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8/16/2019 Sesion 2 Espectrometria de Masas
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CURSO TEÓRICOCURSO TEÓRICO--PRÁCTICO DEPRÁCTICO DE
ESPECTROMETRÍA DE MASASESPECTROMETRÍA DE MASAS
Dra. Pilar Blasco
Dr. Pablo Candela
CURSO FORMACIÓN ESPECÍFICA PAS 2012
El ANALIZADOR esla parte principal delespectrómetro demasas.
Partes del Espectrómetro de MasasPartes del Espectrómetro de Masas
El resto decomponentes debenseleccionarse enfunción de su
compatibilidad y susprestaciones.
2
¿Qué ocurre en la Fuente de Ionización?¿Qué ocurre en la Fuente de Ionización?
IONES en FASE GAS
IONIZACIÓN FRAGMENTACIÓN? C6H5CO+
C6H5+
C4H3+
CH3CO+
C3H3++·
39
105
77
51
43VOLATILIZACIÓN
C6H5COCH5+
120
¿Qué ocurre en el Analizador?¿Qué ocurre en el Analizador?
m/z
A b u n d a n c i a
3
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CONDUCE los iones desde la fuente de ionizaciónhasta el detector.
SEPARA los iones en función de su RELACIÓN
Funciones del AnalizadorFunciones del Analizador
MASA/CARGA m/z .
SELECCIONA iones actuando como filtro.
4
MOVIMIENTO de IONES (o del HAZ de IONES) mediante unaOPTICA IÓNICA equivalente a la óptica del haz luminoso.
Movimiento de iones (o del haz iónico)Movimiento de iones (o del haz iónico)
5
MOVIMIENTO de IONES emplea diferentes elementos: rendijas,lentes, uso de campos eléctricos, magnéticos, de radiofrecuencia, …
Movimiento de iones (o del haz iónico)Movimiento de iones (o del haz iónico)
6
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Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
7
RESOLUCIÓN
PRECISIÓN DE MASA
RANGO de MASAS
Características que definen el analizadorCaracterísticas que definen el analizador
VELOCIDAD de ADQUISICIÓN
RANGO DINÁMICO LINEAL
8
¿¿¿Hay analizador ideal???
Cronología de los Analizadores en E.M.Cronología de los Analizadores en E.M.
1899-1912 Primerespectrómetro demasas
1946 Tiempo devuelo
1949 ICR1974 FT-ICR 2004 LITs
2000 Orbitrap
9
1918 Enfoquesimple (sector)
1952 Doble enfoque(sector)
1953 Quads
1950 FT-MS 1978 Triple Quads
1980 Trampa deiones
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Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
Sector MagnéticoSector Magnético
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
10
Sector MagnéticoSector Magnético
IÓN EN UN CAMPO MAGNÉTICO
m2 m3m1
m1 < m2 < m3
m B2R2
z 2V=
ECUACIÓN FUNDAMENTAL EC = ½ mv2 = zVFc = mv2 /RFm = zvB
zvB = mv2 /R v2 = 2zV/m
11
Sector MagnéticoSector Magnético m B2R2
z 2V=
12
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Sector MagnéticoSector Magnéticom B2R2
z 2V=MODOS DE TRABAJO:
B y V CONSTANTES, R VARIABLE
• VARIABLE B (BARRIDO MAGNÉTICO)• VARIABLE V (BARRIDO ELÉCTRICO)• PEAK-MATCHING
R CONSTANTE, B o V VARIABLE
13
Sector MagnéticoSector Magnético
m/z =74m/z =87m/z =143 BARRIDO
V o B
m B2R2
z 2V=
t0 t1 t2 tSCANt3
14
Sector MagnéticoSector MagnéticoRESOLUCIÓN: es baja debido a la gran dispersidad de energíascinéticas de los iones formados en la fuente.Solución:ANALIZADOR ELECTROSTÁTICO
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Sector MagnéticoSector Magnético
GEOMETRÍAS:
ENFOQUE SIMPLE
DOBLE ENFOQUE GEOMETRÍA NIER-JOHNSON
DOBLE ENFOQUE GEOMETRÍA INVERSA
TRIPLE ENFOQUE
16
Sector MagnéticoSector Magnético
CARACTERÍSTICAS
o Capacidad de medida de masa exacta
o Capacidad de realizar estudios cinéticos y de iones metastables.
o Modo de trabajo Peak-Matchingo Complejidad de manejo, elevado Coste y Mantenimiento
o IRMS
17
En la unidad de Espectrometría de Masas de los SSTTI Sector MagnéticoSector Magnético
DOBLE ENFOQUE (BE) TRIPLE ENFOQUE (EBE)
18
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Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
CuadrupolarCuadrupolar
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
19
CuadrupolarCuadrupolar
IÓN EN UN CUADRUPOLO
Un CUADRUPOLO está formado por CUATRO superficies
“barras” hiperbólicas, EQUIDISTANTES entre sí unadistancia R, sobre las que se aplica un voltaje de radio
frequencia (RF) y una corriente directa (DC).20
CuadrupolarCuadrupolar
Las barras positivas actúancomo un filtro de paso alto,
Cada pareja de barras opuestas están conectadas entre sí. Unade las parejas toma polaridad positiva y la otra negativa.
IÓN EN UN CUADRUPOLO: en la PRÁCTICA
filtrando las masas quetienen un valor de m/z pordebajo del valor deseado.
Las barras negativas actuancomo un filtro de paso bajo,filtrando las masas quetenga un valor de m/z porencima del valor deseado.
21
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CuadrupolarCuadrupolar
ECUACIÓN FUNDAMENTAL
Ecuaciones de Mathieu.
Solo ciertas combinacionesde U (α) y V (q) producentrayectorias estables parauna determinada relaciónmasa/carga.
22
CuadrupolarCuadrupolar
DIAGRAMAS DE ESTABILIDAD
Línea de barrido
23
BARRIDOMODOS DE TRABAJO:
BARRIDO (SCAN)
CuadrupolarCuadrupolar
o Información estructuralo Comparación con librerías
S/N ~1559.4
o Mejor Sensibilidad (S/N)o Mayor Selectividad SIM
24
S/N ~18630.2
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CuadrupolarCuadrupolar
CARACTERÍSTICAS
o Baja resolución (unidad)
o Rango de masas 5-4000 (dependiendo del modelo)
o Baja sensibilidad (en modo barrido)
o Elevada velocidad adquisición (2-10 espectros/segundo)
o Compacto, robusto, económico y de fácil manejo
25
Los CUADRUPOLOS cuando trabajan SOLO con RF no filtran iones,actúan como transmisores de iones. Para este fin también son usadosHEXAPOLOS y OCTAPOLOS.
CuadrupolarCuadrupolar
MULTIPOLOS
26
En la unidad de Espectrometría de Masas de la UA los equipos deGC/MS de baja resolución presentan este tipo de analizador (5en total).
CuadrupolarCuadrupolar
27
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Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
Trampa de ionesTrampa de iones
28
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
Trampa de ionesTrampa de iones
IÓN EN UN TRAMPA DE IONES
Consiste en un ELECTRODO con forma DE ANILLO y dos “TAPAS” ELIPSOIDES
en la parte superior e inferior, que crean un campo cuadrupolar 3D donde losiones son RETENIDOS de forma indefinida en una trayectoria circular.
También conocida como “Cuadrupolo Circular”, Trampa de iones de PAUL, QIT,
QUISTOR, Trampa 3D.29
Trampa de ionesTrampa de ionesECUACIÓN FUNDAMENTAL
30
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Trampa de ionesTrampa de iones
DIAGRAMAS DE ESTABILIDAD
31
MODOS DE TRABAJO:
Trampa de ionesTrampa de iones
La Trampa de Iones trabaja por ETAPAS:
1. ACUMULACIÓN de Iones en la Trampa
2. CIERRE de la trampa
3. EXPULSI N Secuencial de los Iones atrapados hacia el detector o
SELECCIÓN de Ión para su aislamiento.
4. FRAGMENTACIÓN del ión Seleccionado.
5. …
32
Trampa de ionesTrampa de ionesMODOS DE TRABAJO:
BARRIDO (SCAN) Expulsión en el límite de estabilidad Expulsión resonante
TRANSICIONES (MRM)
EXPERIMENTOS MS/MS o MSn
33
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MODOS DE TRABAJO:
BARRIDO (SCAN)
Trampa de ionesTrampa de iones
170 210 250 290
210
222
268 280165
1 90 2 10
210
1
2
1. AISLAMIENTO2. FRAGMENTACIÓN
ION PRECURSOR
TRANSICIONES (MRM)
EXPERIMENTOS MS/MS o MSn
150 170 190 210
210
158
191
160
158
190
191 3
.
210 → 158210 → 191
TRANSICIONES
IONES PRODUCTO
34
1-Acumulación
La energía deFragmentación se aplica
selectivamente. Sólo larecibe el Ión Precursor o
rango de iones que interesefragmentar
Trampa de ionesTrampa de iones
+
3-Excitación3
4-Fragmentación421
2-Aislamiento
Ión
Precursor
Espectrode Masasn
(n=1-11)
(C.I.D.: Disociación Inducida porColisión (con helio) del ión precursor)
Espectro
MSnMS/MSMS/…
En una Trampa el procesode transmisión de Iones
de “Fuente a Detector” esun proceso discontinuo
35
6-Detección6
5-Acumulación
de Fragmentos
5
He
He
Trampa de ionesTrampa de ionesCARACTERÍSTICAS
o Resolución variable, con la velocidad de barrido
o El cut-off (no permite el atrapado de todos los iones, 1/3).
o Elevada sensibilidad (en modo scan más que Q 100veces)
o Elevadas velocidades adquisición 2-10 espectros/s (=Q)
o MS/MS/MS/…(MSn) con MS/MS en el tiempo
o Aplicaciones en ANALISIS ESTRUCTURAL 36
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TRAMPAS LINEALES (2D)
Trampa de ionesTrampa de iones
37
Trampa de ionesTrampa de iones
En la unidad de Espectrometría de Masas de la UA
38
Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
39
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico
OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
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Tiempo de vueloTiempo de vuelo
IÓN EN UN TIEMPO DE VUELO (TOF)
ACELERACIÓNde los iones
VELOCIDADES
DETECCIÓN
TIEMPOS
40
Tiempo de vueloTiempo de vuelo
ECUACIÓN FUNDAMENTAL
EC = zV = 1/2 mv2
m/z = 2V / v2 = 2Vt2 / L2
41
Tiempo de vueloTiempo de vuelo
IONIZACIÓN
RETARDO
ACELERACIÓN
ANÁLISIS (VUELO)
DETECCIÓN
42
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Distribuciones temporales Distribuciones de E.Cinética inicial Distribuciones espaciales.
Tiempo de vueloTiempo de vueloRESOLUCIÓN.La resolución de iones se obtiene a partir de dt, por ello los iones debenabandonar la fuente al mismo tiempo (pulsos de nanosegundos).
Extracción pulsada (1-2 etapas) Voltajes elevados de aceleraciónTiempo de retardo Reflectores 1-2 eta as
REFLECTOR
s/REFLECTOR
c/REFLECTOR
43
Tiempo de vueloTiempo de vuelo
MODOS DE TRABAJO:
BARRIDO (SCAN)MALDI-TOF
100 fmol digerido de BSA
44
Tiempo de vueloTiempo de vueloCARACTERÍSTICAS
o Alta resolución (FWHMTRAP>Q
o Precio TOF>TRAP>Q 45
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Transformada de Fourier/Ión ciclotrónicoTransformada de Fourier/Ión ciclotrónico
MODO DE TRABAJO:
49
La parte fundamental de un instrumento de transformada deFourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan enórbitas bien definidas durante largos periodos. Tales cavidadesse construyen aprovechando el fenómeno de resonancia iónicaciclotrónica.
Transformada de Fourier/Ión ciclotrónicoTransformada de Fourier/Ión ciclotrónico
CARACTERÍSTICAS
o Alta resolución - Masa exacta Es posible alcanzar una resolución
extremadamente elevada (superior a 106) dado que las medidas de
frecuencia se pueden realizar con elevada precisión.o Los espectrómetros de masas FT proporcionan mejores relaciones
señal/ruido, velocidades mayores y sensibilidad y resolución más
elevadas. 50
Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
51
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico
OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos
OrbitrapOrbitrap
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OrbitrapOrbitrap
o Trabaja solo con DC.
o FT.
CARACTER STICAS
52
Sector MagnéticoSector Magnético
CuadrupolarCuadrupolar
Trampa de ionesTrampa de iones
Analizadores de MasasAnalizadores de Masas
53
Transformada de Fourier/IónTransformada de Fourier/Ión ciclotrónicociclotrónico
OrbitrapOrbitrap
Sistemas híbridosSistemas híbridos Sistemas híbridosSistemas híbridos
COMBINAR varios analizadores.
Para FAVORECER las VENTAJAS de cada uno, y EVITAR los
INCONVENIENTES.
Sistemas híbridosSistemas híbridos
e s m o zan me an e a com nac n e as en
su orden.
Es posible casi CUALQUIER COMBINACIÓN.
Permite realizar análisis de MS/MS en el ESPACIO.
54
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Sistemas híbridosSistemas híbridos
ENERGÍA CINÉTICA DE LOS IONES
CLASIFICACIÓN de los ANALIZADORES
MS/MS EN EL ESPACIO o EN EL TIEMPO
PODER DE RESOLUCIÓN o PRECISIÓN DE MEDIDA
55
Instrumentos Híbridos “Beam-Beam”
Instrumentos Híbridos “Beam-Trap”
QqQ, QTOF, BEBE, BEqQ o EBqQ, …
Sistemas híbridosSistemas híbridos
CLASIFICACIÓN
Instrumentos Híbridos “Trap-Beam”
Instrumentos Híbridos “Trap-Trap”
QIT, QqLIT, Q/FTICR, …
QIT/TOF, LIT/TOF, QTRAP, …
LIT/FT-ICR, LIT/Orbitrap, …
56
57
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20/28
Sistemas híbridosSistemas híbridos
ALGUNOS EJEMPLOS
58
QqQ QqTOF(QTOF)
Sistemas híbridosSistemas híbridos
ALGUNOS EJEMPLOS
59
QqTRAP(QTRAP)
EJERCICIOEJERCICIO
o Sector doble enfoque
(BE o EB)
o Químico de síntesis orgánico que quiere conocer la
masa exacta de un compuesto
o Bioquímico que quiere conocer el peso molecular de
Para cada aplicación elegir la opción más adecuadade analizador, teniendo en cuenta que no podemos
repetir!!!
60
o Cuadrupolo
o Tiempo de vuelo
o FT-ICR
una proteína relativamente grande (MW=300 000).
o EPA quiere confirmación del benceno en extractos
de 3000 muestras sólidas
o Químico de la industria petrolera quiere confirmar
la presencia de 55 compuestos únicos en un único
valor de masas nominal (m/z) en un espectro de
masas
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EJERCICIOEJERCICIO
o Sector doble enfoque (BE o EB)
Ordenar los analizadores siguientes según su
capacidad de realizar experimentos MS/MS en el
tiempo o en el espacio
o Trampa de iones
61
o Cuadrupolo
o QTOF
o FT-ICR
o QqQ (triple cuadrupolo)
o QTrap
o Tiempo de Vuelo
RESUMENRESUMEN
62
El DETECTOR esla parte final delespectrómetro demasas, donde se
Partes del Espectrómetro de MasasPartes del Espectrómetro de Masas
rea za e recuento elos iones separadospor el analizador,generando elespectro de masas.
63
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¿Qué ocurre en¿Qué ocurre en el detector?el detector?
+ + ++
SEÑAL+
+
+
HAZ IONICO
REGISTRO Y AMPLIFICACIÓN
I (V)
(-1200V TO -3000V)
E.M. VOLTS (CDEM)
QUADS
Diagrama de Barras Abundancia vs m/z 64
AMPLIFICACIÓN
RANGO de MASAS
SENSIBILIDAD
Características que definen el DetectorCaracterísticas que definen el Detector
VELOCIDAD de ADQUISICIÓN
65
Sensibi lidad, tiempo de respuesta y precisión son los factores quedeterminan el detector más adecuado.
La sensibilidad está determinada por los iones que alcanzan el detector/moléculas introducidas y por la ganancia.
Algunos detectores son tan sensibles como para detectar un simple ión.
Consideraciones generalesConsideraciones generales
Puede ser deseable una posterior amplificación de la señal en eldetector. También podemos diferenciar entre aquellos detectores quepermiten una medida directa de las cargas que alcanzan el detector, comoson las placas fotográficas y la Copa de Faraday, de aquellos que aumentanla intensidad de la señal como los detectores multiplicadores de electroneso fotones y los detectores “array”.
Los detectores de iones pueden situarse en el eje del haz de iones ofuera de éste, dependiendo del diseño del instrumento.
66
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Los detectores de iones pueden dividirse en dos clases:aquellos que detectan la llegada de todos los iones de formasecuencial en un punto (detector de iones puntual) y aquellosque detectan la llegada de iones de forma simultánea a lolargo de un plano (detector “array”).
ClasificaciónClasificación
67
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
DetectoresDetectores
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
ChanneltronChanneltron
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal MicrochannelMicrochannel PlatePlate
68
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Empleado en los primeros espectrómetros
Detector simultaneo
No cuantitativo
69
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Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
Copa deCopa de FaradayFaraday
DetectoresDetectores
ChanneltronChanneltron ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal
MicrochannelMicrochannel PlatePlate
70
Gran sencillez y robustez
Baja sensibilidad
Puede trabajar a presiones relativamente altas
Gran linealidad de respuesta
Copa deCopa de FaradayFaraday
Combinado con un SEM
Muy precisos. Respuesta independiente de la energía, de
la masa y de la naturaleza del ión
Baja velocidad de barrido Situado en el eje óptico del haz de iones
71
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
DetectoresDetectores
ChanneltronChanneltron
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal
MicrochannelMicrochannel PlatePlate
ChanneltronChanneltron
72
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25/28
a) Multiplicador de electrones secundarios (SEM) dedinodos discretos
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
73
b) Detector Channeltron (CEM)
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
74
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
El más empleado en MS
Tanto para iones positivos como negativos
Amplificación del orden 106-108
75
Requiere alta tensión y mejor vacío
Detector de vida limitada
Robustos y seguros
Ganancias elevadas
Dinodos de conversión
Tiempos de respuesta (ns)
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Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
DetectoresDetectores
ChanneltronChanneltron ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal
MicrochannelMicrochannel PlatePlate
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
76
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
Elevada sensibilidad
77
Larga duración
Elevada velocidad de respuesta
Buena estabilidad
Detección fuera del eje óptico Consta de dinodo, pantalla fosforescente y tubo
fotomultiplicador.
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
DetectoresDetectores
ChanneltronChanneltron
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal
MicrochannelMicrochannel PlatePlate
MulticanalMulticanal
78
8/16/2019 Sesion 2 Espectrometria de Masas
27/28
MulticanalMulticanal
79
Detector simultáneo
Elevada sensibilidad
Medida rápida
Amplificación (104-107)
Diferentes configuraciónes
Placa FotográficaPlaca Fotográfica
Copa deCopa de FaradayFaraday
Multiplicador de ElectronesMultiplicador de Electrones
DetectoresDetectores
ChanneltronChanneltron
ConversiónConversión fotónicafotónica,, DalyDaly o de centelleoo de centelleo
MulticanalMulticanal MicrochannelMicrochannel PlatePlate MicrochannelMicrochannel PlatePlate
80
MicrochannelMicrochannel PlatePlate
81
Elevada sensibilidad
Se pueden conectar varios placas
Amplificación 108
Actúa como un ÚNICO detector puntual que conecta
todos los multicanales.
8/16/2019 Sesion 2 Espectrometria de Masas
28/28
DETECTORES SECUENCIAL(puntual)
SIMULTÁNEA (array)
“medida directa” COPA FARADAY PLACA FOTOGRAFICA
DetectoresDetectores
“con amplificación” SEM
CENTELLEO
DETECTORES MÚLTIPLES
MCP Analizadores Q, Sector, TOF, IT Sector
82
Partes del Espectrómetro de MasasPartes del Espectrómetro de Masas
CONCLUSIÓN:Todos los E. deMasas no soniguales.
Selección delinstrumento que
necesitamos paranuestro análisis.
83