterik.

Pendekatan hubungan struktur aktivitas melalui parameter

sifat kimia fisika oleh Hansch dinyatakan melalui persamaan regresi

linier dibawah ini:

= + d

20


C : Kadar untuk respons biologis baku

: Sumbangan sifat-sifat lipofilk, elektronik,

dan sterik dari gugus-gugus terhadap sifat-sifat senyawa

induk yang berhubungan dengan aktivitas biologis

a, b, c, dan d : Bilangan yang didapat dari perhitungan analisis

regresi linier (Siswandono, 2008).

2.9.1 Parameter hidrofobik

Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan

dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi

(log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f Rekker-

Mannhold dan tetapan kromatografi Rm (Siswandono, 2008).

Koefisien partisi oktanol/air yang dinyatakan dalam log P

merupakan standar kuantitas untuk menentukan sifat

hidrofobik/hidrofilik suatu molekul. Parameter

hidrofobik/hidrofilik adalah sifat yang sangat penting dalam

aplikasi biomedis (Katritzky et al., 1996).

Koefisien partisi atau log P dapat diartikan sebagai

perbandingan konsetrasi suatu senyawa dalam oktanol dan air.

Selain log P terdapat juga parameter hidrofobik yang sering

digunakan, yaitu koefisien distribusi atau Log D. Koefisien

distribusi adalah perbandingan konsentrasi dari seluruh jenis

senyawa dalam oktanol dan air. Berdasarkan reaksi disosiasi

asam-basa, konsep koefisien partisi digunakan untuk senyawa

bersifat kationik, anionic, dan netral (ChemAxon, 2014)

21


2.9.2 Parameter Elektronik

Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam

HKSA model LFER Hansch, yaitu:

a. Pengaruh berbagai substituent terhadap reaktivitas

bagian molekul yang tidak mengalami perubahan.

Penetapannya menggunakan perhitungan orbital

molekul, contoh : tetapan σ Hammet

b. Sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan

ionisasi (pKa) dan berhubungan bentuk terionkan dan

tak terionkan dari suatu senyawa pada pH tertentu.

Penetapannya menggunakan persamaan Handerson-

Hasselbach.

c. Sifat oksidasi-reduksi atau reaktivitas senyawa.

Penetapannya menggunakan perhitungan mekanika

kuantum dari energi orbital (Siswandono, 2008).

Energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital)

dan energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)

merupakan deskriptor yang sangat populer dalam kimia

kuantum. Orbital-orbital ini memainkan peran yang sangat

penting dalam menentukan berbagai reaksi kimia dan dalam

penentuan celah pita elektronik.

Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion

(ChemAxon, 2014)

22


Energi HOMO berhubungan langsung dengan potensial

ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan

terhadap elektrofil (Katritzky et al, 1996). Sedangkan energi

LUMO berhubungan langsung dengan afinitas elektron dan

sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap

nukleofil. Selisih antara energi HOMO dan LUMO (celah

HOMO-LUMO) penting dalam penentuan ukuran stabilitas

molekul. Molekul dengan celah HOMO-LUMO yang besar

berarti molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi,

sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksi-

reaksi kimia. Celah ini juga digunakan pada perkiraan energi

eksitasi terendah molekul (Katritzky et al., 1996).

2.9.3 Parameter sterik

Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat

meruah gugus-gugus dan efek gugus pada kontak obat dengan

sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono, 2008). Parameter

sterik yang sering digunakan para kimiawan dalam setiap

kasus adalah indeks topologi untuk melakukan evaluasi

terhadap toksisitas dan untuk memprediksi aktivitas biologi.

Hal ini karena indeks topologi menawarkan cara yang mudah

dalam pengukuran cabang molekul, bentuk, ukuran, siklisitas,

simetri, sentrisitas, dan kompleksitas (Devillers, 1997).

Indeks topologi menjelaskan bahwa suatu struktur kimia,

disebut sebagai grafik kimia, yaitu suatu model kimia yang

digunakan untuk menjelaskan sifat interaksi antara obyek-

obyek kimia (atom, ikatan, gugusan atom, molekul, pasangan

molekul, dan sebagainya). Salah satu jenis indeks topologi

yang ada adalah indeks harary, Indeks Harary yang

dinyatakan dengan H diturunkan dari hubungan timbal balik

(resiprokal) matriks jarak dan dari sejumlah sifat-sifat yang

menarik.

23


Indeks ini berdasarkan pada dugaan para kimiawan

bahwa situs-situs yang terletak berjauhan dalam suatu struktur

seharusnya memiliki pengaruh yang lebih kecil antara satu

dengan lainnya daripada situs-situs yang letaknya berdekatan

(Fatimah, 2008).

Indeks Randic atau indeks konektivitas molekular Randic

sangat mirip dengan indeks Zagreb, namun lebih dapat

diterima dan digunakan secara luas. Secara matematis

dituliskan pada persamaan:

Sesuai dengan definisi yang diberikan, maka semakin

rapat grafik, maka akan semakin rendah harga χ (Fatimah,

2008). Selain itu descriptor parameter sterik yang biasa

digunakan adalah Refraksi molar (molar refraction = MR)

Refraksi molar dihitung melalui persamaan Lorenz-Lorenz

sebagai berikut:

MR= (n2-1) x BM / (n2-1) x d

n : indeks refraksi

d : kerapatan (density) (Siswandono, 2008).

2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch

Perhitungan statistic yang sering digunakan dalam

hubungan struktur dan aktivitas melalui parameter-parameter

kimia fisika adalah analisa regresi linier dan non linier. Untuk

mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan

aktivitas biologis melalui parameter kimia fisika, dapat

dilakukan perhitungan statistic dengan bantuan computer,

menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR,

STATGRAPHIC, STATISTICA, SIGMASTAT, SPSS, atau

program statistic lainnya (Siswandono, 2008).

24


Analisa regresi linier bila dilihat dari jumlah variabel

bebas yang digunakan, terbagi menjadi dua yaitu analisa

regresi linier tunggal yang menggunakan satu variabel bebas

dan analisa regresi multi linier (Multilinier Regresion) yang

menggunakan lebih dari satu variabel bebas. Perhitungan

regresi linier digunakan untuk mencari hubungan antara

aktivitas biologis dengan satu parameter kimia fisika atau

lebih. Salah satu contoh bentuk persamaan untuk regresi

multilinier yang menggunakan dua dan tiga parameter adalah

sebagai berikut:

Y = aX1+ bX2 + c

Y= aX1 + bX2 + cX3 + d

X1, X2, X3 : parameter-parameter kimia fisika 1, 2, dan 3

(Siswandono, 2008).

2.9.5 Kriteria Statistik

Keabsahan persamaan yang diperoleh dan arti perbedaan

parameter yang digunakan dalam hubungan struktur-aktivitas

model Hansch, dapat dilihat dengan beberapa kriteria statistik,

seperti r, r2, F, t dan s. arti kriteria statistik:

a) Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat

hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan

percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan

persamaan yang diperoleh dari analisi regresi. Koefisien

korelasi adalah angka bervariasi mulai dari 0 sampai 1.

Semakin tinggi nilai koefisien kolerasi maka semakin

baik hubungannya.

b) Nilai r2 menunjukkan berapa % aktivitas biologis yang

dapat dijelaskan hubungannya dengan parameter sifat

fisika-kimia yang digunakan.

25


c) Nilai F menunjukkan kemaknaan hubungan bila

dibandingkan dengan tabel F. Makin besar nilai F makin

besar derajat kemaknaan hubungan. Nilai F adalah

indikator bilangan untuk menunjukkan bahwa hubungan

yang dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah

benar atau merupakan kejadian kebetulan. Semakin tinggi

nilai F semakin kecil kemungkinan hubungan tersebut

adalah karena kebetulan.

d) Nilai t menunjukkan perbedaan koefisien regresi a, b, c,

dan d dari persamaan regresi bila dibandingkan dengan

tabel t

e) Nilai s (simpangan baku) menunjukkan nilai variasi

kesalahan dalam percobaan.

2.10 Penambatan molekuler (Molecular Docking)

Molecular docking atau penambatan molekuler adalah

prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksikan

ikatan non kovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul

besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien,

dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur

yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology

modeling, dll. Tujuan dari molecular docking adalah untuk

memprediksikan konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar,

2012).

Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode

untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu

molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks

yang stabil.

26


Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk

memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua

molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan

antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat,

karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi

sinyal.

Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang

berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh

karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan

jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk

memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil

terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas

molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam

desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011).

Prediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting

karena data tersebut digunakan untuk screening database virtual

molekul mirip obat untuk menemukan senyawa penuntun untuk

mengembangkan obat selanjutnya. Docking juga dapat digunakan

untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang

diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar,

2012).

Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama

adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah

ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi

sinar-x, atau spektroskopi NMR.

Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini

berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan

program docking tergantung pada dua komponen: pencarian

algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi scoring dapat

memprediksi afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan.

Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi

bebas Gibbs.

27


Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa

konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi

bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang

terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam

penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari

pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).

2.11 Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler

2.11.1 Hyperchem

Program HyperChem, merupakan program kimia aplikasi

32 bit, yang dikembangkan oleh HyperCube Inc. HyperChem

merupakan program yang handal dari pemodelan molekul yang

telah diakui mudah digunakan, fleksibel dan berkualitas. Dengan

menggunakan visualisasi dan animasi tiga dimensi hasil

perhitungan kimia kuantum, mekanika dan dinamika molekular,

menjadikan HyperChem terasa sangat mudah digunakan

dibandingkan dengan program kimia kuantum yang lain. Program

Kimia menyediakan fasilitas pembuatan model tiga dimensi (3D),

perhitungan mekanika molekular dan mekanika kuantum

(semiempiris dan ab initio). Disamping itu tersedia pula database

dan program simulasi Monte Carlo dan molecular dynamics (MD)

(Pranowo, 2009).

2.11.2 Protein Data Bank

Protein data bank (PDB; http://www.pdb.org) merupakan

kumpulan arsip tunggal mengenai data structural makromolekul

biologi dari seluruh dunia. Penentuan struktur molekul protein yang

terdapat berkas PDB diperoleh dengan menggunakan data

eksperimen. Data eksperimen ini berasal dari kristalografi sinar x

atau spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).

http://www.pdb.org/

28


Kemudian dilakukan proses dengan program komputer untuk

membuat molekul yang paling sesuai dengan data eksperimen

(Berman et al, 2000). PDB merupakan tempat penampungan data

struktur 3D dari protein dan asam nukleat. Situs PDB dapat diakses

pada alamat http://www.pdb.org oleh seluruh pengguna internet

seluruh dunia secara gratis (Yanuar, 2012).

2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer

Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat

digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk

melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain.

Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang

interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan,

data refleksi X-ray, script, dan data lainnya.Aplikasi ini dapat

digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan

desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar

seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys

Enterprise Platform, 2005).

2.11.4 MarvinSketch

MarvinSketch merupakan aplikasi mendesain gambar struktur

yang didirikan oleh ChemAxon, perangkat lunak yang

dikembangkan untuk bioteknologi dan farmasetikal industry.

MarvinSketch adalah perangkat chemical drawing berbasis Java

yang memungkinkan membuat dan mengedit molekul dalam

berbagai format file (DBM et al., 2014).

2.11.5 Autodock

Autodock merupakan sebuah perangkat lunak yang dibangun

untuk melakukan suatu prosedur dalam rangka memprediksi

interaksi sebuah molekul kecil dari suatu senyawa dengan molekul

target.

http://www.pdb.org/

29


Hal yang menyebabkan tercetusnya pembuatan software ini

adalah karena adanya permasalahan dalam merancang suatu

senyawa bioaktif, khususnya dalam hal perancangan obat dengan

bantuan komputer (Computer Aided Drug Design). Program ini

bertujuan sebagai alat yang dapat digunakan pada computer untuk

membantu proses pembentukan interaksi yang akurat (Yanuar,

2012).

Setiap proses docking dengan AutoDock membutuhkan paling

sedikit empat input file, yaitu: PDBQT file untuk ligan; PDBQT

file untuk makromolekul atau reseptor; grid parameter file (GPF)

untuk perhitungan oleh AutoGrid; dan docking parameter file

(DPF) untuk perhitungan oleh AutoDock (Yanuar, 2012).

2.11.6 Autodock Vina

AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat

dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat,

penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan

diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang

beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk

mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan

dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command

line.

Untuk hasil input dan output vina, file type yang digunakan

dalah struktur molekul PDBQT seperti yang digunakan pada

software Autodock. Untuk pengaplaksiannya, hanya diperlukan

struktur molekul yang akan di docking dan spesifikasi binding site

(Yanuar, 2012).

30


2.11.7 Pymol

Pymol adalah program visualisasi molekuler yang diciptakan

oleh Warren Lyford DeLano. Pymol memberikan kualitas gambar

tiga dimensi yang baik dari molekul kecil dan makromolekul

seperti protein.

Pymol merupakan salah satu program visualisasi yang

digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat

menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu

menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu

molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi

sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur

suatu molekul (DeLano & Bromberg, 2004).

2.11.8 LigPlot

Program Ligplot secara otomatis menghasilkan skema

gambaran 2-D dari interaksi kompleks protein-ligan dari input file

standar Protein Data Bank. Hasil Output yang diberikan berupa

warna, atau hitam-putih, file PostScript memberikan representasi

sederhana dan informatif tentang interaksi antarmolekul dan

kekuatan interaksinya, termasuk ikatan hidrogen, interaksi

hidrofobik dan aksesibilitas atom. Program ini sepenuhnya secara

umum digunakan untuk ligan apapun dan juga dapat digunakan

untuk menunjukkan jenis interaksi protein dan asam nukleat

(Wallace et al., 1994).


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan

Maret hingga Juni 2015.

3.2. Alat

3.2.1. Perangkat Keras

Notebook Asus (X44C series) dengan spesifikasi Intel®

celeron® CPU (B800 @ 1.50GHz (2 CPUS), ~1.50 GHz), RAM

(Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan Graphic Card (Intel®

HD Graphics Family) 784 MB. Notebook terhubung dengan

AC/DC adapter dan terkoneksi internet.

3.2.2. Perangkat Lunak

Sistem operasi menggunakan Windows 7 Ultimate 64 bit,

Autodock Tools, Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys

Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol

(De Lano Scitientific LLC), Marvin Sketch 5.5.1.0

(http://www.chemaxon.com), LigPlot, HyperchemTM

trial for

Windows, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb), SPSS

16.0 for windows, Microsoft Excel 2007.

http://www.chemaxon.com/

http://www.rcsb.org/pdb

32


3.3. Bahan

3.3.1. Struktur molekul tiga dimensi enzim Inh A Mycobacterium

tuberculosis

Struktur tiga dimensi enzim Inh A diunduh dari Bank Data

Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb. Makromolekul

protein yang dipilih adalah enzim Inh A pada Mycobacterium

tuberculosis yang didapat dari metode X-ray Diffraction dengan

resolusi 2,70 Å. Identitas makromolekul tersebut adalah 1ENY

dengan format .pdb.

3.3.2. Struktur tiga dimensi ligan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat.

Ligan yang digunakan adalah ligan dari senyawa amidasi

etil p-metoksisinamat (EPMS) yang dibuat dengan Marvin Sketch

dengan format .mol untuk perhitungan deskriptor dan format .pdb

untuk proses docking.

3.3.3 Data anti-tuberculosis beberapa senyawa beserta strukturnya

Data anti-tuberkulosis beberapa senyawa di ambil dari

referensi dan jurnal penelitian, kemudian digunakan sebagai

training sets dan test sets untuk membangun persamaan HKSA.

Data aktivitas anti-tuberkulosis yang didapat adalah nilai Minimum

Inhibitor Concentration (MIC) dan strukturnya dalam format .mol.

3.4. Cara Kerja

3.4.1. HKSA pendekatan Hansch

3.4.1.1 Pemilihan Data Sets

Pemilihan Senyawa Data sets anti-tuberkulosis yang digunakan

melalui pencarian literatur kemudian dibagi menjadi 2 kelompok

yaitu senyawa training sets dan test sets. Senyawa training sets

digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Sedangkan

senyawa test sets digunakan untuk memvalidasi persamaan HKSA

yang telah dibuat.

http://ww.rcsb.org/pdb

33


3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets

Data deskriptor yang digunakan mewakili parameter

hidrofobik, elektronik, dan sterik. Untuk parameter hidrofobik

digunakan nilai Log D dengan menggunakan aplikasi

Marvinsketch. Parameter elektronik yang digunakan adalah energi

HOMO, energi LUMO, dan Momen dipol dengan menggunakan

aplikasi Hyperchem, perhitungan menggunakan metode

semiempiris AM1. Sedangkan parameter sterik yang digunakan

adalah Harary index, Randic index, dan Molar refractivity dengan

aplikasi Hyperchem dan Marvinsketch. Training sets yang telah

dipilih kemudian dihitung tiap deskriptornya untuk membangun

persamaan HKSA.

3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA

Persamaan HKSA dibuat melalui perhitungan statistik analisis

regresi multilinier dengan program SPSS. Analisa regresi

multilinier dilakukan dengan metode backward, yaitu dengan

memasukkan semua variabel bebas (data deskriptor) yang

digunakan. Kemudian dicoba penghilangan satu-persatu dalam satu

waktu. Persamaan HKSA tersebut merupakan hubungan parameter

sifat fisika-kimia yang merupakan variable bebas pada metode

Hansch dengan aktivitas anti-tuberkulosis (log 1/MIC) sebagai

variable terikat.

3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets

Test set yang telah dipilih dihitung nilai descriptor log D,

Energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary index,

Randic index, dan Molar refractivity menggunakan aplikasi

Hyperchem dan MarvinSketch.

34


3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA

Setelah membangun persamaan multilinier regression metode

backward akan didapatkan beberapa model persamaan. Kemudian

diuji validitasnya dengan menghitung nilai r2, Fhit/Ftabel, Standar

Error, dan predicted residual sums of squares (PRESS). Persamaan

yang diterima harus memenuhi syarat:

1. nilai r2 dari 0,8 hingga 1

2. nilai Fhit/Ftabel > 1

3. nilai SE dan PRESS terkecil atau mendekati 0

Kemudian dihitung nilai Root Mean Standar Deviation

(RMSD) dengan membandingkan nilai Log (1/MIC) eksperimen

pada data test sets dengan Log (1/MIC) prediksi test sets dari hasil

model persamaan yang dibuat. Model persamaan yang diterima

bila nilai RMSD terkecil atau mendekati 0.

3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets

Senyawa amidasi etil p-metoksisinamat pada format .mol

dihitung nilai deskriptor dengan model persamaan yang telah

memenuhi syarat. Nilai deskriptor yang didapat kemudian di

masukkan kedalam persaman HKSA untuk mendapatkan prediksi

aktivitas anti-tuberkulosis (Log 1/MIC) yang baik.

3.4.2. Penambatan Molekuler

3.4.2.1 Penyiapan dan Optimasi Enzim Inh A

Makromolekul enzim InhA diunduh dari Bank Data Protein

melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul pada

situs tersebut adalah 1ENY dalam format .pdb.

Makromolekul protein kemudian dilakukan proses pemisahan

molekul air dan ligan atau residu non standar. Proses ini dilakukan

dengan menggunakan software Discovery Studio 3.5 Visualizer.

Hasil makromolekul yang telah dipisahkan disimpan pada dalam

format .pdb.

http://www.rcsb.org/pdb/

35


Selanjutnya, dilakukan proses optimasi makromolekul

menggunakan software Autodock Tool. Buka software Autodock

tool klik file read molecul pilih makromolekul dengan

format .pdb. Optimasi meliputi penambahan atom hidrogen dan

pengaturan grid box parameter untuk menentukan lokasi

penambatan molekul ligan. Hasil optimasi makromolekul disimpan

dalam format .pdbqt.

3.4.2.2 Penyiapan dan Optimasi Ligan (senyawa uji)

Ligan yang digunakan sebagai pembanding adalah Isoniazid

yang dapat diunggah melalui PubChem

(http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov). Sedangkan senyawa amidasi

Etil p-metoksisinamat yang akan diujikan dibuat struktur tiga

dimensinya dengan software Marvinsketch dan disimpan dalam

format .mol, kemudian dikonversi menjadi .pdb dengan program

open babel. Optimasi struktur ligan yang telah dibuat dengan

menggunakan software Autodock Tools. Dengan cara: Buka ligan

yang telah dibuat (ligand → input → open). Kemudian, optimasi

pengaturan number of active torsion. Simpan ligan hasil optimasi

(ligand → output → save as pdbqt →save) dalam format .pdbqt.

3.4.2.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina

Langkah awal yang dilakukan adalah mengkopi atau

menyimpan data Ligan dan Protein format .pdbqt yang telah

dioptimasi kedalam folder Vina. Kemudian buat pengaturan

konfigurasi file vina pada notepad dan disimpan dengan format

conf.txt. Selanjutnya, jalankan software Vina melalui Command

prompt.

http://pubchem.ncbi.blm.nih.gov/

36


3.4.2.4 Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul

Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format

out.pdbqt. Pemilihan hasil penambatan dengan memilih ligan yang

memilki nilai energi bebas Gibbs (∆Gbind) terendah. Data nilai

energi ikatan setiap ligan dapat dilihat pada output hasil

penambatan ‘log.txt’.

Visualisasi posisi setiap ligan pada makromolekul dan asam

amino yang terikat pada ligan dengan menggunakan program

Pymol dan Ligplot. Pymol digunakan untuk melihat kecocokan

situs tambat pada makromolekul dengan ligan. Pymol akan

menvisualisasi secara 3 dimensi, sedangkan ligplot secara 2

dimensi.

Makromolekul yang sebelumnya telah dioptimasi dengan

format .pdbqt dan data hasil penambatan output.pdbqt, dibuka

menggunakan wordpad. Data dari output.pdbqt disalin kedalam

data makromolekul, kemudian disimpan dalam format .pdb dan

dilihat interaksi asam amino dan ligannya menggunakan program

Ligplot secara dua dimensi.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch

4.1.1 Pemilihan data sets

Data sets yang digunakan adalah senyawa turunan asam sinamat

yang memiliki kemiripan dengan senyawa amidasi EPMS dan

mempunyai aktivitasi anti-tuberkulosis. Data senyawa turunan sinamat

yang digunakan adalah hasil percobaan secara in-vitro yang dilakukan

oleh Guzman et al, (2014) terhadap penghambatan pertumbuhan

Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv atau konsentrasi hambat

minimum (MIC). Data senyawa yang digunakan adalah sebanyak 14,

kemudian dibagi menjadi 2 bagian, yaitu 9 senyawa sebagai training

sets dan 5 senyawa sebagai test sets.

Tabel 4.1 Data sets yang digunakan

No. Nama Senyawa dan Struktur Kode

Senyawa

MIC

(μM)

1

ethyl p-methoxycinnamate

S1 485

2

Cinamic acid

S2 270

3

3,4-methylenedioxycinnamic acid

S3 312

38


4

3-Coumaric acid

S4 366

5

2-O-prenylcoumaric acid

S6 258

6


S7 86.1

7

4-O-geranylcoumaric acid

S8 66.8

8

Methyl 3-O-Prenylcoumarate

S9 172

9

Methyl 4-O-Prenylcoumarate

S10 81.2

10

Methyl 2-Coumarate

S12 112

39


11

Caffeic aldehyde

S13 154

12

2-Coumaric acid

S14 122

13

Methyl 4-Coumarate

S15 224

14


S16 127

Catatan: Untuk mempermudahkan input data, nama senyawa selanjutnya akan

digantikan oleh kode senyawa

Tabel 4.2 Data Training sets Tabel 4.3 Data test sets

No. Kode Senyawa MIC No. Kode Senyawa MIC

1 S1 485 1 S4 366

2 S2 270 2 S3 312

3 S6 258 3 S16 172

4 S15 224 4 S14 122

5 S9 172 5 S7 86.1

6 S13 154

7 S12 112

8 S10 81.2

9 S8 66.8

40


4.1.2 Pemilihan deskriptor Training sets

Deskriptor yang digunakan merupakan hasil dari perhitungan

logika matematika yang mengubah informasi yang dikodekan dalam

suatu molekul kemudian direpresentasikan kedalam angka-angka yang

berguna bagi penelitian berikutnya, baik sebagai pengetahuan tentang

molekul tersebut maupun sebagai model untuk mempresiksi molekul

lain (Todeschini, 2009).

Sehingga hasil dari deskriptor tersebut dapat mewakili parameter

hidrofobik, elektronik, dan sterik pada HKSA model Hansch. Hal ini

dikarenakan proses distribusi, penembusan membran biologis sangat

dipengaruhi oleh sifat kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan

derajat ionisasi (pKa) sehingga dalam HKSA, parameter yang sering

digunakan adalah parameter hidrofobik dan elektronik.Sedangkan untuk

proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia,

kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia, sehingga

dalam HKSA, ketiga parameter tersebut ikut dilibatkan, terutama

parameter elektronik dan sterik (Siswandono, 2008).

Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter hidrofobik

adalah nilai Log D dengan menggunakan program Marvin sketch,

Struktur training sets yang telah dibuat dalam aplikasi Marvin sketch

kemudian pilih clean 3D, setelah itu pilih tools partitioning logD,

untuk mendapatkan nilai logD.

Untuk deskriptor elektronik yang digunakan adalah nilai energi

HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), energi LUMO (Lowest

Unoccupied Molecular Orbital), dan momen dipol menggunakan

aplikasi Hyperchem. Setelah struktur training sets dibuat, kemudian

pilih Build add H and model build. Sebelum dilakukan perhitungan

deskriptor, dilakukan optimasi struktur dengan metode semiempiris

AM1 dan optimasi geometri.

Pemilihan metode semiempiris AM1, karena metode tersebut

sering digunakan dan merupakan metode semiempiris standar untuk

perhitungan senyawa organik (Bultink et al., 2004).

41


Proses optimasi struktur berfungsi untuk mendapatkan struktur

yang stabil ketika dilakukan perhitungan parameter elektroniknya,

sehingga hasil perhitungan deskriptor yang didapat sesuai dengan sifat-

fisika kimia senyawa yang sebenarnya. Proses perhitungan deskriptor

energi HOMO dan LUMO dengan cara, pilih Compute kemudian pilih

Orbitals. Sedangkan untuk momen dipol, pilih Compute Single Point

Properties.

Kemudian, pemilihan deskriptor yang mewakili parameter sterik

adalah Molar refractivity, Harary Index, dan Randic Index. Pehitungan

molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dengan cara, pilih

Compute QSAR Properties Refractivity klik Compute.

Sedangkan untuk Harary Index dan Randic Index menggunakan

aplikasi MarvinSketch. Setelah struktur dibuat dan telah di-clean 3D,

pilih tools GeometryTopological analysispilih Harary Index dan

Randic IndexOk. Semua data kemudian dikumpulkan pada program

SPSS dan Microsoft Excel, yang nantinya digunakan untuk membangun

persamaan HKSA. Selanjutnya, aktivitas senyawa yaitu nilai MIC

diubah menjadi Log (1/MIC) sebagai variabel tak bebas dan 7 data

deskriptor sebagai variabel bebas.

Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training set

No Kode

Senyawa

Log

(1/MIC) logD

Energi

HOMO

Energi

LUMO

Momen

dipol

Harary

index

Randic

index

Molar

refractivity

1 S1 -2.686

2.71 -8.943 -0.639 2.346 39.412 12.815 63.09

2 S2 -2.431

-0.665 -9.471 -0.793 2.679 25.102 8.734 47.2

3 S6 -2.412

0.183 -9.394 -0.615 2.02 47.893 14.695 72.69

4 S15 -2.350

2.207 -9.059 -0.731 3.731 32.25 10.419 53.57

5 S9 -2.236

0.237 -9.215 -0.784 4.055 47.233 14.695 72.69

6 S13 -2.188

1.36 -8.974 -0.847 5.397 29.204 9.272 49.48

7 S12 -2.049

2.205 -9.304 -0.72 1.099 32.639 10.419 53.57

8 S10 -1.91

3.719 -8.922 -0.642 3.029 50.65 15.842 77.46

9 S8 -1.825

1.845 -8.97 -0.71 3.959 66.316 20.222 96.49

42


4.1.3 Membangun dan validasi Persamaan HKSA

Persamaan HKSA yang dibuat dengan cara analisa regresi

multiliner dengan metode backward dibantu oleh program SPSS.

Pemilihan analisa regresi multilinier dikarenakan dalam pembuatan

persamaan, parameter-parameter sifat fisika-kimia yaitu data deskriptor

yang digunakan lebih dari satu. Sembilan data akitivitas (Log 1/MIC)

senyawa training sets dengan masing-masing memiliki 7 data

deskriptor di input pada program SPSS. Kemudian dilakukan analisa

statistic regresi multiliner metode backward dengan cara, pilih analyze

RegressionLinier pilih dependent variabel adalah aktivitas

senyawa (Log 1/MIC) dan independent variabel adalah 7 deskriptor

yang digunakanubah method menjadi backwardOk.

Hasil yang didapat dari program SPSS adalah 3 model persamaan

HKSA dengan nilai r, r2, Fhitung, SE (Standar Error), dan Deskriptor

yang digunakan. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5. Model

persamaan yang diterima dalam penelitian HKSA adalah yang memiliki

nilai r diantara 0,9 hingga 1, nilai r2 antara 0,8 hingga 1, nilai standar

error (SE) < 1 atau mendekati 0, dan nilai Fhitung lebih kecil dari Ftabel

atau Fhit/Ftab>1. Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat

hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan

data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari

analisa regresi. Sedangkan nilai r2

menunjukkan persentase aktivitas

biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan sifat fisika kimia

yang digunakan (Siswandono, 2008; Rifai. et al., 2014).

Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA

Model Deskriptor yang digunakan r r2 SE Fhit Ftab Fhit/Ftab

1 Log D, energi HOMO, energi

LUMO, Momen dipol, Harary

Index, Randic Index, Molar

refractivity

0.994 0.988 0.083 12.218 237 0.052


LUMO, Harary Index, Randic

Index, Molar refractivity

0.992 0.985 0.0679 21.179 19.33 1.096


LUMO , Randic Index, Molar

refractivity

0.988 0.976 0.0684

24.906 9.01 2.764

43


Tabel 4.6 Model Persamaan

Keterangan: EH = energi HOMO, EL = energi LUMO, MD = momen dipole, HI =

Harary Index, RI = Randic Index, MR = Molar refractivity

Dari hasil analisa yang didapat, model persamaan yang memenuhi

syarat adalah persamaan model 2 dan 3. Karena pada persamaan model

1, nilai Fhit/Ftab kurang dari 1 yaitu 0,052. Hal ini dikarenakan nilai F

menunjukkan kemungkinan persamaan tersebut adalah suatu hubungan

yang bermakna diantara hasil-hasil yang didapat. Jika nilai F

perhitungan data percobaan lebih besar dari nilai F tabel maka hasil-

hasil percobaan mempunyai hubungan yang besar pada tingkat

probabilitas yang diberikan (Siswandono, 2008).

Setelah dilakukan validasi pada data output SPSS dilakukan uji

PRESS (prediction sum of squares) dengan menggunakan data aktivitas

senyawa training sets berdasarkan eksperimen (Log 1/MIC eksperimen)

dan data aktivitas senyawa training sets dengan menggunakan model

persamaan yang terpilih ( Log 1/MIC prediksi), yaitu model 2 dan 3.

Perhitungan nilai PRESS dengan menggunakan rumus:

Σ{(log 1/MIC eksperimen) – (Log 1/MIC prediksi)}2

Model Bentuk Persamaan

1

log(1/MIC) = -14.130+0.251(logD)-0.693(EH)-3.027(EL)-0.068(MD)+0.044(HI)-

1.364(RI)+0.294(MR)

2

log(1/MIC) = -18.7+0.298(logD)-1.22(EH)-2.812(EL)+0.034(HI)-1.106(RI)+0.243(MR)

3

log(1/MIC) = -19.106+0.302(logD)-1.226(EH)-2.828(EL)-1.083(RI)+0.265(MR)

44


Tabel 4.7 Data Nilai PRESS

Kode

Senyawa

Log(1/MIC)

eksperimen

Log(1/MIC) prediksi

Model 2 Model 3

S1 -2.686 -2.688 -2.676

S2 -2.431 -2.450 -2.404

S6 -2.412 -2.416 -2.446

S15 -2.350 -2.344 -2.354

S9 -2.236 -2.166 -2.172

S13 -2.188 -2.203 -2.227

S12 -2.049 -2.064 -2.085

S10 -1.910 -1.878 -1.859

S8 -1.825 -1.874 -1.874

Nilai PRESS 0.009 0.014

Dari tabel 4.7 diketahui nilai PRESS yang terkecil atau mendekati

0 adalah model 2 yaitu 0,009. Nilai PRESS yang kecil menandakan

aktivitas prediksi dari suatu persamaan HKSA mendekati aktivitas

eksperimen. Untuk memvalidasi lagi model persamaan yang terpilih,

maka dilakukan uji diluar data senyawa pembuat persamaan HKSA

yaitu pada data test sets.

Sebanyak 5 data tes sets yang digunakan dihitung data deskriptor

terpilih dari persamaan model 2 dan 3, yaitu; Log D, energi HOMO,

energi LUMO, Harary Index, Randic Index, dan Molar refractivity.

Setelah semua data deskriptor terkumpul, maka dilakukan

perhitungan aktivitas yaitu nilai Log 1/MIC prediksi senyawa tes set

menggunakan persamaan model 2 dan 3 untuk mendapat nilai RMSD

(root mean square deviation) terkecil, dengan membandingkannya pada

Log 1/MIC eksperimen senyawa tes set. Perhitungan RMSD dengan

rumus:

n = jumlah senyawa test sets yang digunakan

45


Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set

Kode

Senyawa log(1/MIC) logD

Energi

HOMO

Energi

LUMO

Harary

Index

Randic

Index

Molar

Refractivity

S4 -2.563 -1.322 -9.323 -0.889 28.921 9.272 48.8

S3 -2.494 -1.77 -9.086 -0.947 38.024 10.103 52.79

S16 -2.236 -0.19 -9.172 -0.816 47.233 14.695 72.69

S14 -2.086 -1.309 -9.316 -0.942 29.136 9.272 48.8

S7 -1.935 0.186 -8.973 -0.713 46.751 14.695 72.69

Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set

Kode

Senyawa

Log(1/MIC)

eksperimen

Log(1/MIC) prediksi

Model 2 Model 3

S4 -2.563 -2.633 -2.671

S3 -2.494 -2.533 -2.775

S16 -2.236 -2.255 -2.263

S14 -2.086 -2.481 -2.526

S7 -1.935 -2.692 -2.684

Nilai RMSD 0.384 0.411

Dari hasil RMSD dapat diketahui bahwa model persamaan dengan

nilai RMSD kecil adalah model persamaan 2, hal ini sesuai dengan hasil

uji PRESS, dimana model persamaan 2 memiliki nilai PRESS terkecil.

Sehingga dapat disimpulkan dari hasil validasi model persamaan,

persamaan 2 telah memenuhi syarat pemodelan persamaan HKSA.

46


Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) - 1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary

Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity)

(r = 0.992; r2 = 0.98; SE = 0.0679; Fhit/Ftab = 1.096)

Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa semakin besar nilai

deskriptor log D, Harary index, dan Molar refractivity akan

meningkatkan aktivitas anti tuberkulosis. Sedangkan semakin kecil nilai

deskriptor energi HOMO, energi LUMO, dan Randic Index akan

meningkatkan aktivitas anti tuberculosis. Hal ini dikarenakan koefisien

pada setiap deskriptor mempengaruhi nilai aktivitas suatu senyawa.

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets

Sampel yang digunakan yaitu 11 senyawa amidasi EPMS dan

EPHS (etil p-hidroksisinamat) dibuat bentuk strukturnya dan dihitung

nilai deskriptor terpilih pada persamaan HKSA kedua. Senyawa yang

diujikan merupakan senyawa yang dimungkinkan dapat disintesis,

sehingga nantinya dapat dilakukan uji in-vitro aktivitas anti-

tuberkulosis pada senyawa tersebut.

R² = 0.9843

-3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0

Log (1/MIC) eksperimen

Log (1/MIC)

prediksi

Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC)

prediksi dengan model persamaan HKSA 2 pada 9 senyawa training sets.

47


Sebelum melakukan proses perhitungan deskriptor pada

Hyperchem maupun Marvinsketch, dilakukan optimasi yang sama

seperti perhitungan deskriptor pada training sets dan test sets, yaitu

menggunakan metode semiempirik AM1 pada Hyperchem dan

dilakukan clean 3D pada marvin sketch. Setelah semua data deskriptor

di dapat, dengan menggunakan Microsoft excel semua data

direkapitulasi dan dilakukan perhitungan MIC prediksi senyawa

sampel.

Tabel 4.10 Data sample sets

No. Kode

Senyawa

Nama IUPAC Struktur

1 Amida_1 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-

enamide

2 Amida_2 (2E)-N-hydroxy-3-(4-

methoxyphenyl)prop-2-enamide

3 Amida_3 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop-

2-enamide

4 Amida_4 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,N-

dimethylprop-2-enamide

5 Amida_5 (2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4-


6 Amida_6 (2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4-


48


7 Amida_7 (2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-


8 Amida_8 (2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4-


9 Amida_9 (2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-

2-enamide

10 Amida_10 ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2-

enoate

11 Amida_11 (2E)-N,N-dibenzyl-3-(4-


12 EPHS ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-

enoate

Catatan: Untuk mempermudah analisa data, nama senyawa IUPAC diganti

dengan kode senyawa

Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets

No. Kode

Senyawa Log D

Energi

HOMO

Energi

LUMO

Harary

Index

Randic

Index

Molar

Refractivity

1 Amida_1 1.171 -8.866 -0.484 32.302 10.791 55.4

2 Amida_2 1.165 -9.01 -0.737 35.874 11.329 56.87

3 Amida_3 1.395 -8.842 -0.468 35.874 12.003 60.29

4 Amida_4 1.619 -8.862 -0.505 39.946 13.214 65.19

5 Amida_5 0.815 -8.942 -0.544 39.412 12.563 61.39

6 Amida_6 0.459 -9.022 -0.546 47.938 14.335 67.39

7 Amida_7 0.705 -8.862 -0.491 42.951 13.813 66.58

8 Amida_8 0.239 -8.891 -0.472 56.083 16.835 77.77

9 Amida_9 3.12 -8.874 -0.279 60.358 16.678 89.04

10 Amida_10 2.043 -8.527 -0.528 35.697 12.041 60.27

11 Amida_11 5.068 -8.673 -0.204 97.07 22.565 122.69

12 EPHS 2.564 -9.039 -0.698 35.697 11.669 58.32

49


Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA 2

No. Kode

Senyawa log(1/MIC)

MIC prediksi

(μM)

1 Amida_11 2.122 0.008

2 Amida_9 -0.916 8.249

3 EPHS -2.466 292.434

4 Amida_2 -2.779 601.082

5 Amida_4 -3.401 2518.767

6 Amida_1 -3.548 3530.954

7 Amida_3 -3.586 3856.257

8 Amida_5 -3.655 4519.205

9 Amida_10 -3.662 4587.203

10 Amida_6 -3.870 7410.952

11 Amida_7 -3.935 8619.499

12 Amida_8 -4.269 18581.125 Keterangan: MIC EPMS = 485 μM

Dari tabel diatas dapat dilihat 3 senyawa yang memiliki nilai MIC

terkecil bila dibandingkan dengan EPMS, yaitu Amida_11, Amida_9,

dan EPHS. Prediksi aktivitas pada senyawa amida_11 adalah 0,008 μM,

amida_9 adalah 8,249 μM, dan EPHS adalah 292,434 μM. Bila dilihat

dari data deskriptor yang berpengaruh terhadap aktivitas, pada

amida_11 terdapat deskriptor yang memiliki nilai yang besar yaitu Log

D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity. Hal ini

berbanding lurus dengan persamaan yang digunakan, semakin besar

deskriptor Log D, Harary index, dan Molar refractivity, aktivitas

semakin besar (MIC kecil).Walaupun nilai randic index senyawa

amida_11 besar yang seharusnya kecil, hal ini tidak terlalu berpengaruh

dan juga untuk nilai deskrptor lainnya tidak terlalu berbeda nilainya

dengan deskriptor senyawa lain. Pada amida_9 sama seperti dengan

senyawa amida_11 deskriptor yang memiliki nilai terbesar adalah Log

D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity.

50


Untuk senyawa EPHS (etil p-hidroksi sinamat), peneliti mencoba

melihat pengaruh modifikasi pada gugus metoksi pada cincin benzene

EPMS, yaitu menggantinya dengan gugus hidroksi pada posisi para.

Terlihat bahwa hal ini mempengaruhi nilai energi HOMO dan energi

LUMO yang lebih kecil dari senyawa lainnya. Sedangkan untuk

deskriptor lainnya, nilainya tidak terlalu berbeda dengan deskriptor

senyawa lain. Tetapi peningkatan aktivitas pada EPHS tidak terlalu jauh

dengan MIC EPMS, sehingga perubahan gugus metoksi menjadi

hidroksi tidak terlalu berpengaruh pada aktivitas anti-tuberkulosis.

EPMS EPHS

Amida_9 Amida_11

Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11

Penelitian yang dilakukan oleh De et al., (2011), tentang desain,

sintesis, dan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa turuan asam

sinamat baru, menyatakan bahwa gugus samping pada posisi para

cincin benzene asam sinamat berperan penting terhadap sifat lipofilitas

senyawanya. Sedangkan gugus samping karbonil asam sinamat, yang

pada penelitian ini digantikan oleh gugus amina, merupakan gugus

mirip obat (drug-like molecule) yang berperan penting dalam aktivitas

anti tuberkulosisnya. Berdasarkan hal itu, pada amida_9 dan amida_11

memiliki aktivitas yang baik kemungkinan karena adanya gugus

benzilamin dan dibenzilamin yang memiliki kemiripin dengan struktur

isoniazid.

51


4.2 Penambatan molekuler

4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A

Dalam proses penambatan molekul, hal yang harus disiapkan

adalah makromolekul dan ligan yang akan ditambatkan, kemudian

dilakukan optimasi terhadap makromolekul dan ligan tersebut.

Penyiapan makromolekul pada penelitian ini adalah dengan cara

mengunduh makromolekul enzim Inh A dalam 3D pada Protein Data

Bank (http://www.rcsb.org). Enzim Inh A yang di unduh dengan format

.pdb adalah makromolekul dengan kode 1ENY dan merupakan enzim Inh

A pada Mycobacterium tuberculosis yang diperoleh dari kristalografi

sinar X dengan resolusi 2,20 Å. Pemilihan kode 1ENY mengacu pada

penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Cohen et a.,(2011),

tentang penambatan molekul pada enzim Inh A.

Enzim Inh A yang telah diunduh kemudian dilakukan optimasi

makromolekul. Optimasi bertujuan untuk menghilangkan molekul non

standar dan menargetkan ruang tambat ligan pada makromolekul.

Molekul non standar seperti ligan dan molekul air yang ikut terunduh

dihilangkan dengan menggunakan program Discovery studio, dengan

cara, Pilih ScriptSelectionSelect water molecul dan ligandelete.

Dengan menghilangkan molekul air dan ligan, makromolekul nantinya

akan tepat menambat pada senyawa uji (ligan sampel). Enzim Inh A yang

telah teroptimasi dengan menggunakan program Discovery studio

kemudian di simpan dalam format .pdb.

Optimasi kedua yang dilakukan adalah penambahan atom hidrogen

dan penentuan grid box parameter menggunakan program Autodock

tools. Penambahan atom hidrogen penting untuk interaksi ligan dan

reseptor. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar,

karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Proses

penambahan atom hidrogen adalah, pilih EditHydrogenAddOk.

Setelah dilakukan penambahan atom hidrogen, dilakukan optimasi

grid box parameter. Optimasi grid box parameter berfungsi untuk

membuat peta tiga dimensi interaksi protein dengan setiap jenis atom

yang terdapat pada ligan (Yanuar, 2012).

52


Peta tiga dimensi tersebut merupakan ruang tambat antara

makromolekul dan ligan. Penentuan grid box parameter bisa melalui

pencarian literatur atau melihat ruang tambat ligan yang berasal dari

makromolekul itu sendiri.

Pada penelitian ini grid box parameter mengikuti penelitian yang

dilakukan oleh Cohen et al., (2011). Pengaturan pada grid box meliputi

center_x, center_y, center_z, untuk mengatur letak parameter box pada

makromolekul. Kemudian size_x, size_y, size_z, dan spacing (angstrom),

untuk menentukan ukuran grid box sebagai ruang tambat ligan tersebut.

Hasil pengaturan grid box yang diperoleh adalah center_x = -3.609,

center_y = 37.853 center_z = 18.312, size_x = 37, size_y = 22, size_z =

22, dan spacing (angstrom) = 0,375. Cara pengaturan grid box adalah

dengan pilih Gridgrid boxatur grid box parameter yang

adafileclose saving current. Setelah semua optimasi selesai,

makromolekul tersebut di simpan dalam format .pdbqt, untuk selanjutnya

akan dilakukan proses penambatan molekul dengan program autodock

vina.

4.2.3 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji)

Ligan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 senyawa

amidasi etil p-metoksi sinamat dengan kontrol positifnya adalah isoniazid.

Senyawa yang digunakan dianggap sebagai bukan pro-drug, sehingga

tidak berikatan dengan NADH untuk berinteraksi dengan enzim Inh A.

Hal ini dikarenakan belum diketahui secara langsung bagaimana proses

senyawa amidasi EPMS berinteraksi dengan enzim Inh A. Sedangkan

telah diketahui, suatu senyawa yang berinteraksi dengan enzim Inh A

tidak selalu berikatan dengan NADH.

53


Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking

No. Nama Senyawa (IUPAC) Kode

Senyawa

1

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

Amida_1

2

(2E)-N-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

Amida_2

3

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop-2-enamide

Amida_3

4

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylprop-2-enamide

Amida_4

5

(2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

Amida_5

54


6

(2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-

enamide

Amida_6

7

(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

Amida_7

8

(2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-

enamide

Amida_8

9

(2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

Amida_9

10

ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2-enoate

Amida_10

55


11

(2E)-N,N-dibenzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

amida_11

12

ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate

EPHS

13

Isoniazid

INH

Senyawa tersebut dibuat dengan menggunakan aplikasi Marvin

sketch, setelah proses pembuatan selesai, struktur yang dibuat kemudian

dilakukan clean 3D, dengan cara, pilih structurepilih cleaning

method fine with hydrogenizeclean in 3D. Struktur kemudian

disimpan dalam format .mol. Untuk bisa dilakukan optimasi ligan

dengan menggunakan program autodocktools, maka dilakukan

perubahan format .mol menjadi .pdb dengan menggunakan program

open babel.

Struktur dengan format .pdb kemudian dioptimasi number of active

torsion-nya. Proses ini berfungsi untuk menentukan ikatan-ikatan aktif

pada ligan yang dapat diputar selama proses docking berlangsung.

Proses pengoptimasian dengan cara, pilih ligandtorsion treeset

number of torsiondismiss. Kemudian di simpan dalam format .pdbqt,

dengan cara pilih ligandoutputsave as pdbqt.

56


4.2.4 Penambatan molekul dengan Autodockvina

Setelah data makromolekul dan ligan selesai di optimasi dan di

ubah format file menjadi .pdbqt. Kedua data tersebut kemudian di

pindahkan ke dalam folder vina yang terdapat pada local disc (C:).

Dalam folder vina kemudian juga ditambahkan file konfigurasi

menggunakan notepad, proses konfigurasi dapat dilihat pada lampiran

3. Data konfigurasi pada notepad, meliputi reseptor yang merupakan

makromolekul yang digunakan yaitu 1ENY.pdbqt dan ligan yang

merupakan senyawa uji dengan format .pdbqt. Selanjutnya data

out.pdbqt merupakan hasil dari visualisasi docking ligan pada

makromolekul dan log.txt merupakan nilai energi bebas (ΔGbind) yang

akan keluar setelah proses docking selesai. Dan terakhir adalah data

center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z yang

merupakan grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya. File

konfigurasi ini disimpan dengan nama ‘conf.txt.’

Setelah semua data yang ada difolder vina sudah lengkap, yaitu

1ENY.pdbqt, Ligand.pdbqt, dan conf.txt, maka proses docking dapat

dimulai. Proses docking dijalankan dengan program Command Prompt.

Melalui Command Prompt, masuk kedalam folder vina kemudian

dilakukan perintah dengan mengetik:

Vina --config conf.txt --log log.txt

Proses docking pada penelitian ini berjalan selama 2-5 menit,

kecepatan dari proses docking dipengaruhi oleh spesifikasi computer

dan bentuk ligan yang ditambatkan. Semakin tinggi spesifikasi atau

semakin sederhana bentuk ligan, maka semakin cepat proses docking

berlangsung. Setelah proses docking selesai, akan muncul data baru

pada folder vina, yaitu log.txt dan out.pdbqt. Data log.txt memberikan

hasil nilai afinitas/energi bebas (ΔGbind) dan RMSD dari hasil docking.

Sedangkan data out.pdbqt merupakan bentuk hasil konformasi

ligan dengan ruang tambatnya pada makromolekul. Data tersebut dapat

divisualisasi dengan program autodock tools, Pymol, dan Ligplot, untuk

dilihat interaksi ligan dengan asam amino pada makromolekul.

57


4.2.5 Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekuler

Hasil yang didapat dari proses penambatan molekuler adalah nilai

ΔGbind dan RMSD, serta visualisasi interaksi ligan dengan asam amino

pada enzim Inh A. Nilai ΔGbind merupakan energi konformasi hasil

docking antara ligan dan makromolekul, energi konformasi tersebut

merupakan kontribusi dari ikatan van der waal, hidrofobik, ikatan

hidrogen dari atom-atom netral, ikatan hidrogen atom-atom bermuatan,

dan jumlah ikatan berotasi (Adelin et al., 2013). Sedangkan RMSD

(root mean square deviation), merupakan nilai validasi dari hasil

ΔGbind, semakin kecil nilai RMSD maka konformasi yang terbentuk

semakin baik, sehingga nilai RMSD yang diambil adalah mendekati

atau sama dengan 0.

Interaksi ligan dan asam-asam amino pada enzim Inh A yang

terlihat melalui progam ligplot adalah adanya ikatan hidrogen dan

interaksi hidrofobik secara 2 dimensi, sedangkan pada program Pymol

visualisasi yang terlihat adalah tempat penambatan ligan pada

makromolekulnya yang disebut dengan binding pocket secara 3

dimensi. Proses visualisasi pada Ligplot adalah dengan cara membuka

file ligan hasil docking dan makromolekul dengan format .pdb, dengan

cara, filepdb filecari file yang akan divisualisasiOkRun.

Kemudian, visualisasi pada pymol dengan cara membuka file ligan

out.pdbqt dan makromolekul (1ENY.pdbqt). Prosesnya dengan cara

pilih openpilih file out.pbqt dan 1ENY.pdbqtok, dan untuk

melihat daerah binding pocket ligan dengan makromolekul dengan

cara allactionpresetligand sitepilih tampilan yang diinginkan

(misalkan, solid better)klik kiri. Hasil visualisasi dengan program

Ligplot dan Pymol dapat dilihat pada Lampiran 4.

58


Tabel 4.14 Hasil Penambatan molekuler

Struktur ∆Gbind Jenis asam amino

Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrofobik

Amida_11 -9.4 Gly96 Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95,

Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16

Amida_9 -8.4 Thr39 Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96,

Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130

Amida_2 -7.2 Thr39, Gly14 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122

Amida_7 -7.1 Gly14, Ala22, Ser94 Phe41, Val65, Gly96, Ile16, Ser20, Ile21, Ile95, Asp64

Amida_5 -6.9 Ile21, Ala22, ser94 Asp64, Ile95, Gly96, Ile16, Ser20, Gly14, Phe41

Amida_3 -6.7 Thr39 Leu63, Val65, Phe41, Phe97, Gly96, Ile95, Ser13,

Gly14, Met130

Amida_1 -6.6 Thr39, Gly14 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122

Amida_4 -6.6 Thr39 Ser13, Gly14, Leu63, Phe41, Ile16, Ile95, Val65, Met130

Amida_8 -6.5 Gly14, Ala22, Ser94 Ile95, Ile122, Gly96, Ile16, Ser20, Thr196, Ile21, Phe41,

Val65

Amida_6 -6.4 Gly14, Ala22, Ser94,

Ile21, Gly96 Ile16, Phe41, Ile95, Ser20, Ile15, Asp42

Amida_10 -6.1 Thr39 Ile95, Leu63, Phe41, Phe97, Gly14, Val65

EPHS -6.1 Thr39 Gly14, Phe41, Phe97, Val65, Ile95, Leu63

Isoniazid -6 Thr39, Gly14 Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65

Dari tabel 4.14 nilai ∆Gbind tiga senyawa terkecil adalah senyawa

dengan kode Amida_11, Amida_9, dan Amida_2, dengan nilai energi

-9,4 kcal/mol, -8,4 kcal/mol, dan -7,2 kcal/mol. Nilai ∆Gbind kecil

menandakan bahwa konformasi yang terbentuk antara ligan dengan

makromolekul merupakan kompleks yang stabil. Selain itu, bisa dilihat

bahwa isoniazid yang merupakan kontrol positif pada docking memilki

nilai ∆Gbind besar yaitu -6, hal ini membuktikan bahwa isoniazid

memang harus berikatan dengan NADH untuk membentuk konformasi

yang stabil dengan enzim Inh A.

59


Senyawa Visualisasi Ligplot Visualisasi Pymol

INH

Amida_11

Amida_9

60


Amida_2

Keterangan: C=hitam, O=Merah,

N=biru, ikatan hidrogen=garis hijau,

dan ikatan hidrofobik= garis merah

menyerupai alis

Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru,

H=putih, P=jingga

Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3

senyawa uji dengan ∆Gbind terendah)

Dilihat dari residu asam amino yang berinteraksi, isoniazid

berikatan hidrogen dengan Thr39 dan Gly14, sedangkan untuk yang

berikatan hidrofobik adalah dengan asam amino Ile22, Ser13, Gly40,

Ile95, Leu63, Phe41, Val65.

Selanjutnya pada 3 senyawa dengan ∆Gbind terendah. Amida_11

dan Amida_9 memilki jumlah residu asam amino yang sama yaitu 13

asam amino dan lebih banyak dari amida_2. Amida_11 berikatan

hidrogen dengan Gly96, dan berikatan hidrofobik dengan Thr39, Val65,

Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16.

Amida_9 berikatan hidrogen dengan Thr39, dan berikatan hidrofobik

dengan Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15,

Ile16, Phe41, Met130. Sedangkan pada Amida_2 hanya berikatan

dengan 8 asam amino, yaitu Thr39 dan Gly14 yang berikatan hidrogen,

serta Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 yang berikatan

hidrofobik.

61


Ikatan hidrogen merupakan ikatan antara atom H yang mempunyai

muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan

dan mempunyai sepasang oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Adanya

ikatan hidrogen dapat mempengaruhi sifat fisika kimia obat, sehingga

berperan penting terhadap aktivitas biologis obat.

Sedangkan ikatan hidrofobik adalah ikatan yang menggambungkan

daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar pada reseptor

biologis (Siswando, 2008). Oleh karena itu, ikatan hidrogen dan ikatan

hidrofobik mempengaruhi kestabilan konformasi yang terjadi antara

ligan dan makromolekul. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh

Eghdami, et al (2015) tentang target ikatan isoniazid dengan enzim Inh

A, menyatakan bahwa situs aktivitas enzim Inh A, dicirikan dengan

adanya 5 asam amino, yaitu G1y14, Thr39, Phe41, Leu63 and Ile95.

Berdasarkan hal tersebut, Senyawa dengan nilai ∆Gbind terendah yaitu

amida_11 telah tepat menambat pada binding pocket enzim Inh A untuk

memberikan aktivitas anti-tuberkulosis.

Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi

No. Struktur

Penambatan

molekuler HKSA

∆Gbind (Kcal/mol) MIC prediksi (μM)

1 Amida_11 -9.4 0.008

2 Amida_9 -8.4 8.249

3 Amida_2 -7.2 601.082

4 Amida_7 -7.1 8619.5

5 Amida_5 -6.9 4519.21

6 Amida_3 -6.7 3856.26

7 Amida_1 -6.6 3530.95

8 Amida_4 -6.6 2518.77

9 Amida_8 -6.5 18581.1

10 Amida_6 -6.4 7410.95

11 Amida_10 -6.1 4587.2

12 EPHS -6.1 292.434

62


Dari tabel 4.15 terlihat bahwa senyawa dengan kode amida_11

selain memiliki nilai ∆Gbind terendah (-9,4 Kcal/mol), juga memiliki

MIC prediksi terkecil yaitu 0,008 μM. Diketahui bahwa MIC Isoniazid

yang merupakan pengobatan lini pertama tuberkulosis adalah 0,03–0,06

μg/ml (Zhang et al, 2005), bila dikonversikan dalam satuan molar yaitu

membagi dengan berat molekulnya (137,14 g/mol) (Depkes, 1995),

maka didapat MIC isoniazid adalah 0,219-0,438 μM. Berdasarkan hal

tersebut, nilai MIC prediksi amida_11 memiliki aktivitas sekitar 100

kali lebih baik dari isoniazid.

Walaupun MIC prediksi amida_11 lebih kecil dari isoniazid, nilai

tersebut hanya didapat dari perhitungan aktivitas senyawa yang

dibandingkan dengan sifat fisika-kimianya, sehingga perlu dilakukan uji

selanjutnya, seperti uji in-vitro senyawa dengan kode amida_11 pada

Mycobacterium tuberculosis langsung. Karena tujuan dari penggunaan

model HKSA adalah proses awal dalam rancangan obat dalam usaha

mendapatkan suatu obat baru dengan aktivitas yang lebih besar,

keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil

mungkin dan kenyamanan yang lebih besar, dengan biaya yang lebih

ekonomis, waktu yang lebih singkat, dan dapat menekan faktor coba-

coba sekecil mungkin dalam sintesis kandidat senyawa uji, sehingga

jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

a. Hasil analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA) pendekatan

Hansch, deskriptor yang mempengaruhi aktivitas anti-tuberkulosis adalah

LogD, energi HOMO, energi LUMO, Randic Index, Harary Index, dan

Molar refractitvity. Dengan persamaan:

Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi

LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(Molar

Refractivity).

b. Hasil penambatan molekuler dan persamaan HKSA, senyawa dengan

kode amida_11 yaitu ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-

enamide) memiliki nilai ΔGbind terendah yaitu, -9,4 dengan MIC prediksi

0,008 μM.

5.2 Saran

Hasil data aktivitas anti-tuberkulosis (MIC) yang didapat merupakan nilai

prediksi yang dilihat dari sifat fisika-kimia senyawa dan penambatan

molekuler pada enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis. Sehingga

dibutuhkan pengujian lebih lanjut seperti uji in-vitro dan in-vivo terhadap

senyawa Amidasi EPMS dengan aktivitas anti-tuberkulosis terbaik.


DAFTAR PUSTAKA

Accelrys Enterprise Platform. (2005). Introduction to the Discovery Studio

Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc

Adelin, et al (2013). Penambatan molekuler kurkumin dan analognya pada enzim

Siklooksigenase-2. Jurnal Medika Veterinaria. Vol. 7, No. 1, Februari

2013

Barus, rosbiana. (2009). Amidasi Etil p-metoksisinamat yang diisolasi dari

Kencur (Kaempheria Galanga, Linn),USU Repository

Bultink, P., Winter, H. D., Langenaeker, W. dan Tollenaere, J. P., 2004,

Computational Medicinal Chemistry for Drug Discovery, Marcel Dekker,

Inc., New York

Chemaxon, (2014) Log P and Log D Calculation. ChemAxon docs.

https://docs.chemaxon.com/display/CALCPLUGS/LogP+and+logD+calcu

lations

Cohen et al. (2011). Effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme from

Mycobacterium tuberculosis in molecular docking simulations. BMC

Genomic. Ouro Preto, Brazil

Darmin Sumardjo. 2008. Pengantar Kimia. Jakarta: EGC.

Dash, Pritesh Ranjan , et al. (2014). In vivo cytotoxic and In vitro antibacterial

activities of Kaempferia galangal. Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry 2014; 3 (1): 172-177

DBM, Virupakshaiah, et al. In Silico Designing of Methicillin Antibiotic Analog

for The Treatment of Staphylococcus aureus. Journal of Advanced

Bioinformatics Applications and Research ISSN 0976-2604.Online ISSN

2278–6007 Vol 5, Issue1, 2014, pp33-36

De, et al (2011). Design, Synthesis, and Biological Evaluation of New Cinnamic

Derivatives as Antituberculosis Agents. Journal of medicinal chemistry.

France

DeLano, W. L., & Bromberg, S. (2004). PyMOL User's Guide. San Carlos,

California, U.S.A: DeLano Scientific LLC.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995), Farmakope Indonesia. Edisi

IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

65


Depkes RI. (2005). Pharmaceutical Care untuk Penyakit Tuberkulosis. Direktorat

Bina Farmasi Kominitas dan Klinik: Jakarta.

Depkes RI. (2011). Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis, Edisi 2

Cetakan Tahun 2011: Jakarta.

Eghdami, et al (2015). Investigation of Physicochemical Properties of Isoniazid

and its Target Protein-Ligand Docking. Biological Forum–An

International Journal 7(1): 1248-1255(2015).

Fatimah, Nur Fitri. (2008). Aplikasi Metode MLR dan PCR pada Analisis

Hubungan Kuantitatif Struktutr dan Aktivitas Antitoksoplasma Senyawa

Turunan Kuinolon Berdasarkan Deskriptor Teoritik. Jurusan Kimia

FMIPA UGM: Yogyakarta.

Fessenden, R. J., Fessenden, J. S. (1999), Kimia Organik, Jilid 1, Edisi ketiga,

Penerbit Erlangga, Jakarta.

Funkhouser, T. (2007). Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey,

U.S.A: Princeton University.

Goodman and Gilman. (2005). Dasar Farmakologi Terapi Edisi 10. Jakarta: EGC

Gusmita, W., Mustafa, D., & Emdeniz. (2013). Studi Toksisitas Nitro Anilin

Berdasarkan Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) Toksis

Amina Aromatik. Jurnal Kimia Unand (ISSN No. 2303-3401), Volume 2

Nomor 1, Maret 2011.

Guzman, et al, (2014). 2-Hydroxy-substituted cinnamic acids and acetanilides are

selective growth inhibitors of Mycobacterium tuberculosis. Med. Chem.

Commun., 2014, 5, 47.

Pranowo, Harno D. 2009. Peran Kimia Komputasi dalam Desain Molekul Obat.

Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada.

He, xin, et al. (2007). Inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl acyl

carrier protein reductase InhA by arylamides. Bioorg. Med. Chem. 15

(2007) 6649–6658.

Katritzky, A.R., Karelson, M., dan Lobanov, V.S., 1996, Quantum-Chemical

Descriptors in QSAR/QSPR Studies, J. Am. Chem. Soc. 96, 3, 1027 -1044.

66


Katzung, Bertram G. (2004) Farmakologi Dasar dan Klinik edisi 4. Alih bahasa :

Staf Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya.

Jakarta : EGC.

Kolyva, A.S., Karakousis, P.C. (2012). Old and New TB Drugs: Mechanisms of

Action and Resistance . USA: Johns Hopkins University Center for

Tuberculosis Research Baltimore, M.D.,

Kubinyi, H. (1993). QSAR: Hancsh Analysis and Related Approaches, VCH

Verlaggesellschaft, Wienhem.

Lakshmanan et al, (2011). Ethyl pmethoxycinnamate isolated from a traditional

anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of

Mycobacterium tuberculosis in vitro. Fitoterapia. In Press, Corrected

Proof.

Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP.

Nofriyanda. (2010). Analisis Molekuler Pada Proses Resistensi Mikrobakterium

tuberculosis terhadap Obat-Obat Anti Tuberkulosis. Bagian Pulmonologi

dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNAND dan RS.DR.M.DJAMIL

PADANG.

Patrick, G. (2001). Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific

Publisher.

Poeloengan, M, I. Komala and S.M. Noor ( 2007). Bahaya dan Penanganan

Tuberculosis.Lokakarya Nasional Zoonosis . Balai Penelitian Veteriner

Bogor.

Rifai, et al. (2014). Kajian HKSA Senyawa Turunan Deoksibenzoin terhadap

Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisis Regresi Multilinier. Indo. J.

Chem. Sci. 3 (3) (2014) Indonesian Journal of Chemical Science.

Robitzek, E. H. and I. J. Selikoff (1952). "Hydrazine derivatives of isonicotinic

acid (rimifon marsilid) in the treatment of active progressive caseous-

pneumonic tuberculosis; a preliminary report." Am Rev Tuberc 65(4):

402-428.

Siswandono, (2008). Kimia Medisinal edisi 2 cetakan 2 jilid 1. Surabaya:

Airlangga University Press.

67


Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T (2010). Genetic

variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast

DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet. Mol. Res., 9: 1957-

1973.

Todeschini et al.,(2009) Molecular descriptor for Cheminformatics. Volume I &

II. Wiley-VCH

Umar, et al. (2011) Phytochemistry and medicinal properties of Kaempferia

galanga L. (Zingiberaceae) extracts African Journal of Pharmacy and

Pharmacology Vol. 5(14), pp. 1638-1647, 15 October, 2011.

WHO,2015, Health Topics Tuberculosis

http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/.

Yanuar, Arry. 2012. Penambatan molekular: Praktek dan Aplikasi Virtual

Screening. Depok: Fakultas Farmasi UI.

Zhang, Y.et al. ( 2005 ). Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium

tuberculosis. In Tuberculosis and the Tubercle Bacillus, 2nd edn, pp. 115–

140. Edited by S. T. Cole and others. Washington, DC: American Society

for Microbiology.

http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/


LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Penelitian

1.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktivitas Model Pendekatan Hansch

Pencarian literatur data anti-tb (MIC)

turunan asam sinamat beserta

strukturnya (Data sets)

Training sets Test sets

Pemilihan dan Perhitungan

deskriptor

Pemilihan dan

Perhitungan deskriptor

Membangun

persamaan HKSA

Validasi Persamaan

HKSA

Struktur senyawa

amidasi EPMS

Pemilihan dan

Perhitungan

deskriptor

Persamaan HKSA

Prediksi aktivitas anti-tb senyawa

amidasi Etil p-Metoksisinamat

69


1.2 Penambatan Molekul

v

Penyiapan struktur molekul enzim InhA, dengan

mengunduh struktur dari Bank Data Protein

(http://www.rcsb.org/pdb/).

Output berupa file 1ENY.pdb

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non

standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer.

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non

standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer.

Output berupa file 1ENY.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock Tools yang

meliputi : penambahan atom hidrogen dan

pengaturan grid box parameter.

Output berupa file 1ENY.pdbqt

Penyiapan struktur ligan. Ligan yang

digunakan adalah struktur senyawa

amidasi EPMS. Struktur 3D dibuat dengan

program MarvinSketch, simpan dalam

format .pdb

Output berupa file ligan.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock

Tools, yaitu pengaturan number of

active torsion.

Output berupa file ligan.pdbqt

Penambatan molekul dengan program autodock vina

Analisis hasil pada nilai log.txt dan visualisasi hasil pada out.pdbqt dengan program Pymol serta

Ligplot

Output berupa nilai:

1. Pose: Posisi dan Orientasi Ligan terhadap Asam Amino Protein

2. ΔGbind

70


Lampiran 2 Prosedur Kerja HKSA

2.1 Pembuatan struktur pada marvin sketch

Setelah struktur dibuat, kemudian dilakukan clean 3D dengan cara: pilih

structureclaening methodfine with HydrogenizeClean in 3D

2.2 Perhitungan deskriptor Log D

Proses perhitungan dengan pilih toolspartitioningLogDklik kiri. Akan didapat hasil

seperti gambar diatas, kemudian pilih nilai Log D pada pH 7,4

2.3 perhitungan deskriptor Harary dan Randic index

Pilih toolsGeometryTopology Analysisklik kiriOk. Akan muncul hasil nilai

Randic dan Harary index (lingkaran merah) seperti pada gambar diatas

71


2.4 Pembuatan struktur pada Hyperchem

Struktur yang telah dibuat kemudian ditambahkan atom hidrogen dengan cara:

buildadd H & model buildklik kiri

2.5 Optimasi struktur pada Hyperchem

optimasi dengan cara pilih setupsemiempiricalklik kirikemudian pilih AM1Ok

2.6 Perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO

Pilih computeGeometry Optimizationklik kiriPilih pada semiempirical

optimization “Polak Ribere” Ok

72


Setelah optimasi selesai pilih computeOrbitalsklik kiripilih energi HOMO

dan LUMO

2.7 Perhitungan deskriptor momen dipole

Pilih computesingle pointproperties akan didapat tampilan diataspilih momen

dipoleok

2.8 Perhitungan deskriptor Molar refractivity

Pilih computeQSAR propertiesPilih RefractivityComputeAkan didapat

nilai Molar refractivity

73


2.9 Rekapitulasi Data Deskriptor Training dan Test sets pada Microsoft excel

2.10 Membangun persamaan HKSA

Setelah semua data training set telah di input ke dalam program SPSS, kemudian pilih

analyzeRegressionLinierakan muncul tampilan pada gambar disamping.

Masukkan data dependent variabel: Log(1/MIC) dan Independent variabel:7 data

deskriptorganti method: BackwardOk

74


2.11 Hasil Validasi HKSA pada SPSS

Variables Entered/Removedb

Model

Variables

Entered Variables Removed Method

1 Molar_Refractivit

y, MomenDipole,

LogD, E_LUMO,

E_HOMO,

Harary_Index,

Randix_Indexa

. Enter

2 . MomenDipole

Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=

.100).

3 . Harary_Index

Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=

.100).

a. Tolerance = .000 limits reached.

b. Dependent Variable: Log(1/MIC)

Model Summary

Model R R Square

Adjusted R

Square

Std. Error of the

Estimate

1 .994a .988 .908 .083051

2 .992b .985 .938 .067998

3 .988c .976 .937 .068409

a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD,

E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index

b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO,

E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index

c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO,

E_HOMO, Randix_Index

75


ANOVAd

Model Sum of Squares df Mean Square Fhitung Sig.

1 Regression .590 7 .084 12.218 .217a

Residual .007 1 .007

Total .597 8

2 Regression .588 6 .098 21.179 .046b


Total .597 8

3 Regression .583 5 .117 24.906 .012c


Total .597 8

a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD, E_LUMO, E_HOMO,

Harary_Index, Randix_Index

b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index,

Randix_Index

c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Randix_Index

d. Dependent Variable: Log(1/MIC)

Coefficientsa

Model

Unstandardized Coefficients

Standardized

Coefficients

t Sig. B Std. Error Beta

1 (Constant) -14.130 8.466 -1.669 .344

LogD .251 .094 1.278 2.677 .228

E_HOMO -.693 .955 -.535 -.726 .600

E_LUMO -3.027 .793 -.871 -3.817 .163

MomenDipole -.068 .116 -.320 -.584 .664

Harary_Index .044 .044 2.104 .992 .503

Randix_Index -1.364 .569 -18.640 -2.398 .252

Molar_Refractivity .294 .122 17.387 2.400 .251

76


2

(Constant) -18.700 2.637 -7.092 .019

LogD .298 .039 1.518 7.655 .017

E_HOMO -1.220 .253 -.943 -4.832 .040

E_LUMO -2.812 .575 -.809 -4.890 .039

Harary_Index .034 .034 1.637 1.018 .416

Randix_Index -1.106 .292 -15.108 -3.781 .063

Molar_Refractivity .243 .070 14.353 3.475 .074

3 (Constant) -19.106 2.622 -7.286 .005

LogD .302 .039 1.543 7.789 .004

E_HOMO -1.226 .254 -.947 -4.824 .017

E_LUMO -2.828 .578 -.814 -4.889 .016

Randix_Index -1.083 .293 -14.804 -3.693 .034

Molar_Refractivity 0.265 .067 15.681 3.978 .028

2.12 Nilai Ftabel

Nilai Ftabel model persamaan 1 (lingkaran merah), nilai Ftabel model persamaan 2

(lingkaran biru), dan nilai Ftabel model persamaan 3 (lingkaran hijau)

77


2.13 Perhitungan Log(1/MIC)prediksi dengan Microsoft Excel

Pada cell K3, ketik persamaan HKSA yang sudah tervalidasi (persamaan HKSA 2)

seperti pada lingkaran warna merahUbah deskriptor yang digunakan sesuai letak cell-

nyakemudian enterdrag kebawah cell K3 untuk melihat data Log(1/MIC)prediksi

senyawa lain

Lampiran 3. Prosedur Penambatan Molekuler

3.1 Penyiapan Makromolekul Enzim Inh

Enzim Inh A di unduh dari situs http://www.rcsb.org/pdb/, dengan kode 1ENY. Data

enzim yang di dunduh adalah dalam bentuk 3D dengan format .pdb.

http://www.rcsb.org/pdb/

78


3.2 Proses penghilangan molekul non standar pada Makromolekul

dengan Discovery studio

Pilih scriptselectionSelect water molecule dan Select ligandeletesave as

1ENY.pdb

3.3 Optimasi penambahan atom hidrogen pada makromolekul dengan

Autodock tools

Pilih

editHydrogenAddall

hydrogenOk

3.4 Optimasi Grid Box parameter makromolekul

Pilih GridMacromolecule

Choose pilih 1ENYselect

moleculeSave as

1ENY.pdbqt

79


Kemudian atur grid option sesuai pada gambar di

sampingpilih fileClose saving current

3.5 Konversi format ligan (sampel uji) menjadi .pdb dengan Open Babel

Pada ‘input format’ pilih ‘…’ kemudian dipilih ligan yang akan digunakan. Pada ‘output

format’, pilih ‘…’ kemudian pilih destinasi tempat menyimpan. Pastikan format dalam

bentuk .pdb. Klik ‘Convert’

3.6 Optimasi number of active torsion pada ligan dengan program Autodock

tools

pilih ligandinputopenpilih ligan yang akan dioptimasiTorsion treeSet number

of torsionpilih fewest atomsdismisssave as .pdbqt

80


3.7 Penambatan molekul dengan Autodock vina

Proses penambatan molekul dimulai dengan menyalin data ligan.pdbqt dan

makromolekul 1ENY.pdbqt yang telah di optimasi pada folder vina di Local Disc (C:).

Kemudian ditambah data config file (conf.txt) dengan notepad, pengaturan conf.txt sesuai

pengaturan gridbox parameter

3.8 Proses penambatan dengan menggunakan Command prompt

Masuk kedalam folder vina cd “C:\vina” enterketik: vina -–config conf.txt -–log

log.txtenter.

3.9 Hasil penambatan molekuler

Akan muncul file baru log.txt dan out.pdbqt. Log.txt merupakan hasil nilai ∆Gbind dan

out.pdbqt visualisasi hasil docking ligan dengan makromolekul

81


Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya

1. Isoniazid

Ligplot Pymol Nilai RMSD

2. Amida_11


3. Amida_9


82


4. Amida_2


5. Amida_7


6. Amida_5


83


7. Amida_3


8. Amida_1

Ligplot Pymol

9. Amida_4


84


10. Amida_8


11. Amida_6


12. Amida_10


85


13. EPHS


Keterangan: C=hitam, O=Merah,

N=biru, ikatan hidrogen=garis

hijau, dan ikatan hidrofobik=

garis merah menyerupai alis

Keterangan: C=hijau, O=merah,

N=biru, H=putih, P=jingga

Documents

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTUR- …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/29325/1/WAHIDIN... · Inh A enzyme. The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives