7
Stabilization of a-Chymotrypsin by Ionic Liquids in Transesteri®cation Reactions Pedro Lozano, 1 Teresa de Diego, 1 Jean-Paul Guegan, 2 Michel Vaultier, 2 Jose  L. Iborra 1 1 Departamento de BioquõÂmica y BiologõÂa Molecular B e InmunologõÂa, Facultad de QuõÂmica, Universidad de Murcia, P.O. Box 4021, E-30100 Murcia, Espan Äa; telephone: 34 968 36 73 98; fax: 34 968 36 41 48; e-mail: [email protected] 2 Universite  de Rennes 1, Institut de Chimie, UMR CNRS 6510, Campus de Beaulieu, Avenue du Ge Âne Âral Leclerc, 35042-Rennes, France Received 28 February 2001; accepted 26 July 2001 Abstract: Five different ionic liquids, based on dialky- limidazolium and quaternary ammonium cations asso- ciated with per¯uorinated and bis tri¯uoromethyl) sulfonyl amide anions, were used as reaction media to synthesize N-acetyl-L-tyrosine propyl ester by transe- steri®cation with a-chymotrypsin at 2% v/v) water con- tent at 50°C. The synthetic activity was reduced by the increase in alkyl chains length of cations and by in- creases in anion size, which was related to the decrease in polarity. Incubation of the enzyme with and without substrate) in ionic liquids exhibited ®rst-order deactiva- tion kinetics at 50°C, allowing determination of deacti- vation rate constants and half-life times 1±3 h). Ionic liquids showed a clear relative stabilization effect on the enzyme, which was improved by increased chain length of the alkyl substituents on the imidazolium ring cations and the anion size. This effect was 10-times enhanced by the presence of substrate. For example, 1-butyl-3- methylimidazolium hexa¯uorophosphate increased the a-chymotrypsin half-life by 200 times in the presence of substrate with respect to the 1-propanol medium. These results show that ionic liquids are excellent enzyme- stabilizing agents and reaction media for clean bioca- talysis in non-conventional conditions. ã 2001 John Wiley & Sons, Inc. Biotechnol Bioeng 75: 563±569, 2001. Keywords: ionic liquids; enzyme stability; imidazolium salts; transesteri®cation; a-chymotrypsin INTRODUCTION Ionic liquids consist of salts that are liquid at room temperature and that can be used as solvents for a wide variety of chemical processes i.e., extraction, reaction media, chemical catalysis, etc.; Huddleston et al., 1998; Welton, 1999; Earle and Seddon, 2000; Wasserscheid and Keim, 2000; Freemantle, 2001). The most com- monly used are dialkylimidazolium and tetraalkylam- monium salts with anions that have a strongly delocalized negative charge e.g., BF 4 , PF 6 , SbF 6 an- ions; Sun et al., 1998; Holbrey and Seddon, 1999). From a biotechnological point of view, the most in- teresting properties of these liquids are their negligible vapour pressure and excellent chemical and thermal stabilities up to 400°C) Wilkes and Zaworotko, 1992; BonhoÃte et al., 1996). Additionally, the physical prop- erties of ionic liquids, such as density, viscosity, melting point, polarity, and miscibility with water or organic solvents, can be ®nely tuned by changing either the an- ion or the substituents in the cation or both. These nu- merous possibilities make ionic liquids an exciting ``green'' alternative, as non-conventional media, to volatile organic solvents, with no detrimental eect on the environment or human health Freemantle, 1998; Blanchard et al., 1999). Cull et al. 2000) ®rst reported the biotransformation of 1,3-dicyanobenzene to 3-cyanobenzamide catalyzed by Rhodococus R312 in a biphasic system, where the ionic liquid acts as substrate reservoir. Subsequently, two groups used ionic liquids in enzymatic synthetic processes. Erbeldinger et al. 2000) described the syn- thesis of aspartame catalyzed by soluble thermolysin in 1-butyl-3-methylimidazolium hexa¯uorophosphate with 5% v/v) water content at 37°C. These authors obtained a synthetic activity of the same order of magnitude as in conventional organic solvents and also showed the possibility of recycling the ionic liquid by simply wash- ing with water, as one of the main advantages of these media. Madeira Lau et al. 2000) showed several syn- thetic reaction models catalyzed by free and immobilized Candida antarctica lipase B in 1-butyl-3-methylimi- dazolium tetra¯uoroborate and hexa¯uorophosphate, at 40°C. Both ionic liquids were suitable for performing ammoniolysis and transesteri®cation reactions. The free enzyme appeared to be less effective than the immobi- lized one. For the ®rst time in the literature, this article describes a study of soluble a-chymotrypsin activity and stability in ®ve ionic liquids to ascertain the possibility of using these new solvents as reaction media under denaturative con- ditions low water content and 50°C). a-Chymotrypsin was selected because it has been widely used as a catalyst for peptide and ester syntheses in non-aqueous media Correspondence to: Prof. Jose L. Iborra ã 2001 John Wiley & Sons, Inc.

Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

������������ � ��� ��������� �� ����������� � ���������������� ��������

����� ������� ������ �� ��!��� "������� #��!��$

%�� �� &��������$ "���' �( �������

����������� �� � ����� �� � � ����� �������� � � ����������������� �� ����� ��� � ���� ��� �� ���� �� �� � �! "#$�� %&'#�##���� �� %���(�) �����*�+ '" ,-. '- /' ,.) 0�!+ '" ,-. '- "� ".)�&�� �+ 1� 2���3�����$� ���� ��� �� 4��� �� ��� ��� �� 5* � �� ��4 5647 -8�#�5����� �� ����� ��� 9���� �� :������� ;������� '8#"$&4���� �����

4��� ��� $. ��2����� $##�) �������� $- <��� $##�

)�������� ���� ������� ���� ������� ����� � ��� ��� ������� ��� �� �������� ������� ����� ���������� ��� ����������� �� ��� ������������ ��� ��� ����� ����� ���� ���� �� ������ ����� ��������� 6����� ��������� ����� ���� �� ��������� ���� ��� ������������ � !" ��#�� ���� ���� � $%�&' (�� ������ ������ ��� ������� �� ��������� � � �� ����� �)� �� ����� �� �� ��������� � ��� ����� ����� ��� �� ��� � �� ��������� �� ����' *������ �� �� ����� ���� �� ������������� � ���� ������ �+������ �������� ���������� ������ � $%�&� � ���) ��������� �� ���������� ��� ����� �� �� �� ��� ���� �,-. ��' *��� ������ ������ � � ��� �� ���� ���� ����� ����� � �������� ����� ��� �������� �� �������� ���� �)��� �� � �� �������� � �� ������� ��� ��) ������� �� ��� ����' (��� ����� ��� ,%����� ������ ���� ������� �� �������' ��� �+��� �� ,���� �.����� ������� ��� ��+�������������� �������� �������������� �� �� ��� �� !%% ���� � �� ������� ��������� ��� ������ � �� ,������� ������' (�������� � ���� �� ���� ������ ��� �+�� � ���������� ���) �)�� �� ������ ����� ��� � �� ������� ���� � ��������� �������' � !%%, /�� 0� ��1 2��� *�' � ���*� � �� *+, $3.-$34� !%%,'-��.����, ���� ������5 ����� ���� ��5 ������� ����� �5 �������� ����5 ������������

�/��0 1���0/

����� ����� ����� �� �� �� � �� ����� � ���������� ���� � �� � � � �� �� ������ ��� ���� ����� �� ������ � ������ ������ ���� ������ �� �������� � ������ � � � ���� ����� ������� �� ��� ����� ������ ����� ! ��� � "���� #$$$� ������ � %���� #$$$� &���� ����� #$$�'� (�� ��� ���)����� �� �� � �*����� +����� � ���� �*�� �)������ �� ���� ���� �� � � �� ����,������ ��+� ��, ���� �� �,� ���,�� -&�. � /&

�0 � "�&

�0 �)

���� "�� �� ��� ����� ������� � "���� ����'�&��� �����������,�� � ����� �� ����� ��� ��� ��)

�������, ��������� �� ���� ����� �� ����� ��,��,����

� ���� ������ � ��������� ������ � � ����� �� ������� ��� �� .$$�1' � ��*� � 2 �����*�� ���#�-����3 �� �� ��� ���0'� 4����� ���� ��� ����� � ����)����� �� ����� ������ ��� ������ �������� ������,������ ��� ����� � ���������� ���� � ��� �� ��, ���������� � � �� 5���� ���� �� �� �,��, ������ ��� �)��� �� ��� ��������� �� ��� � ���� �� ����� (��� ��)����� ���������� � *� ����� ����� � �������,66,����77 ����� ����� ���)���������� � ��� � ����� ���� ��, ��� ������� ���� �� �������� � �8��� ����� ����������� �� ��� � �� ��� �&���� ����� �����-� ��� � �� ��� ����'�1��� �� �� �#$$$' 5�� ������� ��� ����� ����� ����

�� ��9)��� �����+��� �� 9)�� �����+ ��� � � ��+��� ���������� :9�# �� ���� �� ����� ����� �������� ����� �� ���� �� ��������� "�������������� ,���� �� ����� ����� �� ��+�� ��� ��������������� !������,�� �� �� �#$$$' ������ ��� ��)���� �� � �� �� � � ��+� �� ������ ���������� ���)�����)9)��������� +����� ��� ;��������� �� ����<� ��=�' � ��� ������� � 9>�1� (��� ����� ��� ��� �������� ������� �� ��� �� ���� �� � ,����� ������������ � ��, ��� ������ � �� ���� ������������ �� ��������, ��� ����� ����� �� ����� � �)��, ���� � ���� ��� �� ��� � �� � �� ,� �� ������� � ? ��� @ � �� �� �#$$$' ���� ���� � ��)������ �� ����� ���� � � ��+� �� ���� � ��������+����� � ���� ��� � - �� �)�����)9)���������) +����� ���� ;������� �� � ��� ;��������� ��� �.$�1� -��� ����� ����� ���� ��� ��� ��� ���������, ��������� � �� ������5� ���� �� ������ (�� ������+��� ��� �� �� �� �� ��������� �� � ��� ������)��+� ����&�� ��� 5�� ���� �� ��� ����� ����� ��� ������ ������

��� �� ������ �)����������� ������� � � ������ ��5�� ����� ����� �� ���� �� ��� ��������� �� ���, ������� ������ �� ����� ��� ���� �� ��� ���� ���)����� ���� � ��� ������� � <$�1'� �)1����������� ������ ��� �� �� � ���� ����� �� � � ������ ������ � ���� ������ �� ���) ����� ��� �� �������� ��� /���� A��B @� �����

� !%%, /�� 0� �� 1 2��� *�'

Page 2: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�% � ���� �� ��� ���<� C��� �� ��� ���0� @����*� �� �������'� �� ��� ������� ��� ���� ��� � ��, ��� ��)���� �@�+ �� �� ��� ���> � @����*� �� ��� #$$$' ������� ���� �@�+ �� �� ��� ���.� ���>�'� �� ��� � �� �����+�� ��� ������ �� �) �����)@)������� ������ �����4(/!' �� �� ������5� ����� ���� �) �����)@)������������ ���� �4(!!' � �)���� ���� � ����� �� �)��������� ����� ����� ���� ������ ��� �� ��� ���� �� ��� �� � �� ������ ���������� ��, ��� ������ ���������� ���� ��� ���� ���� ��� ����' � ������ ����� 1 ���)�� �� � "���� #$$$� 4*� �� ��� #$$�'D ��' �)�����)9)��������� +����� ���� ;������� ��� E!����FE-&�. F� ���'�)�����)9)��������� +����� ��E����;����������'����)���F ��� �� ���;����� E!����FE(�#G�F� ����' �)�����)9)��������� +����� ���� ;������� ��� E-����FE-&�. F����' �)�����)9)��������� +����� ��� ;��������� ���E-?���FE/&�0 F� � ��' �������������� ������� ���;�)��� E?(H4�FE(�#G�F�

%)�2��)�� )/ %2�30 �

� ������� �� 2����

�)1���������� �1(' �!1 9�.�#���' ���� �� ���� ������� ���� � 4(!! ���� ����� � ���� "�,� 1����� � 1�� "������ � ����� ������ � ���� ���)�� � ���� "�,� )4�����)&��* 1����� � 1�� ����� �� ��� ��,��� ������ � �� ����

��� ���� � ���� �������

�&%�*��&'&���*�� � ��=� �� >����?��2����@%� �6A@���

7 A

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� "� ��+ �� ������0'D .�.$ , �� !?���-�� �#9�$ ����' � #��9 , ������ ���� ;������� �� �#9�$ ����' ���� ���� �� #<�@ �� ������� 4���� #. �� ��� �� ����� ������� � 5����� �����,� � �� ������ � ������ ������ ������ � ����� !��� ����� �� ��� ����� ���� 1�#1�#�<$ �@'� 5��� ����� �� ��� ���� �� ��� ������ ��������� ������� � ����, ���� ��,� � ���� ��$�#

����' � <$�1 ��� #. � �� �� 9��< , �� E!����FE-&�. F ��� � ��� ����.� ��� � ����'�

�&%�*��&'&���*�� � ��=� �� �����&>� ?��&6&@B�� ?�����*��C 7��0��A ���*�����0�� ��@%� �6A@>0!6

�A�(�� ����� ����� � ��� ��� ������, �� ��� �����)

��� �� -����3 �� �� �� ����0'D �9��0 , �0���� ����' ��!����-�� �#$�< ,��@�G(�# �0��������'���������� <$ �@ �� ��� � ��� �>$�1'� !��� ����� ���� 1�#1�#�# � <$ �@'� �������� ���� ���� ����� ������� �����, ���� ��,� � ���� ��$�# ����' � �$$�1 ��� #. � ���� #9�� , �� E!����FE(�#G�F ��.���� � ����'�

�&�����&'&���*�� � ��=� �� >����?��2�����@�� �6A@���

7 A�

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� "� ��+ �� ������0'� "���� ���� ;������� �� �<��9 ,� <9�� ����'� � �� ������� �� -����1�� ���9$ ,� <9������' �� ������ �<$ �@' � ���� ������ ����� 4����#. � ���� ������,� ��� �� ����� ������� � 5����������,� ���, �� ������ � ��� ������ � ���������� ��,� � ����� ,����, ���9� , �� E-����FE-&�. F ��<� ��� � ����'�

�&�����&'&���*�� � ��=� �� D�!�?���*��*����@�� �6A@��3

�A

(�� ����� ����� � ���� �� ������, �� ��������� �� �����' ������D ��� ;������������� �� ���9���' � ����� � �� ������� �� �)�)�����)9)��������� +����� ������� ��>0�< ,� � ���' �� <$$ �@�� � ���� 4���� ������, ��� �# �� ��� ����� ���� ���)�� � ��� � �� ���� (�� ����� ����� ����� �������� � �� ���� � ��� ����� ��� � ���, ���� �����,�� ����� (�� ����� ����� � ���� ��� ���� ��,�� ���� ��$�# ����' � >$�1 ��� #. � �� ��, �� #<#�� , ��E-����FE/&�0 F ��� � ��� ���� ��� � ����'�

���*�� >� ������� �� � �B>� ?�����*��C7��0�� 9� ��� @�> 96A@>0!6

�A(�� �� �������� ��� -����-&�. � ��D �$

���� �� 4���� � 990 �.�$. ,' � �$ ���� �� @�G(�#���<. ,' ���� ����� �� <$ �@ �� ������ � ���������� ����� 4���� #. �� ��� �� ����� ������� � 5�)���� �����,� ���, �� ������� (�� ������ � ���������� ����� ������ � ��� ����� ����� ��� ������,� � ���� ��$�# ����' � >$�1 ��� #. �� ,����, .�9> ,�� ��� � ��� ��<� ��� � ����'� ��G?: �4������ 0�9$$ ?�+� ����=(?"'�D 9�.� ��� 0�'� 9�#� �� 9�'� ���$���� 0�'� ��9� ��� 90�'� $��� ��� A I 0�0 �+� ��'��91G?: �4������� <$ ?�+� ����=(?"'�D �#9�<������<#� �#�.�� 0#�<#� 9#�<�� 9#�.�� #0�.�� #9�9$� #9�#9�##�>�� �.�9#� /������)��� @"�?" ��=+'D �$�.��� �$.#����$>$��� �$����� ��#0��� ��<.���

���������������� ��������

H��)����� ������)5�� �����,� � ��� ����� �� $�� ?4(!! �� �)���� ��� ���� ����, $�. ? �������� ����� � �� ����)� ��� �� � �� � �@ ��� � ���������� ����, �<< �@ �� � �� ����� ������ E!����FE-&�. F�E!����FE(�#G�F� E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 �� �E?(H4�FE(�#G�F� (�� �� ����� � � ��� �� ��,#$ �@ �� � �,=�@ �� �)����������� �� � ��� � ��� � <$�1 ���� � *��, ��� � �� 4� ��,�� � ���� ������ ��#<)�@ ������ ���� ���� ��� � ����� �� .>< �@

$37 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 3: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�� <$� ��=�' ����� �� �� ��� ��� �� ������ " �������� ��,������ � *�� ��� < ���� � ���� � ��+� ����,�)������� ��� ����� ����� ��,� ��� ��/@1'� !�)�������� ���� �������� �� ����� ���

3��� )������

"���� �� � ������ �������� ���� ���� ���������� �/@1 ���, @�1������� :/)�� ������ ��< �����,�� � 9�� �� ������ � � ������ < �� � ������ �+� � �$ �� ���� �+�'� " ���� ���� ����� ���, ���� �,� ���� �/� � 4D �$� �=� ����������� � �� �=� ����� ��� /� � -D <$� �=� ����������� � �� �=� ����� ��' � � �@ ����� ;�� � ��� !������ ���5�� ������������ � #>0 ��� H�� ���� �� �������� ������� � �5�� ��� ����� �� ��+��� �� � ������ � ���� ���) �����)@)������� ������ ���� �4(/!' ��� ����

2���� ��������� � � � ������� � ���� �������

���� �8����� ����)� ��� �� � �� � �@ ��� � ���������� ����, �<< �� �� ����� ����� E!����FE(�#G�F�E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 F� � E?(H4�FE(�#G�F�

#$ �@ �� � �,=�@ �� �)����������� �� � ��� ���� � � ��� ������� ����� �� � <$�1 �� ��� ������� ���� ��� (���� � �8����� ����� �#< �@ �� ��)�� �� ������� �$�� ? 4(!! �� �)���� ��� ���� $�. ?�������� ����' � � �� � �� �� �� � ��� �� ������ ������� ������ ����� &�� ����� ���� �� ���������� �� ���� ��� � � � �� ����� ���� ����� ����� �8����� ����� � <$�1� � ���� �#< �@ �� �������� �� ������� � � � ������ ����� (�� ��) ����� � �� � ��+� �� �/@1 ������ �����

�2�1��� )/ ���1���0/

���������������� ������� � ���� �������

-���, *������ ��� ��������� ������ ��� �� ����� )���� �� � ���� �� ���� �� ����� ����� � � ��,���

������� �� ��� ����������� ������� ������ �� ����� ����� ��� � 4 � � �� ��� �� "����� � ��� ������������ ��� ����������� ���������� �� ��� � ��)�� ����� ���)��+��� �������� �� ������� � �����������' � ������ ������������ �� ,���� ��� �)���� ��� ��� ������5� ����'� (��� ��� �J������ ����+��� ������� � � �� ������ �� ��� �������� � ������ ���)���� ���������� � ��� � ��� � ��� ����������� �� ����� � �� �����������'� �� ��� � �� ���� � ����� �%��� �� ��� ����� H�� �� �� ��� ���<� - ����� ��� ����' ������ ��� ��� ������� �� ��� �)����)������� ������� ��� ���� ������ � ���� ������ ����� ������� �� �������� �����4(/! ������ � � ��+� �� �)����������� �

�������� �� 5�� ����� �����D E!����FE-&�. F�!����FE(�#G�F� E-����FE-&�. F� E-?��

�FE/&�0 F �E?(H4�F E(&#G�F� (�� ��+��� �� ����� � ��� ��������� �� �)����������� ��������+� ����� � ���)������ ����� �� � *��, ����,�� �� ��� ����� �������� �� ��� ����� �� ��+��� ���� ��� �� ����� ��� �"���� �� ��������� � ���� ������ ���� ������)����������� ������� � � �� ��� �� ����� ��)� � 4 � �� ����� &�,��� �4 ��� ��� ���� ����� ������ �� ��������� �� 4(!! � � ��+� �� �)���������)�� �� ���� ���� ��)���� ���' � E-����FE-&�. F ���������� ����� � <$�1 � #� ��=�' � ��� �������� 4� � �� ���� ��� ��+��� ������� � �� ���� ��� +��� ����9$ ��� �� �� ����� �� �)���� ��� ����� �� �� ��+���� ���� ����� &�� ��� E-����FE-&�. F ������ ������)��� ���5�� �� 4(/! ��������� � ������� /��5���� �� ��� ����� ����� ����� �� ���� ���� �� &�,��� �-����� ��� �8��� �� ������ ���� �� ��� �������� ��������� �)����������� �� �)���� ��� ����� � #� ��=�'� ��� �������� ����� ��� ��,��� ������� � ������ �<$�1� ( ��� � ��� ��� �������� ������� � ����������� � ����� �������� �� �)����������� �� 4(/!������ �� ���� ��)���� ���' � ��� �8����� ���������� �� �� ����� ��� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1� (�� �� �� ��+��� ����� ������� ������ � �� ��� ����� ����� ���� ��� ��� ��� ��� ����)�����������)� � ��+� �� ������5� ���� �� ������

������ �� "������ �� 4(/! ���� 4(!! � �)���� ��� � � ��+� �� �)������������

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $3$

Page 4: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�����,� ��� ����� � �������� � �� � ����� �� � �� � ���)���� ���� 4�� ����� � � �� ���� ��� �� ��� ����5������� � � ����� � ��������� �� ���� ����� ����� � ����� ����� ����� ���� ��� ��+����"���� � ����� �-����3 �� �� ��� ���0� "�� �� ��� �����

������� � "���� ����� 1 ����� �� � "����#$$$� 4*� �� ��� #$$�' � �� ������ ���� � ����� � � ������ � �� � �������� ������ ����� � ���������������������� ������������� � ������ �������� ��)���� ���������� ����' �� ����� ����� �������� �� �������� (�� ������ ���������� ��� ���� � �������� � ��� ������� *�� � � ����� ��� � ��+��, ��� ��)� ���� �� �)����������� �� ����� ����� ��� �� ����� � 8��� ���� ��� ��+��� ������� � � )�� ��������� ����� ������������ ���� ��� �� ����� ������1 ����� �� � "��� �#$$$' � 4*� �� �� �#$$�'

� ��+� ��� ��� ���� �� �) �*��)9)��������� +���������� ����� �� ;��������� ����������� (��� �)���� ������� �� � ��� ���� �� ���� ����� ����� � ���� � ��� �� �� � �� ��� ����� ������ ������ ���� ������� ���� ����'� 4����� ���� ������ ���� ������� ������� � �� ���� ��� �� �� ���,�� �� ��� �*�� ������)

��� �� ��� ��� +����� ���, �� ��� � ���� � ��� �����+�� ���� � ����� � �� ��� ���� � � �� ������� (���1 ����� �� � "��� �#$$$' ������� �� � ��� ��)� ���� �� ����� ����� � �������� �� ��� ���� ������� ���� ����, ���� �) �*�� ,���� � �� ��� � ������� ���� ���� ����, ���, �) �*�� ,����� -� ���, ����������� � ��� �� ����� ����� �� ��� ���* ���� ���� �5� �� ��� ���� ������D E!����FE-&�. F KE!����FE(�#G�F K E-����FE-&�. F K E-���

�FE/&�0 FKE?(H4�F E(�#G�F� -� ���� ���� ���� � �� ( ��� ���� � � �� ��� ��� ��� �������� ������� � �� ��)��� �� ��� ���� � �� ��� ��� ���� �� ��� ����� ���������� ��� ��������� �� E!����FE-&�. F� (�� � � � ������������ ���� � ��� � � ���� �� ������� ��� � � ���)������� ������ � ��*� � 2 �����*�����#� -����3 �� �� ��� ���0'� %��������*� �� �� �����'������ ��� �)����������� � ���� ���� �� ������������ �� �8����� � ���)������� ��, ��� ������ ���������� �� ��� ��������� �� ��� ��� ���� ���� ���������� �� ����� ������ � ����� �� � ��� ��������� ��� �� �� ��� ��, ��� ������ ��������� ����� �� � �� ��� ��, ���� �8��� E!����FE-&�. F �� ����)����������� ������� � ��� � ��� ������� ���� �� �������� �� ��� ����� ����� ����� ���� ��� ��+������������ �������, ������� �� ��� ���� �� � ����������, �@�+ �� �� ��� ���> '� �������� ��� ���� ��� ��� ���� �� E-����FE-&�. F ���� �� ������� �� ���� ����� ��� �� � � ����� ������� ����, ��� �� ����������� ��� ���� �� ����������� �� ��� ��+��� � ��������� ��,��� �� � �� � �� �)���� ��� ���� � � �� �� ������H� ��� ����� � �� �� � ������� �� � ����� �����

��� � ��� ��� ������� ������ 9. �/ � <>. �/ ���E!����FE(�#G�F � E?(H4�F E(�#G�F� �����������'�-����3 �� �� ��� ���0� "�� �� ��� ����' ���� ������ ����� �)���� ��� ����� �# �/'� ��� ���,�� �� ��� ��)

���� �� �4' (���)����� �� 4(!! ��������� �� �)����������� �� ������ 4(/! �� �� ������5� ���� �� �)���� ��� ��' � E-����FE-&�. F��'� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1� �-' !8��� �� ������ ���� �� 4(/! ������ � � ��+� �� �)����������� �� �)���� ��� � #� ��=�'� ��� ��������

���� �� "�������� ������� � ���������� �������� �� �)�����)������ � � ��+��,�) �����)@)������� ������ ���� ������ �� ��������

����� ����� � #� ��=�' � ��� ������� � <$�1�

"�������� 4������� "����������

?�� �L=�, ��+' ��'

�)/��� ��� #9�# M $�� �$�� M #��

E!����FE-&�. F $�. M $�� �$$�$ M $�$

E!����FE(&#G�F �9�0 M $�< ><�# M #��

E-����FE-&�. F .�� M $�# >��< M 9�#

E-����FE/&�0 F ��� M $�� >0�# M .�$

E?(H4�FE(�#G�F #�9 M $�� 00�. M #��

$33 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 5: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�������� �*�� �� �� �� ��� � ���� � ��� ���� ��+ )���� �� ��, ���� �� �,� �� ���� �������� � "��������' ���� ����� ��������� ��� ��� ����� ����� ����� � �� � ����� � �� ��� ������� �� ��� �� ���������� � ������ ���� E!����FE-&�. F �� E?(H4

�FE(�#G

�F � � � �� � )�� ���� �������, � � ������� � ���� �� ����� ��� ��+�� ��� �������� ����������� ����� ����� ����� ����� E!����FE-&�. F ������� ���� �������� ��������(�� ���������� � � ����� �� ��� �� ����� ��� ( ��� �'

���� ��,�� �������� ���� ��� ����� � �� ��� �*���� �� ���,�� �� � ����� ����� ����� �� ������� ��� � �� � ���� ��� �������� (���� ������ ��������� �� �������� �� ���� ��� ������ �� ���� �� �� �� ����,��)��� ���� �=�� ������� � ��� �,����� ���� ��+ ���� �� ��� �� �,� �� ��� ���� � ����������'� �� ��� � � �� ��� ��� +�����)� � ����� �������� � ���� �� � ����� ��, ��� �� �� ���,�� �� ;����)� ���, �*�� ��������� �� ���� ��� � ���� � ������ �� ,�� ��� �,��� �� ������������� �� ����� ������-����3 �� �� ��� ���0� 4������, �� ��� ����'� (��� ����������� �� ���������� � �� ,������� ���� ��� ��)��� � �� ������������� �� ��� ��� � (��������� ����� �� � ��� ������� �#� �=�'� ��� ����� � �� ����)��������� �� ��� ����� ���� �� ��� �� ���� � ��)��� � �� � ��� ������� ���� ��� �������� ������, �����+��� ����� �� ��� ��������� � � �� ��� ������� ������ � ��� ��������� ����� � � �� ������������ ��) ,��� ��� "����� �' �� ����,� ���.� @����*� �� ���#$$$'� �� ��� � �� ��� ��� ���������� ����� �����E!����FE-&�. F� ����� ������ ��,� ������� �� ��� ��� �������,� ��,�� � �� ��� ����� � ��� ������� ���� ��� ������� �� ���� ��� ��� �����������

2���� ��������� � ���� �������

(� *��� ��� ����� ��;����� �� ���� ����� ����� ����� ��+���� ��� � ������ �� �)����������� � ������ ����� ���� ���� � ������� ��� ������� �� ��)�� �� �4(!!' � <$�1� �� � ���� ���� �� � �)����������� ������� � ������ �� ������� �� �� � )��� ����� � ������ ���� ��,��� �� � ��� ������,����� �.9���1'� ����� ���� ��� �� �� ������� ��� �,� �@�+ �� �� ��� ���.� ���>�'�

(�� ����������� �� ���� ���� �� �)����������� ��)+��� � ���� ��� ���� ������ �� ����)�������)��� � ���� ���� ���� �@�+ �� �� ��� ���.����>�'� �������� ��� � �� ������� �� ����� ����� ��$$� �� ��� ��� ����, �$N�<�' ���� �� ��� ������������� �� ��� ��������, ���)��� � ���� ���� ����)�����

! � !$ � �����*������� * ��

��' � ��� 5��)���� � ���� ���� � �� ���)� ��� � !$ � ! �� ����� � � ���� � �������� )���� �� ����� ��+���� ������������ 4����� ���� ����! I !$=#� ��� ���� ��' � � �� �5�� � �� ���� �������=#'� � �� ��=# I ��#=��&�,��� # ��� ��� � ���� ���� ���5�� �� �)������)

����� �� ���� �8����� ����� ����� �E!����FE(�#G�F�E-����FE-&�. F� E-���

�FE/&�0 F � E?(H4�FE(�#G�F'

� �)���� ��� ��� � <$�1� 4 � � �� ���� �� �) ���� ���� ���5�� 5��� ��� ���� ���� ��� 5��)����*������ ���� � # K $��>'� ������, � ���� ���� �� ���� ���� ���� � �� ���� �� � � ��)���� ���� ����

���� �� &���)���� � ���� ���� ���5�� �� �)����������� �� ��)�� � ��� E�� �)���� ���� �� E!����FE(�#G�F� �� E-����FE-&�. F� ��E-����FE/&�0 F� �� E?(H4

�FE(�#G�F �� ��� ����� �� ���� �� �<$�1� "��� ���� 5��� �� ���� � ��,����� � ����

���� ��� &���)���� � ���� ���� � �� ���� �� � � ��)���� ���� �� �)����������� �������� �� ����� ���� �� �8����� ����� ����� � #O �=�� ��� ������� � <$�1�

������ ���� �� ��� ���� ��

?�� * ����' ��=# ��' * � �$# ����' ��=# ��'

�)/��� ��� .�.< M $��# $��< N N

E!����FE(�#G�F $�0. M $�$# ��$� <�0# M $��� �#�99

E-����FE-&�. F $�90 M $�$� ���9 .��� M $�9< �.��<

E-����FE/&�0 F $�.. M $�$# ��<� #�90 M $��# #��9.

E?(H4�FE(�#G�F $�#0 M $�$� #�09 <�00 M $�#� �#�#.

*D P� ���� ���� � �� ���� ��� ��=#D � �� ���� �����

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $3C

Page 6: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

�� ( ��� ��� P� ���� ���� ���5�� �� �)����������� ����� ������� �� ��� ���� �� ���� ������' ���������� � ���� � ���5��� 4 � � �� ���� ��� �)���� �������� ������ � � � �� �� ��� �)����������� �)������� ���������, � ��)���� ���� �� $��< �� �� ,����������� ��� �� ����� ���5�� ���� �� &�,��� �4� ����������� �� �� �� ��� ����� ����� ������� ��� � ��� ���)���� �� ��+��� � ������� ���� �� ��� ���� � �� ���� ���� ���� � �� ���� �� � ����� � �� ��� � ��)��������� 4����� ���� ( ��� �� ��� ��� ��� ����� � ��� ��)���� ���� � �� ���� ��� �� ,������� ���� ��� ��)��� � �� ������������� �� ��� ����� ������ �� ��� � ����� ����� � �� ������������� �� ��� ���� ���� ������� ������ ���� �� ��� ����� � � ��� � ��� ���� ���������� ��������� ������, ��� ����� �������)��� �����) ����� � � ��� ����, ��� ��+��� � ������ ��� ��� ��� ���� ��������� (� ���� �� ��� �8��� �� ���������� �� ��+��� � ���� ����� ��� ���� � ����+ ����� � ����� � � �� �5�� ��� � ��� �� �)������������ ��)���� ���� �� ���� ��� � �� ������ ��� ���,��)���� ���'� &�,��� 9 ��� ��� ��� ���� � ����+ ���� ����� �� ����� ����� �� �)����������� � ������ �<$�1� �� �� � �� ��� ������� �� ��� �������� ���� ���4(!!' �� ��� � ���� ���� ��� ����� ��� ��+��� ���� ,�� ��� ��������� �����, ��� � ��� ������� ��� ��)���� ���� �� ��� ����� ������ �� ��� � �� �� � � ����� �� � ��� ��� ���� � ����+ ���� ��� ��� �� ���,E-����FE/&�0 F �� ��� ������� �� ���� �� � �� ���#$$� (�� ��� ������� �� ��� �)����������� ����� �� ������ ������ �� ��� ������� �� ���� �� � �������� �� ����� ��� � 0$�1� ����� ��� � ��)����� ����� � �.$ ���� �@�+ �� �� ��� ���.'� 4��� ��������� ���� �� ,������� ���� ��� ��������� �� !����)��,�� �� �� �#$$$'� ����� ����� ����� ��,�� � ����+���+��� �� ,�� ��� ������ �� � ��� �������� ��

��, ��� ������� 4����� ���� ? ��� @ � �� �� �#$$$'������� �� � ���� ���� � ��������+� ��� � ���� ���� ��� �� ������5� ���� �� ������ ����� ��� ���� ��)+��� � �� �8������ �� � ��������+� ���� �����(��� � �� �,,�� �� � ��� �� �� ��������+� ���� )���� ���� ������� ��+��� � ������ �� ����� ����� ���� ��� ����� � ��� ���� � ����+ ���� �8��� �� ������� ���� � �� � ��� �� ��� � � ����� ����,���� �� ��� ��)+��� �@����*� �� ��� #$$$'�

�0/��1��0/�

����� ����� � �� ���� ���� �� �� ���������� ��� ��� �)����������� �������� �� ������ 4����� �������� ������ �� ���� ���� �� � ����+� ��� ��+��������� ��, ,�� ��� �)����������� � ��)����� (�� ��� ����� ����+ ���� �� ���� ����� ����� ���� �� ��� �� �� ����������� �� ��� ���� �� ��� ����� � �� ���,�� �� ������������� �*�� �� �� �� � ���� ��= � ���� �+��4��� ��� ������� �� ���� �� ,�� ��� ������� ��)+��� � ������� E-����FE/&�0 F � ���� �� �� ������ � ����+��, ,���� ����� ����� ��� �� ,�� ����� ���� �� ��, ��� ������ ��� �� ��� � ���)���������� � ��� �� ��+�� ��� �������� �������

(�� ���* � � ��� ��� ������� �� ��� 1�1Q( ,� ��

-�H��)$.�#)1$#)$��

��������

4*� "GR%� -������*� A&� " � �� 4� #$$�� ��� ��� � �� ����)

������ ���� ����� �����S 1��� 1����� �D.�9N.�.�

4������, P � �� @� @�� Q"� ����� !� ��� ���� �� ����� ����� �

����� ����� ����� ���� ��������� ���� �� � ���� �� �� � ��

, ����� ��,� ���� 4� � 1��� >�D9�>9N9�>0�

- ���:A� ���T� !� 4��������+ /� ����� !�� ������� �� ��������+�

����� � � � ��+� ������� ������ �� ��� ������� �� ��������

������ �� ������������ !�+��� ?����� (������ #.D.�$N.���

-����3 �� /� P� 4/� / � ,���,��� G� % �� � �� � � %� C� U �+���

?� ���0� ����������� ��,��� ��������� ������ ������ ����

������ ��� ����, 1��� 9<D��0�N��>��

-� ��� � @4� � ��� P� -��*� � !A� -������*� A&� ����� C����

�������, ���, ����� ����� � 1H#� G ���� 9��D#�N#��

1 ����� �� 4A� "��� %:� #$$$� /�� ���� ��� �� ��� �) �*��)9)

��������� +����� ������)������ ���� ����� ����� ���� ���

��� ��������� ��� G��� ��� A /�� H�, 1��� �9D<��N<�<�

1��� "C� ������� AP� R �, )?�� R� "��� %:� @�� CA #$$$�

:��� ������ ���� ���� ������ ��� ��, ��� ������ �� �����)

�� � �������� ���� ����� -�������� -����, 0�D##>N#99�

! ��� ?A� "��� %:� #$$$� ����� ������ C���� ������ ��� ���

������� /��� 4��� 1��� >#D�9��N�9���

!������,�� ?� ?�� �� 4A� :��� 4A� #$$$� !�+�� ��� � � ��� ��

���� ���� �� 2) � �� �� �� ����� ������ 4� ����� ���� �� ��+�)

� ��� � � ��� �� ��, ��� ������� -��������� /��, �0D��#�N��9��

&���� ���� ?� ����� P��,��� ������� ����� ����� � � ���� ��� �

��������,� ����������� 1��� !�,�� G�� >0D9#N9>�

&���� ���� ?� #$$�� G�� ����+�� ��� ����� ������ 1��� !�,��

G�� >�D#�N#<�

C��� �� @�B ��+)& ���V � :� A��� W� R����� !G� ���0� -����,�� ���

����� ������ � ��+�� ��� ���� ��� �� ����� ����������

!�+��� ?����� (������ ��D�0#N��9�

���� �� :�� ���� � ����+ ���� �� ����� ����� �� �)����������� �<$�1� �� ��� ����� � ������� �� ��� ���� �� �4(!!'�

$3I 8*9(:&;<9�9=> ?<@ 8*9:<=*<::A*<=� B9�' C$� <9' $� @:&:D8:A $� !%%,

Page 7: Stabilization of α-chymotrypsin by ionic liquids in transesterification reactions

� ����, /A� ���.� (������� ��� ��������� ��� ���� � ��� ��

������������� � ��� D (������ ���� � �������� ���� ���

���������� � ��,� � � ���� !�+��� ?����� (������

�0D�>�N#$0�

������� AP� "��� %:� ����� (�� �� � ��� ����� �� �) �*��)9)

��������� +����� ���� ;������ ��� ����� ����� � ����� �����

���� �� A 1��� "�� P ���� (� � �9D#�99N#�9��

������� AC� ��� ��� �P� "� ���*� :/� R��� 4!� :�,�� :P�

����� :���)������ ���� ����� ����� ����� ��� ��� 66��� �77

�����)����� ���� ������ 1��� 1����� �0D�>0<N�>00�

% � ���� %� "�, � � �� "�,�� � "� � � �� �� ���<� !8��� ��

� ��� ������� �� ��� �� �������������� �� �)����������� � � ����� ��, ��� ��� � -��������� @��� �>D��0�N��00�

%�������*� Q@� ?�+� �� RR� -���� 4-� "��,��� ?R� ? �����*

%� ����� P�� ��� ���� � � ����D ��� ��������� ��� �������� ��

��, ��� ������ �� ����� ��� �� ���� � ���� !�� A -������

���D9�N.��

%��� �� &�T����� %� G������� �� ����� !�+�� ��� �� �����

�� �����)��, ��� ��� � R�� /����� ������ �� �)������)����� �� ����������� ��, ��� ������� A -��������� �D

#>�N#�$�

@����*� RQ� @�+ �� /� ����� A@� ����� %������ � ��� �� � ���)

� ���� �� ��������+� �)����������� �� � ���)�������

��, ��� ������ �� *��������� ������� -��������� -����,

0<D�>$N)�><�

@����*� RQ� @�+ �� /� ����� A@� #$$$� P��,���, ��+�� ��� *��)

������� ������ �� ��, ��� ��� ���� ��� � ��� �������� !�)

+��� ?����� (������ #0D0$�N0�9�

@�+ �� /� 1���� P� ����� A@� ���.� !8��� �� ������ �� �)����)������� ������� ������D ���� ����� � ��� �� ��� ��+���

� ����+ ����� A -��������� 9<D�N���

@�+ �� /� � P��,� (� ����� A@� ���> � ������������� � � ���

������� ��� ������� �� � ���)������� ������ ������ �� *��)

������� ������ � � ��+� �� �)������������ -��������� @�����D�$$<N�$$��

@�+ �� /� � P��,� (� ����� A@� ���>�� P�� ��� ��������=��������

��� ������� �� ��� �)����������� � ���� ���� ����� �� �� � � ��� !�� A -������ #.�D�$N�<�

? ��� @ � :� � � : ����T* &� "��� %:� "����� :4� #$$$�

@�� �)� � ��+� �� ����� �� ����� ������ H�, @��� #D.���N.����

H�� �� �� ����� Q� %�� � �� 4� "�, � � (� ���<� (� ������5)

� ���� � � ��+� �� ����������)������� ����������� �� ����)

���D (�� �8��� �� ����� ��+ ���� �� � �� �� ���� ,���� �� ����,

�� ���������� ����� -��������� -����, .�D.#N.��

"� ��+ /42� P����� A!@� !������ "� P� "��+ :&� P����� A� ���0�

(�� �� �� ��� ����� ����� �� ���)�� � � � ����� ����,�� ����

�� ����� �� ������ ��������� /�������� �<D�#�>N�#���

"�� A� &����� ?� ? �& �� �� P:� ����� :���)������ ���� ������

�� � � �� �� ���� �� ������� ���� A /�� 1��� -

�$#D��<�N��0.�

������ /� %��� � #$$$� ����� �����XG�� ������� ���

�� ������ ��� � � � ���� 4�,�� 1��� ��� ! 9�D9>>#N9>���

����� (� ����� :���)������ ���� ����� ������ "������ ��� ��)

���� � � � ���� 1��� :�� ��D#$>�N#$�9�

��*� A"� 2 �����*� ?A� ���#� 4�� � � ��� �)�����)9)���������)

+����� � � ����� ������ A 1��� "�� 1��� 1����� �9D�0<N

�0>�

�9E?<9 :( ?�'� ��&;>D9(A>F2*< 8:;?B*9GA *< *9<*& �*HG*@2 $34