Serum Darah

5/24/2018 Serum Darah

1/13

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT SERUM DARAH

I. TUJUANMenentukan transaminase glutamat-piruvat yang terdapat pada serum darah ayam

II. DASAR TEORIAsam amino mempunyai peranan penting bagi tubuh. Selain menyediakan kebutuhan

nitrogen, asam-asam amino dapat digunakan sebagai sumber energi jika nitrogen dilepas.

Asam-asam amino tidak dapat disimpan dalam tubuh. Jika jumlah asam amino berlebih

atau kekurangan sumber lain (karbohidrat atau protein), tubuh akan menggunakan asam

amino sebagai sumber energi.Asam amino memerlukan pelepasan gugus amin. Gugus amin ini kemudian dibuang

karena bersifat toksik bagi tubuh. Terdapat dua tahap pelepasan gugus amin dari asam

amino yaitu transaminasi dan deaminasi oksidatif. Transaminasi merupakan proses utama

untuk melepaskan gugus nitrogen dari asam amino. Umumnya nitrogen dipindahkan

sebagai gugus amino dari asam amino ke -ketoglutarat sehingga terbentuk glutamat.

Sedangkan asam amino semula berubah menjadi asam keto padanannya.

Misalnya asam amino aspartat dapat diubah atau mengalami transaminasi

membentuk asam -ketooksaloasetat dalam proses ini gugus amino dipindahkan ke -

ketoglutarat yang berubah menjadi asam amino glutamat.

Semua asam amino kecuali asam amino lisin dan treonin dapat mengalami reaksi

transaminasi. Enzim yang mengkatalisis reaksi ini dikenal sebagai enzim transaminase atau

aminotransferase. Untuk sebagian besar reaksi ini, -ketoglutarat dan glutamate berfungsi

sebagai salah satu pasangan asam -keto, asam amino. kofaktornya adalah piridoksal fosfat.

Secara keseluruhan, pada reaksi transaminasi, gugus amino dari salah satu gugus

asam amino pada asam amino kedua karena bersifat reversibel, reaksi ini dapat digunakan

untuk mengeluarkan nitrogen dari asam amino atau untuk memindahkan nitrogen ke dalam

-keto untuk membentuk suatu asam amino. Dengan demikian, reaksi tersebut berperan

pada penguraian maupun pembentukan asam amino. Oleh karena itu, reaksi ini amat

penting dalam metabolisme asam amino.


2/13

Pada reaksi transaminasi, gugus -amino dipindahkan secara enzimatik ke atom

karbon pada -ketoglutarat sehingga dihasilkan asam -keto, analog dari asam amino

yang bersangkutan. Reaksi ini menyebabkan terjadinya aminasi -ketoglutarat membentuk

L-glutamat.

Glutamat dapat mengalami deaminasi oksidatif melalui oksidasi yang dikatalisis oleh

glutamat dehidrogenase yang menghasilkan ion ammonium dan -ketoglutamat. Dimana

NAD+ atau NADP

+ berfungsi sebagai kofaktor. Reaksi ini berlangsung di mitokondria

sebagian besar sel bersifat reversibel. reaksi ini dapat menggabungkan ammonia ke

glutamate atau membebaskan ammonia dari glutamate. akibat reaksi transaminasi,

glutamate dapat memperoleh nitrogen dari asam amino lain dan melepaskan amoniamelalui

reaksi glutamat dehidrogenase. proses ini merupakan salah satu sumber ammonia yangmasuk ke dalam siklus urea.

Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi -ketoglutarat sebagai molekul

penerima gugus amino. Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik sebagai

substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa

transaminase yang paling penting dinamakan sesuai dengan molekul pemberi gugus

aminonya.

Asam L-alanin + -ketoglutarat piruvat + L-glutamat

Asam L-aspartat+ -ketoglutarat oksaloasetat + L-glutamat

Asam L-leusin + -ketoglutarat -ketoisokaroat + L-glutamat

Asam L-tirosin + -ketoglutarat p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamat

Hati, ginjal, dan otot mengandung banyak transaminase glutamat-oksaloasetat (TGO),

disebut juga sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamat-piruvat (TGP),

disebut juga sebagai alanin aminotransferase. Serum pada keadaan normal menunjukkan

aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah. Hanya apabila terjadi kerusakan sel pada jaringan-

jaringan tersebut, maka enzim-enzim intraseluler di atas akan keluar dari sel dan masuk ke

dlaam darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP serum dapat dijumpai pada jenis penyakit

yang menyangkut jaringan tertentu.

Pada praktikum ini dilakukan penentuan transaminase glutamat-piruvat serum darah

ayam.


3/13

III. ALAT DAN BAHANAlat yang digunakan dalam praktikum

ALAT JUMLAH

Tabung reaksi 1 rak

Batang pengaduk 1 buah

Spatula 2 buah

Gelas kimia 100 mL 1 buah

Gelas kimia 250 mL 1 buahGelas kimia 50 mL 1 buah

Heater 1 buah

Kaca arloji 1 buah

Termometer 100 1 buah

Pipet Volumetri 5 mL 1 buah

Filer 1 buah

Speftrofotometer 1 buah

Bahan yang digunakan dalam praktikum

BAHAN JUMLAH

Serum Darah Secukupnya

Larutan 2,4dinitrifenilhidrasin Secukupnya

Larutan NaOH 0,4 N Secukupnya

Larutan buffer fosfat pH 4,7 Secukupnya

Larutan standar piruvat Secukupnya

Larutan substrat Secukupnya


4/13

IV. PROSEDUR KERJA DAN HASIL PENGAMATANNO PROSEKUR KERJA HASIL PENGAMATAN

1 0,5 mL substrat dimasukan ke dalam

tabung reaksi dan inkubasi dalam

penangas air dalam suhu 37selama 3

menit.

Larutan substrat bening tak berwarna Setelah dilakukan inkubasi selama 3

menit pada suhu 37 larutan tetap

bening tak berwarna.

2 Tambahkan dengan 0,1 mL serum,

dicampurkan dengan baik dan

diinkubasi selama 60 menit.

Setelah dilakukan penambahan 0,1mL serum larutan berubah warna

menjadi sedikit merah.

Setelah dilakukan inkubasi larutantetap berwarna kemerahan.

3 Tabung yang telah diikubasi diambil

dan keudian ditambahkan 0,5 mL

DNFH kemudian dikocok degan baik

Larutan DNFH berwarna oranye

Gambar 1

Larutan DNFH

Setelah dilakukan penambahanlarutan DNFH maka larutan yang

berwarna kemerahan berubah warna

menjadi merah sedikit oranye.

4 Sebanyak 0, 5 mL substrat ditambahkan

dengan 0,5 mL larutan DNFH dan

Setelah dilakukan penambahanlarutan larutan DNFH pada larutan


5/13

kemudian ditambahkan dengan 0,1 mL

larutan serum (larutan ini digunakan

sebagai larutan control)

substrat yang bening tak berwarna

terbentuk larutan yang berwarna

oranye.

Kemudia setelah ditambahkanlarutan serum terbentul larutan yang

berwarna kemerahaan.

5 Sebanyak 0,5 mL larutan substrat

ditambahkan dengan 0,1 mL aquades

dan kemudian ditambahkan larutan

DNFH (larutan ini sebagai larutan

blanko)

Setelah dilakukan penambahanaquades pada larutan substrat

terbentuk larutan yang being tak

berwarna.

Ketika dilakukan penambahanlarutan DNFH maka terbentuk

larutan yang berwarna oranye.

6 Sebanyak 0,5 mL larutan standar piruvat

ditambahkan dengan larutan substrat

sebanyak 0,4 mL dan ditambahkan 0,1

mL aquades dan kemudian

ditambahakan larutan DNFH sebanyak

0,5 mL (larutan ini digunakan sebagai

larutan standar)

Larutan standar piruvat ditambahkandengan larutan standar terbentuk

larutan yang bening tak berwarna

dan kemudian dilakukan

penambahan aquades maka terbentuk

larutan yang bening tak berwarna

Setelah dilaukan penambahan larutanDNFH yang berwarna oranye maka


oranye.

7 Semua tabung yang telah diisi dengan

larutan DNFH dibiarkan bereaksi

selama 20 menit dan kemudian

dilakukan penamabahan larutan NaOH

0,4 N sebanyak 5 mL

Tabung 1 (larutan sampel) yangawalnya berarna oranye kemerahan

ketika ditambahkan larutan NaOH

0,4 N yang being tak berarna


coklat.


6/13

Gambar 2

Larutan sampel ditambah NaOH

Tabung 2 (larutan control) yangberwarna kemerahan ketikadilakukan penambahan larutan

NaOH 0,4 N sebanyak 5 mL


merah.

Tabung 3 (larutan blanko) larutanyang berwarna oranye dan kemudian

ditambahkan dengan larutan NaOH

0,4 N larutan awalnya berwarna

oranye terjadi perubahan warna pada

larutan yaitu menjadi berwarna

coklat.


7/13

Gambar 3

Larutan blanko ditambah NaOH

Tabung 4 ( larutan standar) yaituyang awalnya berwarna orante ketika

ditambahkan larutan NaOH 0,4 N

yang bening tak berwarna, larutan

mengalami perubahan warna menjadi

berwarna merah.

8 Campuran pada prosedur diatas

dicampurkan dengan baik kemudian

didiamkan pada suhu kamar selama 10menit kemudian ditentukan serapannya

Setelah campuran didiamkan selama 10

menit kemudian ditentukan serapannya

maka didapatkan hasil sebagai berikut:Tabung Absorbansi %T

Tabung 1

(larutan

sampel)

0,455 45%

Tabung 2

(larutan

control)

0,395 40,5 %

Tabug 3

(larutan

Blanko)

0,375 42,5 %

Tabung 4

(larutan

standar)

0,76 17%

V. PEMBAHASANPada praktikum ini dilakukan penentuan transaminase glutamat-piruvat (TGP) yang

terdapat pada serum darah. Transaminasi merupakan proses utama untuk melepaskan gugus

nitrogen dari asam amino. Umumnya nitrogen dipindahkan sebagai gugus amino dari asam


8/13

amino ke -ketoglutarat sehingga terbentuk glutamat. Sedangkan asam amino semula

berubah menjadi asam keto padanannya.

Agar reaksi ini dapat berlangsung, diperlukan suatu enzim yaitu enzim transaminase

glutamat. Enzim transaminase glutamat adalah enzim yang mengkatalisis reaksi

transaminasi antara asam L-alanin dan -ketoglutarat menghasilkan asam piruvat dan asam

L-glutamat. Dalam reaksi ini terjadi pelepasan gugus nitrogen dari alanin sehingga

menghasilkan asam piruvat. Gugus nitrogen yang dilepaskan alanin ditangkap oleh -

ketoglutarat menghasilkan L-glutamat. Reaksi transaminasi yang terjadi adalah sebagai

berikut.

Gambar 4Reaksi Transaminasi Glutamat

Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik terhadap -ketoglutarat sebagai

molekul penerima gugus amino. Substrat dalam percobaan ini adalah amino L-alanin dan

asam -ketoglutarat. Pada reaksi tersebut, gugus -amino pada asam amino alanin

dipindahkan secara enzimatis ke dalam atom karbon pada -ketoglutarat sehingga

dihasilkan asam piruvat yang merupakan asam -keto analog dengan asam L-alanin. Reaksi

tersebut juga diikuti dengan aminasi -ketoglutarat menghasilkan asam L-glutamat. Reaksi

tersebut diikuti dengan aminasi -ketoglutarat menghasilkan asam L-glutamat.

Pada percobaan ini dilakukan beberapa pengujian yaitu untuk larutan sampel,

larutan kontrol, larutan blangko, dan larutan standar. Untuk larutan uji digunakan 0,5 mL

substrat (mengandung 200 mM asam L-alanin dan 2 mM asam -ketoglutarat). Kemudian

ditambahkan 0,1 mL larutan serum darah ayam. Fungsi dari serum darah ayam adalah

CH NH 3+

COO-

+

COO -

CH 2

CH 2

C O

COO -

transaminase

COO -

O

C

CH 2

CH 2

COO -

+

-COO

+

NH 3H

C

CH 3 CH 3Glutamat Piruvat

Alanin -ketoglutarat asam piruvat L-glutamat


9/13

sebagai penyedia enzim transaminase glutamat-piruvat. Sebelum ditambahkan serum darah,

larutan uji terlebih dahulu diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 menit. Inkubasi ini

bertujuan untuk mengkondisikan suhu larutan substrat sesuai dengan suhu optimum

terjadinya reaksi transaminase glutamat piruvat.

Setelah proses inkubasi selesai, larutan kemudian ditambahkan 0,1 mL serum darah

ayam terhadap larutan uji. Setelah itu kembali diinkubasi selama 60 menit. Setelah

diinkubasi selama 60 menit, dilakukan penambahan larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin.

Senyawa 2,4-dinitrofenilhidrazin yang ditambahkan akan bereaksi dengan asam piruvat

yang dihasilkan dari reaksi transaminasi sehingga menghasilkan senyawa berwarna.

Senyawa berwarna ini kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektronik

20+. Reaksi yang terjadi melibatkan gugus karbonil pada asam piruvat menghasilkansenyawa kompleks piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin. Dengan adanya penambahan larutan

DNFH menyebabkan warna larutan menjadi oranye yang mengindikasikan terbentuknya

kompleks berwarna. Reaksinya yang terjadi adalah sebagai berikut.

Gambar 5 Reaksi pembentukan piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Kemudian untuk larutan kontrol, dibuat dengan cara mencampurkan 0,5 mL substrat

dengan 0,5 mL DNFH dan 0,1 mL serum darah ayam. Kemudian diinkubasi selama 10

menit. Pengujian terhadap larutan kontrol ini bertujuan untuk mengetahui jumlah DNFH

yang bereaksi dengan substrat. Pada -ketoglutamat terdapat gugus karbonil yang dapat

bereaksi dengan DNFH menghasilkan kompleks berwarna. adapun reaksi yang terjadi

adalah sebagai berikut.

O

COOH

C

CH 3

+ NO 2HN N

NO 2

CH 3

C

COOH

NO 2

N NH NO 2

asam piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin


10/13

Gambar 6 Reaksi Pembentukan ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Adanya jumlah DNFH yang bereaksi dengan substrat akan mengganggu dan

berkontribusi dalam absorbansi larutan sampel. Adanya reaksi ini menyebabkan absorbansi

larutan sampel menjadi bertambah. Dalam perhitungan, absorbansi larutan sampel akan

dikurangi dengan hasil absorbansi larutan kontrol. Dengan perlakuan ini maka absorbansi

yang terukur bisa saja hanya absorbansi kompleks piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin. Dengan

cara ini absorbansi larutan substrat yang mengandung piruvat dapat diketahui.

Kemudian dilakukan pula pengujian terhadap larutan standar. Larutan standar dibuat

dengan menambahkan 0,4 mL larutan substrat, 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan DNFH

ke dalam 0,1 mL larutan standar piruvat dan kemudian diinkubasi selama 20 menit.

Pengujian terhadap larutan standar ini bertujuan untuk membandingkan absorbansinya

dengan larutan yang diuji. Dengan perbandingan tersebut, bila larutan standar telah

diketahui konsentrasinya maka konsentrasi piruvat dalam larutan uji dapat diketahui.

Pengujian terhadap larutan blangko juga dilakukan karena larutan yang digunakan

menunjukkan warna tertentu. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengukuran absorbansi

larutan blanko yang mengandung aquades dan larutan DNFH. Larutan blangko dibuat dari

0,5 mL substrat ditambahkan 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan DNFH. Selanjutnya,

larutan yang terbentuk diinkubasi selama 20 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 5 mL

NaOH, diaduk dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian diukur

serapannya pada panjang gelombang 510 nm.

COO -

CH 3

CH 3

C O

COO -

+ NO2

NHN

NO 2NO 2

NHN NO 2

COO -

C

CH 3

CH 3

COO -

-ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin


11/13

Sebelum dilakukan pengujian absorbansi dengan spektronik 20+, pada larutan

sampel, larutan standar dan larutan kontrol dilakukan penambahan 5 mL NaOH 0,4 N

terlebih dahulu. Tujuannya adalah untuk menghentikan reaksi antara gugus karbonil dan

asam piruvat. Reaksi antara gugus karbonil dan asam piruvat hanya berlangsung dalam

suasana sedikit asam, sehingga ketika ditambahkan larutan NaOH 0,4 N reaksi akan

terhenti.

Dari hasil pengukuran absorbansi dengan menggunakan spektronik 20+ didapatkan

harga %T dari larutan sampel, kontrol, standar, dan blanko sebagai berikut.

Tabel 1. Hasil pengukuran absorbansi

Tabung Absorbansi %TTabung 1 (larutan sampel) 0,455 45%

Tabung 2 (larutan control) 0,395 40,5 %

Tabug 3 (larutan Blanko) 0,375 42,5 %

Tabung 4 (larutan standar) 0,76 17%

Dari tabel diatas maka dapat dihitung kada puruvat pada serum dara dengan rumus sebagai

berikut:

piruvatmM4BS

KT

dengan,

T = serapan untuk zat yang diuji (sampel)

K = serapan untuk kontrol

S = serapan untuk standar

B = serapan untuk blanko

Piruvat yang terbentuk per menit oleh per liter serum adalah sebagai berikut.

mol67xBS

KT

0,1

1000x0,1x4x

BS

KT


12/13

serumliterpermenitperpiruvatmM0,6234

piruvamM4x0,385

,060

piruvamM4x0,3750,76

0,395455,0

piruvatmM4xBS

KT

serumliterpermenitpermmol44,10670,3750,76

0,395455,0mmol67x

BS

KT

mmolx

Berdasarkan hasil perhitungan diatas, maka kadar piruvat yang dihasilkan dalam

serum darah yang diuji yaitu sebesar 10,44 mmol piruvat per menit per liter serum, kadar

ini lebih rendah bila dibandingkan dengan kadar maksimum normal yaitu 23 mmol piruvatper menit per liter serum. Maka kadar piruvat dalam serum darah ayam tersebut adalah

tergolong normal.

Kadar piruvat yang dihasilkan ini dapat digunakan sebagai tolak ukur kadar

transaminase glutamat piruvat yang dihasilkan pada serum darah. Dengan mengasumsikan

bahwa kadar piruvat sebanding dengan kadar transamirase glutamat piruvat pada serum

darah, maka kadar enzim transaminase glutamat piruvat dapat dinyatakan sebesar

10,44mmol piruvat per menit per liter serum.

VI. KESIMPULANBerdasarkan pembahasan diatas maka dapat disimpulkan bahwa kadar enzim

transaminase glutamat piruvat sebanding dengan kadar piruvat dalam serum darah ayam

yaitu sebesar 10,44 mmol piruvat per menit per liter serum.

VII. DAFTAR PUSTAKAFessenden, F dan Fessenden. 1994.Kima Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga

Frieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu

Pendidikan Negeri Singaraja.

Girindra, Aisyah dan Titin Supriyanti. 1994.Dasar dasar Biokimia.Jakarta ; Universitas

Indonesia.


13/13

Ismono. 1978. Cara-cara Optik Dalam Analisis Kimia. Diktat. Bandung: Jurusan Kimia

ITB.

Lehninger, Albert.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1 dan 3 Alih Bahasa Maggy

Thenawidjaya. Jakarta: Erlangga.

Morrison, Robert Thornton and Robert Neilson Boyd.1983.Organic Chemistry Fourth

Edition.Singapore: Allyn and Bacon, Inc

Redhana, I Wayan. 2004. Buku Ajar Biokimia Jilid I. Singaraja : Institut Keguruan dan

Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.

Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas

Pendidikan Ganesha.

Tika, I Nyoman. 2010. Buku Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: UniversitasPendidikan Ganesha.

Documents

Serum Darah