3

ตรวจเอกสาร

เชื้อ Staphylococcus aureus ลักษณะและคุณสมบัติของเชื้อ Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus เปนแบคทีเรียแกรมบวก มีรูปรางกลม มักพบเปนคูเกาะกันดวยสายส้ันๆ เปนกิ่งหรือเปนลักษณะพวงองุน (spherical shape) สามารถเจริญไดในสภาวะทีไ่มมีอากาศและมีอากาศ (facultative anaerobes) อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 15 – 45 องศาเซลเซียส และเจริญไดในระดับความเขมขนของเกลือสูงถึง 15 เปอรเซ็นต เปนสาเหตุของการเกิดโรคตางๆ เชนการติดเชื้อบริเวณเนื้อเยื่อ และโรคอาหารเปนพิษ (Todar, 2005) มีการสรางเม็ดสี (pigment) เหลืองในโคโลนี (Rosenbach, 1884)

S. aureus จดัอยูใน Family Micrococcaceae เปนแบคทีเรียรูปรางกลม ติดสีแกรมบวก

สรางเอนไซมคาตาเลส (catalase) ใชกลูโคสไดทั้งในสภาพที่มีอากาศและไรอากาศ เซลลเรียงตัวเปนกลุมทําใหดูเหมือนพวงองุน บางครั้งอยูเปนคูหรือเปนสาย โคโลนีมีสีเหลืองทอง แตบางครั้งอาจพบเปนสคีรีมได โดยเฉพาะเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อหลายๆ คร้ัง สีเกิดจากสารประกอบพวกคาโรตีนอยด (carotenoid) แตการเกดิสีบนโคโลนีมคีวามแตกตางกันสูงมาก สวนใหญจําแนกเชื้อ S. aureus จากเชื้อชนดิอื่นๆ ของ Staphylococcus โดยใชความสามารถในการทําใหพลาสมาแข็งตัวเนื่องจากการสรางเอนไซมโคแอคกูเลส (coagulase) (Davis et al. 1980; Easmon and Goodfellow, 1990)

S. aureus มียีนทั้งหมดประมาณ 2,600 ยีน และมีดีเอน็เอทั้งหมดในโครโมโซม 2.8 ลาน

เบสแพร S. aureus แบงออกเปน 2 ชนิดคือ S. aureus aureus และ S. aureus anaerobius (Ryan and Ray, 2004)

S. aureus สามารถสรางสารหรือโครงสรางที่มีคุณสมบัติเปนแอนติเจนตางๆไดแก (Davis et al. 1980)

1. แคปซูล (Capsule) เปนโครงสรางที่หุมอยูช้ันนอกสุดของเซลล การสรางแคปซูลจะพบในสายพันธุที่มีความรุนแรงในการทําใหเกิดโรค เช้ือ S. aureus สามารถสรางแคปซูลเมื่ออยูในส่ิงมีชีวิต และอาจสูญเสียการสรางไปเมื่อเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ สายพันธุที่สรางแคปซูลได

4

นั้นไมสามารถใชวิธีการจัดจําแนกดวย phage (phage typable) และไมสามารถสรางเอ็นไซมโคแอคกูเลสชนิดติดกับเซลล (Clumping Factor)

2. กรดไทโคอิก (Teichoic acid) เปนสารประกอบคารโบไฮเดรตที่มีฟอสเฟตชนิดจําเพาะกับสายพันธุ (species – specific carbohydrate antigens) เชื้อชนิดที่สรางแอนติเจนนี้ ไดแก S. aureus ที่มี polysaccharide A และ S. epidermidis ที่มี polysaccharide B

3. โปรตีนเอ (Protein A) เปนโปรตีนอยูทีผ่นังเซลลโดยเชื่อมติดกับผนงัเซลลช้ันเปปติโดไกลแคน (peptidoglycan) (Murray et al. 1990)

4. เอนไซมโคแอคกูเลสชนิดตดิกับเซลล อาจเรียกวา clumping factor สรางโดย S. aureus สายพันธุที่ไมสรางแคปซูล โดยจะเกาะกนัเมื่ออยูในพลาสมา (plasma) ที่มีสารไฟบริโนเจน (fibrinogen) อยูดวย เชื่อกนัวาเอนไซมโคแอคกูเลสชนิดติดกับเซลลนี้เปนสวนของผิวเซลลซ่ึงทําปฏิกิริยากับ ∝ และ β chain ของไฟบริโนเจน ทําใหเกิดการเชื่อมตอกันแบบไขว (cross linking)

Staphylococcus aureus ในสิ่งแวดลอม มักพบเชื้อ staphylococcus ในคนและสัตวเลือดอุนชนดิอื่นๆ โดยเฉพาะในคนที่มีผิวหนัง

ผิดปกติ เชน เปนฝ แผลผาตัด แผลอักเสบ เปนตน เชื้อนีย้ังแยกไดจากสัตวเล้ียง เชน สุนัข เปด ไก โค กระบือ สุกร หาน และในอาหารสัตว S. aureus กอใหเกดิโรค mastitis ในสัตว โดยเฉพาะโค กระบือ แพะและแกะ S. aureus (Alberton et al. 2001) สายพันธุที่สรางเอ็นเตอโรท็อกซินที่พบในสัตวจะมนีอยกวาสายพันธุที่พบในคน

S. aureus มีความทนทานตอสภาพแวดลอมภายนอกไดดีมาก ทาํใหสามารถมีชีวิตอยู

ภายนอกรางกายสัตวไดดี มกักอใหเกดิน้ําเนาเสียแบบระยะยาว (Borrego et al. 1987) และสามารถพบเชื้อแพรกระจายอยูรอบสิ่งแวดลอมในโรงงานผลิตอาหาร เชน ในโรงงานบรรจุหีบหอสัตวปก (poultry packing plants) โดยเชื้อสามารถเกาะตดิอยูกบัเครื่องมือดึงขนและปนเปอนลงในสัตวปกขณะบรรจุหีบหอได (Mead and Adam, 1986; Bolton et al. 1988)

ความเกี่ยวของระหวาง Staphylococcus aureus กับคน มักพบวาคนเปนพาหะของ S. aureus ไดมากพอกับทีพ่บเชื้อในอาหาร ถาผูเปนพาหะจับ

ตองอาหารดวยมือ จะทําใหเชื้อปนเปอนลงไปและอาจกอใหเกดิอาการอาหารเปนพิษเมื่อบริโภคอาหารได (วันทนา, 2538)

5

S. aureus เปนเชื้อที่กอใหเกิดโรคที่สําคัญที่ผิวหนัง เชน ฝ การติดเชื้อของแผลผาตัด แผลอักเสบ เปนตน คนทีเ่ปนพาหะของเชื้อนี้ไมไดพบเฉพาะคนทีก่ําลังเปนโรคเนื่องจากตดิเชือ้นี้เทานั้น แตพบในคนที่มีสุขภาพดีดวย นอกจากนี้ S. aureus ยังพบตามสวนอื่นๆ ของรางกายไดอีก เชน ผิวหนัง ในจมกู คอ และผม บางครั้งพบในอุจจาระดวย จมูกเปนแหลงสําคัญที่ทําใหเกิดการปนเปอนในอาหารโดยพบในรูจมูกรอยละ 10 – 40 และพบในโพรงจมูกมีปริมาณเชื้อมากกวา 103 CFU/swab (Varnam and Evan, 1991) เมื่อ S. aureus เขาสูรางกายของ host S. aureus จะใชประโยชนจากโปรตีนเอ รวมกับโปรตีนอื่นๆ และ surface factors ในการชวยเหลือใหตัวมันมีชีวิตรอดจากระบบภูมิคุมกันภายในรางกาย ดวยเหตุนี้เชื้อจึงสามารถกอใหเกดิการอักเสบของเนื้อเยื่อได โปรตีนเอจะชวยยับยั้งการเขาจับกินของ phagocyte และแสดงการบิดเบอืนระบบภูมิคุมกัน ในการทดลอง S. aureus ที่กลายพันธุซ่ึงขาดโปรตีนเอ phagocyte จะสามารถจับกินเชื้อไดอยางมีประสิทธิภาพ และเชื้อจะกอใหเกดิโรคไดลดลง (Goodyear and Silverman, 2003) โปรตีนเอ โปรตีนเอของ S. aureus เปนสวนประกอบของผนงัเซลล ที่มีรายงานพบวามีน้าํหนักโมเลกุลประมาณ 42,000 ดาลตัน โปรตีนมีรูปรางเปน extended shape (Björk et al. 1972) และผลการวิเคราะหลําดับนิวคลีโอไทดพบวามี 2 region ในโมเลกุลที่ทราบหนาที่อยางชัดเจน โดยทางดาน NH2 – terminal มีน้ําหนักโมเลกุลเทากับ 27,000 ดาลตัน ประกอบดวย IgG – binding units ที่เหมือนกนั 4 ตําแหนง โดยมีน้ําหนกัโมเลกุลประมาณ 7,000 ดาลตัน ทางดาน COOH – terminal มีน้ําหนกัโมเลกุลประมาณ 15,000 ดาลตัน (Sjödahl, 1977b) ซ่ึงเปนตําแหนงที่เชื่อมสาย peptidoglycan ดวยพันธะโควาเลนท โดยไมมีสวนที่สามารถจับกับ IgG ได โปรตีนเอมีความสัมพันธกับ Fc fragment region ของ immunoglobulin จาก สัตวเล้ียงลูกดวยนม (Forsgren and Sjöquist, 1966) โปรตีนนี้สามารถนําไปพัฒนาปริมาณและคณุภาพเทคนิคทางอิมมูโนวิทยา (Goding, 1978)

โปรตีนเอเปนโปรตีนที่พบอยูบนผนังเซลลของ S. aureus มีคุณสมบตัิเปนแอนติเจนและสามารถตกตะกอนกับน้ําเหลืองของคนปกติได เดิมเรยีกวา แอนตเิจนเอ ตอมาพบวาแอนติเจนนี้เปนโปรตีน จงึเรียกวาโปรตีนเอ มีน้ําหนกัโมเลกุล ประมาณ 13,000 – 42,000 ดาลตัน S. aureus สามารถสรางโปรตีนเอแลวปลอยออกมานอกเซลล หรือเก็บไวที่ผนังเซลลก็ได ตามปกติมกัพบ

6

โปรตีนเอใน S. aureus สายพันธุที่กอใหเกิดโรคกับคน สําหรับสายพันธุที่กอโรคในโคและกระบือจะพบนอย (Easmon and Goodfellow, 1990)

โปรตีนเอเปนโปรตีนที่อยูบนผนังเซลล มีคุณสมบัติสามารถเกาะกับสวน Fc ของโมเลกุลแอนติบอดี (Fc receptor) ในรางกาย ทําใหแอนติบอดีทาํงานไมได และทําใหเกิดการกระตุนระบบคอมพลีเมนท (complement system) ซ่ึงกอใหเกิดการอักเสบตามมา Goodyear และ Silverman (2003) พบวา โปรตีนเอสามารถทําลาย B lymphocytes ไดอยางด ี ซ่ึงในปจจุบนัเชื่อกันวา B lymphocytes เปนหัวใจสําคัญของระบบภูมิคุมกันในการปองกันการเขาทําลายของเชื้อแบคทีเรียตางๆ

โปรตีนเอเปนโพลีเปปไทด ที่มีน้ําหนกัโมเลกุล 42 กิโลดาลตัน โดยจะจับกับสวน Fc ใน

โดเมนที่ CH2 และ CH3 ของ immunoglobulin heavy chains ซ่ึงจะมีความแตกตางดานความสามารถในการจับกับแอนติบอดีของโปรตีนในแตละชนิดของสัตวและ isotypes ที่แตกตางกันภายใน species เดยีวกัน โดยโปรตีนเอสามารถจับกับ IgG ที่ตําแหนง Fc ที่ไดจากสัตวหลายชนิด และในสัตวแตละชนิด โปรตีนเอจะมีความสามารถในการจับกับ IgG ในแตละ isotypes ที่ตางกัน ดังตารางที่ 1 (Richman et al. 1982)

Moks et al. (1986) ศึกษา staphylococcal protein A พบวาโปรตีนเอประกอบดวย 5 IgG –

binding domains และไดอธิบายถึงคุณสมบัติของ IgG – binding ในสวน N – terminal ของ staphylococcal protein A (region E)

การสรางโปรตีนเอทางชีวภาพจะเกิดขึ้นในระหวางระยะ exponential growth phase ของ S. aureus (Movitz, 1974) สวนมากของโปรตีนจะอยูในผนังเซลล แตในชวงระยะ stationary growth phase ของแบคทีเรีย บางสวนนาจะมีการปลอดปลอยเกิดขึ้นเนื่องจาก autolysis (Movitz, 1976) มีสายพนัธุของเชื้อ S. aureus ที่กลายพันธุบางชนิดที่โปรตีนเอไมสามารถเกาะกับผนังเซลลได ดังนั้นโปรตีนจะถูกพบในอาหารเลี้ยงเชื้อ ในการผลิตโปรตีนเอออกสูนอกเซลล นิยมใช สายพันธุที่ตานทานสารปฏิชีวนะเมทิซิลิน (methicillin - resistant Staphylococcus aureus : MRSA) (Winblad and Ericson, 1973)

7

โปรตีนเอทนความรอนไดสูงมาก สามารถสกัดออกมาจากเซลลโดยการตมเชื้อใน phosphate buffer pH 5.9 ใหเดือดเปนเวลา 1 ช่ัวโมง (Forsgren and Sjöquist, 1969) หรือสามารถสกัดออกมาโดยตมเชื้อที่อยูในอาหารใหเดือดเปนเวลา 15 นาที (Archibald, 1972) โปรตีนเอทําใหเกิดปฏกิิริยาการจับกลุมของ S. aureus ทุกสายพันธุในน้ําเหลืองของคนปกติ ในกรณนีี้เปนเพราะโปรตีนเอจับกบัสวน Fc ของ IgG ในน้ําเหลืองแบบไมจําเพาะ โปรตีนเอทําปฏิกิริยาแบบนี้กับ IgG ของหนูตะเภาและ IgG ของหนูเมาส (mouse) แตเกดิปฏิกริิยาเล็กนอยกับ IgG ของกระตาย ในน้ําเหลืองของคนโปรตีนเอจะเกาะติดกบับาง subclass ของ IgG คือ IgG1, IgG2, และ IgG4 (Lindmark et al. 1983) โปรตีนเอ ทําใหเกิดผลทางชวีภาพหลายประการ เชน เกิดภาวะภูมไิวเกนิแบบ anaphylaxis ทําใหเกิดโรคหรือพยาธิสภาพตอเนื้อเยื่อแบบเฉพาะที่และทั่วรางกายในสัตว เกิดตุมคลายยุงกัดหรือลมพิษ (wheal) และเกดิขอบแดงรอบๆ เนื่องจากเกดิ erythema (flare) เกิดภาวะภูมไิวเกนิที่มีเลือดและการเนาตายของเนื้อเยื่อ (Arthus reaction) ซ่ึงความรุนแรงขึน้อยูกับปริมาณของแอนตเิจน กระตุน complement ทั้งระบบ altermate และ classic ทําใหเกิด chemotactic factor ซ่ึงมีผลทําใหเกิดการอกัเสบ และการทําลายของเนื้อเยื่อขางเคียง ยับยั้งการจับของแอนติบอดี เนื่องจากโปรตีนเอไปแยงจับกับสวน Fc receptor ของเม็ดเลือดขาว เหนี่ยวนําใหมกีารปลอยสารฮีสตามีน จากเม็ดเลือดขาว และกระตุนใหมกีารเพิ่มปริมาณ บี ลิมโฟซัยท (B lymphocyte) ในคน

เมื่อศึกษาดวยกลองจุลทรรศนอิเล็กตรอนจะพบวา โปรตีนเอมีคุณสมบัติตอตาน

phagocytosis ปริมาณโปรตีนเอจาก S. aureus สายพันธุที่มาจากคนมกีารสรางมากหรือนอยแตกตางหันไป นอกจากนี้ยังพบวา S. aureus สายพันธุที่ทําใหโคเปน mastitis แบบเฉียบพลันจะสรางโปรตีนเอมากกวาสายพันธุที่ทําใหโคเปน mastitis แบบเรื้อรัง

Forsgren (1970) ศึกษาการสรางโปรตีนเอและ deoxyribonuclease (DNAse) จาก S. aureus

พบวาสายพนัธุที่สรางเอนไซมโคแอคกูเลส จํานวน 700 สายพันธุ สามารถสราง DNAse ไดทุกสายพันธุ โดยมเีพียง 8 สายพนัธุเทานั้นที่ไมสรางโปรตีนเอชนิดปลอยออกมานอกเซลล Aasen และ Oeding (1971) ศึกษาการสรางโปรตีนเอของ S. aureus จํานวน 48 สายพันธุ ดวยวิธี double diffusion agar ไมพบสายพันธุใดที่สรางโปรตีนเอ

8

โปรตีนเอ จากเชื้อ S. aureus เปนโมเลกุลขนาดใหญที่มีประโยชน มีขอสมมุติฐานวาโปรตีนเอจะทาํใหเชื้อ S. aureus มีความรุนแรงขึ้น (Forsgren, 1972; Forsgren et al. 1976; Mudd, 1971) และเปนสารที่สําคัญสําหรับการจําแนกผลิตภณัฑดวยวิธีการตกตะกอนทางอิมมูโนวิทยา ในปจจุบันโปรตนีเอถูกใชในการตรวจสอบมะเร็งและโรคตางๆ (Bansal et al. 1978) มีการศึกษาการทํางานในดานการวิเคราะหทางดานชีวภาพและดานเคมขีองโปรตีนเอออกมามากมาย แตทราบถึงขอมูลดานพันธุศาสตรเพยีงเล็กนอย แตมีรายงานจาก Sven et al. (1983) เปนครั้งแรกที่อธิบายถึงการแยกยนีโปรตีนเอและลักษณะของยีน

โปรตีนเอไดถูกนํามาใชเปนตัวบงชี้ในการติดเชื้อ S. aureus ในคน โดยวิธี latex

agglutination (Larsson และ Sjöquist, 1989) และการตรวจหา S. aureus สายพันธุทีส่รางโปรตีนเอในอาหาร (Fey and Burkhard, 1981; Mirhabibollahi et al. 1990; Brook et al. 1990; Brook et al. 1991)

การโคลนยีนในแบคทีเรีย เทคนิคทางพนัธุวิศวกรรมเปนกระบวนการที่ทําใหเกดิการเปลี่ยนแปลงของสารพันธุกรรมในสิ่งมีชีวิต เพื่อใหไดส่ิงมีชีวิตใหมที่มีคณุสมบัติตามทีป่ระสงค โดยอาศัยวิธีการที่สามารถทําใหเกิดขึ้นตามขัน้ตอนที่วางแผนไวได (สกล, 2529) การโคลนยีนเปนเทคนิคที่สําคัญอยางหนึ่งสําหรับงานทางพันธุวศิวกรรม หมายถึง การแยกยีนใดยีนหนึ่งที่สนใจนาํมาเพิ่มปริมาณใหไดมากเทาที่ตองการ เพื่อใชในการศึกษาหรือใชสําหรับถายยีน (อรพิน, 2531; นิตยศรี, 2533; สุรินทร, 2536) การโคลนยีนในแบคทีเรียนิยมกันมาก เพราะเปนเซลลที่เล้ียงงายและเจริญเติบโตอยางรวดเร็ว ทําใหไดดีเอ็นเอหรอือารเอ็นเอและโปรตีนปริมาณมากในเวลาอันรวดเรว็ (Lewin, 1994) จะเห็นวาในการศึกษากลไกของเซลล การศึกษายนี และการถายฝากยีนโดยอาศัยเทคนิคทางพนัธุวิศวกรรมจะตองใชวิธีการโคลนยีนรวมดวยเสมอ ดังนั้นการโคลนยีนจึงมีความสําคัญและจําเปนมาก (อรพิน, 2531; นิตยศรี, 2533; สุรินทร, 2536)

โปรตีนเอจะถกูโคลนขึ้นภายใน Escherichia coli สําหรับใชในงานดานอิมมูโนวิทยา และงานวิจยัอ่ืนๆ ทางดานชีววิทยา โปรตีนเอมักจะคูกับโมเลกุลอ่ืนๆ เชน fluorescent dye, enzyme markers, biotin, colloidal gold หรือ radioactive iodine ที่ไมมี antibody binding site และยังใชคูกับ

9

magnetic, latex and sepharose beads โปรตีนเอมักถูกใชในวิธีการเตรียมแอนติบอดีบริสุทธิ์ จาก สารผสม crude protein เชน serum, ascites fluid หรือใชในการตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีน (Goodyear and Silverman, 2003)

Duggleby และ Jones (1983) ศึกษาการโคลนการแสดงออกของยีนโปรตีนเอของ S. aureus

ใน E. coli HB 101 และใช pBR 327 เปนพลาสมิดพาหะ การแสดงออกของยนี Staphylococal protein A (SPA) สายผสม จะถูกตรวจสอบโดยใชวิธีการ IgG – binding assay ในการสังเคราะห SPA ใน E. coli พบวาชิน้สวนดเีอ็นเอที่ไดมีขนาด 3.2 Kb จากการตรวจสอบดวยวิธี Western bloting และ double diffusion test พบวา สารสกัดจากสายพันธุ Cowan I ใหแถบหลัก 1 แถบ น้ําหนกัโมเลกลุประมาณ 54,000 ดาลตัน การตรวจสอบดวยวิธี SDS – PAGE ของ 35S – methionine pulse – labeled lysates ของ minicells พบสายโพลีเปปไทดตรงกับβ - lactamase (น้ําหนักโมเลกุล 32,000 ดาลตัน) ในสายพันธุที่มีพลาสมิดอยู ของ E. coli ยกเวนสายพนัธุ DS410/SPA – 3 ซ่ึงชิ้นสวนยีน S. aureus ถูกใสเขาไปในตําแหนง PstI ใน β - lactamase gene สายโพลีเปปไทดสายหลักซึง่เกาะกับ IgG – Sepharose จาก pulse – labeled lysate ของ S. aureus Cowan I ปรากฏสายโพลีเปปไทดที่มีน้ําหนักโมเลกุล 45,000 ดาลตัน

Löfdahl et al. (1983) ศึกษายีนของ SPA จาก S. aureus สายพันธุ 8325 – 4 ถูกโคลนดวย

pBR322 ใน E. coli เมื่อนําวิธีการทางอิมมูโนวิทยามาใชในการตรวจสอบการผลิตโปรตีนเอ โปรตีนเอถูกโคลนขึ้นภายใน E. coli พบวาโปรตีนเอจะอยูในสวน periplasmic space การใช IgG – Sepharose affinity chromatography ทําใหไดโปรตีนเอที่บริสุทธิ์และมีความเขมขนสูง โปรตีนเอประกอบไปดวย region S ซ่ึงเปนตําแหนง signal มีลักษณะเหมือน signal ของ prokaryote ทั่ว ๆ ไป, มี 4 IgG – binding domain คือ region D, A, B และ C ตามลําดับ (Sjödahl, 1977a) และ region x ทําหนาที่ในการเกาะกับผนงัเซลล จากการวิเคราะหหาลําดับนิวคลีโอไทดของ SPA จากตําแหนง HindIII จาก upstream และตาํแหนง map 1.4 kb พบวามขีนาดเทากับ 558 เบสแพร ลําดับกรดอะมิโน 186 เรสิดิวส ซ่ึงแตกตางจากลําดับกรดอะมิโนที่มีการรายงาน (Sjödahl, 1977b) (ภาพที่ 2) โดยกรดอะมิโน 3 เรสิดิวส (ตัวที่ 99, 101, 120) ไดเปลี่ยนไป และพบ region ลําดับที่ 5 (region E) ทางดาน upstream ของยีน โดยลําดับกรดอะมิโนของ region E แตกตางจาก region D 8 เรสิดิวส ใน ลําดับกรดอะมิโน 50 เรสิดิวส

10

Moks et al. (1986) ไดอธิบายถึงคุณสมบัติของ IgG – binding ทางดาน N – terminal ของ SPA (region E) โดยศึกษาชิ้นยีน region E และ region B ในโปรตีนเอ ซ่ึงถูกโคลนและแสดงออกใน E. coli ยนีผลิตภัณฑจะถูกทําใหบริสุทธิ์ดวยวิธี IgG – affinity chromatography และนําไปวิเคราะหโครงสรางและหนาที่ของยีน ช้ินสวนยนีทั้งสองมีประสิทธิภาพดีในการทํา IgG – affinity chromatography แต region B มีประสิทธิภาพที่ดกีวา region E ดานความสามารถในการเกาะกับ Fc ( Fc – binding activity) นอกจากนัน้ทําการรวม 2 region เปนยนีฟวช่ันได ช้ินยนี EB และ EE ความสามารถในการเกาะกบั IgG – Sepharose โดยเรยีงจากประสิทธิภาพดีถึงแยทีสุ่ด ดังนี้ SPA > EB > EE > B > E ผลการวิเคราะหลําดับนิวคลีโอไทดของยีนพบ ตําแหนง IgG – binding region ที่ 5, region E ที่มีลักษณะคลายกับ region D, A, B และ C (Uhlén et al. 1984) ดังนัน้ โปรตีนเอจึงมี IgG – binding domains 5 ตําแหนง ซ่ึงประกอบดวย region E, D, A, B และ C ตามลําดับ นํามาเปรียบเทียบลําดับกรดอะมิโน (ภาพที่ 2) พบวา region A, B และ C มีความคลายคลึงกันมากและไมมีการเปลี่ยนแปลงลําดับกรดอะมิโนในสวน 2 α helices แต region D มีการเปลี่ยนกรดอะมิโน 3 เรสิดิวส และเตมิกรดอะมิโน 3 เรสิดิวส (Ala – Gln – Gln) หลังกรดอะมิโนตัวที ่2 ลําดับกรดอะมิโน 6 ตัวแรกของ region E แตกตางไปจาก region อ่ืน และไมมีกรดอะมิโน 2 เรสิดิวสแรก

ภาพที่ 1 ลําดับกรดอะมิโนของโปรตีนเอ โดยเปรยีบเทียบ IgG – binding region (E, D, A, B และ C) กับ concensus sequence - = กรดอะมิโนที่เหมือนกนั + = กรดอะมิโนที่เปลี่ยนไปเนือ่งจากการกลายพันธุ Boxes = 2 α helicesที่มีความสําคัญตอการเกาะกับสวน Fc ของ IgG Underlined = ตําแหนงที่ทาํหนาที่ในการเกาะ ที่มา : Moks et al. (1986)

11

ตารางที่1 ความสามารถของโปรตีนเอในการจับกับอิมมโูนโกลบูลินของคนและสัตว

Species Protein A Human

IgG1 IgG2 IgG3 IgG4

++++ ++++ ++++ - ++++

Mouse IgG1 IgG2a IgG2b IgG3

++ + ++++ +++ ++

Rat IgG1 IgG2a IgG2b IgG2c

+/- - - - +

Hamster + Guinea Pig ++++ Rabbit ++++ Horse ++ Cow ++ Pig +++ Sheep +/- Goat - Chicken -

ที่มา : Richman et al. (1982)

12

ภาพที่ 2 ลําดับนิวคลีโอไทดจากปลาย 5’ ของยีนโปรตีนเอ -35 และ -10 = 2 promoters ====== = Shine – Dalgarno sequence S, E, D, และ A = สวนเริ่มตนของ region S, E, D, และ A ตามลําดับ ที่มา : Löfdahl et al. (1983)