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Objectifs
1/ Comprendre le principe des statuts sanitaires, l es modalités d’obtention et de maintien d’animaux à statuts défin is
2/ Etablir les conséquences des infections et parasi toses en expérimentation
3/ Que faire en cas de contamination?
Qualité d’un mod èle animal en recherche
Génétique
Statut sanitaire
Environnement Nutrition
Réponse
Analyse
Pourquoi des contrôles sanitaires?
Pour des raisons • Réglementaires • Ethiques• Economiques• Scientifiques • Risques biologiques • D’échanges d’animaux et de matériel biologique
En élevage • Chez les producteurs d’animaux de laboratoire• Dans les élevages d’établissement d’expérimentation (grande densitéd’animaux, sensibilité des femelles gestantes et des jeunes)
En unité d’expérimentation• Pour caractériser les animaux
Validité scientifique des résultats des études Résultats fiables et reproductibles
• Pour protéger les expérimentateurs
Interférence avec les résultats exp érimentaux - Changements pathologiques, maladies cliniques, mortalité
- Contamination des produits biologiques
- Immunomodulation
- Modulation physiologique
- Interférence avec la reproduction
- Compétition entre microorganismes
Zoonoses Performances zootechniques
Interférences avec la recherche
Statut infectieux
Transferts d’animaux ou d’échantillons biologiques entre différents établissements
Organisme pathogène Flore commensale
Micro-organisme opportuniste- individu normal (portage sain)- individu fragilisé et/ou facteurs
favorisants
Malade Pas malade
• Germes zoonotiques (sécurité du manipulateur).
• Germes pathogènes majeurs (santé et bien-être des animaux).
• Germes pathogènes mineurs (biais expérimentaux, atteintes sévères d’animaux plus sensibles).
• Certains germes commensaux ou opportunistes.
Les différents statuts sanitaires
Animaux gnotobiotiques
Animaux dont la flore est parfaitement définie, connue et contrôlable.
Axéniques• Stériles.
• Nés par hystérectomie aseptique ou transfert d’embryon.
• Géniteurs : absence d’infections àtransmission verticale.
• Élevés dans un environnement totalement stérile sous isolateur.
Gnotoxéniques• Issus d’animaux axéniques.
• Ensemencement volontaire et dirigé.
• Flore entièrement déterminée.
• Élevés dans un environnement totalement stérile, sous isolateur.
• Peu fréquent, essentiellement utilisés en microbiologie fondamentale.
Les différents statuts sanitaires
Animaux agnotobiotiques
Animaux dont la flore est ou non connue au départ mais susceptible de varier.
Holoxénique = « conventionnel »• Flore non connue mais aucune maladie infectieuse apparente. • Librement exposé aux microorganismes du milieu. • Peuvent être porteurs sains de germes pathogènes, réservoirs de germes pathogènes pour une autre espèce (sauf pour l’homme).• Élevages de moyennes et grandes espèces.
Hétéroxénique = SPF, EOPS, IOPS, • Flore normale, non entièrement caractérisée, sans pathogène connu• Obtenus à partir d’animaux axéniques. • Elevés dans des conditions d’environnement et d’ hygiène contrôlées (barrières). • Suivi sanitaire régulier et attentif. • Souvent utilisé, fréquent dans les élevages qualifiés. • Statut arbitraire, défini par l’état des connaissances. • SOPF = statut SPF étendu à une liste d’agents opportunistes.
Les différents statuts sanitaires
Animaliers, chercheurs…
Arthropodes
Alimentation Échantillons biologiques
Eau Litière
Poussière
Contacts entre animaux
VECTEURS
Cages et équipement
Comment maintenir un statut sanitaire bien d éfini?
Personnel
• Limiter strictement l’accès
• Formation rigoureuse aux procédures mises en place dans le règlement intérieur de l’animalerie
• Vêtements dédiés et couvrant : blouse, combinaison, charlottes, surchaussures gants, masques…
• Hygiène des mains : nettoyage soigneux, gants (changés régulièrement), manipulation à la pince…
• Douche à eau / douche à air
• Quarantaine, organisation du travail (du plus propre au plus sale)
• Sensibilisation aux risques associés aux NAC (Nouveaux Animaux de Compagnie)
- Vecteur passif de pathogènes- Porteur sain d’opportunistes
(Staph. aureus par exemple)
Aliments et eau• Nourriture irradiée de 10 à 40 kGray sous double emballage ou nourriture autoclavée• Eau filtrée à 0,22µm, traitée par acidification (pH 2,3 maximum) et/ou chloration
Intrusion d ’animaux sauvages• Barrières anti-rongeurs• Barrières anti-insectes (lampes UV, pièges pour les rampants)• Etanchéité des cloisons, des raccords parois-sol et parois-plafond• Etanchéité des gaines de ventilation, des chemins de câblages électriques, des luminaires• Sécurisation des zones de stockage• Protéger les siphons
Génie climatique• Cascade de pressions et filtration de l’air
• Tout animal sorti d’une zone d’animalerie ne peut plus y entrer.
• Le statut sanitaire des animaux entrant doit être connu et interprété par une personne formée et compétente (bilan de moins de 3 mois et historique sur 18 mois, modalités d’hébergement et de contrôle). Un statut sanitaire satisfaisant n’est pas la preuve de l’absence de risque sanitaire.
• Vérification de l’état sanitaire des animaux entrant via une quarantaine active (réalisation d’un contrôle sanitaire) de 6 à 8 semaines et un test sanitaire direct ou via des sentinelles.
• Redérivation (transferts d’embryon ou FIV) ou césarienne aseptique (non efficace pour les agents traversant la barrière placentaire) des lignées entrantes.
Entrée d ’animaux de laboratoire
Entrée de matériel biologique • Contrôle des produits d’origine murine (cellules, sérums, liquides d’ascite) par PCR ou en MAP tests.
• Connaître si possible le statut sanitaire de l’animalerie de production.
• Traçabilité des produits injectés.
• Privilégier les productions in vitro .
Entrée de matériel • Nettoyage puis stérilisation par autoclavage du matériel (121°C, 20 min).
• Désinfection externe du matériel ne supportant pas l’autoclavage (peroxyde d’hydrogène gazeux, désinfectant à base de peroxyde d’hydrogène ou d’ammoniums quaternaires) .
Matériel biologique
Produits biologiques Lignées cellulairesCellules primaires Tissus Sang
Inoculations expérimentales Agents pathogènes OGM
MAP = mouse antibody production test Mise en évidence de virus et bactéries. Inoculation du produit biologique à tester sur souris non consanguines dans un isolateur. Durée 4 à 6 semaines. Autopsie et examens complémentaires (sérologie et bactériologie).
Biologie moléculaire Détecte tous les pathogènes murins en théorie. Intéressant pour le matériel biologique et les animaux immunodéficients.
Minimum requis :•••• A1Cadavres : incinérationObjets piquants, tranchants : DASRI * Autres déchets : DIB**•••• A2Ensemble des déchets : DASRI *•••• A3Ensemble des déchets : Décontamination avant leur sortie de l’établissement et élimination comme DASRI *Décontamination des effluents avant leur sortie de l’établissement
Elimination des d échets
Décontamination des locaux
2222
La marche en avant
Couloir « propre »Couloir « sale »
Laverie côtésale
Laverie côtépropre
Lavage
Box de stabulation
Box de stabulation
Box de stabulation
Box de stabulation
Box de stabulation
La laverie La zone d’élevage
Sas chimique/Autoclave
Autoclave/sas chimique (moins utilisé)
Règlement intérieur + procédures essentiel !
Les flux
Comment réalise t’on un contrôle sanitaire?1/ Les animaux utilisés Age des animaux Spécificités liées à l’âge :
- jeunes : parasitologie (charge parasitaire plus importante)- jeunes adultes : infections virales - reproducteurs : histoire sanitaire de la population
En règle générale : âgés d’au moins 10 semaines durée d’exposition au moins 4 ou 6 semaines.
Souches utilisées Souche très sensible pour UM hébergeant des animaux immuno-déficients pas d’avantages clairs à prendre des animaux de souches consanguines ou non ou des animaux hybrides F1.
Animaux Sentinelles:• spécifiquement dédiés aux contrôles sanitaires • représentatifs des animaux à contrôler • introduits directement à cette fin ou issus d’étude ou d’élevage. • statut sanitaire SPF ou SOPF • possibilité d’utiliser des souris immunodéficientes associées à des souris immunocompétentes
Comment réalise t’on un contrôle sanitaire?
2/ Nombre d’animaux que l’on doit tester : Taille de l’échantillon : formule de l’ILAR (Institute for Laboratory Animal Research)
Formule d’échantillonnage de l’ILARLog 0.05/Log N = taille de l’échantillonAvec N = % d’animaux non infectés.
0.05 = 95% d’indice de confiance
Conditions d’application : •Taille de la population de l’unité microbiologique >100 cages. • La prévalence de l’infection est la même dans les deux sexes et les différentes souches présentes. • Les animaux sont prélevés aléatoirement dans l’unité microbiologique. • L’infection est également répartie dans l’unité microbiologique (cages ouvertes).
Unité microbiologiqueEntité d’hébergement partageant un microbisme similaire y compris en cas de contamination.
Prévalence supposée (%)
Taille de l’échantillon à différents niveaux de confiance
95% 99% 99,9%
10 29 44 66
20 14 21 31
30 10 13 20
40 6 10 14
50 5 7 10
Référence :NRC (National Research Council). 1976. Long-term holding of laboratory rodents. ILAR News 19: L1-L25.
Comment réalise t’on un contrôle sanitaire?
3/ Gestion des cages sentinelles :
• réparties sur différents portoirs dans des endroits stratégiques.• exposées aux même manipulations et procédures d’hébergement que les cages du portoir • favoriser l’exposition :
- exposition indirecte (grande colonie d’animaux)cages placées en partie basse de portoir échange de «litière sale», de nourriture, de biberons….change effectué en dernier dans la piècepas de couvercle filtrant
- exposition directe (petite colonie d’animaux, pathogènes recherchés peu contagieux)
contact direct avec les autres animaux
Comment réalise t’on un contrôle sanitaire?
4/ Choix des laboratoires d’analyse :
Primordial :Interprétation par des spécialistesDialogue et conseil dans la conduite à tenir en cas de résultat positif / douteux
Points techniques pouvant interférer avec le résult at:Parasitologie
• Rapidité du prélèvement après la mort de l’animal (protozoaires flagellés intestinaux : peuvent mourir et disparaître très rapidement)• Utilisation d’une technique d’enrichissement appropriée (concentrer les œufs ou larves pour pouvoir les observer)
Bactériologie • Site de prélèvement• Rapidité du prélèvement après la mort de l’animal
en quelques heures après la mort : les bactéries d’origine intestinale et les bactéries de l’environ nement envahissent le cadavre• Mode de conservation jusqu’à l’analyse• Choix du milieu de culture (à large spectre ou sélectif)• Mode d’ensemencement (direct ou après enrichissement)• Mode d’incubation (aérobiose ou anaérobiose), température et durée d’incubation
Sérologie• Nombreuses évolutions techniques• Interprétation des résultats très importante
- notion de seuil- faux positifs, faux négatifs- réactions croisées : nécessité de tester le même
sérum avec deux ou trois méthodes différentes avant de pouvoir conclure
Cas ELISA MPV PCR fèces
1 + +
2 + -
3 - +
4 - -
Comment réalise t’on un contrôle sanitaire?
5/ Fréquence des contrôles
• du risque d’introduction d’agents pathogènes - Prévalence des agents pathogènes - Qualité de la barrière, de l’hébergement
• de leur influence sur la santé du personnel • de leur influence sur les recherches effectuées • des circonstances• des besoins
En général au moins quatre contrôles par an (1 tous les 3 mois)
Facteurs de risque d’introduction d’agents
Risque élevé
Multipurpose units with various kinds of experimentsFrequent introduction of animals (> 16per month)Frequent entry of research personnel in addition to animal care staffFrequent change of personnel working in the unitIntroduction of animals from different breeding units (from one or several breeders)Introduction of biological materials (e.g. sera, tumours, tissues, (ES) cells) originating from the same animal species that are housed in the unitInfected animals on the site
Risque moyen Occasional introduction of animalsOne or few types of experimentsLong-term experiments (only occasional introduction of animals)‘All in–all out’ systemIntroduction of chemicals only, no biological materials
La liste proposée n’est pas une liste d’exclusion obligatoire. Elle définit un ensemble d’agents qu’il est recommandéde dépister. Elle est en perpétuelle évolution.
Il incombe à chaque laboratoire de définir sa limite de tolérance en matière d’interférences du statut sanitaire avec les programmes de recherche.
6/ Choix des agents pathogènes recherchés fonction :
On ne trouve que ce que l’on cherche sur les animaux testés à un instant donné.
Liste d’agents contrôlés chez le Jackson laboratory :
Microorganismes pathogènes qui peuvent infecter la sou ris. CAR bacillusCitrobacter rodentium (Citrobacter freundii 4280)Clostridium piliformeEctoparasitesEctromelia virusEncephalitozoon cuniculiEDIM virusHantavirus (ni les souris sauvages ni les souris domestiques ne sont des hôtes naturels pour les hantavirus, mais contrôlé car c’est une zoonose) HelminthesK virusLactic dehydrogenase elevating virus Lymphocytic choriomeningitis virus Minute virus of miceMouse adenovirusMouse cytomegalvirusMouse hepatitis virus Mouse parvovirusMouse thymic virus Mycoplasma arthridisMycoplasma pulmonisPneumonia virus of micePolyoma virus Reovirus type 3Salmonella spSendai virus Streptobacillus moniliformisTheiler’s mouse encephalomyelitis virus + agents zoonotiques
Agents opportunistes Bordetella bronchiseptica, Pneumocystis carinii (recherché seulement des souris sévèrement immunodéficientes), Corynebacterium kutscheri, Pseudmonas sp, Helicobacter sp, Staphylococcus aureus, Klebsiellapneumoniae, Streptococcus sp, Murine norovirus, protozoaire opportuniste (Giardia, Spironucleus), Pasteurella pneumotropica
Agents non pathogènes (issus de la flore normale)Klebsiella sp autre que Klebsiella pneumoniae, protozoaire non pathogène (Trichomonads)
Liste d’agents contrôlés chez le Jackson laboratory :
Prévalence des virus chez le rat de labo Prévalence des virus chez la souris de labo
KR Pritchett-Corning et al Lab Anim 2009
D’après
Prévalence des bactéries chez le rat Prévalence des bactéries chez la souris
KR pritchett-Corning et al Lab Anim 2009
D’après
Prévalence des parasites chez le rat de labo Prévalence des parasites chez la souris de labo
KR pritchett-Corning et al Lab Anim 2009
D’après
Exemple d’agents pathogènes murins à rechercher
Dans quels cas, a-t-on à lire et interpréter un bila n sanitaire ?
1) Avant de faire rentrer des animaux dans son animalerie, on doit lire et interpréter un bilan sanitaire de l’animalerie de provenance de ces animaux (contrôle de statut).
2) Lorsque l’on fait un contrôle de routine dans son animalerie, on doit lire et interpréter le bilan sanitaire des résultats.
3) Lors d’un contrôle diagnostic en cas de problème sanitaire dans son animalerie (en cas de mortalité, signes cliniques anormaux, baisse de fécondité), il faudra lire et interpréter le bilan sanitaire des résultats obtenus lors du contrôle sanitaire de ces animaux...
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Que doit-on trouver dans un bilan sanitaire ?
Que doit-on trouver dans un bilan sanitaire ?
D'après les recommandations FELASA, les 8 éléments essentiels que l'on doit retrouver sont :
• Les informations concernant l'animalerie d'origine avec le nom de l'animalerie, l'espèce concernée, le nom de la lignée, le mode d'hébergement, la date d'édition du bilan.• Liste des micro-organismes testés.• La fréquence de réalisation des tests.• La date du dernier contrôle.• Les résultats obtenus (en indiquant nombre de positifs sur nombre d'animaux testés).• Le nom du laboratoire de diagnostics.• La méthode de détection utilisée.• L'historique sur les 18 derniers mois des résultats des différentes pièces de l'animalerie ou les 6 derniers contrôles sanitaires.
Quelles questions se poser en lisant un bilan sanit aire ?
• Connaître la provenance des animaux : pays, région, animalerie (ai-je entendu dernièrement parler d'une épidémie, d'une contamination dans cette région, cette animalerie?)
• S'assurer que l'on parle bien des mêmes animaux (nom de la lignée correspond-elle à celle que j'attends).
• Vérifier la date d'édition pour s'assurer que j'ai bien la version la plus récente.
• Connaître le confinement des animaux : classe OGM voire agents infectieux (A1, A2 ou A3).
• Est-ce un fournisseur occasionnel ou régulier ?
•Tous les micro-organismes que je ne souhaite pas introduire chez moi, sont ils listés ? Ai-je bien tous les types de micro-organismes listés (exemple: les bilans sanitaires américains ne comportent souvent pas de bactériologie)
Quelles questions se poser en lisant un bilan sanit aire ?
• Les micro-organismes sont-ils recherchés régulièrement, autrement dit, y a t’il un suivi sanitaire réellement instauré de l'animalerie ?
• A quand remonte le dernier contrôle ? Inférieur ou supérieur à 3 mois, 6 mois?
• Quels sont les micro-organismes trouvés ? Quelle est la proportion d’animaux positifs sur ceux testés ? Combien d’animaux sont testés ?
• Est ce un laboratoire d’analyses sanitaires connu ? Est-il spécialisé dans les analyses de rongeurs ? A-t-il des certifications (type ISO par exemple)?
• Est-ce une technique courante pour la recherche de ce micro-organisme ? Est-elle pertinente ?
• Y’a t’il eu des micro-organismes trouvés lors des précédents contrôles ? Combien d’animaux ont été testés ? Y-a-t-il eu un plan d’action pour les éradiquer ?
Quelle attitude adopter en cas d’agent infectieux d étecté ?
Lors d’un contrôle sanitaire de routine, mise en éviden ce d’un agent infectieux non désiré :
• Informer les expérimentateurs• Dialoguer avec le laboratoire d’analyse• Retester la zone : plus d’animaux, autre technique, autre laboratoire si possible• Si c’est vraiment positif, évaluer l’importance de la contamination, plusieurs unités microbiologiques sont-elles touchées? , identifier l’origine et les voies de dissémination• Stopper tout flux d’animaux et euthanasier tous les animaux des zones concernées• Informer le personnel afin de limiter la dissémination, pour le protéger• Informer la médecine de prévention si nécessaire (en cas de zoonose par exemple)
Quelle attitude adopter en cas d’agent infectieux d étecté ?
Méthodes d ’éradication
• Redérivation
• Arrêt de l’élevage
• Traitement antibiotique
• Vaccination
Animalerie « contaminée »Souris gestantes infectéesHystérectomie aseptique (ou transfert d’embryons)
IsolateurSouris nourrices (ou receveuses d’embryons) avec un statut sanitaire défini
La prévention restant la solution la plus efficace et la plus économique!
Traitement antiparasitaire
Pour en savoir plus Pour en savoir plus
http://http://www.felasa.euwww.felasa.eu//recommendations.htmrecommendations.htmhttp://www2.vethttp://www2.vet--
lyon.fr/lyon.fr/ensens//expaexpa/guidelines//guidelines/microbio_statuts.htmmicrobio_statuts.htmhttp://http://www.jax.orgwww.jax.org//http://http://www.criver.comwww.criver.com//enen--
USUS//ProdServProdServ//ByTypeByType//ResAnimalDiagResAnimalDiag/Pages//Pages/InfectiousDiseInfectiousDiseaseTechnicalInformation.aspxaseTechnicalInformation.aspx
http://http://www.lal.org.ukwww.lal.org.uk//pdffilespdffiles/LAfel2.PDF/LAfel2.PDFhttp://http://www.radil.missouri.eduwww.radil.missouri.edu/info/dora//info/dora/Dora.htmDora.htm
http://http://www.gvwww.gv--solas.desolas.de//aussauss//hyghyg//index_e.htmlindex_e.htmlhttp://http://www.ram.cnrs.frwww.ram.cnrs.fr
Pour en savoir plus
- Recommendations of the Federation of European Labo ratory Animal Science Associations (FELASA) Working Group on Non-Human Pr imate Health accepted by the FELASA Board of Management, 21 Nove mbre 1998FELASA Working Group on Non-Human Primate Health: H. Weber (Convenor), E. Berge, J. Finch, P. Heidt, F.-J. Kaup, G. Perret ta, B. Verschuere& S. WolfensohnLaboratory Animals Ltd. LaboratoryAnimals(1999) 33 (Suppl. 1), S1:3-S1:18
- Recommendations of the Federation of European Labo ratory Animal Science Associations (FELASA) Working Group on Health Monit oring of Rodent and Rabbit Colonies accepted by the FELASA Board of Man agement, 9 June 2001FELASA Working Group on Health Monitoring of Rodent an d RabbitColonies: W. Nicklas (Convenor), P. Baneux, R. Boot, T. Decell e, A. A. Deeny, M. Fumanelli & B. Illgen-WilckeLaboratory Animals Ltd. Laboratory Animals(2002) 36, 20-42
- Report of the Federation of European Laboratory An imal Science Association (FELASA) Working Group on Animal HealthFELASA Working Group on Animal Health: C. Rehbinder( Scand-LAS), Convener; P. Bagneux (SFEA); D. Forbes (LASA); H. v an Herck(NPV); W. Nicklas(GV-SOLAS); Z. Rugaya(Balt-LASA); G. Winckle r(SGV)Laboratory Animals(1998) 32, 1-17
20 octobre 2011
En vous remerciant
pour votre attention
