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SeraQuest ANTI – SSA SeraQuest ANTI – SSA
ENA – 4 PROFENA – 4 PROF
InmunoDOTInmunoDOT
DNA/ENA DNA/ENA AUTOINMUNITY AUTOINMUNITY
SCREENING PANELSCREENING PANEL
ENA – 6 – SCREEN IENA – 6 – SCREEN I
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Las muestras diluidas son incubadas con el antígeno que esta pegado a los pozos
Si los Ac anti – SSA estan presentes en la muestra se uniran al antigeno
Los residuos de la muestra son eliminados por lavado y secado
Se añade el conjugado (anti – IgG marcada con una enzima) y se incuba la placa
Si los Ac anti – SSA estan presentes, el conjugado se unira al complejo Ag – Ac
Los residuos del conjugado son eliminados por lavado y secado
Finalmente se añade el sustrato y se incuba
En presencia de la enzima el sustrato da un producto final de color amarillo, el cual se lee fotometricamente
EE
SUSTRATO EE
COLORCOLOREE
SUSTRATO
H2SO4
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac específicos para ENA del suero se unen al Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca
Se incuba con un Ac anti – IgG humano conjugado con peroxidasa
Finalmente se añade el cromogeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de hidrogeno (H2O2)
Este sustrato dará lugar a un producto soluble de color amarillo
La reacción enzimática se detiene con H2SO4
La formación del producto se mide a 450 nm
La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción
PODPOD
TMBPODPOD
COLORCOLORPODPOD
TMB
H2SO4
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
El InmunoDOT DNA/ENA Autoinmunity Screening Panel utiliza una técnica de marcado puntiforme (dot) de inmunoensayo (EIA) para la detección de Ac
Los Ag son dispensados como punteados discretos sobre una membrana sólida
Después de adicionar la muestra al envase de reacción, se inserta una cinta de prueba, permitiendo que los Ac del paciente reaccionen con el Ag de prueba para unirse a la membrana sólida de soporte de la cinta
En la segunda fase, la reacción es aumentada por el retiro de materiales unidos inespecíficamente
Durante la tercera fase los anti – Ac humanos conjugados con la fosfatasa alcalina se dejan reaccionar con los Ac unidos del paciente
Finalmente, la cinta es transferida a un reactivo de sustrato enzimático, el cual reacciona con la fosfatasa alcalina unida para producir un punteado diferenciado, fácilmente visible
FAFA
FAFAFAFA
Sustrato Enzimático
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac específicos para ENA del suero se unen al Ag adsorbido a la superficie de los pocillos de la microplaca
Se incuba con un Ac anti – IgG humano conjugado con peroxidasa
Finalmente se añade el cromogeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB) con peroxido de hidrogeno (H2O2)
Este sustrato dará lugar a un producto soluble de color amarillo
La reacción enzimática se detiene con H2SO4
La formación del producto se mide a 450 nm
La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción
PODPOD
TMBPODPOD
COLORCOLORPODPOD
TMB
H2SO4
Las anticardiolipinas son Ac que van dirigidos contra las cardiolipinas, las
cuales son un componente importante de la membrana
mitocondrial. Se presentan en las células metabólicamente activas del
músculo cardíaco y esquelético.
TÉCNICATÉCNICA
ANTI – CARDIOLIPIN ANTI – CARDIOLIPIN ANTIBODIANTIBODI
QUANTA LiteQUANTA Lite
ACA IgG IIIACA IgG III
QUANTA LiteQUANTA Lite
ACA IgM IIIACA IgM III
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBALos pocillos de la microplaca contienen Ag cardiolipina altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo
Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los Ac anti – cardiolipina al Ag que los recubre
El resto de componentes no unidos se eliminan durante el lavado y se añade conjugado anti IgG humana a cada pocillo.
Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los Ac presentes
Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado
Una vez que se haya detenida la producción enzimática de producto coloreado, se determina la presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina por medio de la comparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración de cinco puntos.
Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidades estándar de anticardiolipina IgG (GPL)
EE
TMB EE
COLORCOLOREE
TMB
H2SO4
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBALos pocillos de la microplaca contienen Ag cardiolipina altamente purificado que se ha unido en condiciones que mantienen su estado nativo
Se añaden controles y muestras convenientemente diluidas en pocillos separados, uniéndose durante la incubación los Ac anti – cardiolipina al Ag que los recubre
El resto de componentes no unidos se eliminan durante el lavado y se añade conjugado anti IgM humana a cada pocillo.
Un segundo paso de incubación permite que el conjugado se una a los Ac presentes
Tras un lavado que elimina el conjugado sobrante, se añade un sustrato cromogénico y tras incubación la actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado
Una vez que se haya detenida la producción enzimática de producto coloreado, se determina la presencia o ausencia de Ac contra la cardiolipina por medio de la comparación de la densidad óptica de la muestra con la de una curva de calibración de cinco puntos.
Los resultados se dan a conocer de forma semicuantitativa en unidades estándar de anticardiolipina IgM (MPL)
EE
TMB EE
COLORCOLOREE
TMB
H2SO4
1. Preparar dilución 1:51 del calibrador, controles y muestras
2. Colocar 100 l de las diluciones en los pozos, reservar un pozo para el blanco
3. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
4. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
5. Colocar 2 gotas o 100 l de conjugado en los pozos
6. Incubar a temperatura ambiente por 35 minutos
7. Lavar los pozos cuatro veces con solución de lavado y secar
8. Colocar 2 gotas o 100 l de sustrato en los pozos
9. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos
10. Detener la reacción enzimática con 2 gotas o 100 l de solución de parada (H2SO4)
11. Leer la absorvancia a 405 nm
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac anti – cardiolipina (ACA) del suero, en presencia de 2 – glicoproteína I, se unen a la cardiolipina adsorbida a la superficie de los pocillos de la microplaca
A continuación, se incuba con un Ac anti – IgG o anti – IgM humano conjugado con peroxidasa
Finalmente, se añade el cromógeno 3.3’, 5.5’ – tetrametilbencidina (TMB)con H2O2, sustrato que da color a un producto soluble de color amarillo
La reacción enzimática se detiene con H2SO4 y la formación de producto se mide a 450 nm
La concentración de Ac en la muestra es proporcional a la absorbancia del producto en la reacción
EE
TMB EE
COLORCOLOREE
TMB
H2SO4
Los Ac antinucleares (ANAS) constituyen un conjunto de distintos Ac dirigidos contra componentes macromoleculares normales del núcleo celular
5 grupos de ANAS:
1. Ac antinucleoproteínas (complejo DNA - histonas)
2. Ac contra DNA
3. Ac contra Ag nucleares salino extraíbles dirigidos contra los Ag:
* Sm (proteína nuclear no asociada con Ag nucleicos) *RNP (ribonucleoproteína) *SS – A/Ro *SS – B/La *Jo – 1 *Scl – 70
4. Ac contra ácido ribonucleico del nucleolo
5. Ac contra histonas libres
TÉCNICATÉCNICA
NOVA LiteNOVA Lite
ANA PlusANA Plus
NOVA LiteNOVA Lite
HEp - 2HEp - 2
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos
del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura
ambiente 4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo
ligeramente. Evitar la mezcla de sueros.5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato
Salino)6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos.
Cambiar el PBS y repetir el lavado.7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El
sustrato debe permanecer siempre húmedo.8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una
cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un
cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire.11. Observar al microscopio de fluorescencia
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se unen a sus correspondientes antígenos
Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína
Se visualizan por microscopía de fluorescencia
Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido
1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos
del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura
ambiente 4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo
ligeramente. Evitar la mezcla de sueros.5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato
Salino)6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos.
Cambiar el PBS y repetir el lavado.7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El
sustrato debe permanecer siempre húmedo.8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una
cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un
cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire.11. Observar al microscopio de fluorescencia
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
Los anticuerpos anti-nucleares (ANA) del suero se unen a sus correspondientes antígenos presentes en las células HEp-2
Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína
Se visualizan por microscopía de fluorescencia
Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los Ac anti – DNA penetran la célula, reconocen y se unen al DNA de doble cadena o de cadena simple. La penetracion de estos Ac pueden alterar las funciones celulares e inducir la muerte apoptótica de la célula.
Uno de los métodos utilizados para la detección de los Ac anti – DNA es la IFI sobre el protozoo Crithidia luciliae, cuyo DNA circular y en formade helice esta contenido
dentro de la mitocindria gigante desplazado hacia uno de sus polos, llamado cinetoplasto.
TÉCNICASTÉCNICAS
NOVA Lite NOVA Lite dsDNA Crithidia dsDNA Crithidia
luciliaeluciliae
Inmuno Concepts Inmuno Concepts IgG ANTI - ADNn IgG ANTI - ADNn
ANTI – ADNn ANTI – ADNn ColorzymeColorzyme
PEROXISET PEROXISET ANTI – DNA ANTI – DNA
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos
del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura
ambiente 4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo
ligeramente. Evitar la mezcla de sueros.5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato
Salino)6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos.
Cambiar el PBS y repetir el lavado.7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El
sustrato debe permanecer siempre húmedo.8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una
cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un
cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire.11. Observar al microscopio de fluorescencia
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBA
Los anticuerpos anti – DNA del suero se unen a sus correspondientes antígenos
Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubación con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluoresceína
Se visualizan por microscopía de fluorescencia
Muestras con autoanticuerpos exhiben una fluorescencia verde manzana correspondiente a las áreas de la célula o el núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO1. Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente2. Depositar una gota (50 µL) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos
del portaobjetos (A), procurando cubrirlo perfectamente3. Incubar el portaobjetos en cámara húmeda durante 30 minutos a temperatura
ambiente 4. Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpeándolo
ligeramente. Evitar la mezcla de sueros.5. Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavándolo con PBS (Buffer Fosfato
Salino)6. Lavar el portaobjetos sumergiéndolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos.
Cambiar el PBS y repetir el lavado.7. Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. El
sustrato debe permanecer siempre húmedo.8. Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una
cámara húmeda e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.9. Lavar (ver paso 6) y secar (ver paso 7).10. Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un
cubreobjetos procurando evitar la formación de burbujas de aire.11. Observar al microscopio de fluorescencia
PRINCIPIO DE LA PRUEBAPRINCIPIO DE LA PRUEBALas muestras de los pacientes se incuban con un sustrato antigénico que permite la unión específica de los autoanticuerpos al ADNn del cinetoplasto
Si hay Ac anti – ADNn se forma un complejo Ag – Ac estable
Tras el lavado para retirar los Ac unidos de forma inespecífica, se incuba el sustrato con Ac anti- humanos conjugados con fluoresceína
Si los resultados son positivos se forma un complejo estable con tres partes: el Ac fluorescente unido al Ac anti – ADNn humano, unido a su vez al Ag anti – ADNn
Este complejo se puede visualizar con la ayuda de un microscopio de fluorescencia
En las muestras positivas, el cinetoplasto o el núcleo, o los dos, mostrarán una fluorescencia de color verde manzana brillante en el interior de los microorganismos Crithidia luciliae.
