INSTITUT ZA OCEANOGRAFIJU I RIBARSTVO - SPLITSFR JUGOSLAVIJA

No. 25 BILJEŠKE-NOTES 1969.

Biokemijska istraživanja planktona u JadranuI Dio Pre 1i m i n arn a i s P i t iva n j a b i o k e m i j s k .og s a s t a v asveukupnog zooplanktona Kaštelanskog zaljeva

Biochemical Studies. of Plankton in AdriaticPreliminary s tu d y of b i o c h e m i c a 1 co m p .os i t i o n

of zooplankton of the Kaštela Bay

T. V uce t i c,* A. Dam jan i c** i A. C u bre tov i c**

* Institut za oceanografiju i ribaJrStvo, Split** Zavod za organsku kemiju, Kemijsko-tehnološki fakultet, Split

UVOD

U ekologiji mora sve se v,iše pristupa ispitJivam.jima variranja kemijskogsastava organizama, a narocito pri utvrdivanju uvjeta za produktivnost mor-skih populacija.

za bolje razumjevanje kretanja ene["gije, tj. pretvclranja al10rganskematerije u orga!IlSkiu preko razlicitih lanaca ishrane u moru, poovec]1je se pa~njasadržaju energije kod planktonskih organizama. Kod tog prijenooa ulogaplanktona (fitoplanktona i zooplanktona) studiJra se kvantitatiV1Ilo. Narocitosu potrebni podaci o zooplanktoruskim oQlI'ganizmima ili drugoj karici u produk-oioQnOffilall1cu u manu, a važnoj za ishranu trece ili posljednje nama najlintere-santnije karike..,ribama. Narocito je potrebno detaljnije poznavanje fiziolog-ije ibiokemije ,pojediI1aCll1Jihvrsta woplanktona.

Do sada je :u Jadranu samo -ispitivan kemijski sastav ruba i školjkaša(Krvaric, 1955; Marinkovic, 1968), dok za planktonske organizme nema nikakvihpodataka pa se smatralo potrebnim da se pristupi i ovoj vrsti !istraživanja.

U ovom radu iznooe se ~ltati prelrl.miniranih bLokemijskih istraživanjasveukupnog zooplanktona Kaštelanskog zaljeva iz razdoblja od ltpnja dolistopada 1968. godine. Svrha ,rada bila je da se lispitaju u prvom redu metodeanaliza s obzirom na pos.tojece laboratorijske uvjete ili ~"Perimenta1ne mogu-cnosti te nakon toga utvrdi huduci smjer istraživanja.

~-

INSTITUT' ZA OCEANOGRAFIJU I RIBARSTVO - SPLITSFR JUGOSLAVIJA

Na. 25 BILJEŠKE-NOTES 1969.

Biokemijska istraživanja planktona u JadranuI Dio Pre lim i n arn a i ISP i t iva n j a b i o k e m i j ISkog s as t a v asveukupnag zaaplanktana Kaštelanskag zaljeva

Biochemical Studies' of Plankton in AdriaticPr eli mi na r y s tu d y of b i o c h e mi c ale o m p o s i t i o n

of zooplankton of the Kaštela Bay

T. V uce t i c,* A. Dam jan i c** i A. C u bre t 0'vi c**

* Ins1Jitut za oceanografiju i ribarstvo, Split** Zavod za organsku kemiju, Kemijsko-tehnološki fakultet, Š!>lit

UVOD

U ekologiji mora sve se v,iše pristupa iSJPit~vam.jima variranja kemijskogsastava arganizama, a naracita pri utvrdivanju uvjeta za praduktivnast mar-skih papulacij a.

za bolje razumjevanje kretanja energije, tj. pretvaranja anorganskematerije 'u orga!IlSkIu.preko razlicitih lam.aca ishrane u moTU, posvecuje se painjasadržaju energije kod planktolIlsk,ih organizama. Kod tog prijenosa ul9gaplanktona (fitoplanktona ;i zc>oplanktona) studira se kvan1JitatiV1flo. Narocitosu potrebni podaci o zooplanktorusikim orgamizmima ili drugoj karici 'u produk-oionom lamcu u moru, a važnoj za ishranu trece ili posljednje nama najlin.tere-santnije kaI1ike-il'ibama. Narocito je potrebno detaljnije poznavanje fiziologije ibiokemije pojedinaCil1lih vrsta zooplanMona.

Do sada je :u Jadranu samo -ispitivan kemijski sastav riba i školjkaša(Krvaric, 1955; Marinkovic, 1968), dok za planktonske organizme nema nikakvihpodataka pa se smatralo potrebnri.m da se pristupi i ovoj vrsti ;istraživanja.

U ovom radu ;iznose se rerz;u1tati prelrl.miniranih biokemij:skih istraživanjasveukupnag zooplanktona Kaštelanskag zaljeva iz razdoblja ad l~pnja dolistopada 1968. godine. Svrha .rada bila je da se ,ispitaju u prvom redu metodeanaliza s obzirom na postojece laboratorijske 'Ucvjete il;i ekl&perimentalne mogu-cnosti te nakon toga utvrdi. ibudru.ci smjer istraživanja. .

"-- - --

MATERIJAL I METODIKA

ZooplanktonlSki materijal za bioLošku obradu [kvantJitativno-kva1itativnisastav ili broj kopepoda, dekapoda i kopelata te suha težina sveukupnogzooplanktona (tab. I)] dobiven je vertikalnim potezima Hensenovom srežom100/75-svila. No 3. Uzorci planktona za kemijske analize (tab. II) dobiveni sudijagonalnim i sinusoida1nim potezima vecim sv1ilenim mrežama (Nansen 100/svila No. 3.).

Prije laboratorijske obrade uzorci su makroskopski i mikroskopski pregle-dani i oci,šceni od pnimjesa (od vecih algii ili anorganskih onecišcenja).

Vlažni materijal sušen je u termostatl1 na temperatwi od 60oe, onda jeu ta'nioniku uSlitnjen do brašnastog stanja te analizirali sadržaj: ukupna mast,pepeo, ukupan dUlšik i sastav amino-kise1ina. .

U k u p n e ma s ti - Sadržaj masti kod zooplanktona prvi je proucavaoBrandt (1898). Wimpenny je (1938) ustanovio da se najvece kolicine masti uSjevernom moru javljaju u lipnju, studenom i prosincu, a Fischer i HOGking(1962) u travnju, svibnju i kolovozu. Klalsicnu metodu za odredivanje ukupnemasti primijenili su Fischer (1961) i Giese (1967). Raymont i suradnici (1964)vršili S!U ekstrakciju sa smjesom kloroform-metanol (2:1). Ova metoda jemodificirana miješanjem uzorka zooplanktona sa zrncima kvarca, kako bi sepostigao što bolj,i kontakt otapala IS uzarkom iskra tiLo vrij eme potrebno zaekstrakciju. Ekstrakciju smo vršili u Soxhlet-aparatu sa smjesom kloroform me-tanol (2 :1) kroz 5 sati.

P e p e o - Odredivanje pepela kod zooplanktona izvršili su Raymont isuradniici' (1964) žarenjem uzoraka u mufolnoj peci na 5000e do konstantnetežine. U našim ispitivanjima povecali smo temperaturu žarenja na 8000e azatim smo prije v.aganja uzorak hladili u ek:sikatoru.

U k u p and u š i k - Prva odredivanja ukupnog dušika zooplanktona~pretežno kopepodi) izvršio je Brandt (1898), a zatim Brandt i Raben (1919).

-=-

Tabela I

KOLICINE (suha težina) I SASTAV ZOOPLANKTONA KAŠTELANSKOG ZALJEVA

1 2 3 4 5 6 7 8

ZoO/Pw I{ton K.ape- Cala- Deka- Ko[pe- RibljaDatum suha težina poda nulS h. poda lalta dalja La,rve Poliheta

mg/m3 No/m3 No/m3 Noylm3 No/m3 No/m3 NOI/m3 No!m3

17. VI 1968. 5,8 2,68 612 35 140 3 2,1 0,4

1. VII " 5,8 408 14 58 183 2 2,2 1,1

28. IX " 4,2 165 - 41 113 0,6 1,2 1,7

14.X " 4,2 258 7 2,3 26,4 1 1 1,7

29. X .. 4,2 258 7 23 26,6

Standa["dna metoda odredivanja ukupnog dušika u biološkim materijalima radje po Kjeldahlu uz varij8Jcije razlicitih reagenata i katalizatora Vogel (1958).Modifiairanu Kjeldahlovu metodu primijenili su Corner i Cowey (1964). Ray-mont i suradniici (1964) upotrijebili su konc. H2S04, a kao katalizator bakar.Pare NH3 uvodili su.u bornu kiselinu destilacijom s vodenom parom uz dodatakNaOH.

Tabela II

KEMIJSKI SASTAV ZOOPLANKTONA KASTELANSKOG ZALJEVA

Hri odredivanju ukupnog dušika (UN) pmmijeni1i smo Kje1dahlovu metoduuz proces digestije i destilacije. Kao reagens kod digestije primijenjena je konc.H2S04, a kao prikladan i lako dostupan katalizator CUS04 5H20. Nakon digestijedodana je Na OH te izvršena des1Jilacija u aparatu prema konstrukciji J. L.HOlskinsa. Dobiveni dušik u ob]iku amonijaka apsorbiran je u 0,04 N HC1.Višak kiiseline titriram. je sa 0,04 N NaOH uz metiloranž. Izvršen je takoder islijepi pokus uz gluikozu. Proracun ukupnog dušika izveden je po form).lli:

100 (VI-V2) . 0,5603O/OUN -

w

gdje je: Vt = Volumen utrošene 0,04 N HCl (u ml)V2 = Volumen utrošene 0,04 N NaOH za s.lijepi pokus (u ml)W = težina ukupnog uzorka zooplanktona (u mg)

P r ote i n i - Proteilr1i se mogu odrediti analizom sa biuret reagensomBaymont iLinford (1966). Uobicajeno je da se kolicina bjelancevina dobijemnoženjem postotka za ukupni dušik (UN) protein-konverzionim faktorom 6,25.Primjenom tog faktora izrazili smo postotak ukupnih bjelancevina u uzorcima.

Ami n o - k i s eli n e - Amino-kiseline u zooplanktonu postoje i kaoslobodne i u sastavu bjelanceV'ina. Za kvalitativno odredivanje amino-kiselin9.primijenili smo metodu kromatog["af.ije n.a papiru. -

1 2 3 4 5-

Ukupni B['o,j ,Datum Mast Pepeo dUiŠik (UN) Proteini ustaiIlovljenih

% % % % amino-k:iselina

17. VI 1968. 25,31. VII " 32,5

28. IX " 9.2 57,514. X " 18

29. X " 41,0 15,8 6,1 38,1 18-----

Slika 1. KROMATOGRAM AMINOKISELINA

(dvodimenzionalna-uzlazna metoda)

0.9. Q8.

0.7 0.6. as 0.4 0.3 0.2 0.1. . .

. . . . I

05.

Qt.

0.9

0.8-

0.7Leu

0.6o

O !leu

PheQ

0.5.:Met

8 0'1'1)'Val

0.4 o l'yr

0.3" Qpm Ala OThl

C QGIU

GIYO O SeI

0.1.

0.1"

'Arg

O O oHi,Lys n- butanoHedena ne\ella '<ls,-voda (4:1 :5)

4

o, QS 0.7 0.6.

0.3

Uzorci zooplanktona zagrijavani su sa 6 N HCI uz refluks kroz 24 sata.OhladelIla otopina je filtriralIla i cuvana u tamnoj boci. Kao test supstancijapripremljena je otopina smjese pojedinih definiranih amino-kiselina te nane-sena na papir za kromatografiju Whatman No 1 i razvijena u oba pravcauzlaznim postupkom sa sistemom otapala: n-butanol-Iedena octena kiselina -voda (4:1:5, vjv). Ukupno vrijeme razvijanja kromatograma iznosilo je 83 sata(43 + 40 sati) kod temperature termostata 18,3°C. UstanO!VljelIle su Rf - vr,ijed-noom' ia svakU arillno-lru3elinu rpo<:JSebnote karakteristicna obojenja prskanjem.Icr-omatograma sa 0,20f0-tnom vodenom otopinom ninhiidrina. Isti postupak pri-mijenjen je kod uzorka woplanktorna sa 0,02 mlotopine, uz razvijanje kromato-grama kroz 55 sati (29 + 26 sati) kod temperature 19,2°C. (Slika n

().9

O.6

0: I rO.7'"

I 1-0.6..."cclg I-Q5"cOJ'"cl

I I-Q4c":;-"'="

"0.3

0.2

O Asp

O3

- Cv!s! O. .

0.2 0.1

REZULTATI I DISKUSIJA

B ,io 1o.Š k e ana 1i z e - U podrucj u KaštelanskJOg zalj eva iS/pituj e sezooplankto.n vec dugi niz go.dina u sklopu kompleksnih oceano.grarfskih istraži-vanja (Vucetic, 1961). Kvalirtativn~kvantitativnim istraživanjima utvrdene susezonske i godišnje fluktuacije zao planktona (Vucetic, 1968).

Za analize biokemijsko.g sastava upotrijebljmi su uzorci sveukupnog~ooplankto.na. Kvalitativno-kvantitativni podaci o. sastavu zooplanktona uistraživanim mjesecima ukazuju na koje se grupe vrijednasti adnase. Utabeli I iznesene su vrijednosti (suhe težine u mg) zaaplanktona na m3.Ko.licine glavnih predstavnika ili no.silaca o.ve bio.mase izražene su brojemo.rganizama na m3. Zooplanikton Kaštelanskog zaljeva uglavnom je sastavljeno.d crustacea (kopepoda, dekapodn,ih larva i ostrakoda) i kop elata, dok ostalio.rganizmi dolaze razlicito u pojedinim sezonama. Od tih organizama neštoznacajniju ulogu igraju poliheti, riblja jaja i riblje lalTVe.

B i o.kern i j s k e ana 1i z e - Iz dobivenih rezultata prikazanih u tabeliII proizlazi da je zooplankton u J!ipnju zna1no siromašniji mastima nego ulistopadu. Vrijednosti od 25,3 do. 41,0% masti slicne su vrijednostima koje jedobio. Orr (1934) za korpepode (10,5 do. 47u/o). Nakai je (1955) dobio vrijednostiad 53,9% te sugerira karelaciju vrijednasti masti i prateina u zaaplanktonu'.

Ukupna kolicina pepela raC1.Lnata na suhu težinu kretala se u granicamaod 15,8 do 32,5%, dok ko.licina ukwpno.g dušika od 6,1 do. ~,2%. Primjenomprotein-konverzionog faktora dobili smo kolicinu proteina od 38,1 do. 57,5%.Te vrijednosti za kopepode u i:spiltivanjima Orra (1934) iznose do 77%, a kodBascheri i Mazza 50-60% od suhe težine.

Kvalitativnim odredivanjima amina-kiselina (sl. 1) ustanovili smo prisut-nost 18 amino-k'iselina cije Rf-vrijednosti i obojene reakcije odgovaraju litera-turnim podacima Rais i Macek (1963). Ustanovili smo. prisutnost slijedecihamina-kiselina: cistin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, serin, trea-nin, alanin, tirazin, triptafan, metianin, valin, fenil-alanin, izaleucin, leucin,pralin, arginin, lizin i histidin. Amina-kiseline cistin i triptofan Bascheri isuradnici (1968) ne spaminju kod svojih analiza, dak su .ostale amina-kiseline(za kaje su oni dali i kvantitativne padatke) identicne s našim rezultatima.

ZAKLJUCCL

;;

Kako. je u uvodu receno. ovo. su bili preliminarni potkus.i radi ispitivanjaek.sperimenta1nih uvjeta za rad. Prema dohivenim rezultatima sve vrijednostise kirecu u granicama vrijednosti drugih autora. Kompariranje padataka nijemaguce na malam braju mjerenja, ali kaa primjera kajem se maže diskutiratibila bi komparacija vrijednosti masti iz razlicitih sezo.na. Veci postotak. mastiu lovini iz listopada mo.že se pripisati drukcijem sastavu zooplankt<ma i to.vjerojatno. polihetnim crvima kojih je bilo 4 puta više nego. u uwrku iz lipnja.To je samo. pretpostavka, jer su vjerojatno .i drugi woplanktonski o.rganizmimogli imati veci broj uljnih kapljica, kao. pohranjenu rezervnu hranu.

U buducim istraživanj,ima bilo. bi dobro vršiti pelfmanentni nadzor zooplan-ktona Kaštelanskog zaljeva na jednomjesecnim uzo.rcima, te, ako tehnickemogucnosti dozvole, vršiti kvantitativne anaLize amina-kiselina na pojedinimpo biamasi jacim grupama ili zastupljenim zaaplanktonskim .organizmima.

KRATAK SADRŽAJ

Rad donosi podatke o prvim preliminarnim biokemijskim istražIivanjimaplanktona istolcne obale Jadrana.

Iznesene su ek.!;perimentalne mogucnosti i uvjeti irada. Na materijalu izKaštelanskog zaljeva za razdoblje od lipnja do listopada 1968. iZVflšene supreliminarne analize biokemijskog sastava sveukupnog zooplanktona i dobiveneSiU slijedece v:rijednosti u odnosu prema suhoj tvar,i: masti od 25,3-41,00/0,pepeo 15,8-32,50/0 bjelancevine 38,10/0-57,5, UN (ukupni dušik) 6,1-9,2% ikvahtahvmo je ustanovljeno 18 amino-kiselina.

BIO CHEMICAL STUDIES OF PLANKTON IN ADRIATIC

Prel i min ary study of biochemical compositionof zooplankton of the Kaštela Bay

T. V uce t i c,* A. Dam jan i c** and A. C u bre tov i c**

* Institute of Oceanography and Fisheries, Split

** Institute of Organic Chemistry-Faculty of Chemical Technology, Split

SUMMARY

Presented in this paper are the results of a preliminary study to determinethe biochemical composition of plankton from the eastern coast of Adriatic Sea.

Analytical procedures are desaribed and results obtained from the analysisof zooplankton collected in the Bay of Kaštela from June - Octobar 1968. arepr,esented.

Preliminary analysis of the total z.ooplankton samples gave the fol1owingvalues (percentage of dry material): fat-from 25,3, to 41,0 ash 15,8-32,5, protein

. 38,1-5},5, total nitrogen 6,1-9,2. Eighteen amino acids were detected.

LITERATURA

Bascheri, M. C. § Mazza J. 1968. Contribution Et l'etude biochemique du plancton.LI Va['liati,QIns des ,teneuTS en gluddes et en pr'OIteilI1€S des COIpe:podes du golfede Marseille. Rapp. Comm. int. MeI'. Medit. 19, 3, pp. 547-549.

Bascheri, M. C. comp. 1968. Contribution Et l'etude biochemique du plancton III Com-:pOISitio.n qualitative et qU3JrutitartJi!veen acildes amines de quelques lPI"elevementsdu golfe de Marseille. Rapp. Comm. int. MeI'. Medit. 19, 3, pp. 553-556.

Brandt, K. 1898. »Beitrage zur Kenntnis der chemischen Zusammensetzung des Plank-tons«. Wiss. MeeresulI1ltersuch. Aibt. Kiel. 3:43-90.

Brand!t, K., Ralben, E., 1919, »Zur KenntnilS der C1hemisohen ZusammenseltzulI1g desPlarlkitons«. WLs:s. Meeresuntersluch AJbt. Kiel. N. F. 19:175-2,10.

Corner, E. D. S., Cowey C. B. 1964, »Some Nitrogenous Constituents of the Plankton«,Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rav., 2:147-167.

F1isher, L. R. 1962. »The Totail LilPid iMaJteriail.in same specj,es of Marine ZOoQiplank1l:on«,Rapp. et proc. -verbaux des reunions, 153:129-136.

Fisher, L. R., Hosking, Z. D., 1962. »Vitamin A and fat in the herring (Clupea harengusL.) and in its food«, Mar. Res. No 4. Dept. Arg. Fisc. Scotl.

Krvaric-Škare, M. 1955. Seasonal variations in the chemical composition and nutri-tive value of Sardine (Sardina pilchardus Walb.) of the Central Adriatic. Proc.and tech. paper 3: 441-447.

Giese A. C., 1967. »Some Methods for Study of the Biochemical Constitution of MarineInvertebrates«. Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev. 5: 159-186.

Hais I. M., Macek L., 1963. »Handbuch der Papierchromatographie«, Band I. G. FisherVerlag, Jena str. 520-526.

Marinkovic-Roje, M. 1968. Sezonske varijacije kemijskog sastava dagnji (Mytilusgalloprovincialis Lamk.) iz Limskog kanala, Thalassia Jugoslavica, 4: 69-85.

Nakai, Z., 1955. »The chemical composition, volume, weight and size of the importantmarine plankton« Tokai Reg. Fish. Res. Lab. Spec. Publ., 5:12-23.

Orl', H. P. 1934. On the biology of Calanus finmarchicus Part. IV. Seasonal changesin the weight and chemical composition in Loch Fyne J. Mar. biol. Ass. U. K.,19:613-32.

Raymont J. E. G. Linford E., 1966., »Note on the Biochemical Composition of SomeMediterranean Zooplankton«, Int. Revue ges. Hydrobiol. 51 :485-488.

Raymont J. E. G. Austin J., Linford E., 1964. »Biochemical Studies on marineZooplankton 1. The Biochemical Composltion of Neomysis integer«, J. Cons. int.Explor. MeI'. 28 :354-363.

Vogel, A. I. 1958. »Elementary Practical Organic Chemistry-Quantitative OrganicAnalysis«, Longmans Green - London, 652-657.

Vucetic, T. 1967. Long term observations of zooplankton fluctuation in the Bay ofKaštela, Proc. gen. Fish. Coun. Medi t., 8 :261-65.

.

Vucetic, T. § Pucher-Petkovic, 1969. Long term observation of plankton fluctuationin the central Adriatic. Stud. Rev. gen. Fish. Coun. Medit., 41 :13-23.

Wimpenny, R. S., »A routine method for the estimation of fat in plankton and itsapplication to herring tissues«, J. Cons, int. Explor. MeI'. 13 :338-48.