Società Italiana di Fisiologia "Molecular and Cellular Biophysics of

Excitable Cells“ Scuola di Fisiologia e Biofisica 2015, Pavia

Electrophysiology and imaging : methods

Patch-clamp and calcium imaging recordings Masetto Sergio and Moccia Francesco

Electrophysiology

Con il termine elettrofisiologia si indica una branca della fisiologia che ha come studio il funzionamento dell'organismo dal punto di vista elettrico. In particolare l'elettrofisiologia applicata al funzionamento elettrico delle cellule prende il nome di “elettrofisiologia cellulare". L’eccitabilità elettrica delle cellule dipende dai canali ionici.

I canali ionici

• Il canale ionico è una proteina transmembranaria • Può essere aperto o chiuso, in funzione di voltaggio, ligando, tensione di membrana • Può essere permeabile a una o più specie ioniche • Il flusso netto di ioni può essere entrante o uscente (o zero) in dipendenza da Vm e Veq.

Il “patch-clamp” è una tecnica utilizzata per registrare le correnti ioniche trans-membranarie, ed è l’unica che consente di risolvere le correnti che fluiscono attraverso i singoli canali ionici.

Il “Patch-clamp”

Il patch-clamp è stato introdotta nel 1976 da due studiosi tedeschi, Erwin Neher e Bert Sakmann, ai quali per questa scoperta nel 1991 è stato conferito il premio Nobel.

Set-up da patch-clamp

Microscopio e pipette di registrazione

Con il patch-clamp è possibile variare il potenziale di membrana del patch (della cellula) e nel contempo

registrare le correnti di singolo canale (macroscopiche)

Cell-attached Inside-out

Suction

Pull

Whole-cell Outside-out

Pull

Cell-attached: singolo canale

Le condizioni che modificano il “gating” dei canali ionici agiscono non sulla conduttanza , ma bensì sulla probabilità del canale di trovarsi nello stato aperto o nello stato chiuso.

La corrente macroscopica rappresenta il comportamento medio del singolo canale (per N canali)

La cinetica della corrente macroscopica riflette quella di singolo canale

I = N * i * Po

Whole-cell: correnti macroscopiche

Le ‘bibbie’: • Ion channels of excitable membranes. B. Hille. • Single-channel recording. Sakmann & Neher.

Cell-attached

Whole-cell: risposta in voltaggio

E

Patch-clamp e eso/endocitosi

Patch-clamp e mutagenesi

Patch-clamp e fluorescenza

Se alla soluzione intrapipetta si aggiunge un colorante fluorescente, è possibile visualizzare i dettagli della morfologia cellulare.

Se la sostanza aggiunta nella soluzione intracellulare emette fluorescenza in risposta all’aumento della concentrazione di Ca2+, esempio Fura-2 o Calcium Green-1, è possibile combinare il patch-clamp con misure fluorimetriche della concentrazione del Ca2+.

Ca2+ imaging

Patch-clamp e optogenetica La tecnica optogenetica consente di controllare il potenziale di membrana di cellule geneticamente sensibilizzate alla luce. Questo è possibile grazie all’espressione indotta, nella membrana cellulare, di proteine-canale quali ad esempio le “channelrhodopsin” normalmente espressa dalle alghe, il cui gating viene modulato dalla luce.

Correnti postsinaptiche inibitorie (IPSC) registrate in un topo transgenico ingegnerizzato per esprimere la channelrhodopsin-2 (ChR2) nei neuroni GABAergici. La cellula postsinaptica non è GABAergica (ChR2-negativa). La luce blu produce una depolarizazione delle fibre afferenti GABAergiche, che esprimono ChR2, inducendo rilascio di GABA. Le barre blu indicano il tempo di illuminazione.

IPSCs

IPSCs

In conclusione

Nonostante ‘l’età’, il patch-clamp rimane la tecnica d’elezione per la caratterizzazione delle proprietà più fini dei canali ionici, e più in generale della eccitabilità cellulare. Anzi, il suo potenziale è ulteriormente aumentato grazie all’associazione con nuove metodologie, a dimostrazione delle notevole versatilità di questa tecnica.

Grazie per l’attenzione