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Submitted on 1 Jan 1994

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Simplified apparatus for instrumental insemination ofqueen bees with the ’flexible insemination technique’

Me Kühnert, Hh Laidlaw

To cite this version:Me Kühnert, Hh Laidlaw. Simplified apparatus for instrumental insemination of queen bees withthe ’flexible insemination technique’. Apidologie, Springer Verlag, 1994, 25 (2), pp.144-154. <hal-00891146>

Original article

Simplified apparatus for instrumentalinsemination of queen bees

with the ’flexible insemination technique’

ME Kühnert HH Laidlaw

1 Institut für Bienenkunde (Polytechnische Gesellschaft), Fachbereich Biologie derJW Goethe-Universität Frankfurt am Main, Karl-von-Frisch-Weg 2, 61440 Oberursel, Germany;

2 University of California, Department of Entomology, Davis, CA 95616-8584, USA

Summary &mdash; With the usual insemination method the sting chamber is kept open by two hooks and thesting retracted with the dorsal hook (sting hook). With the new apparatus, and the ’flexible’ insemina-tion technique, hook supports are no longer required. The sting is simply grasped by a pair of forcepsand pulled up to create a large opening into which the insemination syringe can be easily inserted. Thesternite is kept in place by a small hook attached to the queen holding tube. In 10 pairs of queensinseminated with either the classical (A) or the new (B) method, no differences were found in the num-ber of spermatozoa that reached the spermatheca. Queens inseminated with 5 &mu;l semen had 2.7 + 0.3million (A; n = 6), and 2.8 + 0.9 million (B; n = 6) spermatozoa in the spermatheca. With 10 &mu;l sementhe average was 4.7 + 1.0 million (A; n = 4), and 4.9 + 1.4 million (B; n = 4) spermatozoa in the sper-matheca. Size and costs of the equipment are significantly reduced and the insemination routinebecomes faster.

Apis mellifera / reproduction / instrumental insemination / equipment

INTRODUCTION

Instrumental insemination of queen bees is

accomplished with a complex apparatusthat keeps the queen narcotized and heldin position (Laidlaw, 1949; Ruttner et al,1974; Laidlaw and Lorenzen, 1977; Laid-law and Goss, 1990; Woyke, 1991). Usu-ally the sting chamber is kept open by twohooks (Nolan 1932, 1937a, b), one ventralhook and one dorsal or sting hook (Laid-law, 1944). With the aid of a probe, or with

the syringe tip itself, the valvefold is liftedto allow the syringe to enter the queen’smedian oviduct (Laidlaw, 1944, 1977; Mack-ensen, and Roberts, 1948; Ruttner, 1975;Schley, 1983; Harbo, 1985; Moritz, 1989).Correct placement of the hooks is essen-tial and alignment of the syringe a matterof experience.

After more knowledge about anatomicaldetails during the mating flight became avail-able (Koeniger, 1984) new dorsal hookshave been designed (Schafferhans, 1987;

Schley 1988) and the ’flexible inseminationtechnique’ without dorsal hook was devel-oped (Kühnert, 1989, 1991). The insemi-nation procedure has thus become lesscomplicated, however, equipment hasbecome sophisticated and expensive in the’classical’ insemination method. Our objec-tive was to simplify the apparatus so theaverage bee breeder will be able to afford

the equipment. A new insemination appa-ratus has been designed which is both sim-ple and inexpensive.

MATERIALS AND METHODS

Insemination equipment

General description (fig 1A)

The base of the apparatus is a metal block inwhich the CO2 supply tube connects the Laidlaw-Goss queen holder. A new type of ventral hook isfastened to one side of the queen holder tube

like a pencil holding clip. It can be adjusted upand down as needed. The dorsal hook (stinghook) is eliminated and a hand-held pair of for-ceps is used (Kühnert, 1989, 1991). The type ofsyringe and syringe holder can be of variousdesigns. We used a rack and pinion syringe slideafter Ruttner et al (1974) and a Schley (1982)syringe. A 180-220 mm syringe post is recom-mended, fixed to a base plate of any convenientsize to fit over or under the binocular base. The

stand can also be separate.The base with the queen holder can be easily

moved out of the way when space is needed for

semen collection. For easy repositioning, twomarks on the microscope stage and matchingones on the queen holder base are useful. Anyconvenient orientation to the microscope may beused. Leaning the base against two microscopeclamps (fig 2C) or against suction cups preventssliding. If a base plate that carries the syringeholder post is used above the microscope stage,a position guide can be made of a right anglebrass fixed to the plate. The two arms fit againstthe edge of the properly placed queen-holdingbase.

Construction details of the apparatus(fig1B)

The base for the queen holder is a 20-mm thick

disk cut from a brass rod 60 mm in diameter (1).The bottom side of the disk is recessed 2 mm to

avoid ’rocking’ on a surface (2). A blind hole,6 mm in diameter (optionally threaded) is drilledfrom the top, 18 mm from one side at the pre-ferred angle (25° to 32° from perpendicular) (3).Another hole is drilled from the side into the slant-

ing blind hole to receive a brass tube ’fitting’ forattachment of Latex tubing for conduction of CO2(4). The stopper, a tube that fits into the 6-mmslanted hole (5), holds the queen holding tube(8) and allows CO2 access. It is made accordingto Laidlaw and Goss (1990) with a CO2 outlet at

the flattened end (6) and a rubber O-ring (7) forthe queen holding tube to sit on and prevent CO2leakage. A piece of 10 X 33 mm sheet metal(brass) (9) is shaped to gird the queen holdingtube just tight enough to be easily moved up anddown. This clasp carries the ventral hook (10)which is made of a piece of 0.2 mm stainlesssteel wire welded or glued to the outside of theclasp. The wire is shortened to exceed the metalby 15 to 18 mm and is hammered flat at the pro-truding end. Cutting edges are ground. The wireis bent to form a hook that grips the sternite ofthe queen.

Insemination procedure

To introduce the queen into the holding tube theCO2 gas is turned on and the clasp with the ven-tral hook is slid towards the upper end of the

queen holding tube (fig 2A). The queen’s headis introduced into the tube and upon crawling intothe tube, she is immediately narcotized. Asqueens tend to bend ventrally it is easier to havethe queen’s dorsal side facing left (towards theventral hook). In this case the holding tube withthe narcotized queen is then rotated 180° (whilethe clasp is kept in place) to have the queen incorrect position for insemination (ventral side tothe left, dorsal to the right). Queens can also benarcotized in their cages before introduction intothe queen holder. The semen syringe is alignedwith the queen holding tube and the clasp is low-ered until the ventral hook catches the sternum ofthe queen (fig 2B). If necessary a needle or hookcan be used to open the queen’s sting chamber.

With pointed forceps the sting is gripped and liftedin the dorsal direction (fig 2C,D). To get hold of thesting with a steady left hand it is important to sup-port the elbow and the hand, regardless ofwhether the sting is grasped from the rear of theapparatus (fig 2C) or from the front. While liftingthe sting with forceps the sting chamber isstretched and opens forming a funnel. Minor cor-rections of the queen’s position are possible bycareful sting movements until the vaginal orificebecomes clearly visible and the tip of the insem-ination syringe can be inserted guided by the twobasal arms of the sting. After semen is insertedthe queen holding tube is removed from the stop-per and the queen is shaken or blown head firstout of the tube.

Comparison of efficacy of the noveland the traditional apparatus

The efficacy of the above insemination apparatusand method (B) was compared to the classicalinsemination apparatus and method (A) usingthe conventional ventral hook, dorsal hook andvalvefold probe. Glass tips were used in bothcases.

Twenty queens were inseminated with 5 &mu;l or10 &mu;l semen from consecutive portions of stirredsemen in a syringe by random choice of theinsemination apparatus. They received a 5-minCO2 treatment 24 h prior to insemination. Thequeens were kept in mating nucs with about 1500workers. Four or six weeks after insemination thenumber of spermatozoa in the spermatheca wascounted in 10 pairs of queens with a Fuchs-Rosenthal haemacytometer.

RESULTS AND DISCUSSION

There was no difference (table I) in the num-ber of spermatozoa found in the sperma-theca of queens inseminated by the twomethods (t = 0.36, ns, DF=9). All queenbees had normal reproductive organs anddid not show any sign of damage. With thenew apparatus the number of spermatozoafound in the spermatheca is within the rangefound by Mackensen (1964) and Woyke(1971).

One of the major advantages of the newdevice is that it can be manufactured at lowcosts with standard parts. Using the new’clip-on’ hook and a pair of forceps, the con-ventional pairs of expensive hooks, standsand hook holders are no longer necessary.Additionally, mobility of the queen blockallows plenty of space during semen col-lection and queen manipulation. Reposi-tioning is easily accomplished with matchingmarks around the block and on the micro-

scope stage or syringe stand. Also thequeen’s position can be corrected preciselyby fractional horizontal movements of thesmall block. Thus it is possible to use a sim-ple type of syringe holder. If a fixed posi-tion is preferred the queen block can beconnected to the syringe stand.

One problem with the classical insemi-nation apparatus is that the working dis-tance is too small to be used with manycommon microscopes. Low height and smallsize of the new insemination apparatus plusthe ability to move the syringe stand furtheraway from the queen holder permit moretypes of microscopes to be used withoutalterations. To utilize lower working dis-tances, four holes for the stopper weredrilled into the base plate at angles of 25°,27°, 29° and 32°. We preferred to work atthe 25° angle, but even with working dis-tances lower than that implied by the 32°angle, there is no hook to hinder insertion ofthe syringe. The new device allows the useof various syringe designs, including thosewith very long capillary tubes.

Narcotizing the queens before placingthem into the queen holder eases the intro-duction procedure and makes sure that theduration of CO2 treatment is sufficient tostart onset of oviposition.

After 5 years experience in using forcepsinstead of a dorsal hook, we have foundthat the insemination procedure can beaccomplished with the same success rate inabout 20% less time. By lifting the sting withforceps the vaginal opening becomes visible

which makes insertion of the syringe mucheasier. Sometimes the vaginal orifice openswide enough to see the valvefold being laiddown or erected by pulling the sting.

It is intended that this new apparatus willmake instrumental insemination more widelyavailable to bee breeders. In teachingclasses at the University of Western Syd-ney (Hawkesbury), Australia and at beeresearch institutes in Kirchhain, and inOberursel, Germany the ’flexible insemina-tion technique’ was rapidly learned by bee-keepers. Since only 10-fold magnificationis necessary, it may be possible to replacethe binocular microscope in the future witha simpler and economical magnifying

device. Practical use will show whether the

described apparatus will be accepted andhelps to make instrumental inseminationmore commonly used in bee breeding.

ACKNOWLEDGMENTS

We dedicate this work to Prof F Ruttner at his

80th birthday, who is a pioneer of instrumentalinsemination of queen bees.

We are grateful to N Koeniger and S Fuchsfor support and comments on the manuscript.We thank P Walzer for manufacturing the appa-ratus, Ch Rau for the photographs, and A Mohr forthe drawing.

Deutsche Version

Vereinfachter Apparat zur instrumentellenBesamung von Bienenköniginnen mitder ’Flexiblen Besamungsmethode’

Zusammenfassung &mdash; Bei der herkömmlichen Besamungsmethode halten zwei Häkchen die Sta-chelkammer geöffnet, wobei der dorsale Haken den Stachelapparat zurückhält, die darunterliegendeVaginalöffnung jedoch nicht sichtbar wird. Mit dem neuen Apparat und der "Flexiblen Besamungs-methode" werden Häkchenhalterungen überflüssig. Der Ventralhaken ist verschiebbar auf das geradeKöniginnenröhrchen aufgesteckt. Mit einer Pinzette wird der Königinnenstachel angehoben und nachdorsal bewegt, bis die Vaginalöffnung deutlich sichtbar ist und die Besamungsspritze eingeführt wer-den kann. In einem Vergleich zwischen Besamungen mit herkömmlicher Methode und -Gerät (A) unddem neuen Gerät (B) wurde kein Unterschied in der Anzahl der Spermien, die die Spermatheka errei-chen, festgestellt. Königinnen, die mit 5 &mu;l Sperma besamt waren, hatten 2.7 ± 0.3 Millionen Spermien(n = 6) (A), und 2.8 ± 0.9 Millionen Spermien (n = 6) (B) in der Spermatheka. Mit 10 &mu;l Besamungsmengelag der Durchschnitt bei 4.7 ± 1.0 Millionen (n = 4) (A) und 4.9 ± 1.4 Millionen (n = 4) (B) Spermien inder Spermatheka. Das Gerät ist leicht und preiswert herzustellen. Die Methode ist schnell zu erlernenund die Besamung damit ist einfach und zeitsparend.

Apis mellifera / Reproduktion / instrumentelle Besamung / Besamungsapparate

EINLEITUNG

Instrumentelle Besamung von Bienenköni-ginnen wird mit Hilfe von kompliziertenApparaten durchgeführt, in welchen dieKönigin narkotisiert und in der Besamungs-position festgehalten wird (Laidlaw, 1949;Ruttner et al, 1974; Laidlaw und Lorenzen,1977). Meist wird die Stachelkammer mitzwei Haken offen gehalten (Nolan, 1932,1937a, b), einem Ventralhaken und einemDorsal- oder Stachelhaken (Laidlaw, 1944).Unter Zuhilfenahme einer Sonde oder mitder Besamungsspritze selbst mu&szlig; die

Scheidenklappe (Valvula vaginalis) ange-hoben werden, um die Besamungsspritzein den mittleren Eileiter einführen zu kön-nen (Laidlaw, 1944, 1977; Mackensen undRoberts, 1948; Ruttner, 1975; Schley, 1983;Harbo, 1985; Moritz, 1989). Korrektes Ein-setzen und Form des Dorsalhakens warenebenso ausschlaggebend für den Erfolg wiedas Ausrichten der Spritze auf die meistverdeckte Vaginalöffnung.

Nachdem Arbeiten von Koeniger (1984)Aufschlu&szlig; über die anatomischen Verhält-nisse beim Paarungsflug gaben, folgten Ver-änderungen der Dorsalhaken (Schafferhans,1987; Schley, 1988) sowie die Entwicklungder ’Flexiblen Besamungsmethode’ ohneDorsalhaken (Kühnert, 1989, 1991). TrotzNeuerungen bei den Besamungsapparaten(Laidlaw und Goss, 1990; Woyke, 1991) blie-ben diese doch kompliziert und teuer. UnserAnliegen war es, das Gerät so zu vereinfa-chen, da&szlig; jeder interessierte Imker es kau-fen (oder bauen) und handhaben kann.

MATERIAL UND METHODE

Besamungsinstrument

Allgemeine Beschreibung (Abb 1 A)

Das Gerät besteht aus einer Metallscheibe, inwelcher die CO2-Zuleitung auf den Laidlaw-Goss

Königinnenhalter trifft. Ein neuartiger Ventralha-ken ist an einer ’Spange’befestigt, die um dasKöniginnenröhrchen greift (ähnlich der Halte-klemme an einem Schreibstift). Der Haken kannmit der Spange auf und ab bewegt werden. DerDorsalhaken (Stachelhaken) wird durch einehandgeführte Pinzette ersetzt (Kühnert 1989,1991). Unterschiedlicher Königinnengrö&szlig;e kanndurch Verschieben des O-Ringes am StopperRechnung getragen werden. Die Besamungs-spritze und deren Haltesystem sind beliebig undstehen separat. Wir benutzten vorwiegend einenSpritzenblock mit Schwalbenschwanz-Feintrieb-element nach Ruttner et al (1974), oder die Sprit-zenführung der Fa. Swienty (Dänemark) und eineKolbenbesamungsspritze nach Schley (1982).Die Trägersäule für den Spritzenblock ist 180 bis220 mm hoch und ruht in einer Grundplatte, derenGrö&szlig;e sich nach der Art ihrer Verwendung richtet.Für mehr Bewegungsfreiheit bei der Spermaauf-nahme, kann der Königinnenblock leicht beiseitegestellt werden. Markierungen auf dem Mikros-koptisch erleichtern exaktes Zurückstellen in diegewünschte Position. Zwei Mikroskopklemmenverhindern versehentliches Verschieben. (Abb2C). Soll die Grundplatte der Spritzen-Haltesäuleüber den Mikroskopfu&szlig; reichen, kann ein ent-sprechender Anschlag aus einem Metallwinkeldarauf befestigt werden.

Einzelheiten zur Konstruktiondes Apparates (Abb 1 B)

Die Grundplatte für den Königinnenhalter bestehtaus einer 20-mm dicken Messingscheibe mit 60mm Durchmesser (1). Die Unterseite der Scheibeist 2 mm tief ausgefräst, um eine einwandfreieStandfestigkeit zu gewährleisten (2). Eine 6 mmBohrung mit Gewinde wird 18 mm vom Rand ent-fernt im gewünschten Arbeitswinkel angebracht(3). Eine seitliche Bohrung in die Scheibe wirdso geführt, da&szlig; sie auf die erste Bohrung trifft.Die Öffnung erhält ein Ansatzstück für den CO2-Schlauch (4). Der Königinnenhalter nach Laid-law und Goss (1990) besteht aus dem Stopper(5), einem oben abgeflachten Metallröhrchen mitCO2-Ausla&szlig;öffnungen (6), das in die schräge6 mm Bohrung pa&szlig;t. Ein 35 mm langes Acryl-oder Plexiglasrohr dient als Königinnenhal-teröhrchen (8). Letzteres wird durch einen ver-schiebbaren O-Ring am Stopper getragen undlängenvariabel (7). Ein 10 x 33 mm gro&szlig;es Blech-stück wird zu einer offenen ’Spange’ geformt, diedas Königinnenröhrchen fest umgreift (9), jedoch

verschiebbar bleibt. Der Ventralhaken (10) bestehtaus Edelstahldraht (0.2 mm), der auf die Spangegeschwei&szlig;t wird und diese um ca 18 mm über-ragt. Das Drahtende wird flachgehämmert,beschliffen und zur Mitte des Lumens umgebo-gen.

Besamungsvorgang

Zum Einsetzen der Königin bleibt das Halteröhr-chen auf dem Stopper, die CO2-Zufuhr ist geöff-net und die Spange mit dem Ventralhaken ganznach oben geschoben (Abb 2A). Man lä&szlig;t die

Königin in das Röhrchen einlaufen und sobaldsie den Stopper erreicht hat, setzt die Narkoseein. Narkotisiert man die Königin bereits zum Ein-setzen, gewährleistet dies auch bei sehr kurzemBesamungsvorgang die Induktion der Eiablage.Um die Königin in die richtige Besamungsposi-tion zu bekommen, wird das Königinnenröhrchenin der Spange gedreht, bis die Ventralseite nachlinks zeigt. Die Besamungsspritze wird in derLängsachse der Königin justiert und die Spangeheruntergeschoben, bis der Ventralhaken überden Sternit der Königin greift (Abb 2B). Wennnötig, kann eine Nadel oder ein Häkchen zumÖffnen der Stachelkammer verwendet werden.Mit einer spitzen Pinzette wird der Stachel gegrif-fen und in dorsale Richtung angehoben (Abb2C,D). Zur ruhigen Pinzettenführung ist es rat-sam, Ellbogen und linke Hand locker aufzulegen,gleich ob der Stachel hinter dem Besamungsap-parat gegriffen wird (Abb 2C) oder von vorn.Durch das Anheben des Stachels wird die Sta-chelkammer gestreckt und formt einen Trichter, andessen Boden die Vaginalöffnung deutlich sicht-bar wird. Durch vorsichtiges Hin- und Herbewe-gen des Stachels sind feine Positionskorrektu-ren möglich. Die Besamungsspritze kann nun,geleitet von der Rinne zwischen den Stachel-platten, eingeführt werden. Meist kann der Stachelschon während des Spermainjizierens freigege-ben werden. Nach der Besamung wird die Köni-gin mit dem Kopf voran aus dem Halteröhrchengeschüttelt oder geblasen.

Vergleich der Effektivität des neuen unddes traditionellen Besamungsapparates

Die Effektivität des obigen Apparates (B) und derflexiblen Besamungsmethode wurde mit der her-kömmlichen Technik (A) verglichen.

Zwanzig Königinnen wurden bei zufälligerWahl des Besamungsapparates mit je 5 &mu;l oder10 &mu;l einer gerührten Spermamenge besamt. DieKöniginnen wurden in Kirchhainer Begattungs-kästchen mit ca 1500 Arbeiterinnen gehalten. 24Stunden vor der Besamung erhielten sie eine 5-min CO2-Narkose. Vier bis sechs Wochen nachder Besamung wurden bei 10 Königinnen-Paarendie Spermien aus den Spermatheken mit einemFuchs-Rosenthal Haemacytometer gezählt.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Zwischen beiden Apparaten und Methodenergab sich kein signifikanter Unterschied(t = 0,36, ns, DF=9) (Tabelle I). Alle Köni-ginnen hatten normal entwickelte Ovarienund zeigten keine Anzeichen einer Verlet-zung. Die Anzahl der Spermien in den Sper-matheken entsprach den Werten, die vonMackensen (1964) und Woyke (1971)gefunden wurden.

Einer der Hauptvorteile des neuen Appa-rates ist, da&szlig; er zu niedrigen Kosten ausStandardteilen hergestellt werden kann. Dieneue Ventralhaken-Spange und die Benut-zung einer Pinzette machen die herkömm-

lichen, teuren Hakenpaare und -Haltevor-richtungen überflüssig. Die geringe Grö&szlig;edes Königinnenblockes erlaubt, ihn leichtbeiseite zu stellen, um mehr Bewegungs-freiheit während der Spermaaufnahme undzum Einsetzen der Königin zu haben. Daminimale Positionskorrekturen noch durch

Verschieben des Königinnenblockes vor-genommen werden können, ist es möglich,einen einfachen Spritzenhalter zu verwen-den. Wird eine starre Position von Königin-nenblock und Spritzenhalter bevorzugt,könnte man diese miteinander verbinden.

Ein Problem bei herkömmlichen

Besamungsapparaten war, da&szlig; viele Mikro-

skope nur einen niedrigen Arbeitsabstandzulassen. Die geringe Höhe des neuenKöniginnenblockes, die flexible Position desSpritzen-Ständers und vier Bohrungen mitverschiedenen Neigungswinkeln ermögli-

chen den Einsatz einer grö&szlig;eren Anzahlhandelsüblicher Mikroskopfabrikate ohneUmbau. Jede beliebige Ausrichtung desGerätes nach ergonomischen Gesichts-punkten ist möglich. Alle Besamunsgssprit-zen mit entsprechender Halterung könnenverwendet werden. Die Justierung derSpritze zum Einführen in die Geschlechts-wege ist einfach. Da die Königin nunmehrbei der Besamung langgestreckt wird undihr Genitaltrakt nicht, wie bisher, bajonett-förmig geknickt ist (Ruttner, 1975), wird dieBesamungsspritze in Verlängerung derKöniginnenachse ausgerichtet. Durch dasSichtbarwerden der Vaginalöffnung beimBewegen des Stachels wird der Zielpunktfür die Spritze eindeutig vorgegeben unddiese kann ohne Behinderung durch Hakeneingeführt werden. Es konnte durch dieVaginalöffnung beobachtet werden, wie sichdie dahinterliegende Scheidenklappe durchHochziehen des Stachels niederlegen bzwwieder aufrichten lä&szlig;t.

In fünfjähriger Praxis mit der ’FlexiblenBesamungsmethode’ zeigte sich, da&szlig; die

Besamungen mit gleicher Erfolgsrate bei20%iger Zeitersparnis durchgeführt werdenkönnen.

In Besamungskursen an der Universitätvon West Sydney (Hawkesbury), Australienund in den Forschungsinstituten in Kirch-hain und Oberursel lernten Imker die ’Fle-xible Besamungsmethode’ sehr schnell. Danur eine 10-fache Vergrö&szlig;erung nötig ist,wäre es denkbar das Mikroskop in Zukunftdurch einfachere Geräte zu ersetzen.

Wir hoffen, da&szlig; das neue Besamungs-gerät zu einer breiteren Anwendung derinstrumentellen Besamung beitragen wird.

DANKSAGUNG

Diese Arbeit ist Prof F Ruttner zum 80. Geburts-

tag gewidmet, der ein Wegbereiter auf demGebiet der instrumentellen Besamung von Bie-nenköniginnen ist. Wir danken N Koeniger undS Fuchs für Unterstützung und wertvolle Diskus-

sionen bei der Erstellung des Manuskriptes. Wirmöchten P Walzer für den Bau des Gerätesebenso danken wie Ch Rau für die Fotos und AMohr für die Zeichnung.

Résumé &mdash; Appareil simplifié pour l’insé-mination artificielle des reines d’abeillesavec la technique dite de «l’insémina-tion flexible». Il existe de nombreuxmodèles d’appareils pour l’insémination arti-ficielle des reines d’abeilles. En général onmaintient la chambre de l’aiguillon ouvertepar 2 crochets (Nolan, 1932,1937a, b ; Laid-law, 1944) pour introduire (éventuellementavec l’aide d’une sonde) la seringue d’insé-mination dans l’ouverture vaginale (Laid-law, 1944, 1977 ; Mackensen et Roberts,1948 ; Ruttner, 1975 ; Schley, 1983 ; Harbo,1985). De nombreuses propositions d’amé-liorations ont été publiées dans les annéespassées en s’appuyant sur les nouvellesconnaissances concernant les détails ana-

tomiques au cours du vol nuptial (Koeniger,1984) et la technique s’est, de ce fait, trèssimplifiée (Schafferhans, 1987, Schley,1988, Kühnert, 1989, 1991 ; Laidlaw etGoss, 1990 ; Woyke, 1991 et de nombreuxautres auteurs). Néanmoins l’appareil à insé-miner reste un outil relativement compliquéet coûteux. Nous présentons ici un nouvelappareil, très simple et peu coûteux à pro-duire à partir de pièces disponibles dans lecommerce. L’outil (fig 1A,B) comporte undisque en laiton plein, évidé par dessous(fig 1 B, 1 + 2) avec une perforation obliquede 6 mm (3) qui aboutit à une perforationlatérale où arrive le CO2 (4). L’arrêt (5) dutube de contention de la reine est enfoncé

(ou vissé) dans la perforation selon Laid-law-Goss (1990). Un nouveau crochet ven-tral (10), constitué d’un fil en acier spécial(0,2 mm) recourbé, est soudé à une bouclemétallique (9) qui enserre le tube de conten-tion de la reine (8). Pendant qu’on envoiele CO2, on fait entrer la reine dans le tube decontention (8) qui repose sur l’anneau decaoutchouc de l’arrêt (7) (le côté dorsal de

la reine est tourné vers la gauche, en direc-tion du crochet ventral). La boucle métal-lique avec le crochet ventral (9 + 10) estalors complètement poussée vers le haut(fig 2A). Avant l’insémination le tube decontention (8) subit une rotation de 180°dans la boucle métallique (9) de sorte que laface ventrale soit tournée vers la gauche.Si la chambre de l’aiguillon de la reine nes’ouvre pas d’elle-même, on peut l’y aideravec une aiguille (ou la sonde). Lorsquel’on pousse vers le bas la boucle métallique,le crochet ventral saisit le sternite et le main-tient en position durant l’insémination (fig2B). La reine peut également être mise dansle tube de contention une fois anesthésiée.

L’appareil est facile à déplacer et ne doitêtre installé dans le champ de vision de labinoculaire, à l’endroit marqué précédem-ment, que peu de temps avant l’insémina-tion, ce qui laisse beaucoup de liberté demouvement pour le prélèvement du sperme.La mobilité de l’appareil avec la reine anes-thésiée permet aussi d’utiliser un porte-

seringue très simple, puisque les correc-tions horizontales de position peuvent êtrefaites avec l’appareil au lieu d’être faitesavec la seringue. À l’aide d’une pince poin-tue, l’aiguillon de la reine peut être facile-ment soulevé dans la direction dorsale (fig2D) jusqu’à ce que l’ouverture vaginale soitvisible. Dans cette méthode «flexible»d’insémination d’après Kühnert (1989, 1990)le système du crochet dorsal a été remplacépar une pince tenue à la main. On a com-paré le résultat d’inséminations faites avecla méthode traditionnelle et l’appareil A etavec le nouvel appareil B : aucune diffé-rence n’a été trouvée dans le nombre de

spermatozoïdes présents dans la sperma-thèque (tableau I). L’appareil est facile etbon marché à fabriquer, mis à part les cro-chets et les supports. La méthode est facileà apprendre ; l’insémination en est simplifiéeet raccourcie en temps.

Apis mellifera / insémination artificielle /appareil / reproduction

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